PL192016B1

PL192016B1 - Kompozycja, sposób wytwarzania sztucznego, uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenu, zastosowanie kompozycji oraz kompozycja szczepionki

Info

Publication number: PL192016B1
Application number: PL348452A
Authority: PL
Inventors: Wolfgang A. Renner; Frank Hennecke; Lars Nieba; Martin Bachmann
Original assignee: Cytos Biotechnology Ag
Priority date: 1998-11-30
Filing date: 1999-11-30
Publication date: 2006-08-31
Also published as: CN100534529C; CN1679932A; WO2000032227A3; IL143441A0; DK1135162T3; ATE412434T1; CA2354183A1; EP1135162A2; NZ512456A; JP2010510960A; EP1135162B1; RU2245163C2; CN1333693A; US20040136962A1; MXPA01005389A; IL143441A; WO2000032227A2; DE69939836D1; CN1193791C; AU768807B2

Abstract

1. Kompozycja, znamienna tym, ze zawiera: a) sztuczne rusztowanie molekularne obejmujace: (i) czastke rdzenia która jest czastka wirusopodobna; (ii) organizator zawierajacy co najmniej jedno pierwsze miejsce przylaczania, przy czym ten organi- zator jest polaczony z czastka rdzenia co najmniej jednym wiazaniem kowalencyjnym i organizator jest polipeptydem lub jego reszta aminokwasowa; oraz b) antygen lub determinante antygenowa posiadajaca co najmniej jedno drugie miejsce przylaczania, przy czym to drugie miejsce przylaczania jest wy- brane z grupy obejmujacej: (i) sztuczne miejsce przylaczania antygenu lub determinanty antygenowej; i (ii) naturalne miejsce przylaczania antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym drugie miejsce przylaczania jest zdolne do polaczenia poprzez co najmniej jedno wiazanie niepeptydowe z pierwszym miejscem przylaczania; oraz pierwsze i/lub drugie miejsce przylaczania obejmuje a) antygen, b) przeciwcialo lub fragment przeciwciala, c) biotyne, d) awidyne, e) streptawidyne,…………….. 25. Sposób wytwarzania sztucznego, uporzadkowanego i powtarzalnego ukladu antygenu, znamienny tym, ze: a) zapewnia sie sztuczne rusztowanie molekularne zawierajace: (i) czastke rdzenia, która jest czastka wirusopodobna, (ii) organizator zawierajacy co najmniej jedno pierwsze miejsce przylaczania, przy czym organizator jest polaczony z czastka rdzenia co najmniej jednym wiazaniem kowalencyjnym i organizator jest polipeptydem lub jego reszta aminokwasowa; i b) zapewnia sie antygen lub determinante antygenowa posiadajaca co najmniej jedno drugie miejsce przylaczania, przy czym drugie miejsce przylaczania wybiera sie z grupy obejmujacej: (i) sztuczne miejsce przylaczania wymienionego antygenu lub determinanty antygenowej; i (ii) naturalne miejsce przylaczania wymienionego antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym pierwsze i/lub drugie miejsce przylaczania obejmuje: a) antygen, b) przeciwcialo lub fragment przeciwciala, c) biotyne, d) awidyne, e) streptawidyne,………………………………… PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca uporządkowany i powtarzalny układ antygenów lub determinant antygenowych, sposób wytwarzania sztucznego, uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenu, zastosowanie tej kompozycji oraz kompozycja szczepionki zawierająca uporządkowany i powtarzalny układ antygenów lub determinant antygenowych.

Wynalazek dotyczy dziedzin biologii molekularnej, wirusologii, immunologii i medycyny.

Opracowanie szczepionek do zapobiegania chorobom infekcyjnym wywarło największy wpływ na zdrowie ludzkie spośród wszystkich wynalazków medycznych. Ocenia się, że szczepienia zapobiegają trzem milionom zgonów rocznie na świecie (Hillemann, Naturę Medicine, 4: 507 (1998)). Najbardziej powszechną strategię szczepienia, stosowanie atenuowanych (tj. mniej zjadliwych) patogenów lub blisko spokrewnionych organizmów, po raz pierwszy zademonstrował w 1798 r. Edward Jenner, który zastosował szczepienie przeciw ospie przez podawanie mniej niebezpiecznego wirusa krowianki. Chociaż liczne żywe atenuowane wirusy (np. wirusy odry, świnki, różyczki, ospy wietrznej, adenowirus, wirus polio, wirus grypy) i bakterie (np. prątki Calmette-Guerin (BCG) przeciw gruźlicy) z powodzeniem podawano w celu szczepienia, istnieje ryzyko rozwinięcia się poważnych powikłań związanych z przywróceniem zjadliwości i infekcją przez „szczepionkę” organizmu, w szczególności u osobników mających obniżoną odporność.

Obecnie techniki rekombinacji DNA (tj. inżynieria genetyczna) umożliwiają projektowanie atenuowanych wirusów poprzez tworzenie wariantów delecyjnych lub mutacyjnych. Na przykład, wykazano, że podawanie małpiego wirusa niedoboru immunologicznego (SIV) z delecją w obrębie genu nef chroni makaki przed późniejszą infekcją patogennym szczepem SIV (Daniel i in., Science 258: 1938-1941 (1992)). Jednakże, pojawianie się objawów podobnych do nabytego zespołu niedoboru immunologicznego (AIDS) u zwierząt, którym podawano atenuowanego SIV, zwiększa zaniepokojenie o bezpieczeństwo (Baba i in., Science 267: 1820-1825 (1995)).

W alternatywnym podejściu, atenuowane wirusy można stosować jako nośniki dla genów kodujących antygeny patogenu, który uważany jest za zbyt niebezpieczny do podawania w postaci atenuowanej (np. ludzki wirus niedoboru immunologicznego (HIV)). Po dostarczeniu kodującego antygen genu do gospodarza, antygen syntetyzowany jest in situ. Jako takie nośniki różnych genów w badaniach preklinicznych i klinicznych różnych chorób stosowano wirusa krowianki i zbliżone wirusy ospy ptasiej (np. Shen i in., Science 252: 440 (1991)). Jedną wadą tej strategii szczepienia jest to, że nie naśladuje się powierzchni wirionu, ponieważ zrekombinowane białko ulega ekspresji na powierzchni komórki gospodarza. U osobników mających obniżoną odporność mogą rozwinąć się powikłania, jak udowodniły zagrażające życiu rozsiane infekcje wirusem krowianki (Redfield, N. Engl. J. Med. 316: 673 (1998)).

Czwarty sposób podejścia do szczepienia obejmuje stosowanie wyizolowanych składników patogenu, albo oczyszczonych z patogenu hodowanego in vitro (np. hemaglutynina lub neuraminidaza wirusa grypy), albo po heterologicznej ekspresji pojedynczego białka wirusowego (np. antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B). Na przykład, do szczepień przeciw toksynom błonicy, tężca, cholery i krztuśca stosuje się zrekombinowane, zmutowane (detoksykowane) toksyny (Levine i in., New generation vaccines., wyd. 2, Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork 1997), a wyniki oceny zrekombinowanych białek HIV (gp120 i pełnej długości gp160) jako środka do indukcji neutralizujących przeciwciał skierowanych przeciw HIV były niezadawalające (Connor i in., J. Virol. 72: 1552 (1998)). Ostatnio otrzymano obiecujące wyniki dla rozpuszczalnej, oligomerycznej gp160, która może indukować odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T i wywoływać tworzenie przeciwciał o aktywności neutralizacji izolatów HIV-1 (Van Cortt i in., J. Yirol. 71: 4319 (1997)). Ponadto, można stosować szczepionki peptydowe, w których znane epitopy dla komórek B lub T antygenu sprzęga się z cząsteczką nośnikową, przeznaczoną do zwiększania immunogenności epitopu przez stymulację komórek pomocniczych T. Jednakże, jeden znaczący problem takiego podejścia polega na tym, że zapewnia się ograniczoną odpowiedź immunologiczną na białko jako całość. Co więcej, szczepionki muszą być indywidualnie projektowane dla różnych haplotypów MHC. Najpoważniejszym problemem przy dla tego rodzaju szczepionkach jest to, że ochronne przeciwciała przeciwwirusowe rozpoznają złożone struktury przestrzenne, których peptydy nie mogą naśladować.

Nowsza strategia szczepienia polega na stosowaniu szczepionek DNA (Donnelly i in., Ann. Rev.

Immunol. 15: 617 (1997)), które mogą wywoływać odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T podlegające restrykcji MHC klasy I (bez stosowania żywego wektora). Może to zapewniać szerszą ochronę przed różnymi szczepami wirusa przez ukierunkowanie na epitopy z konserwatywnych białek wewnętrznych

PL 192 016 B1 właściwych dla wielu szczepów tego samego wirusa. Ponieważ antygen wytwarzany jest ze ssaczymi modyfikacjami potranslacyjnymi, konformacją i oligomeryzacją, jest bardziej prawdopodobne, że będzie podobny lub identyczny z białkiem typu dzikiego, wytwarzanym podczas infekcji wirusowej, niż białka rekombinowane lub modyfikowane chemicznie. Jednakże, ta odmienność może okazać się wadą przy stosowaniu antygenów bakteryjnych, ponieważ wynikiem nienatywnych modyfikacji potranslacyjnych może być obniżona immunogenność. Ponadto, wirusowe białka powierzchniowe nie są wysoce zorganizowane w nieobecności białek matriks.

Poza stosowaniem do zapobiegania chorobom infekcyjnym, szczepionki wykorzystuje się obecnie do rozwiązywania problemów immunologicznych związanych z alergiami. U osobników alergicznych, przeciwciała izotypu IgE wytwarzane są w niewłaściwej odpowiedzi immunologicznej na określone antygeny (alergeny). Leczenie, alergii przez immunoterapię wymaga cotygodniowego podawania stopniowo wzrastających dawek określonego alergenu w ciągu okresu do 3-5 lat. Przypuszczalnie wytwarzane są „blokujące” przeciwciała IgG, które wychwytują alergeny w wydzielinach nosowych lub układu oddechowego bądź w błonach, zanim reagują one z przeciwciałami IgE na komórkach tucznych. Jednakże, nie istnieje stała współzależność pomiędzy mianami IgG a złagodzeniem objawów. Obecnie jest to skrajnie czasochłonny i kosztowny proces, którego stosowanie można rozważać tylko dla pacjentów o ciężkich objawach w ciągu długiego okresu każdego roku.

Zostało dobrze ustalone, że podawanie samych oczyszczonych białek zazwyczaj nie jest wystarczające do wywołania silnej odpowiedzi immunologicznej; wyizolowany antygen musi być podawany razem z substancjami pomocniczymi, noszącymi nazwę adiuwantów. Z tymi adiuwantami, podawany antygen chroniony jest przed szybką degradacją oraz adiuwant zapewnia przedłużone uwalnianie niskiego poziomu antygenu.

W przeciwieństwie do wyizolowanych białek, wirusy indukują szybkie i wydajne odpowiedzi immunologiczne w nieobecności jakichkolwiek adiuwantów, zarówno z, jak i bez komórek pomocniczych T (Bachmann i Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol., 15: 235-270 (1997)). Chociaż wirusy często składają się z nielicznych białek, są one zdolne do wywoływania znacznie silniejszych odpowiedzi immunologicznych, niż ich wyizolowane składniki. W przypadku odpowiedzi komórek B wiadomo, że jednym z krytycznych czynników dla immunogenności wirusów jest powtarzalność i uporządkowanie epitopów powierzchniowych. Wiele wirusów posiada guazi-krystaliczną powierzchnię, która wykazuje regularny układ epitopów, które wydajnie sieciują specyficzne wobec epitopów immunoglobuliny na komórkach B (Bachmann i Zinkernagel, Immunol. Today 17: 553-558 (1996)). To sieciowanie powierzchniowych immunoglobulin na komórkach B jest silnym sygnałem aktywującym, który bezpośrednio indukuje postęp cyklu komórkowego i wytwarzanie przeciwciał IgM. Ponadto, takie pobudzone komórki B są zdolne do aktywacji pomocniczych komórek T, które z kolei indukują przestawienie z wytwarzania przeciwciał IgM na IgG w komórkach B i powstawanie długotrwałej pamięci komórek B - cel każdego szczepienia (Bachmann i Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1997)). Struktura wirusa wiąże się nawet z powstawaniem antyprzeciwciał w chorobie autoimmunologicznej oraz jako część naturalnej odpowiedzi na patogeny (patrz Fehr, T. i in., J. Exp. Med. 185: 1785-1792 (1997)). A zatem, antygeny na cząstkach wirusowych, które są uorganizowane w uporządkowany i powtarzalny układ, są wysoce immunogenne, ponieważ mogą bezpośrednio aktywować komórki B.

Poza silnymi odpowiedziami komórek B, cząstki wirusowe są również zdolne do indukcji powstawania odpowiedzi cytotoksycznych komórek T, innego ramienia układu immunologicznego o krytycznym znaczeniu. Te cytotoksyczne komórki T są szczególnie ważne dla eliminacji wirusów niecytopatycznych, takich jak HIV lub wirus zapalenia wątroby typu B, oraz dla likwidacji nowotworów. Cytotoksyczne komórki T nie rozpoznają natywnych antygenów, ale rozpoznają raczej produkty ich degradacji w połączeniu z cząsteczkami MHC klasy I (Townsend i Bodmer, Ann. Rev. Immunol. 7: 601-624 (1989)). Makrofagi i komórki dendrytyczne są zdolne do pochłaniania i przetwarzania egzogennych cząstek wirusowych (ale nie ich rozpuszczalnych, wyizolowanych składników) i prezentowania utworzonych produktów degradacji cytotoksycznym komórkom T, co prowadzi do ich aktywacji i proliferacji (Kovacsovics-Bankowski i in., Proc. Natl. Acad. Sex. USA 90: 4942-4946 (1993); Bachmann i in., Eur. J. Immunol. 26: 2595-2600 (1996)).

Cząstki wirusowe jako antygeny wykazują dwie zalety w porównaniu z ich wyizolowanymi składnikami: (1) z powodu ich wysoce powtarzalnej struktury powierzchni są one zdolne do bezpośredniego aktywowania komórek B, co prowadzi do wysokich mian przeciwciał i długotrwałej pamięci komórek B, oraz (2) cząstki wirusowe, ale nie rozpuszczalne cząsteczki, są zdolne do indukowania odpowiedzi cytotoksycznych komórek T, nawet jeśli wirusy nie są infekcyjne i nieobecne są adiuwanty.

PL 192 016 B1

Kilka nowych strategii szczepienia wykorzystuje właściwą dla wirusów immunogenność. Niektóre z tych podejść skupiają się na szczególnej naturze cząstki wirusowej; na przykład patrz Harding, C.V. i Song, R., (J. Immunology 153: 4925 (1994), który ujawnia szczepionkę składającą się z perełek lateksowych i antygenu; Kovacsovics-Bankowski, M. i in., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 4942-4946 (1993)), który ujawnia szczepionkę składającą się z perełek z tlenku żelaza i antygenu; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 334 394 Kossovsky'ego, N. i in., który ujawnia cząstki rdzenia opłaszczone antygenem; opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 871 747, który ujawnia cząstki syntetycznego polimeru niosącego na powierzchni jedno lub więcej związanych z nimi kowalencyjnie białek i rdzenia z niekowalencyjnie związaną osłonką, która co najmniej częściowo pokrywa powierzchnię rzeczonej cząstki rdzenia, oraz co najmniej jeden biologicznie aktywny czynnik stykający się z rzeczoną osłoniętą cząstką rdzenia (patrz np. WO 94/15585).

Jednakże, wadą tych układów naśladujących wirusy jest to, że nie są one zdolne do odtworzenia uporządkowanego prezentowania antygenu występującego na cząstce wirusowej. Stwierdzono, że antygeny sprzęgane z powierzchnią w losowej orientacji indukują odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T, ale nie indukują lub indukują tylko słabą odpowiedź komórek B. Dla skuteczności szczepionki, oba ramiona układu immunologicznego muszą ulec silnej aktywacji, jak opisano powyżej oraz w Bachmann i Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15: 235-270 (1997).

W innym przykładzie, do dostarczania antygenu wykorzystuje się zrekombinowane wirusy. Stwierdzono, że wirus będący fagiem nitkowatym zawierający antygen poddany fuzji z białkiem kapsydu jest silnie immunogenny (patrz Perham R.N. i in., FEMS Microbiol. Rev. 17: 25-31; Willis i in., Gene 128: 85-88 (1993); Minenkova i in., Gene 128: 85-88 (1993)). Jednakże, układ ten ograniczony jest do bardzo małych peptydów (5 lub 6 reszt aminokwasowych), jeśli białko fuzyjne ulega ekspresji na wysokim poziomie (lannolo i in., J. Mol. Biol. 248: 835-844 (1995)) lub ograniczony jest do niskiego poziomu ekspresji dla większych białek (de la Gruz i in., J. Biol. Chem. 263: 4318-4322 (1988)). Dla małych peptydów dotychczas obserwuje się jedynie odpowiedź cytotoksycznych limfocytów T, ale nie obserwuje się, bądź obserwuje się tylko słabą odpowiedź komórek B.

W jeszcze innym układzie proponuje się zrekombinowane alfawirusy jako sposób dostarczania antygenów (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 766 602, 5 792 462, 5 739 026, 5 789 245 oraz 5 814 482). Problemy z opisanymi dotychczas układami rekombinowanych wirusów obejmują niską gęstość ekspresji heterologicznego białka na powierzchni wirusa i/lub trudność uwieńczonego sukcesem i powtarzalnego tworzenia nowych i różnych zrekombinowanych wirusów do różnych zastosowań.

Rozwijając dalej, w dziedzinie wytwarzania szczepionek wykorzystuje się cząstki wirusopodobne (VLP), zarówno z powodu ich właściwości strukturalnych, jak i ich nieinfekcyjnego charakteru. VLP są supramolekularnymi strukturami, zbudowanymi w symetryczny sposób z wielu cząsteczek białkowych jednego lub więcej rodzajów. Pozbawione są one genomu wirusowego i, dlatego, nie są infekcyjne. VLP można często wytwarzać w dużych ilościach przez heterologiczną ekspresję i łatwo można je oczyszczać.

