MXPA01005389A - Presentacion molecular ordenada de antigenos, metodos de preparacion y uso. - Google Patents
Presentacion molecular ordenada de antigenos, metodos de preparacion y uso.Info
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Abstract
La invencion proporciona composiciones y procesos para la produccion de arreglos de determinantes antigenicas o antigenos ordenadas y repetitivas. Las composiciones de la invencion son utiles para la produccion de vacunas para la prevencion de padecimientos infecciosos, el tratamiento de alergias y el tratamiento de canceres. Las varias modalidades de la invencion se proporcionan para un virus, particulas similares a virus, particulas capsidas virales, fagos o una combinacion de las mismas revestidas con cualquier antigeno deseado en una forma repetitiva y altamente ordenada como el resultado de la produccion especifica de las particulas virales revestidas con el antigeno. Otras modalidades especificas permiten la produccion de las particulas similares al virus de la Hepatitis B revestidos con el antigeno o particulas similares al virus del Sarampion revestidos con el antigeno.
Description
PRESENTACIÓN MOLECULAR ORDENADA DE ANTIGENOS , MÉTODOS DE PREPARACIÓN Y USO
Antecedentes de la Invención Campo de la Invención La presente invención se refiere a los campos de la biología molecular, virología, inmunología y medicina. La invención proporciona una composición que comprende un arreglo determinante antigénico o antigeno repetitivo y ordenado. La invención también proporciona un proceso para producir un determinante antigénico o antigeno en un arreglo repetitivo y ordenado. El determinante antigénico o antigeno repetitivo y ordenado es empleado en la producción de vacunas para el tratamiento de padecimientos infecciosos, el tratamiento de alergias y como un fármaco para prevenir o curar el cáncer y generar los anticuerpos auto-especificos definidos.
Técnica Relacionada El desarrollo de vacunas para la prevención de padecimientos infecciosos ha tenido el impacto más grande en la salud humana que cualquier invención médica. Se
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estima que son prevenidas alrededor del mundo, tres millones de muertes por la vacunación (Hillemann, Na ture Medicine 4:507 (1998)). La estrategia de vacunación más común, el uso de patógenos atenuados (es decir, menos virulentos) u organismos estrechamente relacionados, fue demostrada primero por Edward Jenner en 1976, quien vacunó contra la viruela mediante la administración de un virus de vacuna menos peligroso. Aunque un número de virus atenuados vivos (por ejemplo, sarampión, paperas, rubéola, varicela, adenovirus, polio, influenza) y bacterias (por ejemplo, bacilo Calmette-Guerin (BCG) contra la tuberculosis), son exitosamente administrados por vacunación, existe un riesgo del desarrollo de complicaciones serias relacionadas con la reversión a la virulencia y la infección por el organismo de "vacuna", en particular, en individuos inmunocomprometidos . El diseño especifico de virus atenuados es ahora posible por la tecnología de ADN recombinante (es decir, ingeniería genética) a través de la generación de variantes de supresión o mutación. Por ejemplo, la administración de un Virus de Inmunodeficiencia de Simio diseñado genéticamente (SIV) con una supresión dentro del gen nef, mostró proteger macacos de la infección
subsecuente con una cepa SIV patogénica (Daniel et al . , Science 258: 1938-1941 (1992)). Sin embargo, la progresión de síntomas similares como el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (AIDS) en animales, se refiere a la seguridad alcanzada por el SIV atenuado administrado (Baba et al . , Science 267 : 1820- 1825 (1995)). Como un procedimiento alternativo, los virus o bacterias atenuados pueden ser usados como portadores para los genes que codifican al antigeno de un patógeno que es considerado también inseguro para ser administrado en una forma atenuada {por ej emplo , Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) . Después de la liberación del gen que codifica al antigeno en el hospedero, el antigeno es sintetizado in si tu . La vaccinia y virus avipox relacionados, se han usado como tales portadores para varios genes en los estudios clínicos y pre-clinicos para una variedad de padecimientos (por ejemplo, Shen et al . , Sci ence 252:440 (1991)). Una desventaja de esta estrategia de vacunación es que no imita a la superficie del virion, debido a que la proteina recombinante se expresa en la superficie de la célula hospedera. Adicionalmente, las complicaciones pueden desarrollarse en individuos inmunocomprometidos, como se evidencia por las
infecciones de vaccinia diseminadas que amenazan la vida Redfield, N. Eng. J. Med. 316:673 (1998)). Un cuarto procedimiento de vacunación involucra el uso de componentes aislados de un patógeno, ya sea purificado a partir del crecimiento del patógeno in vi tro (por ejemplo, neuraminidasa o hemaglutinina de la influenza) o después de la expresión heteróloga de una proteina viral única (por ejemplo, antigeno de la superficie de la hepatitis B) . Por ejemplo, toxinas mutadas, recombinantes (destoxificadas) usadas para la vacunación contra la difteria, tétanos, cólera y toxinas pertusis (Levine et a l . , New genera tion va ccines , 2nd. Edn., Marcel Dekker, Inc., ?e York 1997), y proteinas recombinantes de VIH (120 gp y longitud completa de 160 gp) , se evaluaron como un medio para inducir los anticuerpos neutralizantes contra el VIH con resultados frustantes (Connor et al . , J. Virol . 72:1552 (1998)). Recientemente, se obtuvieron resultados prometedores con 160 gp oligomérico soluble, que puede inducir respuestas CTL y estimular anticuerpos los cuales neutralizan la actividad contra VIH-1 asilados (Van Cortt et al . , J. Virol . 71:4319 (1997)). Además, pueden ser usadas las vacunas peptidicas, en las cuales los epitopes
de las células T o B conocidos de un antigeno, se acoplan a una molécula portadora diseñada para incrementar la inmunogenecidad del epitope mediante la estimulación de la ayuda de las células T. Sin embargo, un problema significante con este procedimiento es que se proporciona una respuesta inmune limitada a la proteina como un todo. Sin embargo, las vacunas han sido individualmente diseñadas para haplotipos MHC diferentes. El más serio referente para este tipo de vacuna es que los complejos reconocen anticuerpos antivirales protectivos, estructuras tridimensionales que no pueden ser mimetizadas por los péptidos . Una estrategia de vacunación más nueva, es el uso de vacunas de ADN (Donnelly et al . , Ann . Rev. Immunol . 15:617 (1997)), la cual puede generar respuestas CTL restringidas a la clase I de MHC (sin el uso de un vector vivo) . Este puede proporcionar protección más amplia contra las diferentes cepas de un virus por los epitopes objetivos a partir de las proteinas internas conservadas pertinentes a muchas cepas del mismo virus. Puesto que se produce el antigeno con modificación post-traduccional de mamífero, la conformación y oligomerización es más parecida por ser similar o idéntica a la proteina de tipo
nativa producida por la infección viral que a las proteinas químicamente modificadas o recombinantes. Sin embargo, esta distinción puede cambiar por ser una desventaja para la aplicación de antigenos bacterianos, puestos que una modificación post-traduccional no nativa puede resultar en la inmunogenicidad reducida. Además, las proteinas de superficie viral no están altamente organizadas en la ausencia de las proteinas de matriz. Además de las aplicaciones para la prevención de los padecimientos infecciosos, la tecnología de vacunas está ahora siendo utilizada para dirigir problemas inmunes asociados con las alergias. En individuos alérgicos, los anticuerpos del isotipo IgE se producen en una respuesta inmune humoral inapropiada hacia los antigenos particulares (alérgenos) . El tratamiento de alergias por la inmunoterapia de alergia, requiere administración semanal de dosis que sucesivamente se incrementan del alérgeno particular durante un periodo de hasta 3-5 años. Presumiblemente, los anticuerpos IgG "de bloqueo", generados, interceptan alérgenos en las secreciones nasales o respiratorias o en membranas antes de que reaccionen con los anticuerpos IgE en las células mástil. Sin embargo, no existe relación constante entre los
tituladores de IgG y el alivio de los síntomas. Actualmente, este es un proceso que extremadamente consume costos y tiempo, por ser considerado solamente para pacientes con síntomas severos durante un periodo prolongado cada año. Está bien establecido que la administración de las proteinas purificadas solas, no es usualmente suficiente para estimular una respuesta inmune fuerte; el antigeno aislado generalmente podrá ser dado junto con substancias auxiliadoras llamadas adyuvantes. Dentro de estos adyuvantes, el antigeno administrado es protegido contra la rápida degradación, y el adyuvante proporciona una liberación prolongada en un nivel inferior del antigeno . Los virus, proteinas aisladas diferentes, inducen respuestas inmunes eficientes y prontas en la ausencia de cualquiera de los adyuvantes, tanto con y sin la ayuda de células T. (Bachmann & Zinkernagel, Ann . Rev. Immunol . 15:235-270 (1997)). A pesar de que los virus que a menudo consisten de unas cuantas proteinas, son capaces de provocar respuestas inmunes mucho más fuertes que sus componentes aislados. Para las respuestas de las células B, se sabe que un factor crucial para la inmunogenicidad
de los virus es la repetitividad y orden de los epitopes de la superficie. Muchos virus exhiben una superficie casi cristalina que presentan un arreglo regular de epitopes, los cuales eficientemente reticulan las inmunoglobulinas especificas del epitope en las células B (Bachmann & Zinkernagel, Immunol . Today 17:553-558 (1996). Esta reticulación de inmunoglobulinas de la superficie en las células B, es una señal de activación fuerte que directamente induce la progresión del ciclo celular y la producción de los anticuerpos IgM. Además, tales células B provocadas, son capaces de activar a las células auxiliadoras T, las cuales en cambio, inducen una interrupción de la producción del anticuerpo IgM a IgG en las células B y la generación de la memoria de las células B de larga vida - la meta de cualquier vacunación (Bachmann & Zinkernagel, Ann . Rev. Immunol . 15:235-270 (1997)). La estructura viral está aún, ligada a la generación de anticuerpos en padecimientos autoinmunes y como una parte de la respuesta natural a los patógenos (véase, Fehr, T., et al . , J. Exp . Med. 185 : 1185-1192 (1997)). Asi, los antigenos en las particulas virales que están organizadas en un arreglo ordenado y repetitivo, son altamente inmunogénicos, puesto que pueden directamente,
activar a las células B. Además de las respuestas de las célula B fuertes, las particulas son también capaces de inducir la generación de una respuesta a las células T citotóxicas, otra arma crucial del sistema inmune. Estas células T citotóxicas son particularmente importantes para la eliminación de virus no citopáticos tales como los virus de la hepatitis B o VIH, y para la erradicación de tumores. Las células T citotóxicas, no reconocen antigenos nativos pero preferentemente reconocen sus productos de degradación en asociación con las moléculas de clase I de
MHC (Townsend & Bodmer, Ann. .Rev. Immunol . 7:601-624
(1989)). Los macrófagos y las células dendriticas son capaces de tomar y procesar particulas virales exógenas (pero no sus componentes aislados, solubles) , y presentan el producto de degradación generado a las células T citotóxicas, conduciendo a su activación y proliferación
(Kovacsovics-Bankowski et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA
90:4992-4946 (1993); Bachmann et a l . , Eur. J. Immunol . 26:2595-2600 (1996) ) . Particulas virales como antigenos, presentan dos ventajas sobre sus componentes aislados: (1) Debido a su estructura de superficie altamente repetitiva, son capaces
de activar diree m(0Uctamente a las células B, conduciend tituladores de anticuerpos altos y a memoria de las células B de larga duración; y (2) Particulas virales pero no proteinas solubles, son capaces de inducir una respuesta a la célula T citotóxica, aún, si los virus no son infecciosos y adyuvantes, están ausentes. Varias nuevas estrategias de vacunas explotan la inmunogenicidad inherente de los virus. Algunos de estos procedimientos se enfocan en la naturaleza particulada de la partícula del virus; por ejemplo, véase Harding, C. V. y Song R., (J. Immunol ogy 153:4925 (1994)), la cual describe una vacuna que consiste de perlillas de látex y antigenos; Kovacsovics-Bankowski, M., et al . , (Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 90:4942-4946 (1993)), el cual describe una vacuna que consiste de perlillas de óxido de hierro y antigeno; Patente Estadounidense No .: 5, 334, 394 por Kossovsky, N. Et al . , el cual describe particulas centrales revestidas con antigeno; Patente Estadounidense No. 5,871,747, el cual describe particulas de polímeros sintéticas que llevan en la superficie una o más proteinas covalentemente enlazadas a estas; y una partícula central con un revestimiento covalentemente no enlazado, el cual al menos, parcialmente cubre la superficie de dicha
partícula central, y al menos, un agente biológicamente activo en contacto con dicha partícula central revestida { véase, por ejemplo , WO/94/15585) . Sin embargo, una desventaja de estos sistemas de mimetismo, es que no son capaces de recrear la presentación ordenada del antigeno encontrado en la superficie viral. Los antigenos acoplados a una superficie en una orientación aleatoria, se encuentran induciendo una respuesta CTL y no solamente respuestas de la célula B débiles. Para una vacuna eficiente, ambas armas del sistema inmune han sido fuertemente activadas, como se describe anteriormente y en Bachmann & Zinkernagel, Ann . Rev. Immunol . 15:235 (1997). En otro ejemplo, los virus recombinantes son utilizados para el suministro de antigeno. Los virus del fago filamentosos que contienen un antigeno fusionado a una proteina cápsida se ha encontrado son altamente inmunogénicos (véase, Perham R.N., et al . , FEMS Mi crobiol . Rev. 17:25-31 (1995); Willis et al . , Gene 128 : 85-88 (1993); Minenkova et al . , Gene 128 : 85-88 (1993)). Sin embargo, este sistema está limitado a muy pocos péptidos (5 o 6 residuos de aminoácidos), cuando la proteina de fusión se expresa a un nivel alto (Iannolo et al . , J. Mol .
Biol . . 248:835-844 (1995)) o se limita al nivel de expresión bajo de las proteinas más largas (de la Cruz et al . , J. Biol . Chem . 263 : 4318 -4322 (1988)). Para péptidos pequeños, todavía se observa solamente la respuesta CTL y no, o solamente una respuesta a las células B débil. En aún otro sistema, los alfavirus recombinantes son propuestos como un medio de suministro del antigeno (véase, Patentes Estadounidenses Nos. 5,766,602; 5,792,462; 5,739,026; 5,789,245 y 5,814,482). Los problemas con los sistemas de virus recombinantes descritos todavía incluyen una expresión de baja densidad de la proteina heteróloga en la superficie viral y/o la dificultad de exitosamente y repetidamente, crear un nuevo y diferente virus recombinante para diferentes aplicaciones. En un desarrollo adicional, las particulas como los virus (VLPs) están siendo explotadas en el área de la producción de la vacuna, debido tanto a sus propiedades estructurales como su naturaleza no infecciosa. Las VLPs son estructuras supermoleculares construidas de una manera simétrica a partir de muchas moléculas de proteinas de uno o más tipos. Carecen del genoma viral y, por lo tanto, no son infecciosos. Los VLPs pueden a menudo, ser producidos
en grandes cantidades por la expresión heteróloga y pueden ser fácilmente purificados. Los ejemplos de VLPs incluyen, las proteinas capsidas del virus de la Hepatitis B (Ulrich, et al . , Virus Res . 50:141-182 (1998)), virus del sarampión (Warnes, et al . , Gene 1 60 : 113-118 (1995)), virus Sibdis, rotavirus (Patentes Estadounidenses Nos. 5,071,651 y 5,374,426), virus de padecimientos de boca y pie (Twomey, et al . , Vaccine 13: 1603-1610, (1995)), virus Norwalk (Jiang, X., et al . , Science 250:1580-1583 (1990); Matsui, S. M., et al . , J. Clin . Invest . 87:1456-1461 (1991)), la proteina GAG retroviral (Solicitud de Patente PCT No. WO 96/30523), la proteina Ty retrotransposon pl, la proteina de la superficie del virus de la Hepatitis B (WO 92/11291) y el virus del papiloma humano (WO 98/15631) . En algunos ejemplos, se puede utilizar la tecnología de ADN recombinante para fusionar una proteina heteróloga a una proteina VLP (Kratz, P.A., et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 96 : 19151920 (1990)) . Asi, existe una necesidad en la técnica para el desarrollo de vacunas nuevas y mejoradas que promuevan una respuesta inmune a las células B y CTL fuerte, tan eficientemente como los patógenos naturales.
Breve Descripción de la Invención La invención proporciona una nueva tecnología versátil que permite la producción de particulas revestidas con cualquier antigeno deseado. La tecnología permite la creación de vacunas eficientemente altas contra padecimientos infecciosos y para la creación de vacunas para el tratamiento de alergias y cánceres. En una primera modalidad, la invención proporciona una nueva composición que comprende (A) un andamio molecular no natural y (B) un determinante antigénico o antigeno. El andamio molecular no natural comprende (i) una - partícula central seleccionada del grupo que consiste de (1) una partícula central de origen no natural y (2) una partícula central de origen natural; y (ii) un organizador que comprende al menos, un primer sitio de unión, en donde dicho organizador está conectado a dicha partícula central por al menos, un enlace covalente. El determinante antigénico o antigeno tiene al menos un segundo sitio de unión, el cual se selecciona del grupo que consiste de (i) un sitio de unión que no se origina naturalmente, con dicho determinante antigénico o antigeno; y (ii) un sitio de unión que se origina
naturalmente con dicho determinante antigénico o antigeno. La invención se proporciona para un arreglo de antigeno repetitivo y ordenado a través de una asociación del segundo sitio de unión al primer sitio de unión por medio de al menos, un enlace peptidico. Asi, el determinante antigénico o antigeno y el andamio molecular no natural, son llevados juntos a través de esta asociación del primer y segundo sitio de unión para formar un arreglo de antigeno repetitivo y ordenado. En otra modalidad, la partícula central de la composición mencionada anteriormente comprende un virus, una partícula parecida al virus, un bacteriófago, una partícula capsida viral o una forma recombinante de la misma. Alternativamente, la partícula central puede ser un polímero sintético o un metal. En una modalidad particular, el organizador puede comprender al menos, un primer sitio de unión. El primer y segundo sitio de unión son particularmente elementos importantes de la composición de la invención. En varias modalidades de la invención, el primer y/o segundo sitio de unión, puede ser un antigeno y un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de este; biotina y avidina; estrepavidina y biotina; un receptor y su ligando; una
proteina de enlace al ligando y su ligando; interacción de polipéptidos de cierre de leucina; un grupo amino y un grupo químico reactivo de este; un grupo carboxilo y un grupo químico reactivo de este; un grupo sulfihidrilo y un grupo químico reactivo a este; o una combinación del mismo . En una modalidad preferida, la invención proporciona el acoplamiento de casi cualquier antigeno de selección a la superficie de un virus, bacteriófago, partícula parecida al virus, o partícula capsida viral. Mediante la introducción de un antigeno en una estructura "similar al virus" casi cristalina, la invención explica la reacción inmune antiviral fuerte de un hospedero para la producción de una respuesta inmune altamente eficiente, es decir, una vacunación contra el antigeno mostrado. En una modalidad preferida, la partícula central puede seleccionarse del grupo que consiste de: proteinas recombinantes de Rotavirus, proteinas recombinantes de virus Norwalk, proteinas recombinantes de Alfavirus, proteinas recombinantes de virus de Padecimientos de la Boca y Pie, proteinas recombinantes de Retrovirus, proteínas recombinantes del virus de la Hepatitis B, proteinas recombinantes del virus del mosaico del Tabaco,
proteínas recombinantes del virus Flock House, y proteinas recombinantes de Papilomavirus humano. En otra modalidad preferida, el antigeno puede seleccionarse del grupo que consiste de: (1) una proteina situada para inducir una respuesta inmune contra las células cancerígenas; (2) una proteina situada para inducir una respuesta inmune contra padecimientos infecciosos; (3) una proteina situada para inducir una respuesta inmune contra los alérgenos; y (4) una proteina adecuada para inducir una respuesta inmune en animales de granja . En una modalidad particularmente preferida de la invención, el primer sitio de unión y/o el segundo sitio de unión, comprenden un polipéptido de cierre de leucina de interacción. En más modalidades preferidas, el primer sitio de unión y/o el segundo sitio de unión, se seleccionan del grupo que comprende: (1) el dominio de la proteina de cierre leucina JUN; y (2) el dominio de la proteina de cierre leucina FOS . En otra modalidad preferida, el primer sitio de unión y/o el segundo sitio de unión, se seleccionan del grupo que comprende: (1) un residuo de lisina diseñado genéticamente y (2) un residuo de cisteina diseñado
genéticamente, dos residuos que pueden ser químicamente ligados juntos. Otras modalidades de la invención incluyen procesos para la producción de las composiciones de la invención y métodos de tratamiento médico usando dichas composiciones . Se entenderá que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada, son ejemplares y solamente explicatorias y están propuestas para proporcionar explicación adicional de la invención como se reivindica.
Breve Descripción de los Dibujos Figura 1. Manchado Western que demuestra la producción de particulas virales que contienen la proteina de fusión E2-JUN, usando el vector de expresión pCYTts: :E2 JUN. Figura 2. Manchado Western que demuestra la producción de particulas virales que contienen la proteina de fusión E2-JUN, usando el vector de expresión pTE5'2J: : E2 JUN. Figura 3. Manchado de punto Western que demuestra la expresión bacteriana y eucariótica del antigeno FOS-
hgh. Figura 4. Expresión de HBcAg-JUN en células de E. coli . Figura 5. Manchado Western que demuestra que el HBcAg-JUN es soluble en Usados de E. coli . Figura 6. Análisis SDS-PAGE del enriquecimiento de las particulas capsidas HBc-Ag-JUN en un gradiente de densidad de sucrosa. Figura 7. Análisis SDS-PAGE sin reducción del acoplamiento de particulas hGH-FOS y HBcAg-JUN.
Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas
1. Definiciones Se proporcionan las siguientes definiciones para clarificar el tema sujeto el cual los inventores consideran como la presente invención. Alfavirus: Como se usa aqui, el término "alfavirus" se refiere a cualquiera de los virus de ARN incluidos dentro del género Alfavirus . Las descripciones de los elementos de este género están contenidas en Strauss y Strauss, Microbiol . Rev. , 58:491-562 (1994). Los ejemplos de los alfavirus incluyen virus Aura, virus
Bebaru, virus Cabassou, virus Chikungunya, virus de encefalomielitis equina Easte, virus Fort morgan, virus Getah, virus Kyzylagach, virus Mayoaro, virus Middleburg, virus Mucambo, virus Ndumi, virus Pixuna, virus Tonate, virus Triniti, virus Una, virus de encefalomielitis equina Western, virus Whataroa, virus Sindbis (SIN), virus Semliki forest (SFV) , virus de encefalomielitis equina Venezolana (VEE) , y virus Ross River. Antigeno: Como se usa aqui, el término "antigeno" es una molécula capaz de ser enlazada por un anticuerpo.