Przykłady VLP obejmują białka kapsydów wirusa zapalenia wątroby typu B (Ulrich i icn., Virus Res. 50: 141-182 (1998)), wirusa odry (Warnes i in., Gene 160: 173-178 (1995)), wirusa Sindbis (opisy patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 5 071 651 i 5 374 426), wirusa choroby pyska i racic (Twomey i in., Vaccine 13: 1603-1610, (1995)), wirusa Norwalk (Jiang, X i in., Science 250: 1580-1583 (1990), Matsui, S.M. i in., J. Clin. Invest 87: 1456-1461 (1991)), retrowirusowe białko GAG (zgłoszenie patentowe PCT numer WO 96/30523), białko pl retrotranspozonu Ty, białko powierzchniowe wirusa zapalenia wątroby typu B (światowy opis patentowy numer 92/11291) oraz ludzkiego wirusa brodawczaka (światowy opis patentowy numer 98/15631). W niektórych przypadkach można wykorzystywać techniki rekombinacji DNA do tworzenia fuzji heterologicznego białka z białkiem VLP (Kratz, P.A. i in., Proc. Natl. Acsd. Sci. USA 96: 1915-1920 (1999)).

A zatem, istnieje w tej dziedzinie potrzeba opracowania nowych i ulepszonych szczepionek, które pobudzają silną odpowiedź immunologiczną cytotoksycznych limfocytów T i komórek B równie skutecznie, jak naturalne patogeny.

Kompozycja według wynalazku zawiera:

a) sztuczne rusztowanie molekularne obejmujące:

(i) cząstkę rdzenia, którą jest cząstka wirusopodobna;

PL 192 016 B1 (ii) organizator zawierający co najmniej jedno pierwsze miejsce przyłączania, przy czym ten organizator jest połączony z cząstką rdzenia co najmniej jednym wiązaniem kowalencyjnym i organizator jest polipeptydem lub jego resztą aminokwasową; oraz

b) antygen lub determinantę antygenową posiadającą co najmniej jedno drugie miejsce przyłączania, przy czym to drugie miejsce przyłączania jest wybrane z grupy obejmującej:

(i) sztuczne miejsce przyłączania antygenu lub determinanty antygenowej; i (ii) naturalne miejsce przyłączania antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym drugie miejsce przyłączania jest zdolne do połączenia poprzez co najmniej jedno wiązanie niepeptydowe z pierwszym miejscem przyłączania; oraz pierwsze i/lub drugie miejsce przyłączania obejmuje

a) antygen,

b) przeciwciało lub fragment przeciwciała,

c) biotynę,

d) awidynę,

e) streptawidynę,

f) receptor,

g) ligand receptora,

h) ligand,

i) białko wiążące ligand,

j) oddziałujące polipeptydy zamka leucynowego;

k) grupę aminową

l) grupę chemiczną reaktywną z grupą aminową,

m) grupę karboksylową.

n) grupę chemiczną reaktywną z grupą karboksylową,

o) grupę sulfhydrylową,

p) grupę chemiczną reaktywną z grupą sulfhydrylową, lub r) ich kombinację, przy czym wymieniony antygen lub determinanta antygenowa i rusztowanie oddziaływują ze sobą poprzez to połączenie tworząc uporządkowany i powtarzalny układ antygenu.

Korzystnie, drugie miejsce przyłączania jest polipeptydem lub jego resztą aminokwasową. Korzystne jest także gdy pierwszym miejscem przyłączania jest grupa aminowa, a drugim miejscem przyłączania jest grupa sulfhydrylową.

Korzystnie, gdy cząstką wirusopodobną jest białko kapsydu wirusa zapalenia wątroby typu B i każde z wymienionych pierwsze miejsce przyłączania i drugie miejsce przyłączania obejmuje oddziałujący polipeptyd zamka leucynowego, przy czym korzystnie pierwszym miejscem przyłączania jest polipeptyd JUN, a drugim miejscem przyłączania jest polipeptyd FOS.

Korzystne jest także, że gdy cząstką wirusopodobną jest białko kapsydu wirusa zapalenia wątroby typu B, pierwszym miejscem przyłączania jest reszta lizyny, a drugim miejscem przyłączania jest reszta cysteiny, czyli dwie reszty aminokwasowe, które można ze sobą sieciować chemicznie.

Korzystnie, w kompozycji według wynalazku cząstką wirusopodobną jest białko kapsydu wirusa odry, a wówczas każde z wymienionych pierwsze miejsce przyłączania i drugie miejsce przyłączania korzystnie obejmuje oddziałujący polipeptyd zamka leucynowego, przy czym korzystnie pierwszym miejscem przyłączania i drugim miejscem przyłączania są polipeptydy zamka leucynowego JUN i/lub FOS.

W kompozycji według wynalazku korzystnie cząstka rdzenia zawiera białka wybrane z grupy składającej się z:

a) zrekombinowanych białek alfawirusa,

b) zrekombinowanych białek rotawirusa,

c) zrekombinowanych białek wirusa Norwalk,

d) zrekombinowanych białek wirusa choroby pyska i racic,

e) zrekombinowanych białek retrowirusa,

f) zrekombinowanych białek wirusa zapalenia wątroby typu B,

g) zrekombinowanych białek wirusa mozaiki tytoniu,

h) zrekombinowanych białek wirusa choroby stad, i

i) zrekombinowanych białek ludzkiego wirusa brodawczaka, przy czym korzystnie każde z wymienionych pierwsze miejsce przyłączania i drugie miejsce przyłączania obejmuje oddziałujący polipeptyd zamka leucynowego lub pierwszym miejscem przyłączania

PL 192 016 B1 jest grupa aminowa, a drugim miejscem przyłączania jest grupa sulfhydrylowa. Korzystnie pierwszym miejscem przyłączania i drugim miejscem przyłączania są polipeptydy zamka leucynowego JUN i/lub FOS.

W kompozycji według wynalazku korzystnie antygen lub determinantę antygenową wybiera się z grupy składającej się z:

a) białek odpowiednich do indukcji odpowiedzi immuno logicznej skierowanej przeciw komórkom raka,

b) białek odpowiednich do indukcji odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw chorobom infekcyjnym,

c) białek odpowiednich do indukcji odpowiedzi immuno logicznej skierowanej przeciw alergenom,

d) białek odpowiednich do indukcji odpowiedzi immunologicznej u zwierząt hodowlanych, przy czym korzystnie białko odpowiednie do indukcji odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw komórkom raka jest wybrane z grupy obejmującej:

e) zrekombinowane białko komórek raka gruczołu sutkowego,

f) zrekombinowane białko komórek raka nerki,

g) zrekombinowanego białka komórek raka gruczołu krokowego,

h) zrekombinowane białko komórek raka skóry,

i) zrekombinowane białko komórek raka mózgu,

j) zrekombinowane białko komórek białaczkowych, oraz korzystne jest, gdy każde z wymienionych pierwsze miejsce przyłączania i drugie miejsce przyłączania obejmuje oddziałujący polipeptyd zamka leucynowego.

Korzystnie, białko odpowiednie do wywołania odpowiedzi skierowanej przeciw chorobom infekcyjnym, jest wybrane z grupy obejmującej:

a) zrekombinowane białko HIV,

b) zrekombinowane białko wirusa grypy,

c) zrekombinowane białko zapalenia wątroby typu C,

d) zrekombinowane białko Toxoplasma,

e) zrekombinowane białko Plasmodium falciparum,

f) zrekombinowane białko Plasmodium vivax,

g) zrekombinowane białko Plasmodium ovale,

h) zrekombinowane białko Plasmodium malariae, oraz

i) zrekombinowane białko Chlamydia.

Korzystnie, białko odpowiednie do wywołania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw alergenom jest wybrane z grupy obejmującej:

a) zrekombinowane białko odpowiednie do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciw alergii na użądlenie pszczoły,

b) zrekombinowane białko odpowiednie do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciw alergii na orzechy,

c) zrekombinowane białko odpowiednie do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciw alergiom pokarmowym, lub

d) zrekombinowane białko odpowiednie do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciw astmie. Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania sztucznego, uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenu, w którym:

a) zapewnia się sztuczne rusztowanie molekularne zawierające:

(i) cząstkę rdzenia, którą jest cząstka wirusopodobna, (ii) organizator zawierający co najmniej jedno pierwsze miejsce przyłączania, przy czym organizator jest połączony z cząstką rdzenia co najmniej jednym wiązaniem kowalencyjnym i organizator jest polipeptydem lub jego resztą aminokwasową; i

b) zapewnia się antygen lub determinantę antygenową posiadającą co najmniej jedno drugie miejsce przyłączania, przy czym drugie miejsce przyłączania wybiera się z grupy obejmującej:

(i) sztuczne miejsce przyłączania wymienionego antygenu lub determinanty antygenowej; i (ii) naturalne miejsce przyłączania wymienionego antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym pierwsze i/lub drugie miejsce przyłączania obejmuje

a) antygen,

b) przeciwciało lub fragment przeciwciała,

c) biotynę,

d) awidynę,

e) streptawidynę,

PL 192 016 B1

f) receptor,

g) ligand receptora,

h) ligand,

i) białko wiążące ligand,

j) oddziałujący polipeptyd zamka leucynowego;

k) grupę aminową

l) grupę chemiczną reaktywną z grupą aminową,

m) grupę karboksylową,

n) grupę chemiczną reaktywną z grupą karboksylową,

o) grupę sulfhydrylową,

p) grupę chemiczną reaktywną z grupą sulfhydrylową, r) ich kombinację, i wymienione drugie miejsce przyłączania jest zdolne do łączenia się poprzez co najmniej jedno wiązanie niepeptydowe z pierwszym miejscem przyłączania; oraz

c) łączy się wymienione sztuczne rusztowanie molekularne z wymienionym antygenem lub determinantą antygenową, przy czym antygen lub determinanta antygenowa i sztuczne rusztowanie molekularne oddziaływują ze sobą poprzez to połączenie tworząc uporządkowany i powtarzalny układ antygenu. Korzystnie, drugie miejsce przyłączania jest polipeptydem lub jego resztą aminokwasową.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie kompozycji określonej powyżej do wytwarzania leku do leczenia chorób infekcyjnych, alergii lub raka, a także zastosowanie kompozycji zawierającej:

a) sztuczne rusztowanie molekularne obejmujące:

(i) cząstkę rdzenia, którą jest cząstka wirusopodobna, (ii) organizator zawierający co najmniej jedno pierwsze miejsce przyłączania, przy czym organizator jest połączony z cząstką rdzenia co najmniej jednym wiązaniem kowalencyjnym i organizator jest polipeptydem lub jego resztą aminokwasową; oraz

b) antygen lub determinantę antygenową posiadającą co najmniej jedno drugie miejsce przyłączania, przy czym drugie miejsce przyłączania wybiera się z grupy obejmującej:

a) antygen,

b) przeciwciało lub fragment przeciwciała,

c) biotynę,

d) awidynę,

e) streptawidynę,

f) receptor,

g) ligand receptora,

h) ligand,

i) białko wiążące ligand,

j) oddziałujące polipeptydy zamka leucynowego;

k) grupę aminową

l) grupę chemiczną reaktywną z grupą aminową,

m) grupę karboksylową,

n) grupę chemiczną reaktywną z grupą karboksylową,

o) grupę sulfhydrylową,

p) grupę chemiczną reaktywną z grupą sulfhydrylową, r) ich kombinację, przy czym drugie miejsce przyłączania jest zdolne do łączenia się poprzez co najmniej jedno wiązanie niepeptydowe z pierwszym miejscem przyłączania; oraz antygen lub determinanta antygenowa i rusztowanie oddziaływują ze sobą poprzez to połączenie tworząc uporządkowany i powtarzalny układ antygenu, do wytwarzania leku do immunizacji.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja szczepionki zawierająca: a) sztuczne rusztowanie molekularne obejmujące:

(i) cząstkę rdzenia, która jest cząstką wirusopodobną, (ii) organizator zawierający co najmniej jedno pierwsze miejsce przyłączania,

PL 192 016 B1 przy czym co najmniej jeden z organizatorów jest połączony z cząstką rdzenia co najmniej jednym wiązaniem kowalencyjnym; i organizator jest polipeptydem lub jego resztą amionokwasową, oraz

(i) sztuczne miejsce przyłączania wymienionego antygenu lub determinanty antygenowej; i (ii) naturalne miejsce przyłączania wymienionego antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym drugie miejsce przyłączania jest zdolne do łączenia się poprzez co najmniej jedno wiązanie niepeptydowe z pierwszym miejscem przyłączania; oraz pierwsze i/lub drugie miejsce przyłączania obejmuje

a) antygen,

b) przeciwciało lub fragment przeciwciała,

c) biotynę,

d) awidynę,

e) streptawidynę,

f) receptor,

g) ligand receptora,

h) ligand,

i) białko wiążące ligand,

j) oddziałujące polipeptydy zamka leucynowego;

k) grupę aminową

l) grupę chemiczną reaktywną z grupą aminową,

m) grupę karboksylową,

n) grupę chemiczną reaktywną z grupą karboksylową,

o) grupę sulfhydrylową,

p) grupę chemiczną reaktywną z grupą sulfhydrylową, r) ich kombinację, i wymieniony antygen lub determinanta antygenowa i rusztowanie oddziaływują ze sobą poprzez to połączenie tworząc uporządkowany i powtarzalny układ antygenu.

Korzystnie kompozycja szczepionki zawiera ponadto adiuwant.

Korzystnie, w kompozycji szczepionki drugie miejsce przyłączania jest polipeptydem lub jego resztą aminokwasową.

Korzystnie, cząstka rdzenia obejmuje cząstkę wirusopodobną wirusa zapalenia wątroby typu B.

Korzystnie, cząstka rdzenia obejmuje cząstkę wirusopodobną wirusa odry.

Wynalazek zapewnia uniwersalną nową technologię, która umożliwia wytwarzanie cząstek opłaszczonych jakimkolwiek pożądanym antygenem. Technologia umożliwia tworzenie wysoce skutecznych szczepionek przeciw chorobom infekcyjnym oraz tworzenie szczepionek do leczenia alergii i raków.

Pierwsze i drugie miejsca przyłączania są szczególnie ważnymi elementami kompozycji według wynalazku. W różnych rozwiązaniach wynalazku, pierwszym i/lub drugim miejscem przyłączania może być antygen i skierowane przeciw niemu przeciwciało lub fragment przeciwciała; biotyna i awidyna, streptawidyna i biotyna; receptor i jego ligand; białko wiążące ligand i jego ligand; oddziałujące białka zamka leucynowego; grupa aminowa i reaktywna wobec niej grupa chemiczna; grupa karboksylowa i reaktywna wobec niej grupa chemiczna; grupa sulfhydrylowa i reaktywna wobec niej grupa chemiczna; bądź ich kombinacja.

Wynalazek zapewnia sprzęganie prawie każdego wybranego antygenu z powierzchnią wirusa, bakteriofaga, cząstki wirusopodobnej lub cząstki kapsydu wirusowego. Przez wprowadzenie antygenu do quasi-krystalicznej struktury „wirusopodobnej”, wynalazek wykorzystuje silną przeciwwirusową reakcję immunologiczną gospodarza do wywołania wysoce skutecznej odpowiedzi immunologicznej, tj. szczepienia, przeciw prezentowanemu antygenowi.

Przedmiot wynalazku w korzystnych przykładach wykonania został przedstawiony na rysunku, na którym fig. 1. przedstawia blotting typu Western wykazujący wytwarzanie cząstek wirusowych zawierających białko fuzyjne pCYTts::E2-JUN przy zastosowaniu wektora ekspresyjnego E2JUN, fig. 2. obrazuje blotting typu Western wykazujący wytwarzanie cząstek wirusowych zawierających białko fuzyjne E2-JUN ulegające ekspresji z wektora ekspresyjnego pTESS'2J::E2JUN, fig. 3. blotting plamkowy typu Western wykazujący bakteryjną i eukariotyczną ekspresję FOS-antygen hgh, fig. 4. ekspresję HBcAg-JUN w komórkach E. coli, fig. 5. blotting typu Western wykazujący, że HBcAg-JUN jest

PL 192 016 B1 rozpuszczalne w lizatach E. coli, fig. 6. ilustruje analizę przez SDS-PAGE wzbogacenia cząstek kapsydu HBcAg-JUN w gradiencie gęstości sacharozy, a fig. 7. analizę przez SDS-PAGE w warunkach niedenaturujących sprzęgania cząstek hGH-FOS i HBcAg-JUN.

1. Definicje stosowanych terminów:

Alfawirus: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin „alfawirus” odnosi się któregokolwiek z wirusów RNA objętych rodzajem Alphavirus. Opisy przedstawicieli tego gatunku zawarte są w Strauss i Strauss, Microbiol. Rev., 58: 491-562 (1994). Przykłady alfawirusów obejmują wirusa Aura, wirusa Bebaru, wirusa Cabassou, wirusa Chikungunya, wirusa wschodnioamerykańskiego końskiego zapalenia mózgu i rdzenia, wirusa Fort Morgan, wirusa Getah, wirusa Kyzylagach, wirusa gorączki Mayaro, wirusa Middleburg, wirusa Mucambo, wirusa Ndumu, wirusa Pixuna, wirusa Tonate, wirusa Triniti, wirusa Una, zachodnioamerykańskiego końskiego zapalenia mózgu i rdzenia, wirusa Whataroa, wirusa Sindbis (SIN), wirusa gorączki Semliki Forest (SFV), wirusa wenezuelskiego końskiego zapalenia mózgu i rdzenia (VEE) i wirusa Ross River.

Antygen: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin „antygen” oznacza cząsteczkę zdolną do ulegania wiązaniu przez przeciwciało. Antygen jest ponadto zdolny do indukowania humoralnej odpowiedzi immunologicznej i/lub komórkowej odpowiedzi immunologicznej, co prowadzi do wytwarzania limfocytów B i/lub T. Antygen może posiadać jeden lub więcej epitopów (epitopów B i T). Specyficzną reakcję, określoną powyżej, należy rozumieć jako oznaczającą, że antygen będzie reagował, w sposób wysoce selektywny, z odpowiadającym mu przeciwciałem, a nie z wieloma innymi przeciwciałami, które mogą być pobudzone przez inne antygeny.

Determinanta antygenowa: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin „determinanta antygenowa” należy rozumieć jako odnoszący się do tej części antygenu, która jest specyficznie rozpoznawana przez limfocyty B albo T. Limfocyty B odpowiadają na obce determinanty antygenowe wytwarzaniem przeciwciał, podczas gdy limfocyty T są mediatorami odporności komórkowej. A zatem, determinantami antygenowymi lub epitopami są te części antygenu, które są rozpoznawane przez przeciwciała lub, w kontekście MHC, przez receptory komórek T.

Połączenie: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie termin „połączenie”, jeśli dotyczy pierwszego i drugiego miejsca przyłączania, stosuje się w odniesieniu do co najmniej jednego wiązania niepeptydowego. Charakter połączenia może być kowalencyjny, jonowy, hydrofobowy, polarny lub stanowić ich dowolną kombinację.

Miejsce przyłączania, pierwsze: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie zwrot „pierwsze miejsce przyłączania” odnosi się do elementu „organizatora”, związanego z cząstką rdzenia w sposób nielosowy, z którym może łączyć się drugie miejsce przyłączania, położone na antygenie lub determinancie antygenowej. Pierwszym miejscem przyłączania może być białko, polipeptyd, peptyd, cukier, polinukleotyd, polimer naturalny lub syntetyczny, wtórny metabolit lub związek (biotyna, fluoresceina, retinol, digoksygenina, jony metali, fluorek fenylometylosulfonylu), bądź ich kombinacja, lub ich chemicznie reaktywna grupa. Na powierzchni niewystępującego naturalnie rusztowania molekularnego obecnych jest wiele pierwszych miejsc przyłączania w powtarzającej się konfiguracji.

Miejsce przyłączania, drugie: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie zwrot „drugie miejsce przyłączania” odnosi się do elementu połączonego z antygenem lub determinantą antygenową, z którym może łączyć się pierwsze miejsce przyłączania, położone na powierzchni niewystępującego naturalnie rusztowania molekularnego. Drugim miejscem przyłączania antygenu lub determinanty antygenowej może być białko, polipeptyd, peptyd, cukier, polinukleotyd, polimer naturalny lub syntetyczny, wtórny metabolit lub związek (biotyna, fluoresceina, retinol, digoksygenina, jony metali, fluorek fenylometylosulfonylu), bądź ich kombinacja, lub ich chemicznie reaktywna grupa. Na antygenie lub determinancie antygenowej obecne jest co najmniej jedno drugie miejsce przyłączania.

Cząstka rdzenia: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie termin „cząstka rdzenia” odnosi się do sztywnej struktury o właściwym powtarzalnym uorganizowaniu, która zapewnia fundament dla przyłączania „organizatora”. Cząstką rdzenia w znaczeniu tu stosowanym może być produkt procesu syntezy lub produkt procesu biologicznego.

Działający w konfiguracji cis: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie zwrot sekwencja „działająca w konfiguracji cis” odnosi się do sekwencji kwasów nukleinowych, z którymi wiąże się replikaza w celu katalizowania zależnej od RNA replikacji cząsteczek RNA. Wynikiem tych zdarzeń replikacji jest replikacja pełnej długości i częściowych cząsteczek, a zatem subgenomowy promotor alfawirusa również jest sekwencją „działającą w konfiguracji cis”. Sekwencje „działające w konfiguracji

PL 192 016 B1 cis” mogą być położone na lub blisko końca 5', końca 3' bądź obu końców cząsteczki kwasu nukleinowego, jak również wewnętrznie.

Fuzja: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie termin „fuzja” odnosi się do kombinacji sekwencji aminokwasowych o różnym pochodzeniu w jednym łańcuchu polipeptydowym przez połączenie w jednej ramce odczytu kodujących je sekwencji nukleotydowych. Termin „fuzja” zdecydowanie obejmuje fuzje wewnętrzne, tj. insercje sekwencji o różnym pochodzeniu w łańcuchu polipeptydowym, poza fuzją na jednym z jego końców.

Sekwencja heterologiczna: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie termin „sekwencja heterologiczna” odnosi się do drugiej sekwencji nukleotydowej obecnej w wektorze według wynalazku. Termin „sekwencja heterologiczna” odnosi się również do każdej sekwencji aminokwasowej lub RNA kodowanej przez heterologiczna sekwencję DNA zawartą w wektorze według wynalazku. Heterologiczne sekwencje nukleotydowe mogą kodować białka lub cząsteczki RNA, normalnie ulegające ekspresji w rodzaju komórek, w których są one obecne, bądź cząsteczek, które normalnie nie ulegają w nich ekspresji (np. białka strukturalne Sindbis).

Wyizolowana: W znaczeniu stosowanym w niniejszym wynalazku, gdy termin „wyizolowana” stosuje się w odniesieniu do cząsteczki, oznacza on, że cząsteczka została usunięta z jej natywnego środowiska. Na przykład, polinukleotyd lub polipeptyd naturalnie obecny w żyjącym zwierzęciu nie jest „wyizolowany”, ale ten sam polinukleotyd lub polipeptyd oddzielony od współwystępującego materiału z jego stanu naturalnego jest „wyizolowany”. Ponadto, do celów niniejszego wynalazku zrekombinowane cząsteczki DNA zawarte w wektorze uważa się za wyizolowane. Wyizolowane cząsteczki RNA obejmują produkty replikacji in vivo lub in vitro cząsteczek DNA i RNA. Wyizolowane cząsteczki kwasów nukleinowych obejmują ponadto cząsteczki utworzone syntetycznie. Dodatkowo, cząsteczki wektora zawarte w zrekombinowanych cząsteczkach gospodarza również są wyizolowane. A zatem, nie wszystkie cząsteczki „wyizolowane” muszą być „oczyszczone”.

Czynnik immunoterapeutyczny: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie termin „czynnik immunoterapeutyczny” odnosi się do kompozycji do leczenia chorób lub zaburzeń. Bardziej szczegółowo, termin stosuje się w odniesieniu do sposobu leczenia alergii lub sposobu leczenia raka.

Osobnik: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie termin „osobnik” odnosi się do organizmu wielokomórkowego i obejmuje zarówno rośliny, jak i zwierzęta. Korzystnymi organizmami wielokomórkowymi są zwierzęta, korzystniejszymi kręgowce, jeszcze korzystniejszymi są ssaki, a najkorzystniejszymi są ludzie.

Niski lub niewykrywalny: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, zwrot „niski lub niewykrywalny”, gdy stosuje się go w odniesieniu do poziomu ekspresji genu, dotyczy poziomu ekspresji, który jest albo znacząco niższy od tego widocznego, gdy gen ulega maksymalnej indukcji (np., co najmniej pięciokrotnie niższy), albo nie jest łatwo wykrywalny metodami stosowanymi w poniższej części z przykładami.

Lektyna: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, białka, szczególnie otrzymane z nasion roślin strączkowych, ale również z wielu innych źródeł roślinnych i zwierzęcych, posiadające miejsca wiązania specyficznych mono- lub oligosacharydów. Przykłady obejmują konkanawalinę A i aglutyninę kiełków pszenicznych, które szeroko stosuje się jako analityczne i preparatywne czynniki w badaniach glikoprotein.

Pochodzenie naturalne: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin „pochodzenie naturalne” oznacza, że całość lub jej części nie są syntetyczne i istnieją lub są wytwarzane w przyrodzie.

Nienaturalny: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin generalnie oznacza niewystępujący w przyrodzie, bardziej szczegółowo termin oznacza wykonany przez człowieka.

Pochodzenie nienaturalne: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie termin „pochodzenie nienaturalne” generalnie oznacza pochodzenie syntetyczne lub nie z przyrody; bardziej szczegółowo termin oznacza wykonany przez człowieka.

Sztuczne rusztowanie molekularne: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie zwrot „sztuczne rusztowanie molekularne” odnosi się do jakiegokolwiek produktu wykonanego przez człowieka, który może służyć do zapewnienia sztywnego i powtarzalnego układu pierwszych miejsc przyłączania. Najlepiej, ale nie koniecznie, te pierwsze miejsca przyłączania występują w porządku geometrycznym. Sztuczne rusztowanie molekularne może być organiczne lub nieorganiczne i może zostać zsyntetyzowane chemicznie lub w procesie biologicznym, w części lub w całości. Sztuczne rusztowanie molekularne składa się z: (a) cząstki rdzenia, pochodzenia albo naturalnego, albo nienaturalnego, oraz (b) organizatora, który sam zawiera co najmniej jedno pierwsze miejsce przyłączania i jest

PL 192 016 B1 połączony z cząstką rdzenia co najmniej jednym wiązaniem kowalencyjnym. W szczególnym rozwiązaniu, sztuczne rusztowanie molekularne może być wirusem, cząstką wirusopodobną, cząstką kapsydu wirusowego, fagiem lub ich uzyskaną technikami rekombinacyjnymi postacią, bądź cząstką syntetyczną.

Uporządkowany i powtarzalny układ antygenu lub determinanty antygenowej: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie termin „uporządkowany i powtarzalny układ antygenu lub determinanty antygenowej” ogólnie odnosi się do powtarzalnego wzoru antygenu lub determinanty antygenowej, charakteryzującego się jednolitym uporządkowaniem przestrzennym antygenów lub determinant antygenowych w odniesieniu do rusztowania. W jednym rozwiązaniu wynalazku, powtarzalnym wzorem może być wzór geometryczny. Najlepszy uporządkowany i powtarzalny układ antygenu lub determinanty antygenowej posiadał będzie ściśle powtarzalne krystaliczne uporządkowanie antygenu lub determinanty antygenowej z odstępami od 5 do 15 nanometrów.

Organizator: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie termin „organizator” stosuje się w odniesieniu do elementu związanego w nielosowy sposób z cząstką rdzenia, który zapewnia miejsce zarodkowania do tworzenia uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenu. Organizator jest elementem obejmującym co najmniej jedno pierwsze miejsce przyłączania, które jest związane z cząstką rdzenia co najmniej jednym wiązaniem kowalencyjnym. Organizator może być białkiem, polipeptydem, peptydem, aminokwasem (tj. resztą białka, polipeptydu lub peptydu), cukrem, polinukleotydem, polimerem naturalnym lub syntetycznym, wtórnym metabolitem lub związkiem (biotyną, fluoresceiną, retinolem, digoksygeniną, jonami metalu, fluorkiem fenylometylosulfonylu) lub ich kombinacją, bądź ich grupą reaktywną chemicznie.

Temperatura permisywna: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, zwrot „temperatura permisywna” odnosi się do temperatury, w której enzym posiada stosunkowo wysokie poziomy aktywności katalitycznej.

Oczyszczona: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, gdy termin „oczyszczona” stosuje się w odniesieniu do cząsteczki, oznacza on, że stężenie cząsteczki, która została oczyszczona, zostało zwiększone w stosunku do cząsteczek towarzyszącej jej w jej naturalnym środowisku. Naturalnie towarzyszące cząsteczki obejmują białka, kwasy nukleinowe, lipidy, i cukry, ale generalnie nie obejmują wody, buforów i odczynników dodawanych w celu zachowania integralności lub ułatwiania oczyszczania cząsteczki, która została oczyszczona. Na przykład, nawet jeśli mRNA rozcieńczono rozpuszczalnikiem wodnym podczas chromatografii na kolumnie z oligo-dT, cząsteczki mRNA oczyszczono przez tę chromatografię, jeśli naturalnie towarzyszące kwasy nukleinowe i inne cząsteczki biologiczne nie wiązały się z kolumną i zostały oddzielone od będących przedmiotem zainteresowania cząsteczek mRNA.

Receptor: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie termin „receptor” odnosi się do białek lub glikoprotein, bądź ich fragmentów, zdolnych do oddziaływania z inną cząsteczką, noszącą nazwę liganda. Ligand może należeć do jakiejkolwiek klasy związków biochemicznych lub chemicznych. Receptor nie musi koniecznie być białkiem związanym z błoną. Receptorami są również białka rozpuszczalne, np. białko wiążące maltozę lub białko wiążące retinol.

Reszta: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie termin „reszta” oznacza określony aminokwas w szkielecie polipeptydowym, bądź łańcuch boczny.

Wrażliwy na temperaturę: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, zwrot „wrażliwy na temperaturę” odnosi się do enzymu, który z łatwością katalizuje reakcję w jednej temperaturze, ale tę samą reakcję katalizuje wolno lub nie katalizuje jej wcale w innej temperaturze. Przykładem enzymu wrażliwego na temperaturę jest białko replikazy kodowane przez wektor pCYTts, które posiada w innej temperaturze. Przykładem enzymu wrażliwego na temperaturę jest białko replikazy kodowane przez wektor pCYTts, które posiada łatwo wykrywalną aktywność replikazy w temperaturach niższych od 34°C i posiada niską lub niewykrywalną aktywność w temperaturze 37°C.

Transkrypcja: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, termin „transkrypcja” odnosi się do wytwarzania cząsteczek RNA z matryc DNA, katalizowane przez polimerazy RNA.

Zrekombinowana komórka gospodarza: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie termin „zrekombinowana komórka gospodarza” odnosi się do komórki gospodarza, do której wprowadzono jedną lub więcej cząsteczek kwasów nukleinowych według wynalazku.

Zrekombinowany wirus: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, zwrot „zrekombinowany wirus” odnosi się do wirusa, który został zmodyfikowany genetycznie przez człowieka. Zwrot obejmuje wszystkie wirusy znane w nauce. Bardziej szczegółowo, zwrot odnosi się do alfawirusa zmodyfikowanego

PL 192 016 B1 genetycznie przez człowieka, a najbardziej szczegółowo zwrot odnosi się do wirusa Sindbis zmodyfikowanego genetycznie przez człowieka.

Temperatura restryktywna: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie, zwrot „temperatura restryktywna” odnosi się do temperatur, w których enzym posiada niskie lub niewykrywalne poziomy aktywności katalitycznej. Znane są mutanty zarówno wrażliwe na „gorąco”, jak i na „zimno”, a zatem temperatura restryktywna może być wyższa lub niższa od temperatury permisywnej.

Zdarzenie zależnej od RNA replikacji RNA: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie zwrot „zdarzenie zależnej od RNA replikacji RNA” odnosi się do procesów, których wynikiem jest wytwarzanie cząsteczki RNA przy wykorzystaniu cząsteczki RNA jako matrycy.

Zależna od RNA polimeraza RNA: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie zwrot „zależna od RNA polimeraza RNA” odnosi się do polimerazy, która katalizuje tworzenie cząsteczki RNA z innej cząsteczki RNA. Termin stosuje się w opisie jako synonim terminu „replikaza”.

RNA nieulegający translacji: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie zwrot „RNA nieulegający translacji” odnosi się do sekwencji lub cząsteczki RNA, która nie koduje otwartej ramki odczytu, bądź koduje otwartą ramkę odczytu, lub jej część, ale w formacie, w którym nie będzie wytwarzana sekwencja aminokwasowa (np. nie jest obecny kodon inicjacji). Przykładami takich cząsteczek są cząsteczki tRNA, cząsteczki rRNA i rybozymy.

Wektor: W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie termin „wektor” odnosi się do czynnika (np. plazmidu lub wektora) stosowanego do przenoszenia materiału genetycznego do komórki gospodarza. Wektor może składać się albo z DNA, albo z RNA.

Jeden: Gdy w ujawnieniu tym stosuje się termin „jeden”, oznacza on, o ile nie stwierdzono inaczej, „co najmniej jeden” bądź „jeden lub więcej”.

2. Kompozycje uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenu lub determinanty antygenowej oraz sposoby ich przygotowywania

Wynalazek zapewnia kompozycje uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenu lub determinanty antygenowej. Ponadto, wynalazek umożliwia praktykom konstruowanie bez trudu uporządkowanych i powtarzalnych układów antygenów lub determinant antygenowych do różnych celów, które obejmują zapobieganie chorobom infekcyjnym, leczenie alergii i leczenie raków.

Kompozycje według wynalazku zasadniczo składają się z dwóch elementów: (1) sztucznego rusztowania molekularnego oraz (2) antygenu lub determinanty antygenowej z co najmniej jednym drugim miejscem przyłączania, zdolnym do łączenia się przez co najmniej jedno wiązanie niepeptydowe z rzeczonym pierwszym miejscem przyłączania.

Sztuczne rusztowanie molekularne obejmuje: (a) cząstkę rdzenia wybraną z grupy składającej się z (1) cząstki rdzenia pochodzenia nienaturalnego oraz (2) cząstki rdzenia pochodzenia naturalnego, oraz (b) organizatora zawierającego co najmniej jedno pierwsze miejsce przyłączania, przy czym rzeczony organizator jest połączony z rzeczoną cząstką rdzenia co najmniej jednym wiązaniem kowalencyjnym.

Antygen lub determinanta antygenowa posiada co najmniej jedno drugie miejsce przyłączania, które wybiera się z grupy składającej się z (a) miejsca przyłączania niewystępującego naturalnie z rzeczonym antygenem lub determinantą antygenową oraz (b) miejsca przyłączania występującego naturalnie z rzeczonym antygenem lub determinantą antygenową.

Wynalazek zapewnia uporządkowany i powtarzalny układ antygenu dzięki połączeniu drugiego miejsca przyłączania z pierwszym miejscem przyłączania za pomocą co najmniej jednego wiązania niepeptydowego. A zatem, antygen i determinantę antygenową oraz sztuczne rusztowanie molekularne łączy się ze sobą, dzięki temu połączeniu pierwszego i drugiego miejsca przyłączania, tworząc uporządkowany i powtarzalny układ antygenu.

Osoba stosująca wynalazek może specjalnie zaprojektować antygen lub determinantę antygenową i drugie miejsce przyłączania, tak że uporządkowanie wszystkich antygenów lub determinant antygenowych związanych z sztucznym rusztowaniem molekularnym będzie jednolite. Na przykład, można umieścić pojedyncze drugie miejsce przyłączania na antygenie lub determinancie antygenowej na końcu karboksylowym lub aminowym, w ten sposób zapewniając przez konstrukcję, że wszystkie cząsteczki antygenu lub determinanty antygenowej, które są przyłączone do sztucznego rusztowania molekularnego, będą rozmieszczone w jednolity sposób. A zatem, wynalazek zapewnia dogodny sposób umieszczania jakiegokolwiek antygenu lub determinanty antygenowej na sztucznym rusztowaniu molekularnym w określonym uporządkowaniu i powtórzeniu.