Un antigeno es adicionalmente capaz de inducir una respuesta inmune humoral y/o respuestas inmune celulares
• que conducen a la producción de linfocitos T y/o B. Un antigeno puede tener uno o más epitopes (epitopes B y T) . La reacción especifica referida anteriormente, se sugiere para indicar que el antigeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos los cuales pueden evocarse por otros antigenos. Determinante antigénica: Como se usa aqui, el término "determinante antigénica" se sugiere para referirse a tal porción de un antigeno que está específicamente reconocida por ya sea los linfocitos B o
T. Los linfocitos B responden a las "determinantes antigénicas ajenas o extrañas via la producción de anticuerpos, mientras los linfocitos T son el mediador de la inmunidad celular. Asi, las determinantes antigénicas o epitopes, son aquellas partes de un antigeno que son reconocidas por los anticuerpos, o en el contexto de un MHC, por los receptores de las células T. Asociación: Como se usa aqui, el término "asociación" como se aplica al primero y segundo sitios de unión, se usa para referirse al menos a un enlace no peptidico. La naturaleza de la asociación puede ser covalente, iónica, hidrofóbica, polar o cualquier combinación de la misma. Primer sitio de unión: Como se usa aqui, la frase "primer sitio de unión" se refiere a un elemento del "organizador", mismo enlace a la partícula central en una forma no aleatoria, en la cual el segundo sitio de unión localizado en el antigeno o determinante, puede asociarse. El primer sitio de unión puede ser una proteina, un polipéptido, un péptido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un compuesto o metabolito secundario (biotina, fluoresceina, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo) , o una
combinación del mismo, o un grupo del mismo químicamente reactivo. El primer sitio de unión múltiple, está presente en la superficie del andamio molecular no natural en una configuración repetitiva. Segundo sitio de unión: Como se usa aqui, la frase "segundo sitio de unión" se refiere a un elemento asociado con el determinante antigénico o antigeno al cual el primer sitio de unión del "organizador" localizado en la superficie de andamio molecular no natural, puede asociarse. El segundo sitio de unión del determinante antigénico o antigeno puede ser una proteina, un polipéptido, un péptido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero sintético o natural, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceina, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo) , o una combinación de los mismos, o un grupo químicamente reactivo del mismo. Al menos un segundo sitio de unión está presente en el determinante antigénico o antigeno. Particula central: Como se usa aqui, el término "particula central" se refiere a una estructura rigida con una organización repetitiva inherente que proporciona una fundación para la unión de un "organizador". Una particula central como se usa aqui, puede ser el producto de un
proceso sintético o el producto de un proceso biológico. Cis-actuante: Como se usa aqui, la frase secuencia "cis-actuante" se refiere a las secuencias de ácido nucleico a la cual una replicasa se enlaza para catalizar la replicación dependiente del ARN de las moléculas de ARN. Este evento de replicación resulta en la replicación de las moléculas de ARN parcial y de longitud completa, y asi, el promotor subgenómico alfavirus es también una secuencia "cis-actuante". Las secuencias "cis-actuantes" pueden localizarse a o cerca del extremo 5' y 3' , o en ambos extremos de una molécula de ácido nucleico asi como también internamente. Fusión: Como se usa aqui, el término "fusión" se refiere a la combinación de secuencias de aminoácidos de orígenes diferentes en una cadena de polipéptido por una combinación en estructura de sus secuencias de nucleótidos codificantes. El término "fusión", explícitamente abarca fusiones internas, es decir, inserción de las secuencias de diferente origen dentro de una cadena de polipéptido, además de la fusión a uno de sus términos. Secuencia heteróloga: Como se usa aqui, el término "secuencia heteróloga" se refiere a una segunda secuencia de nucleótido presente en un vector de la
invención. El término "secuencia heteróloga" también se refiere a cualquier aminoácido o secuencia de ARN codificada por una secuencia de ADN heteróloga contenida en un vector de la invención. Las secuencias de nucleótidos heterólogas pueden codificar proteinas o moléculas de ARN, normalmente expresadas en el tipo celular en el cual están presentes o las moléculas no se - expresan normalmente ahi (por ejemplo, proteinas estructurales Sinbdis) . Aislado: Como se usa aqui, el término "aislado" se usa en referencia a una molécula, el término significa que las moléculas se han removido de su ambiente nativo. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido naturalmente presente en* un animal viviente, no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural es "aislado". Además, las moléculas de ADN recombinantes contenidas en un vector, son consideradas aisladas para los propósitos de la presente invención. Las moléculas de ARN aisladas incluyen productos de replicación de ARN in vivo o in vi tro, de las moléculas de ADN y ARN. Las moléculas de ácido nucleico aislado, además incluyen moléculas sintéticamente producidas.
Adicionalmente, las moléculas de vectores contenidos en las células hospederas recombinantes también son aisladas. Asi, no todas las moléculas "aisladas" necesitan ser "purificadas". Inmunoterapéutico : Como se usa aqui, el término
"inmunoterapéutico" es una composición para el tratamiento de padecimientos o desórdenes. Más específicamente, el término es usado para referirse a un método de tratamiento para alergias o un método de tratamiento para el cáncer. Individuo: Como se usa aqui, el término
"individuo" se refiere a organismos multicelulares e incluye tanto plantas como animales. Los organismos multicelulares preferidos son animales, más preferidos son vertebrados, aún más preferidos son mamíferos, y más preferidos son humanos. Inferior o no detectable: Como se usa aqui, la frase "inferior o no detectable", cuando se usa en referencia al nivel de expresión del gen, se refiere a un nivel de expresión el cual es ya sea, significantemente inferior que aquel observado cuando el gen está máximamente inducido (por ejemplo, al menos cinco partes inferiores) , o no es fácilmente detectable por los métodos usados en la siguiente sección de ejemplos.
Lectina: Como se usa aqui, las proteinas se obtienen particularmente a partir de las semillas de plantas de leguminosas, pero también de muchas otras fuentes de plantas y animales, que tienen sitios de enlaces para mono y oligosacáridos específicos. Los ejemplos incluyen concanavalina A y aglutinina de germen de trigo, los cuales son ampliamente usados como agentes analíticos y preparativos en el estudio de las glicoproteinas . Origen natural: Como se usa aqui, el término
"origen natural" significa que el total o las partes del mismo no son sintéticas y existen o se producen en la naturaleza. No natural: Como se usa aqui, el término significa de manera general, no natural, más específicamente, el término significa de la mano del hombre . Origen no natural: Como se usa aqui, el término "origen no natural", significa de manera general, sintético o no natural; más específicamente, el término significa de la mano del hombre. Andamio molecular no natural: Como se usa aqui, la frase "andamio molecular no natural" se refiere a
cualquier producto elaborado por la mano del hombre que puede servir para proporcionar un arreglo rigido y repetitivo del primer sitio de unión. Idealmente, pero no necesariamente, estos primeros sitios de unión están en un orden geométrico. El andamio molecular no natural puede ser orgánico o no orgánico y pueden ser sintetizados químicamente o a través de un proceso biológico, en parte o en un todo. El andamio molecular no natural está comprendido de: (a) una particula central, ya sea de origen natural o no natural; y (b) un organizador, el cual el mismo comprende la menos, un primer sitio de unión y está conectado a una particula central por al menos, un enlace covalente. En una modalidad particular, el andamio molecular natural puede ser un virus, una particula parecida al virus, una particula capsida de virus, un fago, una forma recombinante de la misma, o una particula sintética . Arreglo de determinante antigénico o antigeno repetitivo y ordenado: Como se usa aqui, el término "arreglo de determinante antigénico o antigeno repetitivo y ordenado", se refiere de manera general a un patrón de repetición de un determinante antigénico o antigeno, caracterizado por un arreglo espacial uniforme de los
determinantes antigénicos o antigenos con respecto al andamio. En una modalidad de la invención, el patrón de repetición, puede ser un patrón geométrico. Un arreglo determinante antigénico o antigeno repetitivo y ordenado poseerá un orden paracristalino estrictamente repetitivo del determinante antigénico o antigeno con una separación de 5 a 15 nanómetros. Organizador: Como se usa aqui, el término "organizador" se usa para referirse a un elemento enlazado a una particula central en una forma no aleatoria que proporciona un sitio de nucleación para crear un arreglo antigeno repetitivo y ordenado. Un organizador es cualquier elemento que comprende al menos un primer sitio de unión que está enlazado a una particula central por al menos, un enlace covalente. Un organizador puede ser una proteina, un polipéptido, un péptido, un aminoácido (es decir, un residuo de una proteina un polipéptido o un péptido) , un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un compuesto o metabolito secundario (biotina, fluoresceina, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo) , o una combinación del mismo, o un grupo del mismo químicamente reactivo.
Temperatura permisiva: Como se usa aqui, la frase "temperatura permisiva" s~e refiere a temperaturas a las cuales una enzima tiene niveles relativamente altos de actividad catalítica. Purificada: Como se usa aqui, cuando el término
"purificada" se usa con referencia a una molécula, significa que la concentración de la molécula a ser purificada, se ha incrementado con relación a las moléculas asociadas dentro de su ambiente natural. Las moléculas naturalmente asociadas incluyen proteinas, ácidos nucleicos, lipidos y azúcares, pero de manera general no incluyen agua, amortiguadores y reactivos agregados para mantener la integridad o facilitar la purificación de la molécula a ser purificada. Por ejemplo, aún si el ARNm es m(.3Udiluido con un solvente acuoso dur la cromatografía en columna de dT oligo, las moléculas de ARN son purificadas por esta cromatografía si los ácidos nucleicos naturalmente asociados y otras moléculas biológicas no se enlazan a la columna y se separan de las moléculas de ARNm sujeto. Receptor: Como se usa aqui, el término "receptor" se refiere a proteinas o glicoproteinas o fragmentos del mismo capaces de interactuar con otra molécula, llamada el
ligando. El ligando puede portar cualquier clase de compuestos químicos o bioquímicos. El receptor no necesariamente necesita ser una proteina ligada a la membrana. La proteina soluble, como por ejemplo la proteina de enlace a la maltosa o proteina de enlace al retinol, son asi también receptores. Residuo: Como se usa aqui, el término "residuo" se sugiere para significar un aminoácido especifico en una estructura de polipéptido o de cadena lateral. Sensitiva a la temperatura: Como se usa aqui, la frase "sensitiva a la temperatura" se refiere a cualquier enzima la cual fácilmente cataliza una reacción a una temperatura pero cataliza la misma reacción lentamente o no a todas las otras temperaturas. Un ejemplo de una enzima sensitiva a la temperatura es la proteina replicasa codificada por el vector pCYTts, la cual tiene actividad de replicasa fácilmente detectable a temperaturas por debajo de 34 °C y tienen actividad baja o indetectable a 37°C. Transcripción: Como se usa aqui, el término "transcripción" se refiere a la producción de moléculas de ARN a partir de los modelos de ADN catalizados por las
polimerasas de ARN. Célula hospedera recombinante: Como se usa aqui, el término "célula hospedera recombinante" se refiere a una célula hospedera en la cual se han introducido una o más moléculas de ácido nucleico de la invención. Virus recombinante: Como se usa aqui, la frase "virus recombinante" se refiere a un virus que es genéticamente modificado por la mano del hombre. La frase cubre cualquier virus conocido en la técnica. Más específicamente, la frase se refiere a un alfavirus genéticamente modificado por la mano del hombre, y más específicamente, la frase se refiere a un virus Sinbis genéticamente modificado por la mano del hombre. Temperatura restrictiva: Como se usa aqui, la frase "temperatura restrictiva" se refiere a temperaturas a las cuales una enzima tiene niveles bajo o indetectables de actividad catalítica. Tanto los mutantes sensitivos al "frió" o "calor", se conocen y asi, una temperatura restrictiva puede ser superior o inferior que una temperatura permisiva. Evento de replicación de ARN dependiente del ARN: Como se usa aqui la frase "evento de replicación del ARN dependiente del ARN", se refiere a procesos los cuales
resultan en la formación de una molécula de ARN usando una molécula de ARN como un modelo. Polimerasa de ARN dependiente del ARN: Como se usa aqui, la frase "polimerasa de ARN dependiente del ARN", se refiere a una polimerasa, la cual cataliza la producción de una molécula de ARN a partir de otra molécula de ARN. Este término es usado aqui sinónimamente con el término "replicasa". ARN no traducido: Como se usa aqui, la frase "ARN no traducido" se refiere a una secuencia o molécula de ARN la cual no codifica a una estructura lectora abierta o codifica a una estructura lectora abierta, o porción de la
" misma, pero en un formato en el cual una secuencia de aminoácido no se producirá (por ejemplo, no está presente el codon de iniciación) . Los ejemplos de tales moléculas son las moléculas de ARNt, moléculas de ARNr, y ribozimas. Vector: Como se usa aqui, el término "vector" se refiere a un agente (por ejemplo, un plasmido o virus) , usado para transmitir el material genético a una célula hospedera. Un vector puede estar compuesto de ya sea ADN o
ARN. Uno, una o un: Cuando los término "uno", "un" o "una" se usan en esta descripción, significan "al menos
uno" o "uno o más" a menos que se indique de "otro modo.
2. Composiciones de Arreglos de Determinantes
Antigénicos o Antígenos Repetitivos y Ordenados y Métodos para Hacer los mismos .
La invención descrita proporciona composiciones que comprenden un determinante antigénico o antigeno repetitivo y ordenado. Además, la invención convenientemente permite al practicante construir arreglos de determinantes antigénicos o antigenos repetitivos y ordenados para varios propósitos de tratamiento, los cuales incluyen la prevención de padecimientos infecciosos, el tratamiento de alergias y el tratamiento de cánceres. Las composiciones de la invención esencialmente comprenden dos elementos: (1) un andamio molecular no natural; y (2) un determinante antigénico o antigeno con al menos, un segundo sitio de unión capaz de asociación a través de al menos, un enlace no peptidico a dicho primer sitio de unión. El andamio molecular no natural que comprende (a) una particula central seleccionada del grupo que consiste
de (1) una particula central de un origen no natural y (2) una particula central de origen natural; y (b) un organizador que comprende al menos, un primer sitio de unión, en donde dicho organizador está conectado a dicha particula central por al menos, un enlace covalente. El determinante antigénico o antigeno tiene al menos, un segundo sitio de unión, el cual se selecciona del grupo que consiste de (a) un sitio de unión que no se origina naturalmente con dicho determinante antigénico o antigeno; y (b) un sitio de unión el cual se origina naturalmente con dicho determinante antigénico o antigeno. La invención se proporciona para un arreglo antigeno repetitivo y ordenado a través de una asociación del segundo sitio de unión al primer sitio de unión por medio de al menos, un enlace peptidico. Asi, el antigeno o determinante antigénico y el andamio molecular no natural, son introducidos juntos a través de esta asociación del primer y segundo sitio de unión para formar un arreglo de antigeno repetitivo y ordenado. El practicante puede diseñar específicamente el determinante antigénico o antigeno y el segundo sitio de unión, de manera que el arreglo de todos los determinantes antigénicos o antigenos enlazados al andamio molecular no
natural serán uniformes^ Por ejemplo, uno puede colocar un segundo sitio de unión único en el determinante antigénico o antigeno al término carboxilo o amino, con ello, se asegura a través del diseño, que todas las moléculas determinantes antigénicas o antigeno que están unidas al andamio molecular no natural, están colocadas de una manera uniforme. Asi, la invención proporciona un medio conveniente de colocación de cualquier determinante antigénica o antigeno en un andamio molecular no natural en una repetición y orden definidos. Como será claro para un experto en la técnica, ciertas modalidades de la invención, involucran el uso de tecnologías de ácido nucleico recombinantes tales como clonación, reacción en cadena de la polimerasa, la purificación de ADN y ARN, la expresión de las proteinas recombinantes en las células procarióticas y eucarióticas, etc. Tales metodologías son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y pueden convenientemente, encontrarse en manuales de métodos • de laboratorio publicados (por ejemplo, Sambrook., J. Et al . , eds . ,
MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd. Edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
(1989); Ausubel, F. et al . , eds . , CURRENT PROTOCOLS IN
MOLECULAR BIOLOGY, John H, Wiley & Sons, Inc. (1997)). Fundamental laboratory techniques for working with tissue culture cell lines (Celis, J. , ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2da. Edición, (1998)) and antibody-based techonologies (Hatlow, E. and Lañe, D.,", Antibodies: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988); Deutscher, M.P., "Guide to Protein Purification", "Meth. Enzymol . 128, Academic Press San Diego (1990); Scopes, R. K. , "Protein Purification Principies and Practice", 3ra. Ed., Springer-Verlag, New York (1994) ) están también adecuadamente descritos en la literatura, de los cuales todos están incorporados aqui por referencia.
A. Construcción de un Andamio Molecular No Natural
Un elemento en la composición de la invención es un andamio molecular no natural, que comprende una particula central y un organizador. Como se usa aqui, la frase "andamio molecular no natural", se refiere a cualquier producto hecho por la mano del hombre, que puede servir para proporcionar un arreglo repetitivo y rigido de
los primeros sitios de unión. Más específicamente, el andamio molecular no natural comprende (a) una particula central seleccionada del grupo que consiste de (1) una particula central de origen no natural y (2) una particula central de origen natural; y (b) un organizador que comprende al menos, un sitio de unión, en donde dicho organizador está conectado a dicha particula central por al menos, dos enlaces covalentes. Como será fácilmente aparente para aquellos expertos en la técnica, la particula central del andamio molecular no natural de la invención, no está limitada a cualquier forma especifica. La particula central puede ser orgánica o no orgánica y puede ser sintetizada químicamente o a través de un proceso biológico. En una modalidad, la particula central no natural puede ser un polímero sintético, un micelio lipido o un metal. Tales particulas centrales se conocen en la técnica, proporcionando una base a partir de la cual se construye el nuevo andamio molecular no natural de la invención. Por medio del ejemplo, el polímero sintético o las particulas centrales de metal, se describen en la Solicitud de Patente Estadounidense No. 5,770,380, la cual describe el uso de un andamio orgánico calixareno al cual
está unido una pluralidad de lazos peptidicos en la creación de un "anticuerpo mimico", y la Patente Estadounidense No. 5,334,394 describe particulas no cristalinas usadas como un señuelo viral que está compuesto de una variedad amplia de materiales inorgánicos, incluyendo metales o cerámicas. Los metales preferidos en esta modalidad, incluyen cromio, rubidio, hierro, zinc, selenio, niquel, oro, plata, platino. Los materiales de cerámica preferidos en esta modalidad, incluyen dióxido de silicio, dióxido de titanio, óxido de aluminio, óxido de rutenio y óxido de estaño. Las particulas centrales de esta modalidad se pueden hacer de materiales inorgánicos, incluyendo carbono (diamante) . Los polímeros preferidos incluyen poliestireno, nylon y nitrocelulosa. Para este tipo de particula nanocristalina, las particulas hechas de óxido de estaño, dióxido de titanio o carbono (diamante) , son particularmente preferidas. Un micelio lipido puede prepararse por medios conocidos en la técnica. Por ejemplo, los micelios pueden prepararse de conformidad con el procedimiento de Baiselle y Millar (Baiselle, C.J. y Millar, D, B., Biophys, Chem. 4:355-361 81975)) o Corti et al . , (Corti, M., Degriorgio, V., Sonnino S . , Ghidoni R. , Masserini, M. Y Tettamanti,
G., Chem. Phys. Lipids 38:197-214 (1981)) o López et al . , (López, 0. de la Maza, A., Coderch., L., Lopez-Iglesias, C, Wehrli, E. y Parra, J. L., FEBS Lett. 426: 314-318 (1998)) o Topcieva y Karaezin (Topchieva, I. y Karaezin, K., J. Colloid Interface Sci. 213: 29-35 (1999)) o Morein et al . , (Morein, B., Sundquist, B., Hoglund, S., Dalsgaard K. y Osterhaus, A., Nature 308:457-60 (1984)), las cuales están todas incorporadas aqui por referencia. Las particulas centrales pueden también producirse a través de un proceso biológico, el cual puede ser natural o no natural. Por medio del ejemplo, este tipo de modalidad puede incluir una particula central que comprende un virus, una particula similar al virus, un fago, una particula de cápsido viral o una forma recombinante del mismo. En una modalidad más especifica, la particula central puede comprender proteínas recombinantes de Rotavirus, proteinas recombinantes de Norwalkvirus, proteinas recombinantes de Alfavirus, proteinas recombinantes del virus de Padecimientos de la Boca y el Pie, proteinas recombinantes de Retrovirus, proteinas recombinantes del virus de la Hepatitis B, proteinas recombinantes del virus del mosaico del tabaco, proteínas recombinantes del virus Flock House, y proteinas
recombinantes del Papilomavirus humano. Sean naturales o no naturales, las particulas centrales de la invención se caracterizan por comprender un organizador que está unido a la particula central natural por al menos, un enlace covalente. El organizador es un elemento enlazado a una particula central en un modo no aleatorio que proporciona un sitio de nucleación para crear un arreglo de antigeno repetitivo y ordenado. Idealmente, pero no necesariamente, el organizador está asociado con la particula central en un orden geométrico. Mínimamente, el organizador comprende un primer sitio de unión. Como se declaró previamente, el organizador puede ser cualquier elemento que comprende al menos, un primer sitio de unión que está enlazado a una particula central por al menos, un enlace covalente. Un organizador puede ser una proteina, un polipéptido, un péptido, un aminoácido (es decir, un residuo de una proteina, un polipéptido o péptido) , un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito secundario o compuesto (biotina, fluoresceina, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo) , o una combinación del mismo, o un grupo del mismo químicamente
reactivo. En una modalidad más especifica, el organizador puede comprender un primer sitio de unión que comprende un antigeno, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, biotina, avidina, estreptavidina, un receptor, un ligando receptor, un ligando, una proteina enlazante al ligando, un polipéptido de cierre leucina interactuante, un grupo amino, un grupo químico reactivo a un grupo amino; un grupo carboxilo, un grupo químico reactivo al grupo carboxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo químico reactivo a un grupo sulfhidrilo, o una combinación de los mismos. En una modalidad preferida, la particula central del andamio molecular no natural, comprende un virus, un bacteriófago, una particula similar al virus, una partícula cápsida viral o una forma recombinante de la misma. Cualquier virus conocido en la técnica que tiene una estructura de proteina central y/o revestida repetitiva y ordenada, puede seleccionarse como un andamio molecular no natural de la invención; ejemplos de virus adecuados incluyen: sibdis y otros alfavirus; virus somatitis vesicular; rabdo, (por ejemplo, virus de somatitis vesicular) , picorna, toga, ortomixo, polioma, parvovirus, rotavirus, norwalkvirus, virus de padecimiento de la boca y pie, un retrovirus, virus de la hepatitis B,
virus del mosaico del tabaco, virus flock house, papilomavirus humano (por ejemplo, véase Tabla 1 en Bachman, M.F y Zinkernagel, R.M., Immunol . Today 17:553-558 (1996) . En una modalidad, la invención utiliza ingeniería genética de un virus, para crear una fusión entre una proteina de cubierta viral repetitiva y ordenada, y un organizador, que comprende una proteina heteróloga, péptido, determinante antigénico o un residuo de aminoácido reactivo de selección. Otras manipulaciones genéticas conocidas por aquellos en la técnica, pueden incluirse en la construcción del andamio molecular no natural; por ejemplo, puede ser deseable restringir la capacidad de replicación del virus recombinante a través de la mutación genética. La proteina viral seleccionada por fusión a la proteina organizadora (es decir, el primer sitio de unión) , deberá tener una estructura repetitiva y organizada, más preferiblemente una organización paracristalina óptimamente con una separación de 5-15 nm en la superficie del virus. La creación de este tipo de proteina de fusión resultará en organizadores repetitivos y ordenados, múltiples en la superficie del virus. Asi, la organización repetitiva y ordenada del primer sitio de
unión, resultante de este, reflejará la organización normal de la proteina viral nativa. Como se discutirá en más detalle aqui, en una modalidad preferida de la invención, el andamio es un alfavirus recombinante, y más específicamente, un virus Sinbis recombinante. Los alfavirus son virus de ARN de hebras positivas que replican su ARN genómico completamente en el citoplasma de la célula infectada y sin un intermediario de ADN (Strauss, J. , y Strauss, E., Microbiol . Rev. 58:491-562 (1994)). Varios miembros de la familia del alfavirus, Sinbdis (Xiolng, C. et. al., Science 243:1188-1191 (1989); Schlesinger, S., Trends Biotechnol . 11 : 18 -22 (1993)), Semliki Forest Virus (SFV) (Liljestróm, P. & Garoff. H., Bio/Technology 9:1356-1361 (1991)) y otros (Davis, N. L. et al . , Virology 171:189-204 (1989)), han recibido atención considerable para usarse como vectores de expresión a base de virus, para una variedad de proteinas diferentes (Lundstrom, K. , Curr. Opin . Biotechnol . 8:578-582 (1997); Liljestróm, P., Curr. Opin . Biotechnol . 5:495-500 (1994) y como candidatos para el desarrollo de vacunas. Recientemente, un número de patentes se han publicado dirigidas al uso de alfavirus para la expresión de proteinas heterólogas y el desarrollo
de vacunas (véase Patentes Estadounidenses nos. 5,766,602; 5,792,462; 5,739,026; 5,789,245 y 5,814,482). La construcción del andamio alfaviral de la invención puede hacerse por medio conocidos de manera general en la técnica de la tecnología de ADN recombinante, como se describe por los arti culos (OU mencionados anteriormente, los cuales están incorporados aqui por referencia. Pueden ser utilizadas una variedad de células hospederas recombinantes diferentes, para producir una particula central a base de virales para la unión determinante antigénica o antigeno. Por ejemplo, los alfavirus se conocen por tener un amplio rango de hospedero; el virus Sibdis infecta las células de mamífero, reptil, y anfibio cultivadas, asi como también algunas células de insecto (Clark, H., J. Na ti . Cáncer Ine t . 51:645 (1973); Leake, C, J. Gen . Virol . 33:335 (1997); Stollar, V. en THE TOGAVIRUSES, R. W. Schlesinger, Ed., Academic Press, (1980), pp. 583-621). Asi, en la práctica de la invención, se pueden usar numerosas células hospederas recombinantes. Las células BHK, COS, Vero, HeLa y CHO, son particularmente adecuadas para la producción de las proteinas heterólogas debido a que tienen el potencial a las proteinas heterólogas glicosiladas de una manera
similar a las células humanas (Watson "E. et al . , Glycobiology 4:227 (1994)) y pueden seleccionarse (Zang, M. Et al . , Bio/Technology 13 : 89 (1995)) o diseñarse genéticamente (Renner W. et al . , Biotech . Bioeng. 4:476 (1995); Lee K. et al . Biotech . Bioeng 50:336 (1996)) para crecer en un medio libre de suero, asi como también en suspensión . La introducción de los vectores polinucleótidos en las élulas hospederas, puede ser realizada por métodos descritos en los manuales de laboratorio estándares (véase, por ejemplo, Sambrook, J. et al . , eds . , MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL. 2da. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Col Spring Harbor, N.Y. (1989), Capitulo 9; Ausuble, F. et a., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997), Capitulo 16) , incluyendo métodos tales como electroporación, transfección mediada por dextrano-DEAE, transfección, microinyección, transfección mediada por lipidos catiónicos, transducción, carga de hebras, introducción balística, e infección. Los métodos para la introducción de secuencias de ADN exógenas en las células hospederas se discuten en Felgner, P. et. al . , Patente Estadounidense No. 5,580,859.