PL 192 016 B1

Jak będzie oczywiste specjalistów w tej dziedzinie, pewne rozwiązania wynalazku obejmują stosowanie technik rekombinacji kwasów nukleinowych, takich jak klonowanie, reakcja łańcuchowa polimerazy, oczyszczanie DNA i RNA, ekspresja zrekombinowanych białek w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych itp. Takie metodologie są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie i można je bez trudu znaleźć w opublikowanych podręcznikach metod laboratoryjnych (np. Sambrook, J. i in., red., Molecular Cloning, A Laboratory manual, wyd. 2., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), Ausubel, F. i in., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1987)). Podstawowe techniki laboratoryjnej dotyczące pracy z hodowlami tkankowymi linii komórkowych (Celis, J., red., Celi Biology, Academic Press, wydanie 2 (1998)) oraz technologie oparte na przeciwciałach (Harlow, E. i Lane, D., „Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)); Deutscher, M.P., „Guide to Protein Purification”, Meth. Enzymol. 128, Academic Press, San Diego (1990); Scopes, R.K., „Protein Purification Principles and Practice”, wyd. 3, Springer-Verlag, Nowy Jork (1994)) również dostatecznie opisano w literaturze; wszystkie te publikacje włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

A. Konstruowanie sztucznego rusztowania molekularnego

Jednym elementem kompozycji według wynalazku jest sztuczne rusztowanie molekularne zawierające cząstkę rdzenia i organizator. W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie zwrot „sztuczne rusztowanie molekularne” odnosi się do każdego produktu wykonanego przez człowieka, który może służyć do zapewniania sztywnego i powtarzalnego układu pierwszych miejsc przyłączania. Bardziej szczegółowo, sztuczne rusztowanie molekularne zawiera (a) cząstkę rdzenia wybraną z grupy składającej się z (1) cząstki rdzenia pochodzenia nienaturalnego oraz (2) cząstki rdzenia pochodzenia naturalnego, oraz (b) organizator zawierający co najmniej jedno pierwsze miejsce przyłączania, przy czym rzeczony organizator jest połączony z rzeczoną cząstką rdzenia co najmniej jednym wiązaniem kowalencyjnym.

Jak będzie bez trudu zrozumiałe dla specjalistów w tej dziedzinie, cząstka rdzenia sztucznego rusztowania molekularnego według wynalazku nie jest ograniczona do jakiejkolwiek określonej postaci. Cząstka rdzenia może być organiczna lub nieorganiczna, i może zostać zsyntetyzowana chemicznie lub w wyniku procesu biologicznego.

W jednym rozwiązaniu, sztuczną cząstką rdzenia może być syntetyczny polimer, micela lipidowa lub metal. Takie cząstki rdzenia są znane w nauce, zapewniając podstawę, z której buduje się nowe sztuczne rusztowanie molekularne według wynalazku. Dla przykładu, cząstki rdzenia z syntetycznego polimeru lub metalu opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 770 380, który ujawnia stosowanie kaliksarenowego rusztowania organicznego, do którego przyłącza się liczne pętle peptydowe, tworząc „układ naśladujący przeciwciało”, a opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 334 394 opisuje nanokrystaliczne cząstki stosowane do wychwytywania wirusów, które składają się z szeregu różnorodnych materiałów nieorganicznych, włącznie z metalami i materiałami ceramicznymi. Metale korzystne w tym rozwiązaniu obejmują chrom, rubid, żelazo, cynk, selen, nikiel, złoto, srebro, platynę. Korzystne w tym rozwiązaniu materiały ceramiczne obejmują ditlenek krzemu, ditlenek tytanu, tlenek glinu, tlenek rutenu i tlenek cyny. Cząstki rdzenia według tego rozwiązania mogą być wykonane z materiałów organicznych, włącznie z węglem (diamentem). Korzystne polimery obejmują polistyren, nylon i nitrocelulozę. W przypadku tego rodzaju mikrokrystalicznej cząstki, szczególnie korzystne są cząstki wykonane z tlenku cyny, ditlenek tytanu lub węgla (diamentu). Micele lipidowe można przygotowywać jakimkolwiek sposobem znanym w tej dziedzinie. Na przykład, micele można przygotowywać zgodnie z procedurą opisaną w Baiselle i Millara (Baiselle, C.J. i Millar, D.B., Biophys Chem. 4: 355-361 (1975)) lub Corti'ego i in. (Corti, M., Degrigorio, V., Sonnino, S., Ghidoni, R., Masserini, M. i Tettamanti, G., Chem. Phys. Lipids 38: 197-214 (1981)) lub Lopeza i in. (Lopez, O., de la Maza, A., Coderch, L., Lopez-Iglesias, C., Wehrli, E. i Parra, J.L., FEBS Lett. 426: 314-318 (1998)) lub Topchievej i Karezina (Topchieva, I. i Karaezin, K.J., Colloid Interface Sci. 213: 29-35 (1999)) lub Moreina i in. (Morein, B., Sundauist, B., Hoglund, S., Dalsgaard, K. i Osterhaus, A., Naturę 308: 457-60 (1984)); wszystkie te publikacje włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

Cząstkę rdzenia można również wytwarzać sposobem biologicznym, który może być procesem naturalnym lub nie. Dla przykładu, ten rodzaj rozwiązań może obejmować cząstkę rdzenia obejmującą wirusa, cząstkę wirusopodobną, faga, cząstkę kapsydu wirusowego lub ich zrekombinowaną postać. W bardziej szczegółowym rozwiązaniu, cząstka rdzenia może zawierać zrekombinowane białka rotawirusa, zrekombinowane białka wirusa Norwalk, zrekombinowane białka alfawirusa, zrekombinowane

PL 192 016 B1 białka wirusa choroby pyska i racic, zrekombinowane białka retrowirusa, zrekombinowane białka wirusa zapalenia wątroby typu B, zrekombinowane białka wirusa mozaiki tytoniu, zrekombinowane białka wirusa choroby stad, oraz zrekombinowane białka ludzkiego wirusa brodawczaka.

Cząstkę rdzenia według wynalazku, niezależnie od tego, czy jest naturalna, czy sztuczna, charakteryzuje to, że zawiera organizator, który jest połączony z naturalną lub niewystępującą naturalnie cząstką rdzenia co najmniej jednym wiązaniem kowalencyjnym. Organizator jest elementem związanym z cząstką rdzenia w sposób nielosowy, który zapewnia miejsce zarodkowania do tworzenia uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenu. Najlepiej, chociaż nie jest to konieczne, organizator jest połączony z cząstką rdzenia w sposób geometryczny. Minimalnie, organizator stanowi pierwsze miejsce przyłączania.

Jak stwierdzono uprzednio, organizatorem może być jakikolwiek element obejmujący co najmniej jedno pierwsze miejsce przyłączania, które jest związane z cząstką rdzenia co najmniej jednym wiązaniem kowalencyjnym. Organizator może być białkiem, polipeptydem, peptydem, aminokwasem (tj. resztą białka, polipeptydu lub peptydu), cukrem, polinukleotydem, polimerem naturalnym lub syntetycznym, wtórnym metabolitem lub związkiem (biotyną, fluoresceiną, retinolem, digoksygeniną, jonami metalu, fluorkiem fenylometylosulfonylu) lub ich kombinacją, bądź ich grupą reaktywną chemicznie. W bardziej szczegółowym rozwiązaniu, organizator może zawierać pierwsze miejsce przyłączania obejmujące antygen, przeciwciało lub fragment przeciwciała, biotynę, streptawidynę, receptor, ligand receptora, ligand, białko wiążące ligand, oddziałujący polipeptyd zamka leucynowego, grupę aminową, grupę chemiczną reaktywną wobec grupy aminowej, grupę karboksylową, grupę chemiczną reaktywną wobec grupy karboksylowej, grupę sulfhydrylową, grupę chemiczną reaktywną wobec grupy sulfhydrylowej, bądź ich kombinacje.

W korzystnym rozwiązaniu, cząstkę rdzenia niewystępującego naturalnie rusztowania molekularnego stanowi wirus, bakteriofag, cząstka wirusopodobna, cząstka kapsydu wirusowego lub ich zrekombinpwana postać. Jako sztuczne rusztowanie molekularne według wynalazku można wybrać jakiegokolwiek wirusa znanego w nauce, który posiada uporządkowaną i powtarzalną strukturę osłonki i/lub rdzenia; przykłady odpowiednich wirusów obejmują: wirusa Sindbis i inne alfawirusy, wirusa pęcherzykowatego zapalenia jamy ustnej, rabdowirusa (np. wirusa pryszczycy), pikornawirusa, togawirusa, ortomyksowirusa, parvowirusa, rotawirusa, wirusa Norwalk, wirusa choroby pyska i racic, retrowirusa, wirusa zapalenia wątroby typu B, wirusa mozaiki tytoniu, wirusa choroby stad, ludzkiego wirusa brodawczaka (na przykład, patrz tabela I w Bachman, M.F. i Zinkernagel, R.M., Immunol. Today 17: 553-558 (1996)).

W jednym rozwiązaniu, wynalazek wykorzystuje inżynierię genetyczną wirusa do utworzenia fuzji pomiędzy uporządkowanym i powtarzalnym białkiem osłonki wirusowej a organizatorem obejmującym wybrane heterologiczne białko, peptyd, determinantę antygenową lub reaktywną resztę aminokwasową. Konstruowanie sztucznego rusztowania molekularnego może obejmować inne manipulacje genetyczne znane specjalistom w tej dziedzinie; na przykład, pożądane może być ograniczenie zdolności zrekombinowanego wirusa do replikacji poprzez mutację genetyczną. Białko wirusowe wybrane do fuzji z białkiem organizatora (tj. pierwszym miejscem przyłączania) powinno posiadać uorganizowaną i powtarzalną strukturę, korzystniej organizację parakrystaliczną, optymalnie o odstępach 5-15 nm na powierzchni wirusa. Wynikiem utworzenia tego rodzaju białka fuzyjnego będą wielokrotne, uporządkowane i powtarzalne organizatory na powierzchni wirusa. A zatem, powstała w wyniku tego uporządkowana i powtarzalna organizacja pierwszych miejsc przyłączania będzie odzwierciedlać normalną organizację natywnego białka wirusowego.

Jak będzie dyskutowane bardziej szczegółowo w niniejszym opisie, w korzystnym rozwiązaniu wynalazku rusztowaniem jest zrekombinowany alfawirus, a bardziej szczegółowo, zrekombinowany wirus Sindbis. Alfawirusy są wirusami RNA plus, które replikują swój genomowy RNA w całości w cytoplazmie zainfekowanej komórki, bez pośredniego etapu DNA (Strauss, J. i Strauss, E., Microbiol. Rev. 58: 491-562 (1994)). Kilku przedstawicielom rodziny alfawirusów, wirusowi Sindbis (Xiong, C. i in., Science 243: 1188-1191 (1989); Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11: 18-22 (1993)), wirusowi gorączki Semliki Forest (SFV) (Liljestrom, P. i Garoff, H., Bio/Technology 9: 1356-1361 (1991)) oraz innym (Davis, N.L. i in., Virology 171: 189-204 (1989)) poświęcono wiele uwagi pod względem ich wykorzystania do opartych na wirusach wektorów ekspresyjnych dla szeregu różnych białek (Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 578-582 (1997); Liljestrom, P., Curr. Opin. Biotechnol. 5: 495-500 (1994)) oraz jako do opracowywania szczepionek. Ostatnio u licznych pacjentów stosowano alfawirusy w celu ekspresji heterologicznych białek i opracowywania szczepionek (patrz opisy patentowe Stanów Zjednoczonych

PL 192 016 B1

Ameryki o numerach 5 766 602, 5 792 462, 5 789 245 i 5 814 482). Skonstruowania rusztowania alfawirusowego według wynalazku można dokonać sposobami generalnie znanymi w dziedzinie technik rekombinacji DNA, jak opisano w uprzednio wymienionych artykułach, które włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

Do wytwarzania opartych na wirusach cząstek rdzenia do przyłączania antygenów i determinant antygenowych można wykorzystywać szereg różnych komórek gospodarza. Na przykład, wiadomo, że alfawirusy posiadają szeroki zakres gospodarzy; wirus Sindbis infekuje komórki ssaków, gadów i płazów w hodowlach, jak również niektóre komórki owadów (Clark, H., J. Natl. cancer Inst. 51: 645 (1973); Leake, C., J. Gen. Virol. 35: 335 (1977); Stollar, V., w: Togaviruses, R. W. Schlesinger, red., Academic Press, (1980), str. 583-621). A zatem, w praktycznym stosowaniu wynalazku można wykorzystywać liczne zrekombinowane komórki gospodarza. Do wytwarzania białek heterologicznych szczególnie użyteczne są komórki BHK, COS, Vero, HeLa i CHO, ponieważ posiadają one możliwości glikozylacji białek heterologicznych w sposób podobny do komórek ludzkich (Watson, E. i in., Glycobiology 4: 227, (1994)) i można je selekcjonować (Zang, M. i in., Bio/Technology 13: 389 (1995)) lub modyfikować technikami inżynierii genetycznej (Renner, W. i in., Biotech. Bioeng. 4: 476 (1995); Lee, K. i in., Biotech. Bioeng. 50: 336 (1996)), tak aby rosły w podłożu wolnym od surowicy, jak również w zawiesinie.

Wprowadzanie wektorów polinukleotydowych do komórek gospodarza można przeprowadzać metodami opisanymi w standardowych podręcznikach laboratoryjnych (patrz, np., Sambrook, J. i in., red., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), rozdział 9; Ausubel, F. i in., red., Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997), rozdział 16), włącznie z takimi metodami, jak elektroporacja, transformacja za pośrednictwem DEAE-dekstranu, transfekcja, mikroiniekcja, transfekcja za pośrednictwem lipidów kationowych, transdukcja, wprowadzanie mechaniczne, wprowadzanie balistyczne i infekcja. Metody wprowadzania egzogennych sekwencji DNA do komórek gospodarza przedyskutowano w Felgner, P. i in., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 5 580 859.

Do infekowania komórek gospodarza można również stosować upakowane sekwencje RNA. Te upakowane sekwencje RNA można wprowadzać do komórek gospodarza przez ich dodawanie do podłoża hodowlanego. Na przykład, przygotowywanie nieinfekcyjnych cząstek alfawirusowych opisano w licznych źródłach, włącznie z „Sindbis Expression System”, wersja C (Katalog Invitrogen, nr K750-1).

Jeśli jako zrekombinowane komórki gospodarza do wytwarzania opartych na wirusach cząstek rdzenia stosuje się komórki ssacze, będą one generalnie namnażane w hodowli tkankowej. Metody namnażania komórek w hodowli są dobrze znane w nauce (patrz, np., Celis, J., red., Celi Biology, Academic Press, wydanie 2 (1998); Sambrook, J. i in., red., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel, F. i in., red., Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley & Sons, Inc. (1997); Freshney, R., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc. (1983)).

Jak będzie zrozumiałe dla specjalistów w tej dziedzinie, pierwsze miejsce przyłączania może być jakimkolwiek odpowiednim białkiem, polipeptydem, cukrem, polinukleotydem, peptydem (aminokwasem), naturalnym lub syntetycznym polimerem, metabolitem wtórnym lub ich częścią, bądź ich kombinacją, które mogą służyć do specyficznego przyłączania wybranego antygenu lub determinanty antygenowej do rusztowania. W jednym rozwiązaniu, miejscem przyłączania jest białko lub peptyd, które można wybrać spośród tych znanych w nauce. Na przykład, pierwsze miejsce przyłączania można wybrać z następującej grupy: ligand, receptor, lektyna, awidyna, streptawidyna, biotyna, epitop, taki jak znacznik HA lub T7, myc, Max, domeny immunoglobulinowe i jakakolwiek inna znana sekwencja aminokwasowa znana w nauce, która mogłaby być użyteczna jako pierwsze miejsca przyłączania.

Powinno być ponadto zrozumiałe dla specjalistów w tej dziedzinie, że dla innego rozwiązania wynalazku pierwsze miejsce przyłączania można tworzyć w drugiej kolejności w stosunku do organizatora (tj. białka lub polipeptydu) wykorzystywanego przy konstruowaniu fuzji z białkiem kapsydu w jednej ramce odczytu. Na przykład, białko można wykorzystywać do fuzji z białkiem otoczki o sekwencji aminokwasowej, o której wiadomo, że w specyficzny sposób ulega glikozylacji, a dodana w wyniku reszta cukrowa może następnie służyć jako pierwsze miejsce przyłączania rusztowania wirusowego za pomocą wiązania z lektyną, służącą jako drugie miejsce przyłączania antygenu. Alternatywnie, sekwencja organizatora może być biotynylowana in vivo i reszta biotynowa może służyć jako pierwsze miejsce przyłączania według wynalazku, lub sekwencję organizatora można poddawać in vitro

PL 192 016 B1 chemicznej modyfikacji odrębnych reszt aminokwasowych, gdzie modyfikacja służy jako pierwsze miejsce przyłączania.

Jedno szczególne rozwiązanie wynalazku wykorzystuje wirusa Sindbis. Genom RNA wirusa Sindbis jest upakowany w białkowy kapsyd, który otacza dwuwarstwa lipidowa zawierająca trzy białka, nazwane E1, E2 i E3. Te tak zwane białka otoczki są glikoproteinami i glikozylowane części położone są na zewnątrz dwuwarstwy lipidowej, gdzie kompleksy tych białek tworzą „kolce”, które, jak można zobaczyć na mikrografach elektronowych, wystają z powierzchni wirusa. W korzystnym rozwiązaniu wynalazku, jako pierwsze miejsce przyłączania wybiera się domenę zamka leucynowego białka JUN lub FOS, którą poddaje się fuzji w jednej ramce odczytu z białkiem E2 otoczki. Jednakże, dla wszystkich osób zajmujących się tą dziedziną, będzie oczywiste, że w fuzyjnym konstrukcje białkowym do umieszczania pierwszego miejsca przyłączania w rusztowaniu według wynalazku można wykorzystywać inne białka otoczki.

W najbardziej korzystnym rozwiązaniu wynalazku, jako pierwsze miejsce przyłączania wybiera się domenę zamka leucynowego białka JUN-FOS, którą poddaje się fuzji w jednej ramce odczytu z białkiem kapsydu (rdzenia) wirusa zapalenia wątroby typu B. Jednakże, dla wszystkich osób zajmujących się tą dziedziną będzie jasne, że w fuzyjnym konstrukcje białkowym do umieszczania pierwszego miejsca przyłączania w rusztowaniu według wynalazku można wykorzystywać inne białka kapsydu wirusowego.

W innym korzystnym rozwiązaniu wynalazku, jako pierwsze miejsce przyłączania wybiera się resztę lizyny lub cysteiny, którą poddaje się fuzji w jednej ramce odczytu z białkiem kapsydu (rdzenia) wirusa zapalenia wątroby typu B. Jednakże, dla wszystkich osób zajmujących się tą dziedziną będzie oczywiste, że w fuzyjnym konstrukcje białkowym do umieszcznia pierwszego miejsca przyłączania w rusztowaniu według wynalazku można wykorzystywać inny kapsyd wirusowy lub cząstki wirusopodobne.

Przykład 1 przedstawiono w celu zademonstrowania konstruowania w jednej ramce odczytu białka fuzyjnego pomiędzy białkiem E2 otoczki wirusa Sindbis a domeną zamka leucynowego białka JUN z zastosowaniem wektora Hahna i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2679-2683 (1992)). Sekwencja aminokwasowa JUN wykorzystana do pierwszego miejsca przyłączania jest następująca:

CGGRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 59)

W tym przypadku, przewidywanym drugim miejscem przyłączania na antygenie może być domena zamka leucynowego białka FOS, a sekwencja aminokwasowa może być następująca:

CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 60).

Sekwencje te pochodzą z czynników transkrypcyjnych JUN i FOS, i każdą z nich flankuje po obu stronach krótka sekwencja zawierająca resztę cysteiny. O sekwencjach tych wiadomo, że oddziałują ze sobą wzajemnie. Oryginalna hipotetyczna struktura zaproponowana dla dimeru JUN-FOS zakładała, że hydrofobowe łańcuchy boczne monomeru splatają się z odpowiednimi łańcuchami bocznymi drugiego monomeru w sposób podobny jak w zamku błyskawicznym (Landschulz i in., Science 240: 1759-1764 (1988)). Jednakże, hipoteza ta okazała się zła i wiadomo, że białka te tworzą superhelisę helis a (0'Shea i in., Science 243: 538-542 (1989); O'Shea i in., Cell 68: 699-708 (1992); Cohen i Parry, Trends Biochem. Sci. 11: 245-248 (1986)). A zatem, termin „zamek leucytowy” często stosuje się w odniesieniu do tych domen białkowych z powodów bardziej historycznych, niż strukturalnych. W tym opisie patentowym termin „leucynowy zamek błyskawiczny” stosuje się w odniesieniu do sekwencji przedstawionych powyżej lub sekwencji zasadniczo podobnych do tych przedstawionych powyżej. Terminy JUN i FOS stosuje się raczej dla ich odpowiednich domen leucynowego zamka błyskawicznego, niż całych białek JUN i FOS.

W jednym rozwiązaniu, wynalazek zapewnia wytwarzanie rusztowania E2 wirusa Sindbis-JUN z zastosowaniem układu ekspresyjnego pCYTts (zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 60/079 562, złożone 27 marca 1998 r.). Układ ekspresyjny pCYTts zapewnia nowe wektory ekspresyjne, które umożliwiają ścisłą regulację ekspresji genów w komórkach eukariotycznych. Wektory DNA tego układu ulegają transkrypcji z utworzeniem cząsteczek RNA, które następnie replikowane są przez temperaturowrażliwą replikazę z utworzeniem dodatkowych cząsteczek RNA. Utworzone przez replikację cząsteczki RNA obejmuje sekwencję nukleotydową, która może ulegać translacji z utworzeniem białka będącego przedmiotem zainteresowania, lub która koduje jedną lub więcej nieulegających

PL 192 016 B1 translacji cząsteczek RNA. A zatem, układ ekspresyjny umożliwia wytwarzanie zrekombinowanych cząstek wirusa Sindbis.

Przykład 2 podaje szczegóły dotyczące wytwarzania sztucznego rusztowania molekularnego E2 wirusa Sindbis-JUN według wynalazku. Dodatkowo, w przykładzie 3 podano inny sposób wytwarzania zrekombinowanego rusztowania E2 wirusa Sindbis-JUN z zastosowaniem utworzonego w przykładzie 1 wektora pTE5'-2JE2:JUN. A zatem, wynalazek zapewnia dwa sposoby, układ ekspresyjny pCYTts (przykład 2) i układ wektora pTE5'2J (Przykład 3), dzięki którym można wytwarzać zrekombinowane, sztuczne rusztowanie molekularne E2 wirusa Sindbis-JUN. Analizę cząstek wirusowych wytworzonych w każdym układzie przedstawiono na fig. 1 i na fig. 2.

Jak stwierdzono uprzednio, wynalazek obejmuje oparte na wirusach cząstki rdzenia, które obejmują wirusa, cząstkę wirusopodobną, faga, cząstkę kapsydu wirusowego lub ich zrekombinowaną postać. Specjaliści posiadają wiedzę umożliwiającą im wytwarzanie takich cząstek rdzenia i przyłączania do nich organizatorów. W celu dostarczenia innych przykładów, wynalazek zapewnia w niniejszym opisie sposób wytwarzania cząstek podobnych do wirusa zapalenia wątroby typu B oraz cząstek kapsydu wirusa odry jako cząstek rdzenia (przykłady od 17 do 22). W takim rozwiązaniu, jako organizator, a stąd jako pierwsze miejsce przyłączania, dla sztucznego rusztowania molekularnego według wynalazku, można zastosować domenę zamka leucynowego białka JUN lub domenę zamka leucynowego białka FOS.

Przykłady 23-29 podają szczegóły dotyczące wytwarzania cząstek rdzenia wirusa zapalenia wątroby typu B niosących peptyd poddany fuzji w jednej ramce odczytu z reaktywną resztą lizyny oraz antygenów niosących wprowadzoną przez fuzję genetyczną resztę cysteiny, odpowiednio jako pierwsze i drugie miejsce przyłączania.

B. Konstruowanie antygenu lub determinanty antygenowej z drugim miejscem przyłączania

Drugim elementem w kompozycji według wynalazku jest antygen lub determinanta antygenowa, posiadająca co najmniej drugie miejsce przyłączania, zdolne do łączenia się poprzez co najmniej jedno wiązanie niepeptydowe z pierwszym miejscem przyłączania sztucznego rusztowania molekularnego. Wynalazek zapewnia kompozycje, które różnią się pod względem wybranego antygenu lub determinanty antygenowej w zależności pożądanego wpływu terapeutycznego. Inne kompozycje zapewnia się przez zróżnicowanie cząsteczki wybranej jako drugie miejsce przyłączania.

Antygeny według wynalazku można wybierać z grupy składającej się z: (a) białek odpowiednich do indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciw komórkom raka; (b) białek odpowiednich do indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciw chorobom infekcyjnym; (c) białek odpowiednich do indukcji odpowiedzi immunologicznej przeciw alergenom oraz (d) białek odpowiednich do indukcji odpowiedzi immunologicznej u zwierząt hodowlanych.

W jednym szczególnym rozwiązaniu wynalazku, antygen lub determinanta antygenowa są użyteczne do zapobiegania chorobie infekcyjnej. Takie traktowanie będzie użyteczne do leczenia szerokiego zakresu chorób infekcyjnych dotykających szerokiego zakresu gospodarzy, np. człowieka, krowę, owcę, świnię, psa, kota, inne gatunki ssaków, jak również gatunki nienależące do ssaków. Choroby infekcyjne, które można leczyć są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie; przykłady obejmują infekcje o etiologii wirusowej, takie jak powodowane przez HIV, grypa, powodowane przez wirusa opryszczki, wirusowe zapalenie wątroby, powodowane przez wirusa Epsteina-Barra, powodowane przez wirusa polio, wirusowe zapalenie mózgu, odrą, ospa wietrzna, itp., lub infekcje o etiologii bakteryjnej, takie jak zapalenie płuc, gruźlica, kiła itp., bądź infekcje o etiologii pasożytniczej, takie jak malaria, trypanosomatoza, leiszmanioza, rzęsistkowica, amebiaza itp. A zatem, antygeny lub determinanty antygenowe wybrane do kompozycji według wynalazku będą dobrze znane specjalistom z dziedziny medycyny; przykłady antygenów lub determinant antygenowych obejmują: antygeny gp140 i gp160 HIV, antygeny hemaglutyninę i neuraminidazę wirusa grypy, antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B, białko circum-sporozoitów zarodźca malarii.

W innym szczególnym rozwiązaniu, kompozycje według wynalazku są czynnikami immunoterapeutycznymi, które mogą być użyteczne do leczenia alergii lub raka.

Wybór antygenów lub determinant antygenowych do kompozycji i sposobu leczenia alergii będzie znany specjaliście w dziedzinie medycyny leczącemu takie zaburzenia; reprezentatywne przykłady tego typu antygenu lub determinanty antygenowej obejmują: fosfolipazę A2 jadu pszczół, Bet v I (alergen pyłku brzozy), 5 Dol m V (alergen jadu szerszenia), Der p I (alergen roztoczy kurzu domowego).

Wybór antygenów lub determinant antygenowych do kompozycji i sposobu leczenia raka będzie znany specjaliście w dziedzinie medycyny leczącemu takie zaburzenia; reprezentatywne przykłady

PL 192 016 B1 tego typu antygenu lub determinanty antygenowej obejmują: Her2 (rak gruczołu sutkowego), GD2 (nerwiak niedojrzały), EGF-R (glejak złośliwy), CEA (rak rdzeniasty tarczycy), CD52 (białaczka).

W określonym rozwiązaniu wynalazku, antygen lub determinantę antygenową wybiera się z grupy składającej się z: (a) zrekombinowanego białka HIV, (b) zrekombinowanego białka wirusa grypy, (c) zrekombinowanego białka wirusa zapalenia wątroby typu C, (d) zrekombinowanego białka ToKoplasma, (e) zrekombinowanego białka Plasmodium falciparum, (f) zrekombinowanego białka Plasmodium vivax, (g) zrekombinowanego białka Plasmodium ovale, (h) zrekombinowanego białka Plasmodium malariae, (i) zrekombinowanego białka komórek raka gruczołu sutkowego, (j) zrekombinowanego białka komórek raka nerki, (k) zrekombinowanego białka komórek raka gruczołu krokowego, (l) zrekombinowanego białka komórek raka skóry, (m) zrekombinowanego białka komórek raka mózgu, (n) zrekombinowanego białka komórek białaczkowych, (o) zrekombinowanej profiliny, (p) zrekombinowanego białka alergii na użądlenie pszczoły, (q) zrekombinowanego białka alergii na orzechy, (r) zrekombinowanych białek alergii pokarmowych, zrekombinowanych białek astmy oraz zrekombinowanego białka Chlamydia.

Po wybraniu antygenu lub determinanty antygenowej kompozycji, podczas przygotowywania do konstruowania uporządkowanego i powtarzalnego układu związanego ze sztucznym rusztowaniem molekularnym według wynalazku, do cząsteczki można dodać co najmniej jedno drugie miejsce przyłączania. Wiedza na temat co może tworzyć odpowiednie drugie miejsce przyłączania, będzie znana specjaliście w tej dziedzinie. Reprezentatywne przykłady drugich miejsc przyłączania obejmują, ale nie ograniczają się do: antygenu, przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, biotyny, streptawidyny, receptora, liganda receptora, liganda, białka wiążącego ligand, oddziałującego polipeptydu zamka leucynowego, grupy aminowej, grupy chemicznej reaktywnej wobec grupy aminowej, grupy karboksylowej, grupy chemicznej reaktywnej wobec grupy karboksylowej, grupy sulfhydrylowej, grupy chemicznej reaktywnej wobec grupy sulfhydrylowej, bądź ich kombinacji.

Połączenie pomiędzy pierwszym i drugim miejscem przyłączania będzie zdeterminowane przez cechy charakterystyczne odpowiednich wybranych cząsteczek, ale będzie obejmować co najmniej jedno wiązanie niepeptydowe. Zależnie od kombinacji pierwszego i drugiego miejsca przyłączania, charakter połączenia może być kowalencyjny, jonowy, hydrofobowy, polarny lub stanowić ich dowolną kombinację.

W jednym rozwiązaniu wynalazku, drugim miejscem przyłączania może być domena zamka leucynowego białka FOS lub domena zamka leucynowego białka JUN.

W najbardziej szczegółowym rozwiązaniu wynalazku, wybranym drugim miejscem przyłączania jest domena zamka leucynowego białka FOS, która specyficznie łączy się z domeną zamka leucynowego białka JUN sztucznego rusztowania molekularnego według wynalazku. Połączenie domen zamka leucynowego białek JUN i FOS zapewnia podstawę dla tworzenia uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenu lub determinanty antygenowej na powierzchni rusztowania. Domenę zamka leucynowego białka FOS można poddać fuzji w jednej ramce odczytu z wybranym antygenem lub determinantą antygenową albo na końcu aminowym, końcu karboksylowym, albo, jeśli jest to pożądane, umiejscowioną wewnątrz białka.

Dla przykładu, zapewnia się kilka konstruktów fuzyjnych FOS. Ludzki hormon wzrostu (przykład 4), fosfolipaza A2 (PLA) jadu pszczół (przykład 9), owoalbumina (przykład 10) i gp140 HIV (przykład 12).

W celu uproszczenia tworzenia konstruktów fuzyjnych FOS, ujawnia się kilka wektorów, które zapewniają potencjalne narzędzia do projektowania i konstruowania antygenu lub determinanty antygenowej (patrz przykład 6). Wektory pAVl-4 zaprojektowano do ekspresji fuzji z FOSw E. coli, wektory pAV5 i pAV6 zaprojektowano do ekspresji białek fuzyjnych FOS w komórkach eukariotycznych. Krótko opisano właściwości tych wektorów.

1. pAVl: Wektor ten przeznaczono do wydzielania białek fuzyjnych z FOS na końcu C do przestrzeni peryplazmatycznej E. coli. Gen będący przedmiotem zainteresowania można ligować w miejscach StuI/Notl wektora.

2. pAV2; Wektor ten przeznaczono do wydzielania białek fuzyjnych z FOS na końcu N do przestrzeni peryplazmatycznej E. coli. Gen będący przedmiotem zainteresowania można ligować w miejscach NotI/EcoRV (lub Notl/Hindlll) wektora.

3. pAV3: Wektor ten przeznaczono do cytoplazmatycznego wytwarzania białek fuzyjnych z FOS na końcu C w E. coli. Gen będący przedmiotem zainteresowania można ligować w miejscach EcoRV/NotI wektora.

PL 192 016 B1

4. pAV4: Wektor ten przeznaczono do cytoplazmatycznego wytwarzania białek fuzyjnych z FOS na końcu N w E. coli. Gen będący przedmiotem zainteresowania można ligować w miejscach NotI/EcoRV (lub Notl/Hindlll) wektora. Po zsyntetyzowaniu białka, N-końcową resztę metioniny usuwa się proteolitycznie (Hirel i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8247-8251 (1989)).

5. pAV5: Wektor ten przeznaczono do eukariotycznego wytwarzania białek fuzyjnych z FOS na końcu C. Gen będący przedmiotem zainteresowania można wstawiać pomiędzy sekwencje kodujące sekwencję sygnałową hGH a domenę FOS przez ligację w miejscach Eco47III/NotI wektora. Alternatywnie, gen posiadający własną sekwencję sygnałową można poddawać fuzji z regionem kodującym FOS przez ligację w miejscach StuI/Notl.

6. pAV6: Wektor ten przeznaczono do eukariotycznego wytwarzania białek fuzyjnych z FOS na końcu N. Gen będący przedmiotem zainteresowania można ligować w miejscach Notl/StuI (lub Notl/Hindlll) wektora.

Jak będzie zrozumiałe dla specjalistów w tej dziedzinie, konstruowanie białka fuzyjnego FOS-antygen lub -determinanta antygenowa może obejmować dodawanie pewnych elementów genetycznych dla ułatwiania wytwarzania zrekombinowanego białka. Przykład 4 podaje informację na temat dodawania pewnych elementów E. coli, regulujących translację, a przykład 7 podaje informację na temat dodawania eukariotycznej sekwencji sygnałowej. Wybrać można inne elementy, zależnie od specyficznych potrzeb osoby stosującej wynalazek.

Wynalazek obejmuje również wytwarzanie białka fuzyjnego FOS-antygen lub FOS-determinanta antygenowa albo w komórkach bakteryjnych (przykład 5), albo w komórkach eukariotycznych (przykład 8). Wybór rodzaju komórek, w których ma zachodzić ekspresja białka fuzyjnego pozostaje w zakresie umiejętności specjalistów w tej dziedzinie i zależy od takich czynników jak to, czy w zaprojektowanej kompozycji ważne jest uwzględnienie modyfikacji potranslacyjnych.

Jak stwierdzono uprzednio, wynalazek ujawnia różne sposoby konstruowania białka fuzyjnego FOS-antygen lub FOS-determinanta antygenowa poprzez zastosowanie wektorów pAV. Poza umożliwianiem ekspresji w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych, wektory te umożliwiają osobom stosującym Wynalazek wybór pomiędzy N- i C-końcowym łączeniem z antygenem domeny zamka leucynowego białka FOS. Zapewnia się konkretne przykłady, w których wykonuje się N- i C-końcowe fuzje FOS z PLA (przykład 9) i owoalbuminą (przykład 10). Przykład 11 przedstawia oczyszczanie białek fuzyjnych PLA i owoalbuminy z FOS.

W najbardziej szczegółowym rozwiązaniu, wynalazek obejmuje antygen lub determinantę antygenową kodowane przez genom HIV. Bardziej szczegółowo, antygenem HIV jest gp140. Jak przedstawiono w przykładach 11-15, można tworzyć gp140 HIV z domeną zamka leucynowego białka FOS i syntetyzować oraz oczyszczać białko fuzyjne do przyłączania do niewystępującego naturalnie rusztowania molekularnego według wynalazku. Jak powinien wiedzieć specjalista w tej dziedzinie, w tworzeniu kompozycji według wynalazku można stosować inne antygeny lub determinanty antygenowe HIV.