Las secuencias de ARN empaquetadas, pueden también ser usadas para infectar células hospederas. Estas secuencias de ARN empaquetadas se pueden introducir en las células hospederas por la adición de estas al medio de cultivo. Por ejemplo, la preparación de particulas alfavirales no infectivas, se describe en un número de fuentes, incluyendo "Sistema de Expresión de Sinbdis", Versión C, { Invi trogen Catálogo No. K750-1) . Cuando las células de mamífero se usan como células hospederas recombinantes para la producción de particulas centrales a base de virales, estas células de manera general, se hacen crecer en un cultivo de tejidos. Los métodos para el crecimiento de las células en cultivos, son bien conocidos en la técnica { véase , por ej emplo , Celis, J. , ed., CELL BIOLOGY, Academic press, 2da. Edición, (1998); Sambrook, J. et al., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2da. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989); Ausubel, F. et al., eds. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGI, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997); Freshney, R. , CULTURE OF ANIMAL CELLS, Alan R. Liss, Inc. (1983)). Como se entenderá por aquellos en la técnica, el primer sitio de unión puede estar o ser una parte de
cualquier proteina, polipéptido, azúcar, polinucleótido, peptido (aminoácido) , polímero natural o sintético, un metabolito secundario o combinación de los mismos adecuados, que puede servir para unir específicamente el determinante antigénico o antigeno de selección al andamio. En una modalidad, el sitio de unión es una proteina o péptido que puede seleccionarse de aquellos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el primer sitio de unión puede seleccionarse del siguiente grupo: un ligando, un receptor, una lectina, avidina, estreptavidina, biotina, un epitope tal como extremo, HA o T7, Myc, Max, dominios de inmunoglobulina y cualquier otra secuencia de aminoácido conocida en la técnica que podria ser usada como un primer sitio de unión. Deberá además, entenderse por aquellos en la técnica, que con otra modalidad de la invención, se puede crear el primer sitio de unión secundariamente al organizador (es decir, la proteina o polipéptido) , utilizado para construir la fusión en estructura a la proteina cápsida. Por ejemplo, puede utilizarse una proteina para la fusión a la proteina cubierta con una secuencia de aminoácido conocida por ser glicosilada en una forma especifica, y la porción azúcar agregada como un
resultado, puede entonces servir al primer sitio de unión del andamio viral por medio del enlace a la lectina, sirviendo como el sitio de unión secundario de un antigeno. Alternativamente, la secuencia organizadora puede ser biotinilada in vivo y la porción biotina puede servir como el primer sitio de unión de la invención, o la secuencia organizadora puede someterse a la modificación química de los residuos de aminoácidos distintos in vitro, la modificación sirve como el primer sitio de unión. Una modalidad especifica de la invención utiliza el virus Sinbis. El genoma del ARN del virus sinbis es empaquetado en una proteina capsida que está circundada por una bicapa lipida que contiene a las tres proteinas llamadas El, E2 y E3. Estas asi llamadas proteinas cubiertas son glicoproteinas, y las porciones glicosiladas se localizan en el exterior de la bicapa lipida, en donde los complejos de estas proteinas forman las "espigas" que pueden observarse en los micrógrafos de electrones para proyectarse hacia fuera de la superficie del virus. En una modalidad preferida de la invención, el primer sitio de unión se selecciona por ser el dominio de la proteina de cierre leucina JUN o FOS, que está fusionada en estructura a la proteina cubierta E2. Sin embargo, será claro para
todos los individuos en la técnica, que otras proteinas cubiertas pueden utilizarse en la construcción de la proteina de fusión para localizar el primer sitio de unión en el andamio de la invención. En una modalidad más preferida de la invención, el primer sitio de unión se selecciona por ser el dominio de la proteina de cierre de leuciná JUN-FOS , que está fusionado en la estructura a la proteina cápsida (central) de la Hepatitis B. Sin embargo, será claro para todos los individuos en la técnica, que otras proteinas capsidas virales pueden ser utilizadas en la construcción de la proteina de fusión para localizar el primer sitio de unión en el andamio de la invención. En otra modalidad preferida de la invención, el primer sitio de unión se selecciona por ser un residuo de lisina o cisteina que se fusiona en estructura a la proteina central (capsida) de la Hepatitis. Sin embargo, será claro para todos los individuos en la técnica, que pueden ser utilizadas otras particulas como las virales o cápsidas virales, en la construcción de la proteina de fusión para localizar el primer sitio en el andamio de la invención. Se proporciona el Ejemplo 1 para demostrar la
construcción de una proteina de fusión en estructura entre la proteina cubierta E2 del virus Sinbis y el dominio de la proteina de cierre de leucina JUN, usando el vector pTE5'2J de Hahn et al. (Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 89:2679-2683)). La secuencia de aminoácido JUN utilizada para el primer sitio de unión es la siguiente:
CGGRIARLEEKVKTLKAQ?SELASTA?MLREQVAQLKQKVM?HVGC (SEC ID ?O: 59) .
En este ejemplo, el segundo sitio de unión anticipado en el antigeno, podria ser el dominio de la proteina de cierre leucina FOS y la secuencia de aminoácido podria ser la siguiente:
CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIA?LLKEKEKLEFILAAHGGC (SEC ID ?O: 60) .
Estas secuencias se derivan de los factores de transcripción JI7N y FOS, cada uno flanqueado con una secuencia corta que contiene un residuo de cisteina en ambos lados. Estas secuencias se conocen por interactuar con cada una de las otras. La estructura hipotética
original propuesta para el dimero JUN-FOS, asume que las cadenas laterales hidrofóbicas de un monómero se entrelazan con las cadenas laterales respectivas del otro monómero de una manera similar al cierre (Landschulz et a . , Science 240 : 1159-1164 (1988). Sin embargo, esta hipótesis comprobada como impropia, y estas proteinas se conocen por formar un espiral enroscado a-helicoidal (O'Shea et al . , Science 243 : 538 -542 (1989); 0' Shea et al . Cell 68 : 699-108 (1992); Cohén & Parry, Trends Biochem . Sci . 11:245-248 (1986)). Asi, el término "cierre leucina" es usado frecuentemente para referirse a estos dominios de proteínas para más razones históricas que estructurales. En toda esta patente, el término "leucina de cierre" es usado para referirse a las secuencias demostradas anteriormente o secuencias esencialmente similares a una demostradas anteriormente. Los términos JUN y FOS son usados para los dominios de cierre de leucina respectivos, en lugar de las proteinas JUN y FOS completas. En una modalidad, la invención proporciona para la producción de un andamio E2-JUN del virus Sinbis, usando el sistema de expresión pCYTts (Solicitud de Patente Estadounidense Sol. No. 60/079,562; Presentada el 27 de Marzo de 1998). El sistema de expresión pCYTts
proporciona nuevos vectores de expresión los cuales permiten la estrecha regulación de la expresión del gen en células eucarióticas. Los vectores de ADN de este sistema se transcriben para formar moléculas de ARN las cuales entonces se replican por una replicasa sensitiva a la temperatura para formar moléculas de ARN adicionales. Las moléculas de ARN producidas por replicación contienen una secuencia de nucleótido la cual puede ser traducida para producir una proteina de interés o la cual codifica a una o más moléculas de ANR no traducidas. Asi, el sistema de expresión permite la producción de particulas del virus Sinbis recombinante. El Ejemplo 2 proporciona detalles en la producción del andamio molecular no natural de Sinbis E2-JUN, de la invención. Proporcionado de manera adicional en el Ejemplo 3, está otro método para la producción del andamio del virus Sinbis E2-JUN recombinante, usando el vector pTE5' 2JE2 : JUN producido en el Ejemplo 1. Asi, la invención proporciona dos medios, el sistema de expresión pCYTts (Ejemplo 2) y el sistema de vector pTE5'2J (Ejemplo 3) , por el cual se puede producir el andamio molecular, no natural E2-JUN del virus Sinbis recombinante. Un análisis de las particulas virales producidas en cada sistema está
proporcionada en la Figura 1 y Figura 2. Como se declaró previamente, la invención incluye partículas centrales a base de virales, los cuales comprenden un virus, una particula similar al virus, un fago, una particula cápsida viral o una forma recombinante de la misma. Los artesanos expertos, tienen el conocimiento para producir tales particulas centrales y organizadores unidos a estos. Por medio de proporcionar otros ejemplos, la invención se proporciona aqui para la producción de particulas similares al virus de la Hepatitis B y particulas cápsidas virales del sarampión (Ejemplos 17 a 22) . En tal modalidad, el dominio de la proteina de cierre de leucina JT7N, o el dominio de la proteina de cierre leucina FOS, pueden ser usados como un organizador, y por lo tanto, como un primer sitio de unión, para el andamio molecular no natural de la invención. Los Ejemplos 23-29 proporcionan detalles de la producción de las particulas centrales de la Hepatitis B que llevan un péptido fusionado en estructura con un residuo de lisina reactivo y antigeno que llevan un residuo de cisteina genéticamente fusionado, como un primer y segundo sitio de unión, respectivamente.
B. Construcción de un Determinante Antigénico o Antígeno con un Segundo Sitio de Unión
El segundo elemento en la composición de la invención es un determinante antigénico o antigeno que posee al menos, un segundo sitio de unión capaz de asociación a través de al menos, un enlace no peptidico al primer sitio de unión del andamio molecular no natural. La invención se proporciona para composiciones que varían de conformidad con el determinante antigénico o antigeno seleccionado en consideración del efecto terapéutico deseado. Otras composiciones se proporcionan mediante la variación de la molécula seleccionada para el segundo sitio de unión. Se pueden seleccionar los antigenos de la invención a partir del" grupo que consiste de los siguientes: (a) proteinas adecuadas para inducir una respuesta inmune contra las células cancerígenas; (b) proteínas adecuadas para inducir una respuesta inmune contra los padecimientos infecciosos; (c) proteinas adecuadas para inducir una respuesta inmune contra alérgenos, y (d) proteinas adecuadas para inducir una respuesta inmune en animales de granja.
En una modalidad especifica de la invención, la determinante antigénica o antigeno es una que es empleada para la prevención de padecimientos infecciosos. Tal tratamiento será usado para tratar una amplia variedad de padecimientos infecciosos que afectan un amplio rango de hospederos, por ejemplo, humanos, vacas, ovejas, cerdos, perros, gatos, otras especies de mamíferos y especies no mamiferas también. Los padecimientos infecciosos tratables son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, los ejemplos incluyen infecciones de etiología viral tal como VIH, influenza, Herpes , hepatitis viral, Epstein
Bar, polio, encefalitis viral, sarampión, varicela, etc; o infecciones o etiología bacteriana tal como neumonía, tuberculosis, sífilis, etc.; o infecciones de etiología parasítica tal como malaria, tripanosomiasis, leishmaniasis, tricomoniasis , amebiasis, etc. Asi, las determinantes antigénicas o antigenos seleccionados para las composiciones de la invención, serán bien conocidos por aquellos en la técnica médica; los ejemplos de determinantes antigénicas o antigeno incluyen la siguiente: antigenos VIH de gp 140 y gp 160; los antigenos de influenza hemaglutinina y neuramidinasa, antigeno la superficie de la hepatitis B, proteina circunsporozoita de
malaria. En otra modalidad especifica, las composiciones de la invención son inmunoterapéuticas que pueden ser usadas para el tratamiento de alergias o cánceres. La selección de determinantes antigénicos o antigenos para la composición y método de tratamiento para alergias, podrá conocerse por aquellos expertos en la técnica médica tratando tales alteraciones; los ejemplos representativos de este tipo de determinante antigénica o antigeno "incluyen los siguientes: fosfolipasa de veneno de abeja A2, Bet v I (alérgeno del polen de abedul) , 5 Dol m V (alérgeno de veneno de avispón de cara blanca) , Der pl (alérgeno de acaro del polvo de casa) . La selección de determinantes antigénicas o antigenos para la composición y método de tratamiento del cáncer, podrá conocerse por aquellos expertos en la técnica médica tratando tales padecimientos; los ejemplos representativos de este tipo de determinante antigénica o antigeno incluyen las siguientes: Her2 (cáncer de mama), GD2 (neuroblastoma) , EFG-R (glioblastoma maligno) , CEA (cáncer de la tiroides medilar) , DC52 (leucemia) . En una modalidad particular de la invención, el determinante antigénico o antigeno se selecciona del grupo
que consiste de: (a) una proteina recombinante de VIH, (b) una proteina recombinante del virus de la Influenza, (c) una proteina recombinante del virus de la Hepatitis C, (d) una proteina recombinante de Toxoplasma, (e) una proteina recombinante de falciparun Plasmodio, (f) una proteina recombinante de Plasmodio vivax, (g) una proteina recombinante de Plasmodium ovale, (h) una proteina recombinante de Plasmodium malaria, (i) una proteina recombinante de células de cáncer de mama, (j) una proteina recombinante de células de cáncer de riñon, (k) una proteina recombinante de células de cáncer de próstata, (1) una proteina recombinante de células de cáncer de la piel, (m) una proteina recombinante de células de cáncer cerebral, (n) una proteina recombinante de células de leucemia, (o) un perfil recombinante, (p) una protelna recombinante de la alergia al piquete de abeja, (q) proteínas recombinantes de alergia a la nuez,
(r) proteinas recombinantes de alergias a los alimentos, proteinas recombinantes de asma, y una proteina recombinante de Clamidia. Una vez que se selecciona el determinante antigénico o antigeno de la composición, al menos un segundo sitio de unión puede agregarse a la molécula en la
preparación para construir el arreglo repetitivo y organizado asociado con el andamio molecular no natural de la invención. El conocimiento de que constituirá un segundo sitio de unión apropiado, se conocerá por aquel experto en la técnica. Los ejemplos representativos del segundo sitio de unión incluyen, pero no están limitados a los siguientes: un antlgeno, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, biotina, avidina, estrepavidina, un receptor, un ligando receptor, un ligando, una proteina enlazante al ligando, un polipéptido de cierre interactuante, un grupo amino, un grupo químico reactivo a un grupo amino; un grupo carboxilo, un grupo químico reactivo a un grupo carboxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo químico reactivo a un grupo sulfhidrilo, o una combinación de los mismos. La asociación entre el primer y segundo sitios de unión, se determinará por las características de las moléculas respectivas seleccionadas, pero comprenderá al menos, un enlace no peptidico. Dependiendo de la combinación de los primeros y segundos sitios de unión, la naturaleza de la asociación puede ser covalente, iónica, hidrófoba, polar, o una combinación de los mismo. En una modalidad de la invención, el segundo sitio de unión puede ser el dominio de la proteina de
cierre de leucina FOS o el dominio de la proteina de cierre leucina JUN. En una modalidad más especifica de la invención, el segundo sitio de unión seleccionado es el dominio de la protelna de cierre leucina FOS, el cual se asocia específicamente con el dominio de la proteina de cierre leucina JUN del andamio molecular no natural de la invención. La asociación de los dominios de la proteina de cierre leucina JT7N y FOS, proporcionan una base para la formación de un arreglo de determinante antigénico o antigeno repetitivo, en la superficie del andamio. El dominio de la proteina de cierre leucina FOS puede ser fusionado en estructura al determinante antigénico o antigeno de selección a ya sea el termino amino, término carboxilo o internamente localizado en la proteina, si se desea. Se proporcionan varios constructos de fusión FOS para propósitos ejemplares. La hormona de crecimiento humana (Ejemplo 4) , fosfolipasa de veneno de abeja A2 (PLA) (Ejemplo 9), ovalbümina (Ejemplo 10) y HIV gp 140 (Ejemplo 12) . Para simplificar la generación de constructos de fusión FOS, se describen varios vectores que proporcionan
opciones para el diseño y construcción de determinantes antigénicos o antigeno (véase Ejemplo 6) . Los vectores pAVl-4 se diseñaron para la expresión de la fusión FOS en E. coli ; los vectores pAV5 y pAV6 se diseñaron para la expresión de las proteinas de fusión FOS en células eucarióticas. Las propiedades de estos vectores se describen brevemente: 1. pAVl : Este vector se diseñó para la secreción de las proteínas de fusión con FOS al C-término en el espacio periplásmico de E . coli . El gen de interés (g.o.i) se puede ligar en los sitios Stul/Notl del vector. 2. pAV2 : Este vector se diseñó para la secreción de las proteinas de fusión con FOS al N-término en el espacio periplásmico de E . coli . El gen de interés (g.o.i) se ligó en los sitios Notl/EcoRV (o Notl/Hindi) del vector. 3. pAV3 : Este vector se diseñó para la producción citoplásmica de las proteínas de fusión con FOS la C-término en E. coli . El gen de interés (g.o.i) puede estar ligado en los sitios EcoRV/Notl del vector. 4. pAV4 : Este vector se diseñó para la producción citoplásmica de las proteínas de fusión con FOS al N-término en E . coli . El gen de interés (g.d.i) puede estar
ligado en los sitios Notl/EcoRV (o Notl/Hindi) del vector. El residuo de metionina N-términal es proteolíticamente removido después de la síntesis de proteínas. (Hirel et al . , Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 86":8247-8251 (1989)). 5. pAV5 : Este vector se diseñó para la producción eucariótica de las proteínas de fusión con FOS al C-término. El gen de interés (g.d.i) puede insertarse entre las secuencias codificantes para la secuencia de señal hGH y el dominio FOS por ligación en los sitios Eco47III/NotI del vector. Alternativamente, un gen que contiene su propia secuencia de señal puede fusionarse a la región codificante FOS por ligación en los sitios Suti/Notl. 6. pAV6: Este vector se diseñó para la producción eucariótica de las proteínas de fusión con FOS al N-término. El gen de interés (g.d.i) puede ligarse en los sitios Notl/Stul (o Notl/Hindi) del vector. Como se entenderá por aquellos en la técnica, la construcción de una proteina de fusión determinante antigénica o antigeno FOS, puede incluir la adición de ciertos elementos genéticos para facilitar la producción de la proteina recombinante. El Ejemplo 4 proporciona guia para la adición de ciertos elementos regulatorios E. coli , para traducción y el Ejemplo 7 proporciona guia para la
adición de una secuencia de señal eucariótica. Se pueden seleccionar otros elementos genéticos, dependiendo de las necesidades especificas del practicante. La invención está también considerada por incluir la producción de la proteina de fusión de determinante antigénico FOS o antígeno FOS , ya sea en las células bacterianas (Ejemplo 5) o eucarióticas (Ejemplo 8). La selección de cual tipo de célula en la cual se expresa la proteina de fusión está dentro del conocimiento del artesano experto, dependiendo de los factores tal como si las modificaciones post-traduccionales son en consideración importante en el diseño de la composición. Como se notó previamente, la invención describe varios métodos para la construcción de una proteina de fusión de determinante antigénico FOS o antigeno FOS, a través del uso de los vectores pAV. Además de permitir la expresión procariótica y eucariótica, estos vectores permiten al practicante, seleccionar entre -la adición al C-terminal al antigeno del dominio de la proteina de cierre leucina FOS . Se proporcionan aqui ejemplos específicos - y las fusiones Fos C-ter inales se elaboran para PLA (Ejemplo 9) y ovlabúmina (Ejemplo 10). El ejemplo 11 demuestra la purificación de las proteinas de fusión
FOS PLA y ovalbúmina. En una modalidad más especifica, la invención se dirige a un determinante antigénico o antigeno codificado por el genoma del VIH. Más específicamente, el antigeno VIH es gp 140. Como se proporciona para los Ejemplos 11-15, el VIH gpl40 puede crearse con un dominio de la proteina de cierre de leucina FOS, y la proteina de fusión sintetizada y purificada para unirse al andamio molecular no natural de la invención. Como un experto en la técnica podrá saber, se pueden usar otros determinantes antigénicos o antigenos en la creación de una composición de la invención. En una modalidad más especifica de la invención, el segundo sitio de unión seleccionado es un residuo de cisteina, el cual se asocia específicamente con un residuo de lisina del andamio molecular no natural de la invención. El enlace químico del residuo de lisina (Lys) y residuo de cisteina (Cys) proporciona una base para la formación de un arreglo determinante antigénica o antigeno repetitivo y organizado en la superficie del andamio. El residuo de cisteina puede diseñarse en la estructura al determinante antigénico o antigeno de selección a ya sea el término amino, término carboxilo o internamente
localizado en la proteína si se desea. Por medio del ejemplo, PLA y VIH gpl40 se proporciona con un residuo de cisteina para el enlace a un primer sitio de unión del residuo de lisina.