W najbardziej szczegółowym rozwiązaniu wynalazku, wybranym drugim miejscem przyłączania jest reszta cysteiny, która specyficznie łączy się z resztą lizyny sztucznego rusztowania molekularnego według wynalazku. Chemiczne wiązanie reszty lizyny (Nys) i reszty cysteiny (Cyst) zapewnia podstawę do tworzenia uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenu lub determinanty antygenowej na powierzchni rusztowania. Resztę cysteiny można wprowadzić technikami inżynierii genetycznej w jednej ramce odczytu z wybranym antygenem lub determinantą antygenową albo na końcu aminowym, końcu karboksylowym, albo, jeśli jest to pożądane, umiejscowioną wewnątrz białka. Dla przykładu, zapewnia się PLA i gp140 HIV z resztą cysteiny dla wiązania z resztą lizyny pierwszego miejsca przyłączania.

C. Przygotowywanie cząstek szczepionki alfawirusowej Wynalazek zapewnia nowe kompozycje i sposoby konstruowania uporządkowanych i powtarzalnych układów antygenów. Wiadomo, że warunki składania uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenu w dużym stopniu zależą od konkretnego wyboru pierwszego miejsca przyłączania na sztucznym rusztowaniu oraz konkretnego wyboru drugiego miejsca przyłączania antygenu lub determinanty antygenowej. A zatem, wybór osoby stosującej wynalazek podczas projektowania kompozycji (tj. wybór pierwszego i drugiego miejsca przyłączania, antygenu i niewystępującego naturalnie rusztowania) determinował będzie konkretne warunki składania cząstki szczepionki alfawirusowej (połączonych uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenu oraz niewystępującego naturalnie rusztowania). Informacje dotyczące składania cząstki szczepionki alfawirusowej pozostają w zakresie umiejętności osoby stosującej wynalazek, a pomocą mogą jej służyć istniejące liczne pozycje literaturowe (np. Sambrook, J. i in., red., Molecular Cloning,

PL 192 016 B1

A Laboratory manual, wydanie 2., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

(1989), Ausubel, F. i in., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.

(1997), Celis, J., red., Cell Biology, Academic Press, wydanie 2 (1998), Harlow, E. i Lane, D., „Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988);

wszystkie te publikacje włączono do niniejszego opisu poprzez odnośniki literaturowe.

W szczególnym rozwiązaniu wynalazku, jako pierwsze i drugie miejsce przyłączania wykorzystuje się odpowiednio domeny zamka leucynowego białek JUN i FOS. W przygotowywaniu cząstek szczepionki alfawirusowej musi zostać wytworzony i oczyszczony w warunkach sprzyjających składaniu uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenu na niewystępującym naturalnie rusztowaniu. W szczególnym rozwiązaniu z zastosowaniem domeny zamka leucynowego białek JUN/FOS, FOS-antygen lub FOS-determinantę antygenową powinno się poddać traktowaniu czynnikiem redukującym (np. ditiotreitolem (DTT)) w celu zmniejszenia lub wyeliminowania przypadków tworzenia wiązań disiarczkowych (przykład 15).

Do przygotowywania niewystępującego naturalnie rusztowania (tj. zrekombinowanego wirusa Sindbis) w rozwiązaniu z zastosowaniem domeny zamka leucynowego białek JUN/FOS, zrekombinowane cząstki wirusowe E2-JUN powinno się zatężyć, zobojętnić i poddać traktowaniu czynnikiem redukującym (patrz przykład 16).

Składanie uporządkowanego i powtarzalnego układu anty genu w rozwiązaniu z zastosowaniem JUN/FOS prowadzi się w obecności układu regulującego stan oksydoredukcyjny. Cząstki wirusowe E2-JUN łączy się z 240-krotnym nadmiarem molowym FOS-antygenu lub FOS-determinanty antygenowej w ciągu 10 godzin w temperaturze 4°C. Następnie cząstki szczepionki alfawirusowej zatęża się i oczyszcza przez chromatografię (przykład 16).

W innym rozwiązaniu wynalazku, sprzęganie niewystępującego naturalnie rusztowania molekularnego z antygenem lub determinantą antygenową można przeprowadzić przez sieciowanie chemiczne. W najkorzystniejszym rozwiązaniu, czynnikiem chemicznym jest heterobifunkcjonalny czynnik sieciujący, taki jak N-hydroksysukcynimidowy ester kwasu s-maleimidokapronowego (Tanimori i in., J. Pharm. Dyn. 4: 812 (1981); Fujiwara i in., J. Immunol. Meth. 45: 195 (1981)), który zawiera (1) grupę sukcynimidową reaktywną wobec grup aminowych oraz (2) grupę maleimidową, reaktywną wobec grup SH. Heterologiczne białko lub polipeptyd pierwszego miejsca przyłączania można wtaki sposób zmodyfikować technikami inżynierii genetycznej, aby zawierały jedną lub więcej reszt lizyny, które będą służyć jako reaktywna grupa dla sukcynimidowej części heterobifunkcjonalnego czynnika sieciującego. Po chemicznym sprzęganiu z pierwszymi miejscami przyłączania sztucznego rusztowania molekularnego, grupa maleimidową heterobifunkcjonalnego czynnika sieciującego będzie dostępna do reakcji z grupą SH reszty cysteiny antygenu lub determinanty antygenowej. Preparat antygenu lub determinanty antygenowej może w tym przypadku wymagać modyfikacji reszty cysteiny do białka lub antygenu wybranego jako drugie miejsce przyłączania, tak aby mogła reagować z wolną maleimidową grupą funkcyjną czynnika sieciującego związanego z pierwszymi miejscami przyłączania niewystępującego naturalnie rusztowania molekularnego.

3. Kompozycje, szczepionki i ich podawanie oraz sposoby leczenia W jednym rozwiązaniu, wynalazek zapewnia szczepionki do zapobiegania chorobom infekcyjnym u szerokiego zakresu gatunków, szczególnie gatunków ssaków, takich jak człowiek, małpa, krowa, pies, kot, koń, świnia itp. Szczepionki można przeznaczać do leczenia infekcji o etiologii wirusowej, ta kich jak powodowane przez HIV, grypa, powodowane przez wirusa opryszczki, wirusowe zapalenie wątroby, powodowane przez wirusa Epsteina-Barra, powodowane przez wirusa polio, wirusowe zapalenie mózgu, odrą, ospa wietrzna, itp., lub infekcje o etiologii bakteryjnej, takich jak zapalenie płuc, gruźlica, kiła itp., bądź infekcji o etiologii pasożytniczej, takich jak malaria, trypanosomatoza, leiszmanioza, rzęsistkowica, amebiaza itp.

W innym rozwiązaniu, wynalazek zapewnia szczepionki do zapobiegania rakowi u szerokiego zakresu gatunków, szczególnie gatunków ssaków, takich jak człowiek, małpa, krowa, pies, kot, koń, świnia itp. Szczepionki można przeznaczać do leczenia wszystkich rodzajów raka: chłoniaków, raków, mięsaków, czerniaków itp.

W innym rozwiązaniu wynalazku, kompozycje według wynalazku można stosować w projektowaniu szczepionek do leczenia alergii. Ważnymi składowymi reakcji alergicznych są przeciwciała izotypu IgE. Komórki tuczne wiążą przeciwciała IgE na swojej powierzchni i uwalniają histaminy i inne mediatory odpowiedzi alergicznej po związaniu specyficznego antygenu z cząsteczkami IgE związanymi na powierzchni komórek tucznych. Dlatego też, zahamowanie wytwarzania przeciwciał IgE jest

PL 192 016 B1 obiecującym celem dla ochrony przed alergiami. Powinno to być możliwe przez uzyskanie pożądanej odpowiedzi pomocniczych komórek T. Odpowiedzi pomocniczych komórek T można podzielić na odpowiedzi pomocniczych komórek T typu l (TH1) i typu 2 (TH2) (Romagnani, Immunol. Today 18: 263-266 (1997)). Komórki TH1 wydzielają interferon gamma i inne cytokiny, które wyzwalają wytwarzanie przeciwciał IgGl-3 przez komórki B. W przeciwieństwie, cytokiną o krytycznym znaczeniu, wytwarzaną przez komórki TH2 jest IL-4, która kieruje wytwarzaniem przez komórki B IgG4 i IgE. W wielu układach doświadczalnych rozwój odpowiedzi TH1 i TH2 wzajemnie się wyklucza, ponieważ komórki TH1 hamują indukcję komórek TH2 i vice versa. A zatem, antygeny, które wyzwalają silną odpowiedź TH1, jednocześnie hamują rozwój odpowiedzi TH2 i tym samym wytwarzania przeciwciał IgE. Co interesujące, właściwie wszystkie wirusy indukują odpowiedź TH1 u gospodarza, a nie posiadają zdolności wyzwalania wytwarzania przeciwciał IgE (Coutelier i in., J. Exp. Med. 165: 64-69 (1987)). Ten wzór izotypowy nie jest ograniczony do żywych wirusów, ale obserwowano go również dla inaktywowanych lub zrekombinowanych cząstek wirusowych (Lo-Man i in., Eur. J. Immunol. 28: 1401-1407 (1998)). A zatem, dzięki zastosowaniu sposobów według wynalazku (np. technologii szczepionek alfawirusowych), cząstki wirusowe można dekorować różnymi alergenami i stosować do immunizacji. Z powodu otrzymywanej w wyniku „wirusowej struktury” alergenu wywoływana będzie odpowiedź TH1, wytwarzane będą „ochronne” przeciwciała IgGl-3, a zapobiegać się będzie wytwarzaniu przeciwciał IgE, które powodują reakcje alergiczne. Ponieważ antygen prezentowany jest przez cząstki wirusowe, które są rozpoznawane przez odmienną grupę pomocniczych komórek T, niż sam alergen, prawdopodobne jest, że specyficzne wobec alergenu przeciwciała IgGl-3 będą ulegać indukcji, nawet u osobników z alergią posiadających istniejące wcześniej specyficzne wobec alergenu komórki TH2. Obecność wysokich stężeń przeciwciał IgG może zapobiegać wiązaniu alergenów z IgE związanymi z komórkami tucznymi, w ten sposób hamując uwalnianie histaminy. A zatem, obecność przeciwciał IgG może zapobiegać reakcjom alergicznym, które zachodzą za pośrednictwem IgE. Typowe substancje indukujące alergie obejmują: pyłki traw, ambrozji, brzozy lub cedru atlantyckiego, kurz, roztocza, sierść zwierzęca, pleśń, jad owadów oraz leki (np. penicylina). A zatem, immunizacja osobników dekorowanymi alergenem cząstkami wirusowymi powinna być korzystna nie tylko przed, ale i po wystąpieniu alergii.

Kompozycje według wynalazku mogą zawierać sole, bufory, adiuwanty lub inne substancje, które są pożądane dla poprawy skuteczności kompozycji. Przykłady materiałów odpowiednich do stosowania w przygotowywaniu kompozycji farmaceutycznych podano w licznych źródłach, włącznie z Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A., red., Mack Publishing Co., (1980)).

O kompozycjach według wynalazku mówi się, że są „farmaceutycznie dopuszczalne”, jeśli ich podawanie może być tolerowane przez osobnika biorcę. Ponadto, kompozycje według wynalazku będą podawane w „ilości skutecznej terapeutycznie” (tj. w ilości, która wywołuje pożądany wpływ fizjologiczny).

Kompozycje według wynalazku można podawać różnymi sposobami znanymi w dziedzinie, ale normalnie podawać się je będzie przez iniekcję, infuzję, inhalację, podawanie doustne lub innymi odpowiednimi sposobami fizycznymi. Kompozycje można alternatywnie podawać domięśniowo, dożylnie lub podskórnie. Składniki kompozycji do podawania obejmują jałowe roztwory i zawiesiny wodne (np. sól fizjologiczną) lub niewodne. Przykładami rozpuszczalników niewodnych są glikol propylenowy, glikol polietylenowy, oleje roślinne, takie jak oliwa, iniekcyjne estry organiczne, takie jak olefinian etylowy. Do zwiększania przenikalności przez skórę i wzmacniania wchłaniania antygenu można stosować nośniki i opatrunki zamknięte.

Przykłady

Enzymy i odczynniki stosowane w poniższych doświadczeniach obejmowały: ligazę DNA T4 otrzymaną z New England Biolabs; polimerazę DNA Taq, QIAprep Spin Plasmid Kit, QIAGEN Plasmid Midi Kit, QiaExII Gel Extraction Kit, QIAquick PCR Purification Kit otrzymane z QIAGEN; QuickPrep Micro mRNA Purification Kit otrzymany z Pharmacia; SuperScript One-step RT PCR Kit, płodową surowicę cielęcą (FCS), bacto-trypton i ekstrakt drożdżowy otrzymane z Gibco BRL; oligonukleotydy otrzymane z Microsynth (Szwajcaria); endonukleazy restrykcyjne otrzymane z Boehringer Mannheim, New England Biolabs lub MBI Fermentas; polimerazę Pwo i dNTP otrzymane z Boehringer Mannheim. Podłoże HP-1 otrzymano z Celi Culture Technologies (Glattbrugg, Szwajcaria). Wszystkie standardowe odczynniki chemiczne otrzymano z Fluka-Sigma-Aldrich, a wszystkie materiały do hodowli komórek otrzymano z TPP.

Manipulacje DNA prowadzono stosując standardowe techniki. DNA przygotowano zgodnie z instrukcją producenta albo z hodowli bakteryjnej o objętości 2 ml stosując QIAprep Spin Plasmid Kit,

PL 192 016 B1 albo z hodowli o objętości 50 ml stosując QIAGEN Plasmid Midi Kit. Do trawienia enzymami restrykcyjnymi, DNA inkubowano w ciągu co najmniej 2 godzin z odpowiednim enzymem restrykcyjnym o stężeniu 5-10 jednostek (U) enzymu na mg DNA, w warunkach (bufor i temperatura) zalecanych przez producenta. Trawienia więcej niż jednym enzymem prowadzono jednocześnie, jeśli warunki były odpowiednie dla wszystkich enzymów, w przeciwnym przypadku kolejno. Fragmenty DNA izolowane do dalszych manipulacji rozdzielano przez elektroforezę w od 0,7 do 1,5% żelu agarozowym, wycinano z żelu i oczyszczano stosując QiaExII Gel Extraction Kit zgodnie z instrukcjami dostarczonymi przez producenta. W celu ligacji fragmentów DNA, od 100 do 200 pg oczyszczonego DNA wektora inkubowano przez noc z trzykrotnym nadmiarem molowym wstawianego fragmentu w temperaturze

16°C w obecności 1U ligazy DNA T4, w buforze dostarczonym przez producenta (objętość całkowita:

10-20 μΐ). Część (od 0,1 do 0,5 μ!) mieszaniny ligacyjnej stosowano do transformowania E. coli XL-1 Blue (Stratagene). Transformację prowadzono przez elektroporację z zastosowaniem Gene Pulser (BioRAD) i 0,1 cm Gene Pulser Cuvettes (BioRAD) przy oporze 200 Ω, pojemności elektrycznej 25 μF i napięciu 1,7 kV. Po elektroporacji komórki inkubowano z wytrząsaniem w ciągu l godziny w 1 ml podłoża S.O.B. (Miller, 1972) przed wysianiem na elekcyjny agar S.O.B.

Przykład 1

Wstawianie domeny amfipatycznej helisy JUNdo E2

Do wektora pTE5'2J (Hahn i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2679-2683, (1992)) wprowadzono miejsca restrykcyjne M1uI i BstEII pomiędzy kodony 71 (Gin) i 74 (Thr) sekwencji kodującej strukturalne białko E2, otrzymując w wyniku wektor pTE5'2JBM. Wprowadzenia tych miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne dokonano przez PCR stosując następujące oligonukleotydy:

Oligonukleotyd 1:

E2insBstEII/BssHII:

5'-ggggACGCGTGCAGCAggtaaccaccgTTAAAGAAGGCACC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym:1)

Oligonukleotyd 2:

E2insMluIStuI:

5'-cggtggttaccTGCTGCACGCGTTGCTTAAGCGACATGTAGCGG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnymi)

Oligonukleotyd 3:

E2insStuI: 5'-CCATGAGGCCTACGATACCC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym:3)

Oligonukleotyd 4:

E2insBssHII: 5'-GGCACTCACGGCGCGCTTTACAGGC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnymi)

Do przeprowadzenia reakcji PCR stosowano 100 pmoli każdego z oligonukleotydów z 5 ng DNA matrycy w 100 μΐ mieszaniny reakcyjnej zawierającej 4 jednostki polimerazy Taq lub Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 1,5 mM MgSO4. Wszystkie stężenia DNA określano fotometrycznie stosując aparat GeneQuant (Pharmacia). Polimerazę dodawano bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji PCR (punktem wyjściowym była temperatura 95°C). Cykle temperatury prowadzono w następujący sposób i w następującej kolejności: temperatura 95°C w ciągu 2 minut; pięć cykli temperatury 95°C (45 sekund), temperatury

PL 192 016 B1

53°C (60 sekund), temperatury 72°C (80 sekund) oraz 25 cykli temperatury 95°C (45 sekund), temperatury 57°C (60 sekund) i temperatury 72°C (80 sekund).

Dwa otrzymane przez PCR fragmenty analizowano i oczyszczano przez elektroforezę w żelu agarozowym. W celu otrzymania konstruktu końcowego przeprowadzono PCR łączącą dwa fragmenty otrzymane przez PCR, przy zastosowaniu do amplifikacji oligonukleotydu 3 i oligonukleotydu 4.

Do przeprowadzenia łączącej reakcji PCR zastosowano 100 pmoli każdego z oligonukleotydów z 2 ng oczyszczonych fragmentów otrzymanych przez PCR, w 100 μΐ mieszaniny reakcyjnej zawierającej 4 jednostki polimerazy Taq lub Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 1,5 mM MgSO4. Wszystkie stężenia DNA określono fotometrycznie stosując aparat GeneQuant (Pharmacia). Polimerazę dodawano bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji PCR (punktem wyjściowym była temperatura 95°C). Cykle temperatury prowadzono w następujący sposób i w następującej kolejności: temperatura 95°C w ciągu 2 minut; pięć cykli temperatury 95°C (45 sekund), temperatury 57°C (60sekund), temperatury 72°C (90 sekund) oraz 25 cykli temperatury 95°C (45 sekund), temperatury 59°C (60 sekund) i temperatury 72°C (90 sekund).

Końcowy produkt PCR oczyszczono stosując kolumny Qia spin PCR (Quiagen) i strawiono w odpowiednim buforze stosując 10 jednostek każdej z endonukleaz restrykcyjnych BssHII i Stul w ciągu 12 godzin w temperaturze 37°C. Fragmenty DNA oczyszczono z żelu i zligowano ze strawionym BssII/StuI i oczyszczonym z żelu wektorem pTES5'2J (Hahn i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2679-2683). Właściwe wstawienie produktu PCR analizowano najpierw przez analizę restrykcyjną BstEII i Mlul, a następnie przez zsekwencjonowanie DNA fragmentu otrzymanego przez PCR.

Sekwencję DNA kodującą domenę amfipatycznej helisy JUN zamplifikowano przez PCR z wektora pJuFo (Crameri i Suter, Gene 137: 69 (1993)), stosując następujące oligonukleotydy:

Oligonukleotyd 5:

JUNBstEII:

5'-CCTTCTTTAAcggtggttaccTGCTGGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 5)

Oligonukleotyd 6:

MluIJUN: 5'-AAGCATGCTGCacgcgtgTGCGGTGGTCGGATCGCCCGGC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 6)

Do przeprowadzenia reakcji PCR zastosowano 100 pmoli każdego z oligonukleotydów z 5 ng DNA matrycy w 100 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 4 jednostki polimerazy Taq lub Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 1,5 mM MgSO4. Wszystkie stężenia DNA określano fotometrycznie stosując aparat GeneQuant (Pharmacia). Polimerazę dodawano bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji PCR (punktem wyjściowym była temperatura 95°C). Cykle temperatury prowadzono w następujący sposób i w następującej kolejności: temperatura 95°C w ciągu 2 minut; pięć cykli temperatury 95°C (45 sekund), temperatury 60°C (30 sekund), temperatury 72°C (25 sekund) oraz 25 cykli temperatury 95°C (45 sekund), temperatury 68°C (30 sekund) i temperatury 72°C (20 sekund).

Końcowy produkt PCR oczyszczono z żelu i zligowano ze strawionym EcoRV i oczyszczonym z żelu pBluesriptll(KS^-). Z otrzymanego w wyniku wektora wyizolowano sekwencję JUN przez strawienie MluI/BstEII, oczyszczono stosując QiaExII i zligowano z wektorem pTE5'2JBM (uprzednio strawionym tymi samymi enzymami restrykcyjnymi) w celu otrzymania wektora pTE5'2J:E2JUN.

Przykład 2

Wytwarzanie cząstek wirusowych zawierających E2-JUN z zastosowaniem układu pCYTts

Białka strukturalne zamplifikowano przez PCR stosując pTE5'2JE2JUN jako matrycę oraz oligonukleotydy KbalStruct (ctatcaTCTAGAATGAATAGAGGATTCTTTAAC) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12) i StructBspl201 (tcgaatGGGCCCTCATCTTCG TGTGCTAGTCAG) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 87). Do przeprowadzenia reakcji PCR zastosowano 100 pmoli każdego z oligonukleotydów i 5 ng DNA matrycy w 100 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 4 jednostki polimerazy Taq lub Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 1,5 mM MgSO4. Wszystkie stężenia DNA określano fotometrycznie stosując aparat GeneQuant (Pharmacia). Polimerazę dodawano bezpośrednioprzed rozpoczęciem reakcji

PL 192 016 B1

PCR (punktem wyjściowym była temperatura 95°C). Cykle temperatury były następujące: temperatura 95°C w ciągu 3 minut; następnie 5 cykli temperatury 92°C (30 sekund), temperatury 54°C (35 sekund), temperatury 72°C (270 sekund), a następnie 25 cykli temperatury 92°C (30 sekund), temperatury 63°C (35 sekund) i temperatury 72°C (270 sekund). Produkt PCR oczyszczono z żelu i strawiono enzymami restrykcyjnymi XbaI/Bspl201 i zligowano z wektorem pCYTts, uprzednio strawionym tymi samymi enzymami (zgłoszenie patentowe Stanów Zjednoczonych Ameryki numer 60/079 562, złożone 27 marca 1998 r.).

Dwadzieścia μg pCYTtsE2: JUN inkubowano z 30 U Scal w odpowiednim buforze w ciągu co najmniej 4 godzin w temperaturze 37°C. Reakcję zatrzymano przez ekstrakcję fenolem/chloroformem, a następnie przeprowadzony w postać liniową DNA wytrącono izopropanolem. Mieszaninę reakcyjną trawienia restrykcyjnego sprawdzono przez elektroforezę w żelu agarozowym. Do transfekcji, 5,4 μg przeprowadzonego w postać liniową pCYTtsE2: JUN zmieszano z 0,6 μg przeprowadzonego w postać liniową pSV2Neo w 30 μl H₂O i dodano 30 μl 1 M roztworu CaCl₂. Po dodaniu 60 μl buforu fosforanowego (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4, pH 7,05), roztwór mieszano stosując Vortex w ciągu 5 sekund, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 25 sekund. Roztwór bezpośrednio dodano do 2 ml podłoża HP-1 zawierającego 2% FCS (podłoże z 2% FCS). Podłoże w 80% spójnej hodowli komórek BHK21 w 6-studzienkowej płytce zastąpiono następnie podłożem zawierającym DNA. Po inkubacji w ciągu 5 godzin w temperaturze 37°C w inkubatorze CO2, usunięto podłoże zawierające DNA i zastąpiono je 2 ml 15% glicerolu w podłożu z 2% FCS. Zawierające glicerol podłoże usunięto po fazie inkubacji w ciągu 30 sekund i komórki przemywano 5 ml podłoża HP-1 zawierającego 10% FCS. Ostatecznie dodano 2 ml świeżego podłoża HP-1 zawierającego 10% FCS.

Wyselekcjonowano stabilnie stransfekowane komórki i hodowano w podłożu selekcyjnym (podłoże HP-1 wzbogacone o G418) w temperaturze 37°C w inkubatorze CO2. Gdy mieszana populacja tworzyła spójną warstwę, hodowlę dzielono pomiędzy dwie szalki, po czym następował 12-godzinny okres wzrostu w temperaturze 37°C. Jedną szalkę z komórkami przenoszono do temperatury 30°C w celu indukcji ekspresji cząstek wirusowych; drugą szalkę utrzymywano w temperaturze 37°C.

Ekspresję cząstek wirusowych określano przez blotting typu Western (figura 1). Podłoże hodowlane (0,5 ml) poddawano wytrącaniu metanolem/chloroformem i osad ponownie zawieszano w buforze do próbek do SDS-PAGE. Przed nałożeniem na 15% żel poliakryloamidowy próbki ogrzewano w ciągu 5 minut w temperaturze 95°C. Po SDS-PAGE białka przenoszono na membrany nitrocelulozowe Protan (Schleicher & Schuell, Niemcy), jak opisali Bass i Yang, w: Creighton, T.E., red., Protein Function: A Practical Approach, wyd. 2., IRL Press, Oxford (1997), str. 29-55. Membranę blokowano 1% albuminą bydlęcą (Sigma) w TBS (10 x TBS, na litr: 87,7 g NaCl, 66,1 g chlorowodorku Trizma (Sigma) i 9,7 g zasady Trizma (Sigma), pH 7,4) w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano w ciągu 1 godziny z przeciwciałem skierowanym przeciw E1/E2 (surowica poliklonalna). Błot 3 razy przemywano TBS-T (TBS z 0,05% Tween20) w ciągu 10 minut i inkubowano w ciągu 1 godziny z koniugatem alkaliczna fosfataza-przeciwciało skierowane przeciw IgG królika (0,1 μg/ml, Amersham Life Science, Anglia). Po dwukrotnym przemywaniu TBS-T w ciągu 10 minut i dwukrotnym przemywaniu TBS w ciągu 10 minut, prowadzono wywoływanie reakcji stosując odczynniki do wykrywania alkalicznej fosfatazy (10 ml buforu AP (100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) z 50 μl roztworu NBT (7,7% błękit nitrotetrazolowy (Sigma) w 70% dimetyloformamidzie) i 37 μl roztworu X-Phosphate (5% fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolilu w dimetyloformamidzie).

Wytwarzanie cząstek wirusowych przedstawiono na figurze 1. Wzór na błocie typu Western wykazał, że E2-JUN (ścieżka 1) migrowało w SDS-PAGE z wyższą masą cząsteczkową w porównaniu z E2 typu dzikiego (ścieżka 2), a linia komórek gospodarza, BHK21, nie wykazywała żadnego tła.

Przykład 3

Wytwarzanie cząstek wirusowych zawierających E2-JUNz zastosowaniem wektora pTE5'2JE2: JUN

Wolny od RNAzy wektor (1,0 μg) przeprowadzono w postać liniową przez strawienie Pvul. Następnie przeprowadzono transkrypcję in vitro stosując zestaw do transkrypcji in vitro SP6 (InvitroscripCAP, InvitroGen, Invitrogen BV, NV Leek, Holandia). Otrzymany w wyniku mRNA z właściwie zmodyfikowanym końcem 5' analizowano w redukującym żelu agarozowym.

Otrzymany przez transkrypcję in vitro mRNA (5 μg) wprowadzono przez elektroporację do komórek BHK 21 (ATCC: CCL 10) zgodnie z podręcznikiem Invitrogen (Sindbis Expression system, Invitrogen BV, Holandia). Po inkubacji w ciągu 10 godzin w temperaturze 37°C, zawierające FCS podłoże wymieniono na podłoże HP-1 bez FCS, a następnie inkubowano w ciągu dodatkowych 10 godzin

PL 192 016 B1 w temperaturze 37°C. Zebrano supernatant i analizowano poprzez blotting typu Western pod kątem wytwarzania cząstek wirusowych dokładnie w taki sposób, jak opisano w przykładzie 2.

Jak przedstawiono na figurze 2, otrzymane wyniki były identyczne z tymi otrzymanymi dla pCYTtsE2: JUN.

Przykład 4

Fuzja ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) z domeną zamka leucynowego FOS (sekwencja sygnałowa OmpA)

Gen hGH bez ludzkiej sekwencji liderowej zamplifikowano z oryginalnego plazmidu (ATCC 31389) przez PCR. Zaprojektowano oligonukleotyd 7 z wewnętrznym miejscem Xbal do hybrydyzacji z końcem 5' genu hGH oraz oligonukleotyd 9 z wewnętrznym miejscem EcoRI, hybrydyzujący z końcem 3' genu hGH. Do reakcji PCR zastosowano 100 pmoli każdego z oligonukleotydów i 5 ng DNA matrycy w 75 μΐ mieszaniny reakcyjnej (4 jednostki polimerazy Taq lub Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 1,5 mM MgSO4).

Cykle PCR przeprowadzono w następujący sposób: 30 cykli z temperaturą hybrydyzacji 60°C i czasem wydłużania wynoszącym 1minutę w temperaturze 72°C.

Oczyszczony w żelu i wyizolowany produkt PCR zastosowano jako matrycę w drugiej reakcji PCR do wprowadzenia sekwencji sygnałowej ompA i sekwencji Shine-Dalgarno. Do reakcji PCR zastosowano 100 pmoli oligonukleotydów 8 i 9 oraz 1ng otrzymanego przez PCR fragmentu jako matrycy w 75 μΐ mieszaniny reakcyjnej (4 jednostki polimerazy Taq lub Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 1,5 mM MgSO4).Temperatura hybrydyzacji dla pierwszych pięciu cykli wynosiła 55°C, a czas wydłużania 60 sekund w temperaturze 72°C; następnych 25 cykli przeprowadzono z temperaturą hybrydyzacji wynoszącą 65°C i czasem wydłużania wynoszącym 60 sekund w temperaturze 72°C.

Oligonukleotyd 7:

gggtctagattcccaaccattcccttatccaggctttttgacaacgctatgctccgcgccc atcgtctgcaccagctggcctttgacacc (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 7)

Oligonukleotyd 8:

gggtctagaaggaggtaaaaaacgatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactgg ctggtttcgctaccgtagcgcaggccttcccaaccattcccttatcc (sekwencja o numerze identyfikacyjnym:8)

Oligonukleotyd 9:

cccgaattcctagaagccacagctgccctcc (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9)

Otrzymany w wyniku gen hGH zsubklonowano w pBluescript stosując XbaI/EcoRI. Właściwą sekwencję obu nici potwierdzono przez zsekwencjonowanie DNA.

Sekwencję kodującą domenę amfipatycznej helisy FOSzamplifikowano przez PCRz wektora pJuFo (Crameri i Sute, Gene 137: 69 (1993)) stosując oligonukleotydy:

PL 192 016 B1 omp- FOS·.

5'-ccTGCGGTGGTCTGACCGACACCC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10)

FOS-hgh:

5'-ccgcggaagagccaccGCAACCACCGTGTGCCGCCAGGATG-3' (sekwencj a o numerze identyfikacyjnym:11)

Do reakcji PCR zastosowano 100 pmoli każdego z oligonukleotydów i 5 ng DNA matrycy w 75 μΐ mieszaniny reakcyjnej (4 jednostki polimerazy Taq lub Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 1,5 mM MgSO4).

Cykle temperatury były następujące:

92°C w ciągu 2 minut, następnie 5 cykli temperatury 95°C (45 sekund), temperatury 60°C (30 sekund), temperatury 72°C (25 sekund), a następnie 25 cykli temperatury 95°C (45 sekund), temperatury 68°C (30 sekund) i temperatury 72°C (20 sekund).

Produkt PCR oczyszczono, wyizolowano i sklonowano w strawionym Stul pBluescript-ompA-hGH. Hybrydowy gen sklonowano w plazmidzie pKK223-3 (Pharmacia).

P rz ykła d 5

Bakteryjna ekspresja FOS-hGH

Ekspresję omp-A-FOS-hGH w pkk223-3 prowadzono pod kontrolą indukowalnego promotora zależnego od IPTG, jako szczep gospodarza E. coli stosując JM101. Ekspresję przeprowadzono w kolbach do wytrząsania. Komórki indukowano 1 mM IPTG (stężenie końcowe) przy OD600 wynoszącej 0,5. Ekspresję kontynuowano w ciągu 10 godzin w temperaturze 37°C. Komórki zbierano przez wirowanie przy 3600 w temperaturze 10°C w ciągu 15 minut. Osad komórek zamrażano (-20°C w ciekłym N2) i przechowywano w ciągu 16 godzin. Następnie osad rozmrażano w temperaturze 4°C i ponownie zawieszano w 10 ml 10 mM Tris-HC1, pH 7,4, zawierającego 600 mM sacharozy. Po mieszaniu w ciągu 15 minut w temperaturze 4°C, peryplazmatyczne białka uwalniano stosując procedurę szoku osmotycznego. Dodawano schłodzoną (4°C) H2O dejonizowaną i zawiesinę mieszano w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C. Zawiesinę rozcieńczano, ponownie zawieszano i dodawano lizozym w celu zdegradowania ścian komórkowych bakterii. Zawierający FOS-hGH supernatant analizowano przez SDS-PAGE w warunkach redukujących i nie-redukujących oraz blotting plamkowy. Blotting plamkowy prowadzono w sposób opisany w przykładzie 3, stosując przeciwciało skierowane przeciw hGH (Sigma) jako pierwsze przeciwciało i koniugat alkaliczna fosfataza (AP)-przeciwciało skierowane przeciw przeciwciałom myszy jako drugie przeciwciało.

W warunkach redukujących i nieredukuujących można było wykryć pełnej długości, właściwie zmodyfikowane FOS-hGH. Część FOS-hGH związana była z innymi, niezidentyfikowanymi białkami z powodu wolnych cystein obecnych w amfipatycznej helisie FOS. Jednakże, ponad 50% ulegającego ekspresji FOS-hGH występowało w jego natywnej konformacji monoraerycznej (figura 3).

Oczyszczone FOS-hGH zastosowane zostanie do przeprowadzenia pierwszych doświaczeń łączenia z zawierającymi JUN cząstkami wirusowymi.

P rz ykła d 6

Konstruowanie szeregu wektorów pAV do ekspresji białek fuzyjnych FOS

Skonstruowano uniwersalny układ wektorowy, który umożliwiał cytoplazmatyczne wytwarzanie lub wydzielanie białek fuzyjnych z FOS na końcu N lub C w E. coli lub wytwarzania białek fuzyjnych z FOS na końcu N lub C w komórkach eukariotycznych. Wektory pAVl-pAV4, które zaprojektowano do wytwarzania białek fuzyjnych FOS w E. coli, obejmowały wymienione poniżej kasetki DNA, które zawierają następujące elementy genetyczne ułożone w różnej kolejności: (a) miejsce silnego wiązania rybosomów i 5'-końcowy region nieulegający translacji, pochodzący z genu ompA E. coli (aggaggtaaaaaacg) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13); (b) sekwencja kodująca peptyd sygnałowy białka OmpA błony zewnętrznej E. coli (MKKTAIAIAVALAGFATVAQA) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 14); (c) sekwencja kodująca domenę dimeryzacji FOS, flankowaną po obu stronach dwiema resztami glicyny i resztą cysteiny (CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 15); oraz (d) region kodujący krótki łącznik peptydowy (AAASGG) (sekwencja

PL 192 016 B1 o numerze identyfikacyjnym: 16) lub GGSAAA (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 17)) łączący białko będące przedmiotem zainteresowania z domeną dimeryzacji FOS. Odpowiednie regiony kodujące podano dużymi literami. Ułożenie miejsc rozszczepiania restrykcyjnego umożliwia łatwe konstruowanie genów fuzyjnych FOS, z lub bez sekwencji sygnałowej. Kasetki sklonowano w miejscach restrykcyjnych EcoRI/Hindlll wektora ekspresyjnego pKK223-3 (Pharmacia) dla ekspresji genów fuzyjnych pod kontrolą silnego promotora tac.

pAV1

Wektor ten zaprojektowano do wydzielania białek fuzyjnych z FOS na końcu C do przestrzeni peryplazmatycznej E. coli. Gen będący przedmiotem zainteresowania (b.p.z.) można zligować w miejscach StuI/Notl wektora.