C. Preparación de las Partículas Alfavaccinas La invención proporciona nuevas composiciones y métodos para la construcción de arreglos de antigenos ordenados y repetitivos. Como un experto en la técnica podrá saber, las condiciones para el ensamble del arreglo de antigeno ordenado y repetitivo dependen de una gran extensión en la selección especifica del primer sitio de unión del andamio no natural y la selección especifica del segundo sitio de unión del determinante antigénico o antigeno. Asi, la selección del practicante en el diseño de la composición (es decir, la selección de los primeros y segundos sitios de unión, andamio de antigeno y no natural) , determinará las condiciones especificas para el ensamble de la particula Alfavaccina (el arreglo de antígeno repetitivo y ordenado y el andamio molecular natural combinado) . Información con relación al ensamble de la particula alfa vaccina está también dentro del
conocimiento de trabajo del practicante, y existen numerosas referencias para auxiliar al practicante (por ejemplo, Sambrook, J. et al., eds. MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2da. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) ; Ausubel, F. et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997); Celis, J. , ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2n . Edición (1998), de las cuales todas están incorporadas aquí por referencia. En una modalidad especifica de la invención, los dominios de la proteína de cierre de leucina JUN y FOS, se utilizan para los primeros y segundos sitios de unión de la invención, respectivamente. En la preparación de las particulas alfavaccina, el antigeno podrá producirse y purificarse bajo condiciones para promover el ensamble del arreglo de antigeno ordenado y repetitivo en el andamio no natural. En la modalidad del dominio de la proteina de cierre de la leucina JUN/FOS particular, el determinante FOS-antigénico o FOS-antigeno, deberá tratarse con un agente de reducción (por ejemplo, Ditiotreitol (DTT) , para reducir o eliminar la incidencia de la formación del enlace disulfuro (Ejemplo 15). Para la preparación del andamio no natural 8es
decir, el virus Sinbis recombinante) de la modalidad del dominio de la proteína de cierre de leucina JUN/FOS, las partículas virales E2-JT7N recombinantes, deberán concentrarse, neutralizarse y tratarse con el agente de reducción (véase Ejemplo 16) . El ensamble del arreglo de antigeno ordenado y repetitivo en la modalidad JUNE/FOS se hace en la presencia de un desorden redox. Las partículas virales E2-JUN se combinan con un exceso molar de 240 partes de determinante FOS-antígeno o FOS-antigénico por 10 horas a 4°C. Subsecuentemente, la partícula AlfaVaccina se concentra y purifica por cromatografía (Ejemplo 16) . En otra modalidad de la invención, el acoplamiento del andamio molecular no natural al determinante antigénico o antígeno, se puede acompañar por la reticulación química. En una modalidad más preferida, el agente químico es un agente de reticulaión hetero-bifuncional tal como el éster ?-hidroxisuccinimida del ácido e-maleimidopróico (Tanimori et al . , J. Pharm . Dyn 4:812 (1981); Fujiwara et al . , J. Immunol . Meth 45 : 195 (1981) , el cual contiene (1) un grupo reactivo de succinimida con grupos amino y (2) un grupo reactivo maleimida con grupos SH. Una proteina heteróloga o
polipéptido del primer sitio de unión puede ser diseñada genéticamente por contener uno o más residuos de lisina que servirán como una porción reactiva para la porción de succinimida del agente de reticulación hetero-bifuncional . Una vez acoplado químicamente a los primeros sitios de unión del andamio molecular no natural, en grupo maleimida del agente de reticulación hetero-bifuncional, estará disponible para reaccionar con el grupo SH de un residuo de cisteína en el determinante antigénico o antígeno. La preparación del determinante antigénico o antígeno en este ejemplo, puede requerir el diseño por ingeniería genética, de un residuo de cisteína en la proteína o polipéptido seleccionado como el segundo sitio de unión, de manera que pueda hacerse reaccionar a la función maleimida libre en el agente de reticulación enlazado al primer sitio de unión del andamio molecular no natural.
3. Composiciones, Vacunas y la Administración de las Mismas, Métodos de Tratamiento .
En una modalidad, la invención proporciona vacunas para la prevención de padecimientos infecciosos en un amplio rango de especies, particularmente especies de
mamíferos tales' como humano, mono, vaca, gato, perro, caballo, cerdo, etc. Las vacunas pueden ser diseñadas para tratar infecciones de etiología viral tales como VIH, influenza, Herpes , hepatitis viral, Epstein Bar, polio, encefalitis viral, sarampión, varicela, etc.; o infecciones de etiolobia bacteriana tal como neumonía, tuberculosis, sífilis etc.; o infecciones de etiología parasítica tal como malaria, tripanosomiasis, leishmaniasis, tricomoniasis, amibiasis, etc. En otra modalidad, la invención proporciona vacunas para la prevención del cáncer en un amplio rango de especies, particularmente especies de mamíferos tales
' como humano, mono, vaca, perro, gato, caballo, cerdo, etc.
Las vacunas pueden diseñarse para tratar todos los tipos de cánceres: linfomas, carcinomas, sarcomas, melanomas, etc . En otra modalidad de la invención, las composiciones de la invención se pueden usar en el diseño de las vacunas para el tratamiento de alergias Los anticuerpos del isotipo IgE son componentes importantes en las reacciones alérgicas. Las células mástil se enlazan a los anticuerpos IgE en su superficie y liberan histaminas y otros mediadores de respuesta alérgica después del
enlace del antigeno específico a las moléculas IgE enlazadas en la superficie de las células mástil. La inhibición de la producción de los anticuerpos IgE, por lo tanto, es un objetivo prometedor para proteger contra las alergias. Esto deberá ser posible alcanzando una respuesta a las células auxiliadoras T deseadas. Las respuestas a las células auxiliadoras T se pueden dividir en respuestas a las células auxiliadoras T tipo 1 (TH1) y tipo 2 (TH2) (Romagnani, Immunol . Today 18 : 263-266 (1997)). Las células TH1 secretan interferona-gama y otras citocinas las cuales provocan que las células B produzcan anticuerpos IgGl-3. En contraste, una citosina crítica producida por las células TH2 es IL-4, las cuales accionan a las células B para producir IgG4 e IgE. En muchos sistemas experimentales, el desarrollo de las respuestas TH1 y TH2 es mutuamente exclusiva puesto que las células TH1 suprimen la inducción de las células TH2 y viceversa. Así, los antígenos que disparan una respuesta THI fuerte simultáneamente suprimen el desarrollo de las respuestas TH2 y por lo tanto, la producción de los anticuerpos IgE. De manera interesante, virtualmente todos los virus inducen una respuesta TH1 en el hospedero y fallan al disparar la producción de los anticuerpos IgE (Coutelier
et al . , J. Exp . Med. 1 65 : 64 - 69 (1987)). Este modelo de isotipo no está restringido a virus vivos, pero también se han observado por particulas virales recombinantes o inactivadas (Lo-Man et al., Eur. J. Immunol 28:1401-1407 (1998)) . Asi, mediante el uso de los procesos de la invención (por ejemplo, Tecnología AlfaVaccina) , las particulas virales se pueden decorar con varios alérgenos y usarse para inmunización. Debido a la "estructura viral" resultante del alérgeno, se estimulará una respuesta TH1, los anticuerpos IgGl-3 "protectivos" se producirán, y la producción de los anticuerpos IgE los cuales causan reacciones alérgicas se prevendrán. Puesto que tal alérgeno está presentado por las partículas virales las cuales son reconocidas por una serie diferente de células T auxiliadoras que el alérgeno mismo, es probable que los anticuerpos IgGl-3 se inducirán aún en individuos alérgicos albergados PRE-existente en las células TH2 específicas para el alérgeno. La presencia de altas concentraciones de anticuerpos IgG puede prevenir el' enlace de los alérgenos a las células mástil enlazadas IgE, con ello, se inhibe la liberación de histamina. Asi, la presencia de anticuerpos IgG puede proteger de reacciones alérgicas mediadas por IgE. Las substancias
típicas que causan alergias incluyen: pasto, ambrosia, polen de cedro de montaña o abedul, polvo de casa, ácaros, caspa animal, tierra vegetal, veneno de insecto o fármacos (por ejemplo, penicilina) . Así, la inmunización de individuos con partículas virales decoradas con alérgenos deberá ser benéfica no solamente antes sino también después del comienzo de las alergias. Como podrá entenderse por un ordinario experto en la técnica, cuando las composiciones de la invención se administran a individuos, puede estar en una composición la cual contiene sales, amortiguadores, adyuvantes u otras substancias las cuales son deseables para el mejoramiento de la eficacia de la composición. Se proporcionan los Ejemplos de materiales adecuados para usarse en la preparación de composiciones farmacéuticas en numerosas fuentes incluyendo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A. Ed., Mack Publishing Co., (1980)). Las composiciones de la invención se dice son "farmacéuticamente aceptables" si su administración puede ser tolerada por un recipiente individual. Además, las composiciones de la invención se administrarán en una "cantidad terapéuticamente efectiva" (es decir, una cantidad que produce un efecto fisiológico deseado) .
Las composiciones de la presente invención pueden ser administradas por varios métodos conocidos en la técnica, pero normalmente de administrarán por inyección, infusión, inhalación, administración oral, u otros métodos físicos adecuados. Las composiciones pueden alternativamente, ser administradas intramuscularmente, intravenosamente o subcutánea. Los componentes de las composiciones para administración incluyen soluciones acuosas o no acuosas (por ejemplo, salina fisiológica) estériles y suspensiones. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tal como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores o rellenos oclusivos se pueden usar para incrementar la permeabilidad de la piel e incrementar la absorción del antígeno . Además de las tecnologías de vacunas, otras modalidades de la invención se dirigen a métodos de tratamiento médico de cáncer y alergias. Todas las patentes y publicaciones referidas aquí, están expresamente incorporadas por referencia.
Ejemplos
Las enzimas y reactivos usados en los experimentos siguientes incluyen: ligasa de ADN T4 obtenida de New England Biolabs; Polimerasa de ADN Taq, Equipo QIAprep Spin Plasmid, QUIAGEN Plasmid Midi Kit, Equipo de extracción en Gel QuiaExII, Euipo de Purificación por PCR QIAquick obtenido de QUIAGEN; Equipo de Purificación de ARNm Micro QuickPrep obtenido de Pharmacia; SuperScript One-Step RT PRC Kit, suero de ternero fetal (FCS), extracto de levadura y bacto-triptona obtenidos de Gibco BRL; Oligonucleótidos obtenidos de Microsynth (Suiza) ; endonucleasas de restricción obtenidas de Boehringer Mannheim, New England Biolabs o Fermentos MBO; polimerasa Pwo y dNTPs obtenidas de Boehringer Mannheim. El medio HP-1 se obtuvo de las tecnologías de cultivos Celulares (Glattbrugg, Suiza) . Se obtuvieron todos los estándares químicos a partir de Fluka-Sigma-Aldrich, y todos los materiales de cultivos celulares se obtuvieron de TPP. Se llevaron a cabo las manipulaciones de ADN usando técnicas estándares. El ADN se preparó de conformidad con la instrucción del fabricante ya sea de un
cultivo bacteriano de 2 ml usando el Equipo de Plasmido giratorio QUIAprep o de un cultivo de 50 ml usando el Equipo Midi de Plasmido QUIAGEN. Para la digestión de la enzima de restricción, el ADN se incubó al menos, 2 horas con la enzima de restricción apropiada a una concentración de 5-10 unidades (U) de enzima por mg de ADN bajo las condiciones recomendadas por el fabricante (amortiguador y temperatura) . Se realizaron simultáneamente las digestiones con más de una enzima, si las condiciones de reacción fueron apropiadas para todas las enzimas, o de otro modo, consecutivamente. Los fragmentos de ADN aislados para manipulaciones adicionales se separaron por electroforesis en gel de agarosa al 0.7 a 1.5%, escindido del gel y purificado con el Equipo de Extracción de Gel QuiaExII de conformidad con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Para la ligación de los fragmentos de ADN, 100 a 200 pg del vector de ADN purificado se incubaron durante la noche con un exceso molar de tres partes del fragmento insertado a 16°C en la presencia de ligasa de ADN T4 U en el amortiguador proporcionado por el fabricante (volumen total: 10-20 µl) . Una alícuota (0.1 a 0.5 µl) de la reacción de ligación se usó para la transformación de E . coli XLI-Blue
(Stratagene) . La transformación se hizo por electroporación usando un Pulsador de Gen (BioRAD) y 0.1 cm de Probetas del Pulsador de Gen (BioRAD) a 200 O, 25 µF, 1.7 kV. Después de la electroporación, las células se incubaron con sacudiiento por 1 hora en 1 ml de medio S.O.B (Miller, 1972) antes del blindaje en agar S.O.B selectivo .
Ejemplo 1 : Inserción del dominio de hélice anfif ática JUN con E2
En el vector pTE5'2J (Hahn et al., Proc. Na ti . Acad. Sci . USA 89 : 261 -2683 , (1992)), los sitios de enzima de restricción Ml ul y BstEII, se introdujeron entre los codones 71 (Gln) y 74 (THr) de la secuencia codificante E2 de la proteina estructural, que resulta en el vector pTE5'2JBM. La introducción de estos sitios de enzima de restricción se hizo por PCR usando os siguientes oligonucleótidos :
Oligo 1: E2insBstEII BssHII: 5'-ggggACGCGTGCAGCAggtaaccaccgTTAAAGAAGGCACC-3' ( SEC ID NO:l) Oligo 2: E2insMluIStuI: S'-cggtggttaccTGCTGCACGCGTTGCTTAAGCGACATGTAGCGG^' ( SEC ID NO:2) Oligo 3: E2insStuI: 5'-CCATGAGGCCTACGATACCC-S' (SEC ID NO: 3) Oligo4: E2insBssHII: 5'-GGCACTCACGGCGCGCTTTACAGGC-3' (SEC ID NQ4)
Para la reacción de PCR, 100 pmol de cada oligo se usó con 5 ng del ADN modelo en una mezcla de reacción
de 100 µl, que contienen 4 unidades de polimerasa Pwo o Taq, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgS0 . Todas las concentraciones se determinaron fotométricamente usando el aparato GeneQuant (Pharmacia) . La polimerasa se agregó directamente antes del comienzo de la reacción de PCR (punto de inicio fue 95°C). El funcionamiento cíclico de la temperatura se hizo de la siguiente manera y orden. 95°C por 2 minutos; 5 ciclos de 95°C (45 segundos), 53°C (60 segundos), 72°C (80 segundos); y 25 ciclos de 95°C (45 segundos), 57°C (60 segundos), 72°C (80 segundos). Los dos fragmentos de PCR se analizaron y purificaron por electroforesis en gel de agarosa. El
ensamble de PCR en los dos fragmentos usando oligo 3 y oligo 4 para amplificación, se llevó a cabo para obtener el constructo final. Para el ensamble de la reacción de PCR, 100 pmol de cada oligo se usó con 2 ng de los fragmentos de PCR purificados en una mezcla de reacción de 100 µl que contiene 4 unidades de polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM MgS04. Todas las concentraciones de ADN se determinaron fotométricamente usando el aparato GeneQuant (Pharmacia) . La polimerasa se agregó directamente antes del inicio de la reacción de PCR (el punto inicial fue de 95°C) . El funcionamiento de la temperatura cíclica se hizo de la siguiente manera y orden: 95°C por 2 minutos; 5 ciclos de 95°C (45 segundos), 57°C (60 segundos), 72°C (80 segundos); y 25 ciclos de 95°C (45 segundos), 59°C (60 segundos), 72°C (90 segundos). El producto de PCR final se purificó usando columnas de PCR giratorias Quia (Quiagen) y se digirió en un amortiguador apropiado usando 10 unidades cada uno de ssHII y endonucleasas de restricción Stul por 12 horas a 37°C. Los fragmentos de ADN se purificaron en gel y se ligaron en BssHII/SuI digerido y el vector pTE5'2J purificado en gel (Hahn et a l . , Proc . NATL . Acad . Sci . USA
89:2679-2683) . La inserción correcta del producto de PCR se analizó primero por el análisis de restricción BstEII y Mlul y después el secuenciamiento de ADN del fragmento de PCR. La secuencia de ADN codificante para el dominio de hélice anfifática JUN, se amplificó por PCR a partir del vector pJuFo (Crameri y Suter, Gene 137 : 69 (1993)) usando los siguientes oligonucleótidos:
OVigo 5: JLTVBstEII: 5'-CCTTCTTTAAcggtggttaccTGCTGGCAACCAACGTGGTTCATGAC 3' ( SEC ID O;5) Oligo 6: MluIJ W:5'-AAGCATGCTGCacgcgtgTGCGGTGGTCGGATCGCCCGGC-3' ( SEC ID NO:6)
Para la reacción de PCR, 100 pmol de cada oligo se usaron con 5 ng del ADN patrón en una mezcla de reacción
de 100 µl que contiene 4 unidades de polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgS04. Todas las concentraciones de ADN se determinaron fotométricamente usando el aparato GeneQuant (Pharmacia) . La polimerasa se agregó directamente antes del comienzo de la reacción de PCR (el punto inicial fue de 95°C) . El funcionamiento cíclico se hizo en el siguiente orden y manera: 95°C por 2
minutos; 5 ciclos de 95°C (45 segundos), 60°C (30 segundos), 72°C (25 segundos); y 25 ciclos de 95°C (45 segundos), 68°C (30 segundos), 72°C (20 segundos). El producto de PCR final se purificó en gel y se ligó en pBluescript II (KS-) purificado en gel y se digirió en EcoRV. A partir del vector resultante, la secuencia JUN se aisló por la escisión con Ml uI /BstEl l purificado con QiaExII y se ligó en el vector pTE5'2BJM (cortado previamente con las mismas enzimas de restricción) para obtener el vector pTE5' 2J: E2JT7N.
Ejemplo 2: Producción de partículas virales que contienen E2-JX N usando el sistema pCYTts Las proteinas estructurales se amplificaron por
PCR usando el pTE5' 2J: E2JU? como patrón y los XbalStruct de oligonucleótidos. (ctatcaTCTAGAATGAATAGAGGATTCTTTAAC) (SEC ID ?O: 12) y StructBsp 1201 (tcgaatGGGCCCTCATCTTCGTGTGCTAGTCAG) (SEC ID ?O:87). Para el PCR, 100 pmol de cada oligo se usó y 5 ng del AD? de patrón se usó en la mezcla de reacción de 100 µl, que contiene 4 unidades de polimerasa Tac o Pwo, 0.1 mM de d?TPs y 1.5 mM de MgS04. Todas las concentraciones
de ADN se determinaron fotométricamente usando el aparato GeneQuant (Pharmacia) . La polimerasa se agregó directamente antes del inicio de la reacción de PCR (el punto inicial fue de 95°C). Los ciclos de temperatura fueron como sigue. 95°C por 3 minutos, seguidos por 5 ciclos de 92°C (30 segundos), 54°C (35 segundos), 72°C (270 segundos) ; y seguida por 25 ciclos de 95°C (30 segundos), 63°C (35 segundos), 72°C (270 segundos). El producto de PCR se purificó en gel y se digirió con las enzimas de restricción Xbal/Bspl201 y se ligó en el vector pCYTts previamente escindido con las mismas enzimas (Solicitud de Patente Estadounidense Sol. No. 60/079,562; • Presentada el 27 Marzo de 1998). Veinte µg de pCYTtsE2 : JI7N se incubaron con 30 U de Scal en un amortiguador apropiado por al menos, 4 horas a 37 °C. La reacción se detuvo por la extracción de fenil/cloroformo, seguida por la precipitación de isopropalon del AD? linearizado. La reacción de restricción se verificó por electroforesis en gel de agarosa. Para la transfección, 5.4 µg de pCYTtsE2 : JUN linearizado se mezclaron con 0.6 µg de pSV2?eo linearizado en 30 µl de H20 y se agregó una solución de 30 µl de CaCl2
1M. Después de la adición de 60 µl de amortiguador de fosfato (50 mM de HEPES, 280 Mn de NaCl, 1.5 mM de Na2, HP0 , pH 7.05), la solución se sometió a vórtices por 5 segundos, seguida por una incubación a temperatura ambiente por 25 horas. La solución se agregó inmediatamente a 2 ml de medio HP-1 que contiene FCS al 2% (medio FCS al 2%) . El medio de un cultivo de células
BHK21 al 80% de confluencia en una placa de 6 pozos entonces se reemplazo con el ADN que contiene el medio. Después de una incubación por 5 horas a 37 °C en un incubador con C02, el ADN que contiene el medio se removió y se reemplazó por 2 ml de glicerol al 15% en medio FCS al 2%. El medio que contiene el glicerol se removió después de una fase de incubación de 30 segundos, y las células se lavaron por el enjuague con 5 ml de un medio de HP-1 que contiene FCS al 10%. Finalmente se agregaron 2 ml del medio de HP-1 fresco que contiene FCS al 10%. Las células establemente transfectadas se seleccionaron y se hicieron crecer en un medio de selección (medio HP-1, suplementado con G418) a 37°C en un incubador con C02. Cuando la población mezclada se hizo crecer a confluencia, el cultivo se dividió en dos discos, seguido por un periodo de 12 horas de crecimiento a 37°C.
Un disco de las células se cambió a 30°C para inducir la expresión de las partículas virales; el otr disco se mantuvo a 37 °C. La expresión de las particulas virales se determinó por el manchado Western (Figura 1) . El medio de cultivo (0.5 ml) fue metanol/cloroformo precipitado, y la pelotilla se resuspendió en un amortiguador de muestra SDS-PAGE. Las muestras se calentaron por 5 minutos a 95°C antes de ser aplicadas a gel de acrilamida al 15%. Después del SDS-PAGE, las proteinas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa de Profano (Schleicher & Schuell, Alemania) como se describe por Bass y Yang, en Creighton, T. E., ed., Protein Function : A Pra cti cal Approach , 2da . Edición . , IRL Press, Oxford (1997), pp- 29-55. La membrana se bloqueó con albúmina bovina al 1% (Sigma) en TBS (10 x TBS por litro: 87.7 g NaCl, 66.1 g de clorhidrato de Trizma (Sigma) y 9.7 g de base Trizma (Sigma), pH 7.4) por 1 hora a temperatura ambiente, seguido por una incubación con un anticuerpo anti-El/E2 (suero policlonal) por 1 hora. El manchado se lavó tres veces por 10 minutos con TBS-T (TBS con Tween 20 al 0.05%), y se incubó por 1 hora con un conjugado IgG anti-conejo de fosfatasa alcalina (0.1 µg/ml, Amersham Life Science, Inglaterra). Después de
lavar 2 veces por 10 minutos con TBS-T y 2 veces por 10 minutos con TBS, el desarrollo de la reacción se llevó a cabo usando reactivos de detección de fosfatasa alcalina
(10 ml de amortiguador AP (100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) con 50 µl de una solución de NBT (Tetrazolio Nitro Blue al 7.7% (Sigma) en dimetilformamida al 70%), y 37 µl de una solución de X-fosfato (5% de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo en dimetilformamida) . La producción de las particulas virales se muestra en la Figura 1. El patrón del manchado Western mostró que E2-JUN (linea 1) migró a un peso molecular superior en SDS-PAGE, comparado con el tipo silvestre E2
(línea 2) y la línea de células hospederas BHK21 no mostró algún antecedente.
Ejemplo 3 : Producción de partículas virales que contienen E2-JUN usando el vector pTE5 ' 2JE2 : JUN
El vector libre RNase (1.0 µg) se linearizó por digestión Pvul. Subsecuentemente, se llevó a cabo la transcripción in vi tro usando un equipo de transcripción in vitro SP6 (InvitroscripCAP por InvitroGen, Invitrogen
BV, NV Leek, Holanda). El ARNm 5' -coronado resultante, se analizó en una reducción en gel de agarosa. El ARNm transcrito in vi tro (5 µg) se electroporó en células BHK21 (ATCC:CCL10) de conformidad con el manual de Invitrogen (Sistema de Expresión Sindbis, Invitrogen BV, Holanda). Después de 10 horas de incubación a 37 °C, el medio que contiene FCS se intercambió por el medio HP-1 sin FCS, seguido por una incubación adicional a 37 °C por 10 horas. El sobrenadante se cosechó y analizó por el análisis de manchado Western para la producción de particulas virales exactamente como se describe en el Ejemplo 2. El resultado obtenido fue idéntico a uno obtenido con pCYTtsE2 : JUN como se muestra en la Figura 2.
Ejemplo 4 : Fusión de la hormona de crecimiento humana (hGH) al dominio de cierre de leucina FOS (secuencia de señal OmpA)
El gen hGH sin la secuencia lider humana se amplificó a partir del plasmido original (ATCC 31389) por PCR. El oligo 7 con un sitio Xbal interno, se diseñó por ablandamiento al extremo 5' del gen hGH, y oligo 9 con un
sitio EcoRI interno cebado al extremo 3' del gen Hgh. Para
La reacción de PCR, 100 pmol de cada oligo y 5 ng del patrón de ADN se usaron en 75 µl de la mezcla de reacción
(4 unidades de polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgS04) . El funcionamiento cíclico de la PCR se realizó de la siguiente manera: 30 ciclos con una temperatura de annealing de 60 °C y un tiempo de elongación de 1 minuto a 72°C. El producto de PCR aislado y purificado en gel, se usó como un patrón para una segunda reacción de PCR para introducir la secuencia de señal ompA y la secuencia Shine-Dalgarno. Para la reacción de PCR, 100 pmol del oligo 8 y oligo 9 y 1 ng del fragmento del PCR patrón, se usaron en 75 µl de la mezcla de reacción (4 unidades de polimerasa Taq o Pow, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgS04) . La temperatura de ablandamiento para los primeros cinco ciclos fue a 55°C con un tiempo de elongación de 60 segundos a 72°C; otros 25 ciclos se realizaron con una temperatura de ablandamiento de 65°C y un tiempo de elongación de 60 segundos a 72°C.
Oligo7: gggtctagattcccaa^^
Oligo 8:
gggtctagaaggaggtaaaaaacgatgaaaaagacagctatcgcgangcagtggcactggctggtttcgctac cgtagcgcaggccttcccaaccattcccttatcc ( SEC ID NO:8) Oligo 9: cccgaattcctagaagccacagctgccctcc ( SEC ID N0c9)
El gen hGH recombinante resultante se subclonó en pBluescript via Xbal/EcoRI. La secuencia correcta de ambas hebras se confirmó por el secuenciamiento de AND. La secuencia de ADN codificante para el dominio de hélice anfifática FOS se amplificó con PCR a partir del vector pJuFo { Crameri & Suter Gen 137 : 69 (1993)) usando los oligonucleótidos. Omp-FOS: 5'-ccTGCGGTGGTCTGACCGACACCC-3' (SEC ID NO: 10) fos-HGH: 5'-ccgcggaagagccaccGCAACCACCGTGTGCCGCCAGGATG-3' (SEC ID NO:ll) .
Para la reacción de PCR, 100 pmol de cada oligo y
5 ng del patrón de ADN se usaron en 75 µl de la mezcla de
reacción (4 unidades de polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgS04) . Los ciclos de temperatura fueron como sigue: 95°C por 2 minutos, seguidos por 5 ciclos de 95°C (45 segundos), 60°C (30 segundos), 72°C (25 segundos) y seguido por 25 ciclos de 95CC (45 segundos), 68°C (30 segundos), 72°C (20 segundos). El producto de PCR se purificó, aisló y clonó en el pBluescript-ompA-hGH digerido con Stul . El gen híbrido entonces se clonó en el plasmido pKK223-3 (Pharmacia).
Ejemplo 5 : Expresión Bacteriana de FOS-hGH
El ompA-FOS-hGH en pkk223-3 se expresó bajo el control del promotor dependiente de IPTG inducible usando JMl01 como la cepa hospedera E . coli . La expresión se realizó en matraces sacudidores. Las células se indujeron con 1 mM de IPTG (concentración final) a un OD600 de 0.5. La expresión se continuó por 10 horas a 37°C. Las células se cosecharon por centrifugación a 3600 a 10°C por 15 minutos. La pelotilla celular se congeló (-20°C) o N2 liq.) y se almacenó por 16 horas. La pelotilla entonces se
cebó a 4°C y se resuspendió en 10 ml de 10 mM de Tris-HCl, pH 7.4 que contiene 600 mM de sucrosa. Después de la agitación por 15 minutos a 4°C, las proteinas periplásmicas se liberaron por un procedimiento de golpe osmótico. Se agregó H20 desionizada fria (4°C), y la suspensión se agitó por 30 minutos a 4°C. El lodo se diluyó, resuspendió y se agregó la lisozima para degradar la pared celular de la bacteria. Las células y los esferoplastos de la fracción periplásmica se separaron por centrifugación por 20 minutos a 11000 g a 4°C. El sobrenadante que contiene FOS-hGH se analizó por reducción y el SDS-Page sin reducción y manchado Dot. El manchado Dot se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 8, usando un anticuerpo anti-hGH (Sigma) como el primer anticuerpo y un conjugado anticuerpo anti-ratón (AP) de fosfatasa alcalina al segundo anticuerpo. El FOS-hGH correctamente procesado, de longitud completa, podrá detectarse bajo condiciones de reducción y no reducción. Parte del FOS-hGH se enlazó a otras proteinas no identificadas debido a las cisteinas libres presentes en la hélice anfifática FOS . Sin embargo, más del 50% del FOS-hGH expresado, ocurrió en su conformación monomérica nativa (Figura 3) .
El FOS-hGH purificado, se usará para realizar los primeros experimentos de dopaje con partículas virales que contiene JUN.
Ejemplo 6: Constricción de la serie de vectores pAV para la expresión de las proteínas de fusión FOS
Se construyó un sistema de vector versátil que permitió ya sea la producción o secreción citoplásmica de
- las proteínas de fusión FOS C-terminal en E . coli o producción de- proteínas de fusión FOS C-terminal en
- células eucarióticas. Los vectores pAVl - pAV4 los cuales se diseñaron para la producción de las proteinas de fusión FOS en E. coli , abarcan los casetes de ADN listados abajo, los cuales contienen los siguientes elementos genéticos colocados en diferentes órdenes: (a) un sitio de enlace al ribosoma fuerte y una región no traducida 5' derivada del gen ompA de E . coli (aggaggtaaaaaacg) (SEC ID NO: 13); (b) una secuencia que codifica al péptido de señal OmpA de la proteina de membrana exterior de E . coli
(MKKTAIAIAVALAGFATVAQA) (SEC ID NO:14); (c) una secuencia codificante para el dominio de dimerización FOS flanqueado
en ambos aldos por dos residuos de lisina y un residuo de cisteína. (CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC) (SEC ID NO: 15); y (d) una región que codifica un enlazador peptídico corto (AAASGG (SEC ID NO: 16) O GGSAAA (SEC ID NO:17)), que conecta a la proteína de interés con el dominio de dimerización FOS . Las regiones codificantes relevantes están dadas en letras en casillas superiores. El arreglo de los sitios de escisión de restricción, permite la fácil construcción de los genes de fusión FOS con o sin una secuencia de señal. Los casetes son clonados en los sitios de restricción EcoRI/Hindi del vector de expresión pKK223-3 (Pharmacia) para la expresión de los genes de fusión bajo el control del promotor tac fuerte.
pVAl Este vector se diseñó para la secreción de las proteinas de fusión con FOS al C-término en el espacio periplásmico de E. coli . El gen de interés (g.d.i) puede estar ligado en los sitios Stul/Notl del vector.
EcoSI 31/11 ft»«. TW «99 «99 taa acg ATG A??. AAG AC? GCT ATC GCG ATT GC? GTG GC? CTG GCT K K K T A I A Z A V A L A 61/21 Stul Notl GGT rrc GCT ACC OTA oca CAS OCC tm gtg ggg scs scc GCT TCT GGT GGT TGC GGT GGT G F ? T V A Q A (gol) ? ? ? S G G C G G 121/41 151/S1 CTG ACC G?C ACC CTG CAG GCG G?? ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCC CTG CAÁ 7 D T L Q A B T D Q V B D E K S A L Q 181/£1 211/71 ACC SAA ATC GCG AAC CTG CTG A?A G?? ??? G?? AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CAC T ? I A N L K E K E K L E F I A A H 241, £1 Hin III GGT 33T TOC taa qct t (SEC ID NO18) s 3 C A (SEC ID NO-- 14 y 19)
pVA2 Este vector se diseñó para la secrec iiocn de las
proteínas de fusión con FOS al N-término en el espacio
periplásmico de E. co li. El gen de interés (g.d.i) puede
estar ligado en los sitios Notl/EcoRV (o Notl/Hindi) del
vector. EcoRI 31/11 9»*, ttc agg agg taa aaa acg ATG ??? A?ß ACÁ GCT ATC GCß ATT GCA GTG GCA CTG OCT M K K T ? X ? X A V A ? «1/21 Stul 91/31 GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAO OCC TSC OOT GOT CTG ACC OAC ?CC CTG CAO GCG O?? ACC G F A T V ? Q ? C G O I. T D T X. Q A E T 121/41 151/51 GAC CAG sTG aAA GAC OA???? TCC GCs CTs C???CC GAA ATC GCG AAC CTG CTG'??A GA? D Q V E D E K S ? L Q T E X A . » K E -ßi/ßl 211/71 Notl AAA G?? A?G CTG GAO TTC ATC CTO GCG GCA CAC OGT GGT TGC GGT GGT TCT GCG GCC GCT K S K L E F I If ? ? a o G C G S S A A A 241/il ECORV HindIII ggg tgt gg crat ate aa« ctt (goi)
(SEC ID NO: 20) (SEC ID NO: 21)
PVA3 Este vector se diseñó para la DnterésDón citoplásmica proteinas de fusión con FOS al C-término en el espacio periplásmico de E. coli. El gen de Dnterés (g.d.i) puede estar ligado en los sitios EcoRV/Notl del vector . EcoRI E8RV Motl «1--*-..99.gg taa ... c*^ , ggg g^-^^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ <So¿)
GAA AAA TCC GCG CTG C?? 121/41 151/51 *- «««•«--»---«_ « GAA A-?.G« -.««,»«.«. «. E E KK L EE F . L » , H 181/Sl Hin lII GGT GGT TGC ta» qct t
(SEC ID NO: 22) (SEC ID NO: 23)
pVA Este vector se diseñó para la producción citoplásmica de las proteinas de fusión con FOS al N-término en el espacio periplásmico de E. coli. El gen de interés (g.d.i) puede estar ligado en los sitios Notl/EcoRV del vector. El residuo de metionina N-terminal se remueve proteoliticamente después de la síntesis de
proteinas (Hirel et al., Proc. Nati. Acad. Sci USA 86:8241-8251 (1989)).
ECORI 31/11 Sa- ££ -99 «99 ta. a.» ,cg ?TG GCT TGC GGT GGT CTG ?CC GAC ACC CTG C?O GCG GAA T H A C G G L T D T L Q ? E 61/21 91/31 « V E D E K S A L Q T I A N K 121/41 151/51 GAA AAA G?? ??G CTC GAO TTC ATC CTG GCG OCA CAC GGT CGT TCC GCT GGT TCT S A A H G G C G G S A A lßl/dl EcoRV HindIII S£T ggg tgt ggg sat »tt aag ctt A (goi)
(SEC ID NO: 24) (SEC ID NOs: 88 y 25)
Los vectores pAV5 y pAV6, los cuales se diseñaron para la producción eucariótica de las proteinas de fusión
FOS, abarcan los siguientes elementos genéticos colocados en diferentes órdenes: (a) una región codificante para el péptido lider de la hormona de crecimiento humana
(MATGRSTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA) (SEC ID NO: 26); (b) una secuencia codificante para el dominio de dimerización FOS flanqueado en ambos lados por dos residuos de glicina y un residuo de cisteina. (CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC) (SEC ID
NO: 15); y (c) una región que codifica a un enlazador peptidico corto (AAASGG (SEC ID NO: 16) O GGSAAA (SEC ID NO: 17)) que conecta a la proteina de interés con el dominio de dimerización FOS . Las regiones codificantes relevantes están dadas en letras mayúsculas. El arreglo de los sitios de escisión de restricción permiten la fácil construcción de los genes de fusión FOS . Los casetes se clonan en los sitios de restricción EcoRI/HindIII del vector de expresión pMPSVEH (Artelt et al . , Gene 68:213-219 (1988)).
pVA5 Este vector se diseñó para la producción eucariótica de las proteínas de fusión con FOS al C-término. El gen de interés (g.d.i) puede insertarse entre las secuencias codificantes para la secuencia de señal hGH y el dominio FOS por la ligación en los sitios Eco47III/NotI del vector. Alternativamente, un gen que contiene su propia secuencia de señal se puede fusionar a la región codificante FOS por la ligación en los sitios Stul/Notl.
ECORI Stul 31/11 gaa ttc aßg cct ATG GCT ACÁ GGC TCC COG ?CO TCC CTG CTC CTG GCT TTT GGC CTO CTC M A T G S R T S L L L A F G L L 61/21 Eco47III Hotl TGC CTG CCC TGG CTT CAÁ GAG GGC AGC GCT ggg tgt ggg GCG OCC GCT TCT GGT GGT TGC C L P K L Q E G S A (gol) A A A S G G C 121/41 151/51 GGT GGT CTG ACC GAC ?CC CTO C?G GCG G?? ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG G O L T D T L Q A E T D Q V E D E S A X81/61 211/71 CTG CAÁ ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG ??? G?? ??? GAA AAG CTß GAG TTC ATC CTG GCG L Q T E I A N L L K E K E X L E F I L A 241/81 HindXXI GCA CAC GGT GGT TGC ta. qct t A H G G C *
(SEC ID NO: 27) (SEC ID NO: 26 y 28)
pVA6 Este vector se diseñó para la producción eucariótica de las proteinas de fusión con FOS al N-término. El gen de interés (g.d.i) puede estar ligado en los sitios Notl/Stul (o Notl/HindIII) del vector.
Eco?.! 31/11 gaa ttc ATG CCT AC? GGC TCC COG ACG TCC CTß CTC CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG M A T G S R T S L L L A F s L C L 61/21 EC047III 91/31 CCC TGG CTT CAÁ GAG GGC AGC GCT TGC GGT GGT CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACC P « L Q E G S A C G G L T D T L Q A E T 121/41 151/51 GAC CAO OTO GAA GAC GAA AA? TCC GCG CTG CAÁ ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG A?A GA? D Q V E D E S A L Q T E I A N L L K E
131/61 211/71 Notl AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA C?C GGT GGT TOC GGT GGT TCT OCO GCC GCT K E L E F I ? ? H G G C G G S ? ? ? 241/81 StuX HindIII ggg tgt ggg »qg. c,t a,aa_cftt (goi)
(SEC ID NO: 29) (SEC ID NO: 30)
Construcción de los vectores de expresión pAVl-pAV6 Se han sintetizaron los siguientes oligonucleótidos para la construcción de los vectores de expresión pAVl- pAV6: FOS-FOR1: CCGGGGTGGGGGCGGCCGCTTCTGG GGTTGCGGTGGTCTGACC ( SEC IDNO:31); FOS-FOK2: GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATCGGGTGTGGGGCGGCC (SEC ID NO:32); FOS-FOKi: GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAACGATGGCTTGCGGTGGTCTGACC (SECIDNO:33); FOS-FOR4: GCTTGCGGTGGTCTGACC (SEC ID NO:34); F05-REV1: CCACCAAGCTTAGCAACCACCGTGTGC (SEC ID NO:35); FOS-KEV2: CCACCAAGCTTGATATCCCCACACCCAGCGGCCGCAGAACCACCGC
AACCACCG (SEC ID NO:36); FOS-REV3: CCACCAAGCTTAGGCCTCCCACACCCAGCGGC (SEC ID NO:37); OmpA-FORl: GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAACGATG (SEC ID NO:38); hGH-FORl:
GGTGGGAATTCAGGCCTATGGCTACAGGCTCC (SEC ID NO:39); hGH-FOR2: GGTGGGAATTCATGGCTACAGGCTCCC (SEC ID NO:40).
Para La construcción del vector pAV2, las regiones codificantes para la secuencia de señal OmpA y el dominio FOS se amplificaron a partir del gen de fusión ompA-FOS-hGH en el vector pKK223-3 (véase Ejemplo 5) , usando el par cebador OmpA-FORl/FOS-REV2. El producto PCR se digirió con EcoRI/Hindi y se ligó en los mismos sitios del vector pKK223- (Pharmacia) . Para la construcción del vector pAVl, la región codificante FOS se amplificó a partir del gen de fusión ompA-FOS-hGH en el vector pKK223-3 (véase Ejemplo 5) , usando el par cebador FOS-FOR1/FOS-REV1. El producto de PCR se digirió con HindIII y se ligó en pAV2 del vector digerido con StuI/HindIII . Para la construcción del vector pAV3, la región codificante para el dominio FOS se amplificó del vector pAVl usando el par cebador FOS-FOR2/FOS-REV1. El producto
PCR se digirió con EcoRI/HindIII y se ligó en los mismos sitios del vector pKK223-3 (Pharmacia) . Para la construcción del vector pAV4, la región
codificante para el dominio FOS se amplificó a partir del gen de fusión ompA-FOS-hGH en el vector pKK223-3 (véase Ejemplo 5), usando el par cebador FOS-FOR3/FOS-REV2. El producto de PCR se digirió con EcoRI/HindIII y se ligó en los mismos sitios del vector pKK223-3 (Pharmacia) . Para la construcción del vector pAV5, la región codificante para la secuencia de señal hGH se amplificó a partir del gen de fusión hGH-FOS-hGH en el vector pSINrep5
(véase Ejemplo 7), usando el par cebador hGH-FORl/hGHREVl . El- producto de PCR se digirió con EcoRI/Notl y se ligó en los mismos sitios del vector pAVl. El cásete resultante que codifica a la secuencia de señal hGH y el dominio FOS entonces se aisló por digestión EcoRI/HindIII y se clonó en el vector pMPSVEH (Artelt et al . , Gene 58:213-219 (1988)) se digirió con las mismas enzimas. Para la construcción del vector pAV6, la región codificante FOS se amplificó a partir del vector pAV2 usando el par cebador FOS-FOR4/FOSREV3. El producto de PCR se digirió con HindIII y se clonó en el vector pAV5 escindido Eco47III/HindIII . El cásete completo que codifica a la secuencia de señal hGH y el dominio FOS entonces se reamplificaron a partir del vector resultante usando el par cebador hGH-FOR2/FOSREV3 , escindido con
EcoRI/HindIII y ligado en el vector pMPSVEH (Artelt et al . , Gene 68 : 213-219 (1988) escindido con las mismas enzimas .
Ejemplo 7 Construcción del FOS-hGH con la secuencia de señal (hGH) humana
Para la expresión eucariótica de la proteina de fusión FOS-hGH. El gen de fusión OmpA-FOS-hGH se aisló a partir de pBluescript :: OmpA-FOS-hGH (véase Ejemplo 4), por digestión con XbaI/Bpsl20I y se clonó en el vector pSINrep5 (Invitrogen) escindido con las mismas enzimas. La secuencia de señal hGH se sintetizó por PCR (mezcla de reacción: 50 pmol de cad acebador, dATP, dGTP, dTTP, dCTP,
(200 µM de cada uno), 2.5 U de polimerasa de ADN Taq
(Quiagen) , 50 µl del volumen total en el amortiguador suministrado por el fabricante; amplificación: 92 °C por 30 segundos, 55°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos, 30 ciclos) usando los oligonucleótidos traslapantes Sig-hGH- FOR.
(GGGTCTAGAATGGCTACAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCrr TTGGCCTGCTCTG) (SEC IDNO:41) Sig-hGH-REV (CGCAGGCCTCGGCACTGCCCTCTTGAAGCCAGGGCAGGCAGAGCA GGCCAAAAGCCAG)(SEC IDNO:42).
El producto de PCR se purificó usando el equipo QuiExII, se digirió con Stul/Xbal y se ligó en el vector pSINrep5: : OmpA-FAS-hGH escindido con las mismas enzimas.
Ejemplo 8 : Expresión Eucariótica de FOS-hGH
El vector libre de RNase (1.0 µg)
(pSINrep: : 50mpA-F S-hGH) y 1.0 µg de DHEB (Bredenbeek et al . , J. Vriol 57:6439-6446 (1993)), se linearizaron por la digestión de restricción Scal. Subsecuentemente, la transcripción in vi tro se llevó a cabo usando un equipo de transcripción in vi tro SP6 (InvitroscripCAP por
InvitroGen, Invitrogen BV. NV Leek, Holanda). El ARNm 5'-coronado resultante se analizó en reducción por gel de agarosa. 5 µg del ARNm transcrito, in vi tro, se electroporaron en células BHK 21 (ATCC:CCL10) de conformidad con el manual de Invitrogen (Sistema de
Expresión Sindbis, Invitrogen BV, Holanda) . Después De 10 horas de incubación a 37 °C, el medio que contiene FCS se intercambió por el medio HP-1 sin FCS, seguido por una incubación adicional a 37 °C por 10 horas. El sobrenadante se cosechó y analizó por el análisis del manchado dot para la producción de FOS-hgh. El medio de cultivo (2.5 µl) se manchó en una membrana de nitrocelulosa y se secó por 10 minutos a temperatura ambiente. La membrana se bloqueó con albúmina bovina al 1% (Sigma) en TBS (lOxTBS por litro: 87.7 g de NaCl, 66.1 g de clorhidrato de Trizma (Sigma) y 9.7 de base Trizma (Sigma), pH 7.4) por 1 hora a temperatura ambiente, seguida por una incubación con anticuerpo hGH anti-humano de conejo 2 µg (Sigma) en 10 ml de TBS-T (TBS con T een20 al 0.05%) por 1 hora. El manchado se lavó 3 veces por 10 minutos con TBS-T y se incubó por 1 hora con IgG anti-conejo de conjugado de fosfatasa alcalina (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.), diluido 1:5000 en TBS-T. Después de lavar 2 veces por 10 minutos con TBS-T y 2 veces por 10 minutos con TBS, el manchado se desarrolló por el teñido AP como se describe en el Ejemplo 2. los resultados se muestran en la Figura 3.
Ejemplo 9: Construcción de FOS-P A (N y C- terminal)
El siguiente gen se construyó por la síntesis de gen química que codifica para una variante catalíticamente inactiva (Foster et al., J. Allergy Clin. Immunol.
95:1229-1235 (1995)) de fosfolipasa A2 de veneno de abeja
(PLA) .
1/1 31/11 ATC ATC TAC CCA ßGT ACT CTß TGO TGT OOT C?C OGC AAC AAA TCT TCT GOT COO AAC OAA I X Y P G T L H C O H O -II K S S G P N E 61/21 91/31 CTC GGC CGC TTT ?AA CAC ACC G?C GCA TGC TOT CGC ACC CAO GAC ATG TGT CCß GAC GTC L. G R F K H T D A C C R T Q. D M C P D V 121/41 151/51 ATG TCT CCT GGT GAA TCT A?A C?C GGG TT? ?CT ??C ?CC GCT TCT CAC ACO CGT CTC AGC M S A G E S K H G T H T A S H T R i S 181/61 211/71 TGC GAC TOC G?C GAC A?? TTC T?C G?C TGC .CTT ??G AAC TCC GCC GAT ACC ATC TCT TCT C D C D D X F Y D C I. K N S A D T X S S 241/81 271/91 TAC TTC GTT GOT A?A ATO TAT TTC AAC CTG ATC GAT ACC AAA TOT TAC A?A CTO GAA CAC Y F V G X M Y F N I D T X C Y X I, E H 301/101 331/111 CCG GTA ACC OGC TGC GGC GAA COT ACC G?A OGT CGC TGC CTG CAC TAC ACC GTT GAC A?A P V T G C G E R T E G R C li H Y T V D K 361/121 391/131 TCT AAA CCG A?? GTT T?C CAO TGG TTC G?C CTG COC ??? T?C (SEC ID NOl43) K V Q W F D L R K Y (SEClDNO:44)
Para la fusión de PLÁ al N-término del dominio de dimerización FOS, la región se amplifica usando los oligonucleótidos PLA-FORl (CCATCATCTACCCAGGTAC) (SEQ ID NO:45) y PLA-REVl (CCCACACCCAGCGGCCGCGTATTTGCGCAGGTCG) (SEC ID NO: 46)
El producto de PCR se escindió con Notl y se ligó en el vector pAVl previamente escindido con las enzimas de restricción Stul/Notl. Para la fusión de PLA al C-término del dominio de dimerización FOS, la región se amplificó usando los oligonucleótidos PLA-FOR2.
(CGGTGGrrCTGCGGCCGCTATCATCTACCCAGGTAC)(SECIDNO-47) PLA-REV2 (TTAGTATTTGCGCAGGTCG) (SEC ID NO : 48
El producto de PCR se escindió con Notl y se ligó en el vector pAV2 previamente escindido con las enzimas de restricción Notl/EcoRV.
Ejemplo 10 Construcción del gen de fusión FOS-Ovalbrímina (N- y C- terminal)
Para la clonación de la secuencia codificante de ovalbúmina, el ARNm del tejido de oviducto de pollo se
preparó usando el Equipo de Purificación de ARNm Micro QuikPrep™ (Pharmacia), de conformidad con las instrucciones del fabricante. Usando el Equipo de PCR RT de una etapa SuperScript™ (Gibco BRL) , un ADNc que codifica a la parte madura de la ovalbúmina (correspondiente a los nucleótidos 68-1222 del ARNm (McReynolds et al, Na ture 272 : 123-128 (1978)), es sintetizada usando los cebadores Ova-FORl
(CCGGCTCCATCGGTGCAG) (SEC ID NO:49) (ACCACCAGAAGCGGCCGCAGGGGAAACACATCTGCC) (SEC ID NO:50).
El producto PCR se digirió con Notl y se clonó en el vector pAVl digerido Stul/Notl para la expresión de la protelna de fusión con el dominio de dimerización FOS al C-término. Para la producción de una proteina de fusión con el dominio de dimerización FOS al N-término, la región codificante de Ovalbúmina se amplificó a partir del vector construido (pAVl::Ova) usando los cebadores Ova-FOR2
(CGGTGGTTCTGCGGCCGCTGGCTCCATCGGTGCAG) (SEC IDNO:51) y Ova-REV2 (TGAAGGGGAAACACATCTGCC) (SEC ID NO:52).
El producto de PCR se digiró con Notl y se clonó en el vector pAV2 digerido con Notl/EcoRV. Los fragmentos
clonados se verificaron por el análisis de secuencia de AND.
Ejemplo 11 Producción y purificación de Proteínas de Fusión de ovalbúmina de FOS y FOS -PLA
Para la producción citoplásmica de las proteinas de fusión FOS, una cepa E. coli apropiada se transformó con los vectores pAV3 : : PLA, pAV4 : : PLA, Pav3::Ova u pAV4::OVa. El cultivo se incubó en un medio rico en la presencia de ampicilina a 37 °C con sacudimientos. A una densidad óptica (550 nm) de 1, 1 mM de IPTG se agregó y la incubación continuó por otras 5 horas. Las células se cosecharon por centrifugación, se resuspendieron en un amortiguador apropiado (por ejemplo, HCl-tris, pH 7.2, 150 nM NaCl) que contiene DNase, RNase y lisozima y se disolvieron por el paso a través de una célula de presión french . Después de la centrifugación (Sorvall RC-5C, rotor SS34, 15000 rpm, 10 minutos, 4°C), la pelotilla se resuspendió en 25 ml de amortiguador lavando el cuerpo de inclusión (20 mM de tris-HCl, 23% sucrosa, 0.5% Tritón X-' 100, 1 mM de EDTA, pH 8 ) a 4°C se centrifugo como se
describe anteriormente. Este procedimiento se repitió hasta que el sobrenadante después de la centrifugación fue esencialmente claro. Los cuerpos de inclusión se resuspendieron en 20 ml de amortiguador de solubilización (5.5 M de clorhidrato de guanidinio, 25 mM d'e tris-HCl, pH 7.5) a temperatura ambiente y el material insoluble se removió por centrifugación y el subsecuente paso del sobrenadante a través de un filtro estUéril (0.45 µm) . La solución de la proteina se mantuvo a 4°C por al menos, 10 horas en la presencia de 10 mM de EDTA y 100 mM de DTT y después se dializó tres veces contra 10 volúmenes de 5.5 M de clorhidrato de guanidinio. 25 mM de tris-HCl, 10 mM de EDTA, pH 6. La solución se dializó dos veces contra 5 litros de 2M de urea, 4 mM de EDTA, 0.1 M de NH4C1, 20 Mm de borato de sodio (pH 8.3) en la presencia de un arrastre redox (glutationa oxidada/glutationa reducida; cisteina/cisteina) . La proteina replegada se aplicó entonces a una cromatografía de intercambio iónico. La proteina se almacenó en un amortiguador apropiado con un pH arriba de 7 en la presencia de 2-10 mM de DTT para mantener los residuos de cisteina que flanquean al dominio FOS en una forma reducida. Previo al acoplamiento de la proteina con las particulas alfavirus, el DTT se
removió por el paso de la solución de la proteina a través de una columna de filtración en gel Sephadex G-25.
Ejemplo 12: Construcción de gpl40-FOS
El gen gpl40 (Swiss-Prot : P03375) sin el sitio de escisión de la proteasa interna, se amplificó por PCR a partir del plasmido original pAbT4574 (ATCC 40829) que contiene el gen de longitud completa gpl60, usando los siguientes oligonucleótidos:
HIV-1: 5'-ACTAGTCTAGAatgagagtgaaggagaaatatc-3' (SEC ID O:53); HIV- : 5'-TAGCATGCTAGCACCGAAtttatctaattccaataattcttg-3' (SEC ID NO:54); HlV-Cleav:
5'-gtagcacccaccaaggcaaagCTGAAAGCTACCCAGCTCGAGAAACTGgca-3' (SEC ID NO:55); y HTV-CIeav2: 5'-c aagct8tattc< actgcCAGTTTCTCGAGCTGGGTAGCTp ID NO:56).
Para PCR I, 100 pmol de oligo VIH-1 y VIH-Cleav2 y 5 ng del patrón de ADN, se usaron en 75 µl de la mezcla de reacción (4 unidades de polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de
dNTPs y 1.5 mM de MgS04 ) . El funcionamiento cíclico de PCR se hizo de la siguiente manera: 30 ciclos con una temperatura de annealin de 60 °C y un tiempo de elongación de 2 minutos a 72°C. Para PCR II, 100 pmol del oligo VIH-extremo y
VIH-Celav y 5 ng del patrón de ADN, se usaron en 75 µl de la mezcla de reacción, (4 unidades de la polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgS04). El funcionamiento cíclico del PCR se hizo de la siguiente manera: 30 ciclos con una temperatura de ablandamiento de 60 °C y un tiempo de elongación de 50 segundos a 72°C. Ambos fragmentos de PCR se purificaron, aislaron y se usaron en una reacción de PCR de ensamble. Para la reacción de PCR de ensamble, 100 pmol de oligo VIH-1 y VIH-final y 2ng de cada fragmento de PCR (PCRl y PCRII) se usaron en los 75 µl (4 unidades de polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgS04). El funcionamiento cíclico se hizo de la siguiente manera: 30 ciclos con una temperatura ablandamiento de 60 °C y un tiempo de elongación de 2.5 minutos a 72°C. El producto de PCR de ensamble se digirió con Xbal y Nhel. La hélice anfifática FOS se fusionó en estructura al extremo C-terminal de gp-140.
La secuencia de ADN codificante para el dominio de hélice anfifática FOS, se amplificó por PCR a partir del vector pJuFo (Crameri & Suter Gene 137 : 69 (1993)) usando los oligonucleótidos: FOS-VIH: 5'-ttcggtgctagcggtggcTGCGGTGGTCTGACCGAC-3' (SEC ID NO:57);
FOS-Apa: 5' -gatgctgggcccttaaccGCAACCACCGTGTGCCGCC-3' (SEC ID
NO: 58) .
Para la reacción de PCR, 100 pmol de cada oligo y 5 ng del patrón de ADN, se usaron en 75 µl de la mezcla de reacción (4 unidades de la polimerasa Taq o Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 1.5 mM de MgS04). El funcionamiento cíclico de la temperatura se hizo como sigue: 95°C por 2 minutos, seguido por 5 ciclos de 95°C (45 segundos), 60°C (30 segundos), 72°C (25 segundos) y seguido por 25 ciclos de 95°C (45 segundos), 68°C (30 segundos), 72°C (20 segundos) . El fragmento de PCR obtenido se digirió con Nhel y Bspl20L. El vector de expresión final para GP140-FOS se obtuvo en una ligación del fragmento 3 de ambos fragmentos
de PCR en pSinRep5. El vector resultante pSinRep5-GP140-FOS se evaluó por el análisis de restricción y el secuenciamiento de ADN. El GP140-FOS también se clonó en el pCYTts via Xbal y Bspl20L para obtener una linea celular que expresa GP140-FOS inducible, estable.
Ejemplo 13 : Expresión de GP140FOS usando pSinRep5-GP140FOS
El vector libre de Rnase (1.0 µg) (pSinRep5-GP140FOS) y 1.0 µg de DHEB (Bredenbeek et al . , J. Vriol 57:6439-6446 (1993)), se linearizaron por la digestión de restricción. Subsecuentemente, la transcripción in vi tro se llevó a cabo usando un equipo de transcripción in vi tro SP6 (InvitroscripCAP por InvitroGen, Invitrogen BV. NV Leek, Holanda). El ARNm 5' -coronado resultante se analizó en reducción por gel de agarosa. El ARNm transcrito in vi tro (5 µg) , se electroporó en células BHK 21 (ATCC:CCL10) de conformidad con el manual de Invitrogen (Sistema de Expresión Sindbis, Invitrogen BV, Holanda) . Después De 10 horas de incubación a 37 °C, el medio que contiene FCS se intercambió por el
medio HP-1 sin FCS, seguido por una incubación adicional a 37 °C por 10 horas. El sobrenadante se cosechó y analizó por el análisis del manchado Western para la producción de GP140-FOS soluble, exactamente como se describe en el Ejemplo 2.
Ejemplo 14 : Expresión de GP140FOS usando pCYTs-GP140FOS
20 µg de pCYT-GP140-FOS, se linearizaron por la digestión de restricción. La reacción se detuvo por la extracción de fenol / cloroformo, seguida por una precipitación isopropanilo del ADN linearizado. La digestión de restricción se evaluó por la electroforesis en gel de agarosa. Para la transfección, 5.4 µg del pCYTtsGP140-FOS linearizado, se mezclaron con 0.6 µg de pSV2Neo linearizado en 30 µl de H20 y se agregaron 30 µl de una solución de 1 M de CaC12. Después de la adición de 60 µl de amortiguador de fosfato (50 mM de HEPES, 280 mM de NaCl, 1.5 mM de Na2 HP04, pH 7.05), la solución se sometió a vórtices por 5 segundos, seguida por una
incubación a temperatura ambiente por 25 segundos. La solución inmediatamente se agregó a 2 ml del medio HP-1 que contiene FCS al 2% (placa de 6 pozos), entonces se reemplazó por el medio que contiene el ADN Después de una incubación por 5 horas a 37 °C en un incubador de C02, el medio que contiene el ADN se removió y se reemplazó pro 2 ml de glicerol a 15% en un medio FCS al 2%. El medio que contiene el glicerol se removió después de una fase de incubación de 30 segundos y las células se lavaron por el enjuague con 5 ml de un medio de HP-1 que contiene FCS al 10%. Finalmente, se agregaron 2 ml del medio HP-1 que contiene FCS al 10%. Las células establemente transfectadas se seleccionaron y se hicieron crecer en un medio de selección (medio HP-1 suplementado con G418) a 37°C en un incubador de C02. Cuando la población mezclada se hizo crecer a confluencia, el cultivo se dividió en dos discos, seguidos por un periodo de 12 horas de crecimiento a 37°C. Un disco de las células se cambio a 30°C para inducir la expresión de GP140-FOS sol uble . El otro disco se mantuvo a 37°C. La expresión del GP140-FOS se determinó por el análisis del manchado Western. El medio de cultivo (0.5
ml) fue metanol/cloroformo precipitado, y la pelotilla se resuspendió en un amortiguador de muestra SDS-PAGE. Las muestras se calentaron por 5 minutos a 95°C antes de ser aplicadas a gel de acrilamida al 15%. Después del SDS-PAGE, las proteinas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa de Profano (Schleicher & Schuell, Alemania) como se describe por Bass y Yang, en Creighton, T. E., ed., Protein Function : A Practical Approach , 2da . Edición . , IRL Press, Oxford (1997), pp- 29-55. La membrana se bloqueó con albúmina bovina al 1% (Sigma) en TBS (10 x TBS por litro: 87.7 g NaCl, 66.1 g de clorhidrato de Trizma (Sigma) y 9.7 g de base Trizma (Sigma), pH 7.4) por 1 hora a temperatura ambiente, seguido por una incubación con un anticuerpo GP-160 o anti-GP140 por 1 hora. El manchado se lavó tres veces por 10 minutos con TBS-T (TBS con Tween 20 al. 0.05%), y se incubó por 1 hora con un conjugado IgG anti-ratón/conej o/mono/humano de fosfatasa alcalina. Después de lavar 2 veces por 10 minutos con TBS-T y 2 veces por 10 minutos con TBS, el desarrollo de la reacción se llevó a cabo usando reactivos de detección de fosfatasa alcalina (10 ml de amortiguador AP (100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) con 50 µl de una solución de NBT (Tetrazolio Nitro Blue al 7.7% (Sigma) en
dimetilformamida al 70%) , y 37 µl de una solución de X-fosfato (5% de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo en dimetilformamida) .
Ejemplo 15: Producción y Purificación de GP140FOS
Un anticuerpo anti-gp 120 se acopló covalentemente a un NHS/EDC activado por dextrano y empaquetado en una columna de cromatografía. El sobrenadante que contiene GP140FOS se cargó en la columna y después se lavó suficiente, el GP140FOS se eluyó con 0.1 M de HCl. El eluato se neutralizó directamente durante la colección usando 1M de Tris a pH 7.2 en los tubos de colección. La formación del enlace disulfuro podria ocurrir durante la purificación, por lo tanto, la muestra colectada es tratada con 10 mM de DTT, en 10 mM de Tris a pH 7.5 por 2 horas a 25°C. El DTT se removió por la diálisis subsecuente contra 10 Mm de Ms : 80 mM de NaCl pH 6.0. Finalmente, el GP140FOS se mezcló con particulas alfavirus que contienen el cierre de leucina JUN en E2 como se describe en el
Ejemplo 16,
Ejemplo 16: Preparación de las Partículas de AlfaVaccina
Las particulas virales (véase Ejemplos 2 y 3), se concentraron usando Dispositivos de Filtros Centrífugos Ultralibres Miliporo con un peso molecular critico de 100 kD de conformidad con el protocolo suministrado por el fabricante. Alternativamente, las particulas virales se concentraron por centrifugación de gradiente sucrosa como se describe en el manual de instrucción del Sistema de Expresión Sinbdis (Invitrogen, San Diego, California) . El pH de la suspensión del virus se ajustó a 7.5 y las particulas virales se incubaron en la presencia de 22-10 mM de DTT por varias horas. Las particulas virales se purificaron a partir de la proteina contaminante en una columna Sephacryl S-300 (Pharmacia) (particulas virales eluidas con el volumen vacio) en un amortiguador apropiado. Las particulas del virus purificadas se incubaron con al menos 240 partes de exceso molar de la proteina de fusión del antigeno FOS, en un amortiguador apropiado (pH
7.5-8.5) en la presencia de un arrastre de reducción (glutationa oxidada/glutationa reducida; cisteina/cisteina) por al menos, 10 horas a 4°C. Después de la concentración de las particulas usando un Dispositivo de Filtro Centrifugo Ultralibre Milipro, ocn un peso molecular critico de 100 kD, la mezcla se pasó a través de una columna de filtración de gel Sephacryl S-300 (Pharmacia) . Las particulas virales se eluyeron con el volumen vacio.
Ejemplo 17 Fusión del hélice anfif ático JUN al término amino de HBcAg (1-144) .
La hélice JUN se fusionó al término amino de la secuencia de aminoácidos HBcAg 1 a 144 (constructo JUN-HBcAg) . Para la construcción de la secuencia de ADN JUN-HBcAg, las secuencias que codifican a la hélice JUN y HBcAg (1-144) se amplificaron separadamente por PCR. La secuencia JUN se amplificó a partir del plasmido pJuFo usando cebadores EcoRI-JUN(s) y JUN-SacII (as) . El cebador EcoRI-JUN(s) introduce un sitio EcoRI por un codón ATG de inicio. El cebador JUN-SacII (as) introduce un enlazador
que codifica a la secuencia de aminoácido GAAGS . La secuencia HBcAg (1-144) se amplificó a partir del plasmido pEco63 (obtenido de ATCC No. 31518), usando cebadores JUN-HBcAg(s) y HBcAg (1-144) Hind(as). El JUN-HBcAg(s) contiene una secuencia correspondiente al extremo 3' de la secuencia codificante a la hélice JUN seguida por una secuencia que codifica al enlazador GAAGS, y al extremo 5' de la secuencia HBcAg. El HBcAg (1-144 ) Hind (as) , introduce un codón de detención y un sitio HindIII después del codón 14 del gen HBcAg. Para las reacciones de PCR, 100 pmol de cada oligo y 50 ng del patrón ADNs, se usaron en las mezclas de reacción 50 µl con 2 unidades de polimerasas Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 Mm de MgS04. Para ambas reacciones, el funcionamiento cíclico de la temperatura se llevó a cabo como sigue: 94°C por 2 minutos; y 30 ciclos de 94°C (1 minuto), 50°C (1 minuto), 72°C (2 minutos).
Secuencias cebadoras .
EcoRI-JUN(s): (5'-CCGGAATTCATGTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3') (SEC ID NO:61);
JUN-SacU(as): (5'-GTCGCTACCCGCGGCTCCGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3')(SEC ID NO:62);
JUN-HBcAg(s): (5 -GrrGGTTGCGGAGCCGCGGGTAGCGACATTGACCCTTATAAAGAATITGG-3') (SEC ID NO:63); HBcAg(l-l44)Hind(as): (5'-CGCGTCCCAAGCTTCTACGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3') (SEC ID NO:64).
La fusión de los dos fragmentos de PCR se realizó por PCR usando cebadores EcoRI-JUN(s) y HBcAg (1- 144) Hind(as) . 100 pmol de cada oligo se usó con 100 ng de los fragmentos de PCR purificados en una mezcla de
reacción de 50 µl que contiene 2 unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgS04. Las condiciones del funcionamiento cíclico de PCR fueron: 94 °C por 2 minutos, y 35 ciclos de 94°C (1 minuto), 50°C (1 minuto), 72°C (2 minutos) . El producto de PCR final se analizó por electroforesis en gel de agarosa, se purificó y se digirió por 16 horas en un amortiguador apropiado con las
enzimas de restricción EcoRI y HindIII. El fragmento de ADN digerido se ligó en el vector pKK digerido con EcoRI/HindIII, para generar el vector de expresión pKK- JUN-HBcAg. La inserción del producto de PCR se analizó por el análisis de restricción de EcoRI/HindIII y por el secuenciamiento de ADN del inserto.
Ejemplo 18 Fusión de la hélice anfifática JUN al término carboxi de HBcAg (l-144) La hélice JUN se fusionó al término carboxi de la secuencia de aminoácido HBcAG 1 a 144 (constructo HbcA- ' JUN) . Para la construcción de la secuencia de ADN de
HBcAG-JUN, las secuencias que codifican la hélice JUN y HBcAG (1-1449 se amplificaron separadamente por PCR. La secuencia JUN se. amplificó a partir del plasmido pJuFo con los cebadores SacII-JUN(s) y JUN-HindIII (as9. El SacII- JUN(c) introduce un enlazador que codifica a los aminoácidos LAAG. Esta secuencia también contiene un sitio Sacll. El JUN-HindIII (as) introduce un codón de detención (TAA) seguido por un sitio HindIII. La secuencia de ADN HBcAg (1-144) se amplificó a partir del plasmido pEco63 usando cebadores EcoRI-HBcAg (s) y HBcAg (1-144) -JUN (as) . El
EcoRI-HBcAg (s) introduce un sitio EcoRI antes del inicio del ATG de la secuencia codificante HBcAg. El HBcAg (1-144) -JUN (as) introduce una secuencia codificante al enlazador péptido (LAAG) , el cual también contiene un sifio Sacll. Para las reacciones de PCR, 100 pmol de cada oligo y 50 ng del patrón de ADN, se usaron en 50 µl de las mezclas de reacción con 2 unidades de la polimerasa Pwo, 0.1 de mM de dNTPs y 2 mM de MgS04. El funcionamiento cíclico se llevó a cabo como sigue: 94 °C por 2 minutos, y 30 ciclos de 94°C (1 minuto), 50°C (1 minuto), 72°C (2 minutos) .
Secuencias cebadoras Sacü-JUN(s): (5'-CTAGCCGCGGGTTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3') (SEC ID NO:65)
JUN-HindIII(as): (5'-CGCGTCCCAACKrrrTTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC -3') (SEC ID NO.-66);
EcoRI-HBcAg(s): (5'-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3') (SEC ID NO:67); y HBcAg-JUN(as): (5 '-CCGACCACCGCAACCCGCGGCTAOCGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3 ') (SEC ÍD NO.-68).
La fusión de los dos fragmentos de PCR se realizó por PCR usando cebadores EcoRI/HBcAg (s) y JUN-HindIII (as) . Para la fusión de PCR, 100 pmol de cada oligo se usó con 100 ng de los fragmentos de PCR purificados en 50 µl de una mezcla de reacción que contiene 2 unidades polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgS04. Las condiciones del funcionamiento cíclico de PCR fueron: 94°C por 2 minutois; y 35 ciclos de 94°C (1 minuto), 50°C (1 minto) , 72°C (2 minutos) . El producto de PCR final se analizó por electroforesis en gel de agarosa y se digirió por 16 horas en un amortiguador apropiado con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII. El fragmento de ADN se purificó en gel y se ligó en el vector pKK digerido con EcoRI/HindIII para generar el vector de expresión pKK-HBcAg-JUN. La inserción del producto PCR se analizó por el análisis de restricción EcoRI/HindIII y por el secuenciamiento de ADN del inserto.
Ejemplo 19 Inserción de la hélice anfifática JUN en el epitope c/el de HBcAg (1-144)
El epitope c/el (residuos 72 a 88) de HBcAg se
sabe, está localizado en la región delantera de la superficie del cápsido del virus de la Hepatitis B. Una parte de esta región (residuos 76 a 82) de la proteina se reemplazó genéticamente por el hélice HUN para proporcionar un sitio de unión para los antigenos
(constructo HBcAg-JUNIns) . La secuencia de ADN de HBcAg- JUNIns se generó por PCRs: la secuencia de hélice JUN y las dos secuencias que codifican a los fragmentos HBcAG
(residuos de aminoácidos 1 a 75 y 83 a 144) se amplificaron separadamente por PCR. La secuencia JUN se amplificó a partir del plasmido pJuFo con cebadores BamHI-JUN(s) y JUN-SacII (as) . El BamHI-JUN(s) introduce una secuencia enlazadora que codifica a la secuencia peptidica GSGGG que también contiene un sitio BamHI . El JUN-SacII (as) introduce una secuencia que codifica al enlazador peptidico GAAGS seguida por una secuencia complementaria al extremo 3' de la secuencia codificante JUN. La secuencia de ADN de HBcAg (1-75) se amplificó a partir del plasmido pEco63 usando cebadores EcoRIHBcAg (s) y HBcAg75-JUN (as) . El EcoRIHBcAg (s) introduce un sitio EcoRI seguido por una secuencia correspondiente al extremo 5' de la secuencia HBcAg. El HBcAg75-JUN (as) introduce un enlazador que codifica al péptido GGSGGG después del
aminoácido 75 del HBcAg, seguido por una secuencia complementaria al extremo 5' de la secuencia que codifica al hélice JUN. El fragmento HBcAg (83-155) ,m se amplificó usando cebadores JUN-HBcAg83 (s) y HBcÁg (1-144 ) Hind (as) . El JUN-HBcAg83 (s) contiene una secuencia correspondiente al extremo 3' de la secuencia codificante JUN seguida por un enlazador que codifica al péptido, GAAGS y una secuencia correspondiente al extremo 5' de la secuencia que codifica a HBcAg(83-144) . El HBcAg ( 1-144 ) Hind (as ) introduce un codon de detención y un sitio HindIII después del codon 144 del gen HBcAg. Para las reacciones de PCR, 100 pmol de cada oligo y 50 nt del patrón de ADNs se usaron en 50 µl de las mezclas de reacción (2 unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgS04). "El funcionamiento cíclico de la temperatura se realizó como sigue: 94°C por 2 minutos, y 35 ciclos de 94°C (1 minuto), 50°C (1 minuto), 72°C (2 minutos).
Secuencias Cebadoras :
BamHI-JUN(s): (5'-CTAA GGATCCGGTGGGGGCTGCGGTGGTCGGATCGCCCGGCTCGAG-3') CSEC IDNO:69);
(5'-GTCGCTACCCGCGGCTCCGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3 ') (SEC ID NO:70);
EcoRIHBcAg(s): (5'- CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3') (SEC ID NO:7I);
HBcAg75-JUN (as): (5'-CCGACCACCGCAGCCCCCACCGGATCCATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3') (SEC ID NO:72);
JUN-HBcAg83(s): (5'-GTTGGTTGCGGAGCCGCGGsTAGCGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3') (SEC IDNO.-73);
H3cAg(l-144)Hind(as): (5'-CGCGTCCCAAGCTTCTACGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3') (SEC ID NO:74).
La fusión de tres fragmentos de PCR se realizó como sigue. Primero, el fragmento que codifica al HBcAg 1- 75 se fusionó con la secuencia codificante JUN por PCR
usando cebadores EcoRIHBcAg (s) y JUN-SacII (as) . Segundo, el producto obtenido se fusionó con el fragmento HBcAg (83-144) por PCR usando cebadores EcORI HBcAg (s) y HBcAg Hind?II(as) . Para las fusiones de PCR, 100 pmol de cada oligo se usó con 100 ng de los fragmentos de PCR purificados en 50 µl de mezcla de reacción que contiene 2 unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 Mm de MgS04. Los mismos ciclos de PCR s usaron para la generación de los fragmentos individuales. El producto PCR final se digirió por 16 horas en un amortiguador apropiado con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII. El fragmento de ADN se ligó en el vector pKK digerido con EcoRI/HindIII, proporcionando el vector pKK-HBcAg-JUNIs . La inserción del producto por PCR se analizó por el análisis de restricción EcoRI/HindIII y por el secuenciamiento -de AND del inserto.
Ejemplo 20 Fusión de la hélice anfifática JUN al término carboxi de la proteína nucleosápsida (N) del virus del sarampión
La hélice JUN se fusionó al término carboxi del fragmento de la proteina N del virus del sarampión
truncado que comprende los residuos de aminoácidos 1 a 473 (constructo N473-JUN) . Para la construcción de la secuencia de ADN que codifica al N473-JUN, la secuencia que codifica a la hélice JUN y la secuencia que codifica al N473-JUN, se amplificó separadamente por PCR. La secuencia JUN se amplificó a partir del plasmido pJuFo con cebadores SacII-JUN(s) y JUN-HindIII (as) . El SacII-JUN(s) introduce una secuencia que codifica al enlazador peptidico LAAG. Esta secuencia también contiene un sitio Sacll. El cebador anti-sentido JÜN-HindIII (as) introduce un codon de detención (TAA) seguido por un sitio HindIII. La secuencia N (1-473) se amplificó a partir del plasmido pSC-N que contiene la proteina N del virus del sarampión completo codificando la secuencia (obtenida de M. Billeter, Zurcí) , usando cebadores EcoRI-Nmea (s) y Nmea-JUN(as). EcoRI-N(mea) (s) introduce un sitio EcoRI antes del inicio de ATG de la secuencia codificante N. El N (mea) -Jun (as) fue complementario al extremo 3' de la secuencia codificante N (1-473) seguida por una secuencia complementaria a la secuencia codificante para el enlazador peptidico (LAAG) . Para las reacciones de PCR, 100 pmol de cada oligo y 50 ng del patrón de ADNs se usaron en 50 µl de las mezclas de reacción con 2 unidades
de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgS04. El funcionamiento cíclico de la temperatura se realizó como sigue: 94°C por 2 minutos; y 35 ciclos por 94°C (1 minuto), 55°C (1 minuto), 72°C (2 minutos).
Secuencias cebadoras :
SacII-JUN(s): (5'-CTAGCCGCGGGTTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3') (SEC ID NO:75);
JUN-Hind?II(as): (5'-CGCGTCCCAAGCTTTTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC -3') (SEC ID NO:76);
EcoRI-Nmea(s): (5 '-CCGGAATTC?TGGCCACACTTTTAAGGAGC-3 *) (SEQ ID NO:77); y
Nmea-JUN(as): (5'-CGCGTCCCAAGCTTrTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3')(SECID KO:78).
La fusión de los dos fragmentos de PCR se realizó en un PCR adicional, usando cebadores EcoRI-Nmea (s) Nmea- JUN(as). Para la fusión de PCR, 100 pmol de cada oligo se usaron con 100 ng de los fragmentos de PCR purificados en
50 µl de una mezcla de reacción que contiene 2 unidades de
polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgS04. El funcionamiento cíclico de la temperatura se realizó como sigue: 94°C por 2 minutos; y 35 ciclos de 94°C (1 minuto), 50°C (1 minuto), 72°C (2 minutos). El producto de PCR se digirió por 16 horas en un amortiguador apropiado con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII. El fragmento de ADN se purificó en gel y se ligó en el vector pKK digerido con EcoRI/HindIII, proporcionando el plasmido pKK-N473-JUN. La inserción del producto de PCR se analizó por en análisis de restricción EcoRI/HindIII y por el secuenciamiento de ADN del inserto.
EJEMPLO 21 Expresión y Purificación parcial de HBCaG-JUN
Cepa XL-1 blue de E . coli , se transformó con pKK-HBcAg-JUN, 1 ml de un cultivo de bacteria durante la noche se usó para inocular 100 ml de medio LB que contiene 100 µg de ampicilina. Este cultivo se hizo crecer por 4 horas a 37°C, hasta que se alcanzó un OD a 600 nm de aproximadamente 0.8. La inducción de la síntesis de HBcAg-JUN se realizó por la adición de IPTG a una concentración
final de 1 mM. Después de la inducción, la bacteria además se sacudió a 37°C por 16 horas. La bacteria se cosechó por centrifugación a 5000 x g por 15 minutos. La pelotilla se congeló a -20°C. La pelotilla se cebó y resuspendió en al amortiguador de lisis de bacteria (10 mM de Na2HP04, pH 7.0, 30 mM de NaCl, 0.25% de Tween20, 10 mM de EDTA, 10 mM de DTT) , suplementado con 200 µg/ml de lisosima y 10 µl de Benzonase (Merck) . Las células se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente y se disolvieron usando una célula de presión French. Se agregó Tritón X-100 al lisado a una concentración final de 0.2%, y el lisado se incubó por 30 minutos en hielo y se sacudió ocasionalmente. La Figura 4 muestra la expresión de la proteina HBcAg en E . coli , después de la inducción con IPTG. Las células E . coli que albergan el plasmido de expresión pKK-HBcAg-JUN o un plasmido de control, se usaron para la inducción de la expresión HBcAg-JUN con IPTG. Antes de la adición de IPTG, se removió una muestra a partir del cultivo de bacteria que lleva el plasmido pKK-HBcAg-JUN (linea 3) y de un cultivo que lleva el plasmido de control (linea 1) . Siete horas después de la adición de IPTG, las muestras nuevamente se removieron del cultivo que contiene pKK-HBcAg-JUN (linea 4) y del cultivo de control (linea 2) . La
expresión de la proteina se monitoreo por SDS-PAGE seguida por el teñido Coomassie. El lisado se centrifugo por 30 minutos a 12,000 x g para remover los desechos celulares insolubles. El sobrenadante y la pelotilla se analizaron por el manchado Western usando un anticuerpo monoclonal contra HBcAg (YVS1841, adquirido de Achúrate Chemical and Scientific Corp., ' Westbury, NY USA), que indica que una cantidad significantes de HBcAg-JUN fue insoluble (Fig. 5) . Brevemente, los Usados de las células E. coli que expresan HBcAg-JUN y de las células de control, se centrifugaron a 14,000 x g por 30 minutos. El sobrenadantes (=fracción soluble) y pelotilla (= fracción insoluble) , se separaron y diluyeron con el amortiguador de muestra SDS a volúmenes iguales. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE seguido por el manchado Western con anticuerpo monoclonal anti-HBcAg YVS 1841. Linea 1: células de control de la fracción soluble; linea 2 : células de control de la fracción insoluble; linea 3: fracción soluble, células que expresan HBcAg-JUN; linea 4: celas de la fracción insoluble que expresan HBcAG-JUN- El lisado celular aclarado se usó para la etapa de centrifugación de gradiente usando un gradiente de
etapa de sucrosa que consiste de una solución de sucrosa al 65% sobrecargada con una solución de sucrosa al 15%, seguida por 4 ml de lisado bacteriano. La muestra se centrifugo por 3 horas con 100,000 x g a 4°C. Después de la centrifugación, fracciones de 1 ml de la parte superior de gradiente, se colectaron y analizaron por SDS-PAGE, seguidas por el manchado Cooomassie (Figura 6) . Linea 1: lisado de E . coli total antes de la centrifugación. Linea 1 y 2: fracciones de 1 y 2 a partir de la parte superior del gradiente. Linea 4 a 7: fracciones 5 a 8 (sucrosa al 15%) . La proteina HBcAg-JUN se detectó por el teñido Coomassie . La proteina HBcAG se enriqueció a la interface entre 15 y 65% de sucrosa, indicando que se ha formado una particula cápsida. La mayoría de las proteinas bacterianas permanecían en • la capa superior libre de sucrosa del gradiente, por lo tanto, la etapa de centrifugación del gradiente de las particulas HBcAg-JUN, condujo a tanto el enriquecimiento como a una purificación parcial de las particulas.
Ejemplo 22 Acoplamiento Covalente de hGH-FOS a ?BcAG-JUN
Para demostrar el enlace de una proteina a las particulas HBcAg-JUN, seleccionamos una hormona de crecimiento humana (hGH) fusionada con su término carboxi a la hélice FOS como una proteina modelo (hGH-FOS) . Las particulas HBcAG-JUN se mezclaron con hGH-FOS parcialmente purificado y se incubaron por 4 horas a 4°C, para permitir el enlace de las proteinas. La mezcla entonces se dializó durante la noche contra un volumen de 3000 partes de amortiguador diálisis (150 mM de NaCl, 10 mMm de solución de Tris-HCl, pH 8.0), para remover el DTT presente en tanto la solución de HBcAg-JUN como la solución hGH-FOS y con ello, permitir el acoplamiento covalente de las proteinas a través del establecimiento de los enlaces disulfuro. Como controles, las soluciones de HBcAg-JUN y hGH-Fos, se dializaron entonces también contra el amortiguador de diálisis. Las muestras de tres soluciones de proteínas dializadas, se analizaron por SDS-PAGE bajo condiciones no de reducción. El acoplamiento de hGH-FOS a HBcAg-JUN se detectó en un inmunomanchado anti-hGH (Fig. 7) . El enlace de hGH-FOS enlazado a HBcAG-JUN deberá
migrar con una masa molecular aparente de aproximadamente 53 kDa, mientras el hGH-FOS no enlazado migran con una "masa molecular aparente de 31 kDa. El dializado se analizó por SDS-PAGE en la ausencia de un agente de reducción (linea 3) y e la presencia de agente de reducción (linea 2) y detectado por el teñido Coomassie. Como un control, el hGH-FOS que no se ha mezclado con las particulas cápsidas también se cargó en el gen en la presencia de un agente de reducción (linea 1) . Un cambio del hGH-FOS a una masa molecular de aproximadamente 53 kDa se observó en la presencia de una proteina capsida HBcAg-JUN, sugirió que la eficiencia del enlace de hGH-FOS a HBcAg-JUN ha tomado lugar.
Ejemplo 23 Inserción de un péptido que contiene un residuo de Lisina en el epitope c/el de HBcAg (1-149)
El epitope c/el (residuos 72 a 88) del HBcAG se localiza en la región superior de la superficie del cépsido del virus de la hepatitis B (HBcAG) . Una parte de esta región (Prolina 79 y Alanina 80) se reemplazó
genéticamente por el péptido Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (constructo HBcAg-Lys) . El residuo de lisina introducido contiene un grupo amino reactivo en la cadena lateral que puede ser usada para al reticulación química intermolecular de particulas HBcAg con cualquier antigeno que contiene un grupo de Cisteina libre. La secuencia de ADN de HBcAg-Lys se generó por PCRs: Los dos fragmentos que codifican a los fragmentos HBcAg (residuos de aminoácidos 1 a 78 y 81 a 149) se amplificaron separadamente por PCR. Los cebadores usados para estos PCRs también introducen una secuencia de AND que codifica al péptido Gly-Gly-Lys-GLy-GLy . EL fragmento de HBcAG (1 a 78) se amplificó a partir de Eco63 usando cebadores EcoRIHbcAg (s) y Lys-HBcAg (as) . El fragmentos de HBcAg (81 a 149) se amplificó a partir de pEco63 usando cebadores Lys-HBcAg(s) y HBcAg (1-149) Hind (as) . Los cebadores Lys-HBcAg (as) y Lys-HBcAg(s) introducen secuencias de ADN complementarias a los extremos de los dos productos de PCR permitiendo la fusión de los dos productos de PCR en un PCR de ensamble subsecuente. Los fragmentos ensamblados se amplificaron por PCR usando cebadores EcoRIHBcAg (s) y HbcAg (1-149) Hind (as ) . Para el PCRs, 100 pmol de cada oligo y 50 ng del
patrón de ADNs se usaron en 50 µl de mezclas de reacción con 2 unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgS04. Para ambas reacciones, el funcionamiento cíclico de la temperatura se llevó a cabo como sigue: 94 °C por 2 minutos; 30 ciclos ciclos de 94°C (1 minuto), 50°C (1 minuto), 72°C (2 minutos).
Secuencias cebadoras :
EcoRIHBcAg(s): (5'-CCGGAATTC TGGACATTGACCCTTATAAAG-3,) (SEC ID NO:79);
Lys-HBcAg(as): (5--CC AGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAG GTAGC-3') (SEC ID NO:80);
Lys-HBcAg(s): (S'-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTAT GTC -3') (SEC ID NO:81);
HBcAg(l-149)Hind(as): (S'-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-S') (SEC ID NO:82).
Para la fusión de los dos fragmentos de PCR por PCR, 100 pmol de los cebadores EcoRIHBcAg (s) y HBcAg (1-149) Hind (as) , se usaron con 100 ng de los dos fragmentos de PCR purificados en 50 µl una mezcla de reacción que contiene dos unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgS04. Las condiciones de funcionamiento cíclico de PCR fueron: 94°C por 2 minutos; 30 ciclos por 94°C (1 minuto), 50°C 81 minto) , 72°C (2 minutos). El producto PCR ensamblado se analizó por electroforesis en gel de agarosa, se purificó y digirió por 19 horas en un amortiguador apropiado con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII. El fragmento de ADN digerido se ligó en el vector pKK digerido con EcoRI/HindIII para generar el vector de expresión pKK-HBcAg-Lys . La inserción del producto PCR en el vector se analizó por el análisis de restricción EcoRI/HindIII y el secuenciamiento de ADN del inserto .
Ejemplo 24 Expresión y purificación parcial de HBcAG-Lys
Cepas XL-1 blue de E. coli, se transformaron con pKK-HBcAg-Lys . 1 ml de un cultivo de bacteria durante la
noche se usó para inocular 100 ml de medio LB que contiene 100 µg de ampicilina. Este cultivo se hizo crecer por 4 horas a 37 °C, hasta que se alcanzó un OD a 600 nm de aproximadamente 0.8. La inducción de la síntesis de HBcAg-Lys se realizó por la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM. Después de la inducción, la bacteria además se sacudió a 37°C por 16 horas. La bacteria se cosechó por centrifugación a 5000 x g por 15 minutos. La pelotilla se congeló a -20°C. La pelotilla se cebó y resuspendió en al amortiguador de lisis de bacteria (10 mM de Na2HP04, pH 7.0, 30 mM de NaCl, 0.25% de Tween20, 10 mM de EDTA, 10 mM de DTT) , suplementado con 200 µg/ml de lisosima y 10 µl de Benzonase (Merck) . Las células se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente y se disolvieron usando una célula de presión French. Se agregó Tritón X-100 al lisado a una concentración final de 0.2%, y el lisado se incubó por 30 minutos en hielo y se sacudió ocasionalmente. Las células E. coli que albergan el plasmido de expresión pKK-HBcAg-Lys o un plasmido de control, se usaron para la inducción de la expresión HBcAg-Lys con IPTG. Antes de la adición de IPTG, se removió una muestra a partir del cultivo de bacteria que lleva el plasmido pKK-HBcAg-Lys y de un cultivo que lleva el plasmido de control. Siete horas
después de la adición de IPTG, las muestras nuevamente se removieron del cultivo que contiene pKK-HBcAg-Lys y del cultivo de control. La expresión de la proteina se monitoreo por SDS-PAGE seguida por el teñido Coomassie. El lisado se centrifugo por 30 minutos a 12,000 x g para remover los desechos celulares insolubles. El sobrenadante y la pelotilla se analizaron por el manchado Western usando un anticuerpo monoclonal contra HBcAg (YVS1841, adquirido de Achúrate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY USA), que indica que una cantidad significantes de HBcAg-Lys fue insoluble. Brevemente, los Usados de las células E . coli que expresan HBcAg-Lys y de las células de control, se centrifugaron a 14,000 x g por 30 minutos. El sobrenadantes (=fracción soluble) y pelotilla (= fracción insoluble) , se separaron y diluyeron con el amortiguador de muestra SDS a volúmenes iguales. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE seguidas por el manchado Western con anticuerpo monoclonal anti-HBcAg YVS 1841. El lisado celular aclarado se usó para la etapa de centrifugación de gradiente usando un gradiente de etapa de sucrosa que consiste de 4 ml de una solución de sucrosa al 65% sobrecargada con una solución de sucrosa al
15%, seguida por 4 ml de lisado bacteriano. La muestra se centrifugo por 3 horas con 100,000 x g a 4°C. Después de la centrifugación, fracciones de 1 ml de la parte superior de gradiente, se colectaron y analizaron por SDS-PAGE, seguidas por el manchado Cooomassie. La proteina HBcAg-Lys se detectó por el teñido Coomassie. La proteina HBcAg-Lys se enriqueció a la interface entre 15 y 65% de sucrosa, indicando que se ha formado una particula cápsida. La mayoría de las proteina bacterianas permanecían en la capa superior libre de sucrosa del gradiente, por lo tanto, la etapa de centrifugación del gradiente de las particulas HBcAg-Lys, condujo a tanto el enriquecimiento como a una purificación parcial de las particulas.
Ejemplo 25 Acoplamiento Químico del péptido FLAG a HBcAg-Lys usando el reticulador heterobifuncional SPDP El péptido FLAG sintético con un residuo de cisteina a su término amino (secuencia de aminoácido
CGGDYKDDDDK) se acopló químicamente a particulas HBcAg-Lys purificadas para provocar una respuesta inmune contra el péptido FLAG. 600 µl de una solución 95% pura de
particulas HBcAg-Lys (2 mg/ml) se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente con el reticulador heterobifuncional de 3- (2-piridiltio) propionado de N-succinimidilo (SPDP) (0.5 mM) . Después de la terminación de la reacción, la mezcla se dializó durante la noche contra 1 litro de amortiguador de fosfato 50 mM (pH 7.2) con 150 mM de Nal para remover el SPDP libre. Después 500 µl del cápsido HBcAg-Lys derivatizado (2 mg/ml) se mezclaron con 0.1 mM del péptido FLAG (que contienen una cisteina amino-terminal) en la presencia de 10 mM de EDTA para prevenir la oxidación de sulfhidrilo catalizada por el metal. La reacción se monitoreo a través del incremento de la densidad óptica de la solución a 343 nm debido a la liberación de piridin-2-tiona a partir de SPDP después de la reacción con la cisteina libre del péptido. La reacción de los residuos Lys derivatizados con el péptido se completó después de aproximadamente 30 minutos. Las particulas decoradas FLAG se inyectaron en ratones.
Ejemplo 26 Construcción de pMPSV-gpl40cys
El gen gpl40 se amplificó por PCR a partir de pCytTSgpl40FOS usando oligos gpl40CysEcoRI y Sallgpl40. Para el PCR, 100 pmol de cada oligo y 50 ng del patrón de
ADN se usaron en 50 µl de las mezclas de reacción con 2 unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgS04. Para ambas reacciones, el funcionamiento cíclico de la temperatura se llevó a cabo como sigue: 94 °C por 2 minutos; 30 ciclos de 94°C (0.5 minutos); 55°C (0.5 minutos), 72°C (2 minutos). El producto de PCR se purificó usando un equipo QuiaEXII, digerido con SalI/EcoRI y se ligó en el vector pMPSVHE escindido con las mismas enzimas.
Secuencias Oligo :
Gpl40CysEcoRI: S'-GCCGAATTCCTAGCAGCTAGCACCGAATTTATCTAA ' (SEC ID NO:83);
SalIgpHO 5,-GGTTAAGTCGACATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3, (SEClDNO:84).
Ejemplo 27 Expresión de pMPSVgpl40Cys
PMPSVgpl40Cys (20 µg) se linearizó por digestión de restricción. La reacción se detuvo por la extracción de fenol/cloroformo, seguida por una precipitación de isopropanol del ADN linearizado. La digestión de restricción se evaluó por electroforesis en gel de agarosa. Para la transfección, 5.4 µg del pMPSVgpl40-Cys linearizado, se mezclaron con 0.6 µg de pSV2Neo linearizado en 30 µl de H20 y se agregaron 30 µl de una solución CC12 Im. Después de la adición de 60 µl del amortiguador de fosfato (50 mM de HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mMm de Na2HP04, pH 7.05), la solución se sometió a vórtices por 5 segundos, seguida por una incubación a temperatura ambiente por 25 segundos. La solución se agregó inmediatamente a 2 ml de medio de HP-1 que contiene FCS al 2% (medio de FCS al 2%) . El medio de un cultivo celular de BHK21 a 80% de confluencia (placas de 6 pozos) , entonces se reemplazó por el medio que contiene ADN. Después de una incubación por 5 hora a 37 °C en un incubador de C02, el medio que contiene el ADN se removió y se reemplazó por 2 ml de glicerol al 15% en un medio de FCS al 2%. El medio que contiene glicerol se removió
después de una fase de incubación de 30 segundos, y las células se lavaron por el enjuague con 5 ml de un medio de HP-1 que contiene FCS al 10%. Finalmente, se agregaron 2 ml del medio HP-1 fresco que contiene FCS al 10%. Las células establemente transfectadas se seleccionaron y se hicieron crecer en un medio de selección (medio HP-1, suplementado con G418) a 37°C en un incubador con C02. Cuando la población mezclada se hizo crecer a confluencia, el cultivo se dividió en dos discos, seguido por un periodo de 12 horas de crecimiento a 37 °C. Un disco de las células se cambió a 30°C para inducir la expresión de las GP140-FOS soluble. El otro disco se mantuvo a 37 °C. La expresión de GP140-FOS se determinó por el análisis del manchado Western. El medio de cultivo (0.5 ml) fue metanol/cloroformo precipitado, y la pelotilla se resuspendió en un amortiguador de muestra SDS-PAGE. Las muestras se calentaron por 5 minutos a 95°C antes de ser aplicadas a gel de acrilamida al 15%. Después del SDS-PAGE, las proteinas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa de Profano (Schleicher & Schuell, Alemania) como se describe por Bass y Yang, en Creighton, T. E . , ed., Protein ' Function : A Practical Approach, 2da .
Edición . , IRL Press, Oxford (1997), pp- 29-55. La membrana se bloqueó con albúmina bovina al 1% (Sigma) en TBS (10 x TBS por litro: 87.7 g NaCl, 66.1 g de clorhidrato de Trizma (Sigma) y 9.7 g de base Trizma (Sigma), pH 7.4) por 1 hora a temperatura ambiente, seguido por una incubación con un anticuerpo anti-GP140 o GP-160 por 1 hora. El manchado se lavó tres veces por 10 minutos con TBS-T (TBS con Tween 20 al 0.05%), y se incubó por 1 hora con un conjugado IgG anti-ratón/conej o/mono/humano de fosfatasa alcalina. Después de lavar 2 veces por 10 minutos con TBS-T y 2 veces por 10 minutos con TBS, el desarrollo de la reacción se llevó a cabo usando reactivos de detección de fosfatasa alcalina (10 ml de amortiguador AP (100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 9.5) con 50 µl de una solución de NBT (Tetrazolio Nitro Blue al 7.7% (Sigma) en dimetilformamida al 70%), y 37 µl de una solución de X-fosfato (5% de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo en dimetilformamida) .
Ejemplo 28 Purificación de gpl40Cys Un anticuerpo anti-gp 120 se acopló covalentemente a un NHS/EDC activado por dextrano y
empaquetado en una columna de cromatografía. El sobrenadante que contiene GP140Cys se cargó en la columna y después se lavó suficiente, el GP140Cys se eluyó con 0.1 M de HCl. El eluato se neutralizó directamente durante la colección usando 1M de Tris a pH 7.2 en los tubos de colección. La formación del enlace disulfuro podria ocurrir durante la purificación, por lo tanto, la muestra colectada es tratada con 10 mM de DTT, en 10 mM de Tris a pH 7.5 por 2 horas a 25°C. El DTT se removió por la diálisis subsecuente contra 10 Mm de Ms : 80 mM de NaCl pH 6.0. Finalmente, el GP140Cys se mezcló con particulas alfavirus que contienen el cierre de leucina JUN en E2 como se describe en el Ejemplo 16.
Ejemplo 29 Construcción de PLA2-Cys El gen PLA2 se amplificó por PCR a partir de pAV3PLAfos usando oligos EcoRIPLA y PLA-Cys-hind. Para el
CPRs, 100 pmol de cada oligo y 50 ng del patrón de ADNs se usó en 50 µl de las mezclas de reacción con 2 unidades de polimerasa Pwo, 0.1 mM de dNTPs y 2 mM de MgS04. Para
ambas reacciones, el funcionamiento cíclico de la temperatura se llevó a cabo como sigue: 94 °C por 2 minutos; 30 ciclos de 94°C (0.5 minutos9, 55°C (0.5 minutos), 72°C (2 minutos). El producto de pCR se purificó usando un equipo QuiaEXII, digerido con SalI/EcoRI y se ligó en el vector pMPSVHE escindido con las mismas enzimas.
Oligos EcoRIPLA: 5•-TAACCGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATGG-3• (SECID NO:85)
PLACys-hind: S'-GAAGTAAAGCTTTTAACCACCGCAACCACCAGAAG-S' (SEC ID NO:86).
Ejemplo 30 Expresión y Purificación de PLA-cys
Para la producción citoplásmica de las proteinas marcadas Cys, una cepa XL-1 Blue de E. coli se transformó con los vectores pAV3::PLA, y Ppla-Cys. El cultivo se incubó en un medio rico en la presencia de ampicilina a
37°C con sacudimientos. A una densidad óptica (550 nm) de
1, 1 mM de IPTG se agregó y la incubación continuó por otras 5 horas. Las . células se cosecharon por centrifugación, se resuspendieron en un amortiguador apropiado (por ejemplo, HCl-tris, pH 7.2, 150 nM NaCl) que contiene DNase, RNase y lisozima y se disolvieron por el paso a través de una célula de presión french. Después de la centrifugación (Sorvall RC-5C, rotor SS34, 15000 rpm, 10 minutos, 4°C), la pelotilla se resuspendió en 25 ml de amortiguador lavando el cuerpo de inclusión (20 mM de tris-HCl, 23% sucrosa, 0.5% Tritón X-100, 1 mM de EDTA, pH 8) a 4°C se centrifugo como se describe anteriormente. Este procedimiento se repitió hasta que el sobrenadante después de la centrifugación fue esencialmente claro. Los cuerpos de inclusión se resuspendieron en 20 ml de amortiguador de solubilización (5.5 M de clorhidrato de guanidinio, 25 mM de tris-HCl, pH 7.5) a temperatura ambiente y el material insoluble se removió por centrifugación y el subsecuente paso del sobrenadante a través de un filtro estéril (0.45 µm) . La solución de la proteina se mantuvo a 4°C por al menos, 10 horas en la presencia de 10 mM de EDTA y 100 mM de DTT y después se dializó tres veces contra 10 volúmenes de 5.5 M dé clorhidrato de guanidinio. 25 mM de tris-HCl, 10 mM de
EDTA, pH 6. La solución se dializó dos veces contra 5 litros de 2M de urea, (5U4 mM de EDTA, 0.1 M de NH4C1, 20 M de borato de sodio (pH 8.3) en la presencia de un arrastre redox apropiado (glutationa oxidada/glutationa reducida; cisteina/cisteina) . La proteina replegada se aplicó entonces a una cromatografía de intercambio iónico. La proteina se almacenó en un amortiguador apropiado con un pH arriba de 7 en la presencia de 2-10 mM de DTT para mantener los residuos de cisteina en una forma reducida. Previo al acoplamiento de la proteina con las particulas alfavirus, el DTT se removió por el paso de la solución de la proteina a través de una columna de filtración en gel Sephadex G-25.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.
Claims (1)
- REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención co o antecede, se reclama como prioridad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una composición, caracterizada porque comprende : a) un andamio molecular que no se origina naturalmente que comprende: (i) una particula central seleccionada del grupo que consiste de: (1) una particula central de origen no natural; y (2) una particula de origen natural; y (ii) un organizador que comprende .al menos un primer sitio de unión, en donde dicho organizador se conecta a dicha particula central por al menos un enlace covalente; y b) un determinante antigeno o antigénico con al menos un segundo sitio de unión, dicho segundo sitio de unión se selecciona del grupo que consiste de: (i) un sitio de unión que no se origina naturalmente con dicho determinante antigeno o antigénico; y (ii) un sitio de unión de origen naturalmente con dicho determinante antigeno o antigénico, en donde dicho segundo sitio de unión es capaz de asociación a través de al menos un enlace no peptidico para dicho primer sitio de unión; y en donde dicho determinante antigeno o antigénico y dicho andamio interactúan a través de dicha asociación para formar un arreglo de antigeno ordenado y repetitivo. 2. La composición de la reivindicación 1, i caracterizada porque: a) dicha particula central se selecciona del grupo que consiste de: (i) un virus (ii) una particula unida al virus; (iii) una bacteriófago; (iv) una particula capsida viral; y (v) una forma recombinante de (i) , (ii) , (iii) o (iv) ; y b) dicho organizador es un polipéptido o residuo del mismo; y c) dicho segundo sitio de unión es un polipéptido o residuo del mismo. 3. La composición de la reivindicación 2, caracterizada porque donde dicha primer y/o segundo sitio de unión comprende: a) un antigeno y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, además; b) biotina y avidina; c) estrepavidina y biotina; d) un receptor y su ligando; e) una proteina ligando enlazante y su ligando; f) leucina interactúante de polipéptidos de cierre; g) un grupo amino y un grupo químico reactivo de este; h) un grupo carboxi y un grupo químico reactivo de este; i) un grupo sulfhidrilo y un grupo químico reactivo de este; o j) una combinación del mismo. 4. La composición de la reivindicación 3, caracterizada porque donde dicho segundo sitio de unión no ocurre naturalmente con dicho determinante antigeno o antigénico . La composición de la reivindicación 2, caracterizada porque dicha partícula central es un alfavirus recombinante . 6. La composición de la reivindicación 5, caracterizada porque dicho alfavirus recombinante es el virus Sindbis y dicho primer sitio de unión y dicho segundo sitio de unión cada uno comprende una leucina interactúante de polipéptido de cierre. 7. La composición de la reivindicación 6, caracterizada porque dicho primer sitio de unión y dicho segundo sitio de unión son las leucinas JUN y/o FOS de polipéptidos de cierre. 8. La composición de la reivindicación 2, caracterizada porque dicha particula central es una particula ligada al virus. 9. La composición de la reivindicación 8, caracterizada porque dicho primer sitio de unión es un grupo amino y dicho segundo sitio de unión es un grupo sulfhidrilo. 10. La composición de la reivindicación 8, caracterizada porque dicha particula ligada al virus es una proteina capsida del virus de hepatitis B. 11. La composición de la reivindicación 10, caracterizada porque dicho primer sitio de unión y dicho segundo grupo de unión cada uno comprende una leucina interactúante de polipéptido de cierre. 12. La composición de la reivindicación 11, caracterizada porque dicho primer sitio de unión es el polipéptido JUN y dicho segundo sitio de unión es el polipéptido FOS. 13. La composición de la reivindicación 10, caracterizada porque dicho primer sitio de unión es una lisina residual y dicho segundo sitio de unión es una cisteina residual. 14. La composición de la reivindicación 8, caracterizada porque dicha particula unida al virus es una proteina capsida de virus del sarampión. 15. La composición de la reivindicación 14, caracterizada porque dicho primer sitio de unión y dicho segundo sitio de unión, cada uno comprende una leucina interactúante de polipéptido de cierre. 16. La composición de la reivindicación 15, caracterizada porque dicho primer sitio de "unión y dicho segundo sitio de unión son leucina JUN y/o FOS de polipéptidos de cierre. 17. La composición de la reivindicación 2, caracterizada porque dicha particula central se selecciona del grupo que consiste de: a) proteinas recombinantes de Rotavirus, b) proteinas recombinantes del virus Norwalk, c) proteinas recombinantes de Alfavirus, d) proteinas recombinantes del virus de padecimiento de boca y pie, e) proteinas recombinantes de Retrovirus, f) proteinas recombinantes del virus de la hepatitis B, g) proteínas recombinantes del virus del mosaico del Tabaco, h) proteinas recombinantes del virus de Flock House, y i) proteinas recombinantes del Papilomavirus humano . 18. La composición de la reivindicación 17, caracterizada porque el primer sitio de unión y el segundo sitio de unión, cada uno comprende una leucina interactúante del polipéptido de cierre. 19. La composición de la reivindicación 17, caracterizada porque dicho primer sitio de unión es un grupo •amino y dicho segundo sitio de unión es un grupo sulfhidrilo. 2Q. La. composición de la reivindicación 1, caracterizada porque en dicha partícula central no es de origen natural. 21. La composición de la reivindicación 20, caracterizada porque dicha particula central se selecciona del grupo que consiste de: a) polímero sintético, b) un micelio lipido, y c) un metal. 22. La composición de la reivindicación 21, caracterizada porque dicho primer sitio de unión y dicho segundo sitio de unión comprende una leucina interactúante del polipéptido de cierre. 23. La composición de la reivindicación 22, caracterizada porque dicho primer sitio de unión y dicho segundo sitio de unión son la leucina JUN y/o FOS de los polipéptidos de cierre. 24. La composición de la reivindicación 1, caracterizada porque dicho antigeno se selecciona del grupo que consiste de: a) proteinas adecuadas para inducir nuevamente una respuesta inmune en células de cáncer, b) proteinas adecuadas para inducir nuevamente una respuesta inmune en padecimientos infecciosos, c) proteinas adecuadas para inducir nuevamente una respuesta inmune de alérgeno, y d) proteinas adecuadas para inducir una respuesta inmune en animales de granja. 25. La composición de la reivindicación 24, caracterizada porque dicho antigeno es: a) una proteina recombinante de VIH, b) una proteina recombinante del virus de influenza, c) una proteina recombinante del virus de la hepatitis C, d) una proteina recombinante de Toxoplasma, e) una proteina recombinante de Plasmodium falciparum, f) una proteina recombinante de Plasmodium vivax, g) una proteina recombinante de Plasmodium ovale, h) una proteina recombinante de Plasmodium malaria, i) una proteina reco binante de células de cáncer de mama, j) una proteina recombinante de células de cáncer de riñon, k) una proteina recombinante de células de cáncer de próstata, 1) una proteina recombinante de células de cáncer de la piel, m) una proteina recombinante de células de cáncer cerebro, n) una proteina recombinante de células de leucemia, o) un recombinante de perfil, p) una proteina recombinante de alergia al piquete de la abeja, q) una proteina recombinante de alergia a la nuez, r) una proteina recombinante de alergias a los alimentos, o s) una proteina recombinante de asma, o t) una proteina recombinante de Clamidia. 26. La composición de la reivindicación 24, caracterizada porque el primer sitio de unión y el segundo sitio de unión, cada uno comprende una leucina interactúante del polipéptido de cierre. 27. Un proceso para producir un arreglo de antigeno ordenado y repetitivo no naturalmente, caracterizado porque comprende: a) proporcionar un andamio molecular que no ocurre naturalmente, que comprende: (i) una particula central seleccionada del grupo que consiste de: (1) una particula central de origen no natural; y (2) una particula central de origen natural; y (ii) un organizador que comprende al menos un primer sitio de unión, en donde dicho organizador se conecta a dicha partícula central por al menos un enlace covalente; y b) proporcionar un determinante antigeno o antigénico con al menos un segundo sitio de unión, dicho segundo sitio de unión se selecciona del grupo que consiste de: (i) un sitio de unión de origen no natural con dicho determinante antigeno o antigénico; y (i) un sitio de unión de origen natural con dicho determinante antigeno o antigénico, en donde dicho segundo sitio de unión es capaz de asociación a través de al menos un enlace no péptidico para dicho primer sitio de unión; y c) combinación de dicho andamio molecular de origen no natural y dicho determinante antigeno o antigénico, en donde dicho determinante antigeno o antigénico y dicho andamio interactúan a través de dicha asociación para formar un arreglo antigeno ordenado y repetitivo. 28. Los procesos de la reivindicación 27, caracterizados porque a) dicha particula central se selecciona del grupo que consiste de: (i) un virus (il) una particula ligada al virus; (iii) un bacteriófago; (iv) una particula cápsida viral; y (vj una forma recombinante de (i), (ii) , (iii) o (iv) ; y b) dicho organizador es un polipéptido o residuo del mismo; y c) dicho segundo sitio de unión es un polipéptido o residuo del mismo. 29. Los procesos de la reivindicación 28, caracterizados porque dichos primero y/o segundo sitios de unión que comprenden: a) un antigeno y un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo de este; b) biotina y avidina; c) estrepavidina y biotina; d) un receptor y su ligando; e) una proteina enlazante al ligando y su ligando; f) una leucina interactúante de polipéptidos de cierre; g) un grupo amino y un grupo químico reactivo de este; h) un grupo carboxilo y un grupo químico reactivo de este; i) un grupo sulfhidrilo y un grupo químico reactivo de este; o j) una combinación del mismo. 30. Los procesos de la reivindicación 29, caracterizados porque dicho segundo sitio de unión no es de origen naturalmente con dicho determinante antigeno o antigénico. 31. Un alfavirus recombinante aislado, caracterizado porque comprende en su genoma: a) una supresión de las secuencias de señal empacada de ARN; y b) una inserción de origen no natural de la proteina cerrada de leucina JUN de la secuencia dominante del ácido nucleico en la estructura con dicha proteina cubierta alfavirus E2 de la secuencia de ácido nucleico. 32. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende el alfavirus recombinante de la reivindicación 31. 33. Un método de tratamiento medico, caracterizado -porque comprende administrar a un sujeto la composición de la reivindicación 1. 34. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende : a) la composición de la reivindicación 1; y b) un portador farmacéuticamente aceptable. 35. Un método de inmunización, caracterizado porque comprende la administración a un sujeto de una composición que' comprende: a) un andamio molecular de origen no natural que comprende : (i) una particula central seleccionada del grupo que consiste de: (1) una partícula central de origen no natural; y (2) una particula central de origen natural; y (ii) un organizador que comprende al menos un primer sitio de unión, en donde al menos dicho organizador se conecta a dicha particula central por al menos un enlace covalente; y b) un determinante antigeno o antigénico con al menos un segundo sitio de unió, dicho segundo sitio de unión se selecciona del grupo que consiste de: (i) un sitio de unión de origen no natural con dicho determinante antigeno o antigénico; y (ii) un sitio de unión de origen naturalmente con dicho determinante antigeno o antigénico, en donde dicho segundo sitio de unión es capaz de asociación a través de al menos un enlace no peptidico para dicho primer sitio de unión; y en donde dicho determinante antigeno o antigénico y dicho andamio interactúan a través de dicha asociación formando un arreglo antigeno ordenado y repetitivo. 36. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque dicha inmunización produce una respuesta inmune. 37. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque dicha inmunización produce una respuesta inmune humoral . 38. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque dicha inmunización produce una respuesta inmune celular. 39. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque dicha inmunización produce una respuesta inmune humoral y una respuesta inmune celular. 40. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque dicha inmunización produce una respuesta protectiva. 41. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende : a) un andamio molecular de origen no natural que comprende : (i) una partícula central seleccionada del grupo que consiste de: (1) una particula central de origen no natural; y (2) una particula central de origen natural ; y (ii) un organizador que comprende al menos un primer sitio de unión, en donde al menos dicho organizador se conecta a dicha particula central por al menos un enlace covalente; y b) un determinante antigeno o antigénico con al menos un segundo sitio de unión, dicho segundo sitio de unión se selecciona del grupo que consiste de: (i) un sitio de unión de origen no naturalmente con dicho determinante antigeno o antigénico; y (ii) un sitio de unión de origen naturalmente con dicho determinante antigeno o antigénico, en donde dicho segundo sitio de unión es capaz de asociación a través de al menos un enlace no peptidico para dicho primer sitio de unión; y en donde dicho determinante antigeno o antigénico y dicho andamio interactúan a través de dicha asociación formando un arreglo antigeno ordenado y repetitivo. 42. La composición de vacuna de la reivindicación 41, caracterizada porque, además comprende un adyuvante. 43. La composición de vacuna de la reivindicación 41, caracterizada porque: a) dicha particula central se selecciona del grupo que consiste de: (i) un virus (ii) una particula ligada al virus; (iii) un bacteriófago; (iv) una particula capsida viral; y (v) una forma recombinante de (i), (ii), (iii) o (iv) y b) dicho organizador es un polipéptido o residuo del mismo; y c) dicho segundo sitio de unión es un polipéptido o residuo del mismo. 44. La composición de vacuna de la reivindicación 43, caracterizada porque dichas primer y/o segundo sitios de unión comprende: a) un antigeno y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de este; b) biotina y avidina; c) estrepavicina y biotina; d) un receptor y su ligando; e) una proteina enlazada la ligando y su ligando; f) leucina interactúante de polipéptidos de cierre; g) un grupo amino y un grupo químico reactivo de este; h) un grupo carboxilo y un grupo químico reactivo de este, i) un grupo sulfhidrilo y un grupo químico reactivo de este; o una combinación del mismo. 45. La composición de la vacuna de la reivindicación 43, en donde dicha particula central comprende una particula ligada al virus. 46. La composición de la vacuna de la reivindicación 45, caracterizada porque dicha particula central comprende una particula ligada al virus de la hepatitis B. 47. La composición de la vacuna de la reivindicación 45, caracterizada porque dicha particula central comprende una partícula ligada al virus del sarampión. 48. La composición de la vacuna de la reivindicación 43, caracterizada porque dicha particula central comprende un virus . 49. La composición de la vacuna de la reivindicación 48, caracterizada porque dicha particula central comprende el virus Sindbis.
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