EcoRI

agg

taa

aaa

acg

ATG M

31/11

gaa

ttc

agg

AAA K

AAG K

ACA T

GCT A

ATC I

GCG A

61/21

Stul

ATT

GCA

GTG

GCA

CTG

GCT

GGT

TTC

GCT

ACC

GTA

GCG

CAG

GCC

I

A

V

A

L

A

G

F

A

T

V

A

Q

A

Notl

121/41

tgg

gtg

933

GCG

GCC

GCT

TCT

GGT

TGC

GGT

CTG

ACC

(bpz)

A

S

G

C

G

L

T

151/51

GAC

ACC

CTG

CAG

GCG

GAA

ACC

GAC

CAG

GTG

GAA

GAC

GAA

AAA

D

T

L

Q

A

E

T

D

Q

V

E

D

E

K

161/61

TCC

GCG

CTG

CAA

ACC

GAA

ATC

GCG

AAC

CTG

AAA

GAA

AAA

S

A

L

Q

T

E

I

A

N

L

K

E

K

11/7

'1

241/81

GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CAC GGT GGT TGC EKLEFILAAHGGC

Hindlll taa gct t (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 18)

- A (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 14 i 19) pAV2

Wektor ten zaprojektowano do wydzielania białek fuzyjnych z FOS na końcu N do przestrzeni peryplazmatycznej E. coli. Gen będący przedmiotem zainteresowania (b.p.z.) można zligować w miejscach NotI/EcoRV (lub Notl/Hindlll) wektora.

PL 192 016 B1

EcoRI

agg

taa

aaa

acg

ATG M

AAA K

AAG K

31/11

gaa

ttc

agg

ACA GCT

ATC I

GCG A

T

A

61/21

Stul

ATT

GCA

GTG

GCA

CTG

GCT

GGT

TTC

GCT

ACC

GTA

GCG

CAG

GCC

I

A

V

A

L

A

G

F

A

T

V

A

Q

A

91/31

121/41

TGC

GGT

CTG

ACC

GAC

ACC

CTG

CAG

GCG

GAA

ACC

GAC

CAG

C

G

L

T

D

T

L

Q

A

E

T

D

Q

151/51

GTG

GAA

GAC

GAA

AAA

TCC

GCG

CTG

CAA

ACC

GAA

ATC

GCG

AAC

V

E

D

E

K

S

A

L

Q

T

E

I

A

N

181/61

CTG

AAA

GAA

AAA

GAA

AAG

CTG

GAG

TTC

ATC

CTG

GCG

GCA

L

K

E

K

E

K

L

E

F

I

L

A

211/71

Notl

241/81

CAC

GGT

TGC

GGT

TCT

GCG

GCC

GCT

ggg

tgt

ggg

H

G

C

G

S

A

(bpz)

EcoRV Hindlll (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 20) gat atc aag ctt (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 21) pAV3

Wektor ten zaprojektowano do cytoplazmatycznego wytwarzania białek fuzyjnych z FOS na końcu C w E. coli. Gen będący przedmiotem zainteresowania (b.p.z.) można zligować w miejscach EcoRY/Notl wektora.

PL 192 016 B1

EcoRI EcoRV Notl gaa ttc agg agg taa aaa gat atc ggg tgt ggg GCG GCC GCT (goi) AAA

61/21

TCT GGT GGT TGC GGT GGT CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA SGGCGGLTDTLQAE

91/31 121/41

ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAA ACC GAA TDQVEDEKSALQTE

151/51

ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAG CTG CAG TTC ATC IANLLKEKEKLEFI

181/61

CTG GCG GCA CAC GGT GGT TGC taa gct t

L A A H G G C (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 22) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 23) pAV4

Wektor ten zaprojektowano do cytoplazmatycznego wytwarzania białek fuzyjnych z FOS na końcu N w E. coli. Gen będący przedmiotem zainteresowania (b.p.z.) można zligować w miejscach

NotI/EcoRV lub (Notl/Hindlll) wektora. N-końcową resztę metioniny usuwa się proteolitycznie po zsyntetyzowaniu białka (Hirel i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8247-8251 (1989)).

PL 192 016 B1

EcoRI 31/11

gaa

ttc

agg

taa

aaa

acg

ATG

GCT

TGC

GGT

CTG

ACC

E

F

R

-

K

T

M

A

C

G

L

T

61/21

GAC

ACC

CTG

CAG

GCG

GAA

ACC

GAC

CAG

GTG

GAA

GAC

GAA

AAA

D

T

L

Q

A

E

T

D

Q

V

E

D

E

K

91/31

121/41

TCC

GCG

CTG

CAA

ACC

GAA

ATC

GCG

AAC

CTG

AAA

GAA

AAA

S

A

L

Q

T

E

I

A

N

L

K

E

K

151/51

GAA AAG	CTG GAG	TTC ATC	CTG GCG GCA CAC GGT GGT TGC GGT
E	K	L	E	F	I	L	A	A H	G G	C G
GGT	TCT	Notl GCG	GCC	181/61 GCT ggg	tgt	ggg	EcoRV gat atc	Hindlll aag ctt	(sekwencja o
G	S	A	A	A	(goi)		numerze identyfikacyjnym: 24) (sekwencje o numerach identy

fikacyjnch: 88 i 25)

Wektory pAV5 i pAV6, które zaprojektowano do ekspresji białek fuzyjnych FOSw komórkach eukariotycznych, obejmują następujące elementy genetyczne ułożone w różnej kolejności: (a) region kodujący peptyd liderowy ludzkiego hormonu wzrostu (MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 26); sekwencja kodująca domenę dimeryzacji FOS flankowaną po obu stronach dwiema resztami glicyny i resztą cysteiny (CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 15); oraz (c) region kodujący krótki łącznik peptydowy (AAASGG) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 16) lub GGSAAA (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 17)) łączący białko będące przedmiotem zainteresowania z domeną dimeryzacji FOS. Odpowiednie regiony kodujące podano dużymi literami. Ułożenie miejsc rozszczepiania restrykcyjnego umożliwia łatwe konstruowanie genów fuzyjnych FOS. Kasetki sklonowano w miejscach restrykcyjnych EcoRI/Hindlll wektora ekspresyjnego pMPSYEH (Artelt i in., Gene 68: 213-219 (1988)).

pAV5

Wektor ten zaprojektowano do eukariotycznego wytwarzania białek fuzyjnych z FOS na końcu

C. Gen będący przedmiotem zainteresowania (b.p.z.) można wstawiać pomiędzy sekwencje kodujące sekwencję sygnałową hGH a domenę FOSprzez ligację w miejscach Eco47III/NotI wektora. Alternatywnie, gen posiadający własną sekwencję sygnałową można poddawać fuzji z regionem kodującym FOSprzez ligacjęw miejscach StuI/Notl.

PL 192 016 B1

EcoRI

Stul

ATG M

GCT A

ACA T

31/11

gaa

ttc

agg

cct

GGC G

TCC S

CGG R

ACG T

TCC S

CTG L

CTC L

61/21

CTG

GCT

TTT

GGC

CTG

CTC

TGC

CTG

CCC

TGG

CTT

CAA

GAG

GGC

L

A

F

G

L

C

L

P

W

L

Q

E

G

Eco47III

Notl

121/41

AGC

GCT

ggg

tgt

ggg

GCG

GCC

GCT

TCT

GGT

TGC

GGT

S

A

(goi)

A

S

G

C

G

151/51

CTG

ACC

GAC

ACC

CTG

CAG

GCG

GAA

ACC

GAC

CAG

GTG

GAA

GAC

L

T

D

T

L

Q

A

E

T

D

Q

V

E

D

181/61

GAA

AAA

TCC

GCG

CTG

CAA

ACC

GAA

ATC

GCG

AAC

CTG

AAA

E

K

S

A

L

Q

T

E

I

A

N

L

K

211/71

241/81

GAA

AAA

GAA

AAG

CTG

GAG

TTC

ATC

CTG

GCG

GCA

CAC

GGT

E

K

E

K

L

E

F

I

L

A

H

G

Hindlll

TGC taa gct t (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 27)

C (sekwencje o numerach identyfikacyjnych: 26 i 28) pAV6

N. Gen będący przedmiotem zainteresowania (b.p.z.) można ligować w miejscach Notl/StuI (lub Notl/Hindlll) wektora.

PL 192 016 B1

EcoRI

GGC G

TCC S

31/11

gaa

ttc

ATG M

GCT ACA

CGG R

ACG T

TCC S

CTG L

CTC L

CTG L

GCT A

A

T

51/21

Eco47III

TTT

GGC

CTG

CTC

TGC

CTG

CCC

TGG

CTT

CAA

GAG

GGC

AGC

GCT

F

G

L

C

L

P

W

L

Q

E

G

S

A

91/31

121/41

TGC

GGT

CTG

ACC

GAC

ACC

CTG

CAG

GCG

GAA

ACC

GAC

CAG

c

G

L

T

D

T

L

Q

A

E

T

D

Q

151/51

GTG

GAA

GAC

GAA

AAA

TCC

GCG

CTG

CAA

ACC

GAA

ATC

GCG

AAC

V

E

D

E

K

S

A

L

Q

T

E

I

A

N

181/61

CTG

CTG AAA

GAA AAA GAA AAG CTG

GAG TTC

ATC CTG GCG

GCA

L

K

E

K

E

K

L

E

F

I L

A

211/71

Notl

241/81

Stul

CAC

GGT

TGC

GGT

TCT

GCG

GCC

GCT

ggg tgt

ggg

agg

H

G

C

G

S

A

(goi)

Hindlll cct aag ctt (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 29) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 30)

Konstruowanie i ekspresja wektorów pAV1-pAV6

Następujące oligonukleotydy syntetyzowano konstruowania wektorów ekspresyjnych pAVl-pAV6:

PL 192 016 B1

FOS-F0R1:

CCTGGGTGGGGGCGGCCGCTTCTGGTGGTTGCGGTGGTCTGACC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym:31)

FOS-FOR2:

GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATCGGGTGTGGGGCGGCC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym:32)

FOS-FOR3:

GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAACGATGGCTTGCGGTGGTCTGACC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym:33)

FOS-FOR4:

GCTTGCGGTGGTCTGACC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym:34)

FOS-REV1:

CCACCAAGCTTAGCAACCACCGTGTGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 35)

FOS-REV2:

CCACCAAGCTTGATATCCCCACACCCAGCGGCCGCAGAACCACCGCAACCACCG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym:36)

FOS-REV3:

CCACCAAGCTTAGGCCTCCCACACCCAGCGGC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 37)

OmpA-FORl:

GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAACGATG (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 38) hGH-FORl:

GGTGGGAATTCAGGCCTATGGCTACAGGCTCC (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 39 ) ; i hGH-F0R2:

ggtgggaattcatggctacaggctccc (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 40)

PL 192 016 B1

W celu skonstruowania wektora pAV2, regiony kodujące sekwencję sygnałową OmpA i domenę

FOS zamplifikowano z genu fuzyjnego ompA-FOS-hGH w wektorze pKK223-3 (patrz przykład 5) stosując parę starterów OmpA-FOR1/FOS-REV2. Produkt PCR strawiono EcoRI/Hindlll i zligowano w tych samych miejscach wektora pK223-3 (Pharmacia).

W celu skonstruowania wektora pAVl, region kodujący FOS zamplifikowano z genu fuzyjnego ompA-FOS-hGH w wektorze pKK223-3 (patrz przykład 5) stosując parę starterów FOS-FOR1/FOSREV1. Produkt PCR strawiono Hindlll i zligowano ze strawionym StuI/Hindlll wektorem pAV2.

W celu skonstruowania wektora pAV3, region kodujący domenę FOS zamplifikowano z wektora pAVl stosując parę starterów FOS-FOR2/FOS-REVl. Produkt PCR strawiono EcoRI/Hindlll i zligowano w tych samych miejscach wektora pK223-3 (Pharmacia).

W celu skonstruowania wektora pAV4, region kodujący domenę FOS zamplifikowano z genu fuzyjnego ompA-FOS-hGH w wektorze pKK223-3 (patrz przykład 5) stosując parę starterów FOSFORS/FOS-REV2 . Produkt PCR strawiono EcoRI/Hindlll i zligowano w tych samych miejscach wektora pK223-3 (Pharmacia).

W celu skonstruowania wektora pAV5, region kodujący sekwencję sygnałową hGH amplifikuje się z genu fuzyjnego hGH-FOS-hGH w wektorze pSINrepS (patrz przykład 7) stosując parę starterów hHH-FORl/hGHREVl. Produkt PCR trawi się EcoRI/Notl i liguje w tych samych miejscach wektora pAV-l. Następnie izoluje się otrzymaną w wyniku kasetkę kodującą sekwencję sygnałową hGH i domenę FOS przez strawienie EcoRI/Hindlll i klonuje w wektorze pMPSYEH (Artelt i in., Gene 68: 213-219 (1988)) strawionym tymi samymi enzymami.

W celu skonstruowania wektora pAV6, region kodujący FOS amplifikuje się z wektora pAV-2 stosując parę starterów FOS-FOR4/F05REY3. Produkt PCR trawi się Hindlll i klonuje w strawionym Eco47lII/HindIII wektorze pAV-5. Następnie z otrzymanego w wyniku wektora reamplifikuje się całą kasetkę ekspresyjną kodującą sekwencję sygnałową hGH i domenę FOS stosując parę starterów hGH-FOR2/FOSREV3, trawi EcoRI/Hindlll i liguje z wektorem pMPSVEH (Artelt i in., Gene 68: 213-219 (1988)) strawionym tymi samymi enzymami.

Przykład 7

Konstruowanie FOS-hGH z ludzką sekwencją sygnałową (hGH)

Do ekspresji białka fuzyjnego FOS-hGH w komórkach eukariotycznych, gen fuzyjny OmpA-FOS-hGH wyizolowano z pBluescript:rOmpA-FOS-hGH (patrz przykład 4) przez strawienie XbaI/Bspl201 i sklonowano w wektorze pSINrep5 (Invitrogen) strawionym tymi samymi enzymami. Sekwencję sygnałową hGH zsyntetyzowano przez PCR (mieszanina reakcyjna: 50 pmoli każdego ze starterów, dATP, dGTP, dTTP, dCTP (każdy 200 μΜ), 2,5 U polimerazy DNA Taq (Qiagen), objętość całkowita 50 pl w buforze dostarczonym przez producenta; amplifikacja: temperatura 92°C w ciągu 30 sekund, temperatura 55°C w ciągu 30 sekund, temperatura 72°C w ciągu 30 sekund, 30 cykli) stosując zachodzące na siebie oligonukleotydy Sig-hGH-FOR (GGGTCTAGAATGGCTACAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTG) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 41) i Sig-hGH-REV (CGCAGGCCTCGGCACTGCCCTCTTGAAGCC-AGGGCAGGCAGAGCAGGCCAAAAGCCAG) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 42). Produkt PCR oczyszczono stosując QiaExII Kit, strawiono StuI/XbaI i zligowano z wektorem pSINrep5:OmpA-FOS-hGH strawionym tymi samymi enzymami.

Przykład 8

Ekspresja FOS-hGH w komórkach eukariotycznych

Wolny od RNAzy wektor (1,0 pg) (pSINrep5::OmpA-FOS-hGH) i 1,0 pg DHEB (Bredenbeek i in., J. Virol. 67: 6439-6446 (1993)) przeprowadzono w postać liniową przez trawienie restrykcyjne Scal. Następnie przeprowadzono transkrypcję in vitro stosując zestaw do transkrypcji in vitro SP6 (InvitroscripCAP, InvitroGen, Invitrogen BV, NV Leek, Holandia). Otrzymany w wyniku mRNA z właściwie zmodyfikowanym końcem 5' analizowano w redukującym żelu agarozowym.

pg mRNA otrzymanego przez transkrypcję in vitro wprowadzono przez elektroporację do komórek BHK 21 (ATCC: CCL 10) zgodnie z podręcznikiem Invitrogen (Sindbis Expression system, Invitrogen BV, Holandia). Po inkubacji w ciągu 10 godzin w temperaturze 37°C, zawierające FCS podłoże wymieniono na podłoże HP-1 bez FCS, a następnie inkubowano w ciągu dodatkowych 10 godzin w temperaturze 37°C. Zebrano supernatant i analizowano poprzez blotting plamkowy pod kątem wytwarzania FOS-hgh.

Podłoża hodowlane (2,5 pl) nakraplano na membranę nitrocelulozową i suszono w ciągu 10 minut w temperaturze pokojowej. Membranę blokowano 1% albuminą bydlęcą (Sigma) w TBS (10 x TBS, na litr: 87,7 g NaCl, 66,1 g chlorowodorku Trizma (Sigma) i 9,7 g zasady Trizma (Sigma), pH 7,4) w ciągu

PL 192 016 B1 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano w ciągu 1 godziny z 2 pg króliczego przeciwciała skierowanego przeciw ludzkiemu hGH (Sigma). Błot 3 razy przemywano TBS-T w ciągu 10 minut i inkubowano w ciągu 1 godziny ze skoniugowanym z alkaliczną fosfataza przeciwciałem skierowanym przeciw IgG królika (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) rozcieńczonym 1:5000 w TBS-T. Po dwukrotnym przemywaniu TBS-T w ciągu 10 minut i dwukrotnym przemywaniu TBS w ciągu 10 minut, błot wywoływano przez wybarwienie AP, jak opisano w przykładzie 2. Wyniki przedstawiono na figurze 3.

Przykład 9

Konstruowanie FOS-PLA (po stronie N-i C-końcowej). Poniższy gen skonstruowano przez chemiczną syntezę genu kodującego katalitycznie nieaktywny wariant (Forster i in., J. Allergy Clin. Iiwnunol. 95: 1229-1235 (1995)) fosfolipazy A2 (PLA) jadu pszczół.

1/1 31/11

ATC ATC TAC CCA GGT ACT CTG TGG TGT GGT CAC GGC AAC AAA IIYPGTLWCGHGNK

61/21

TCT TCT GGT CCG AAC GAA CTC GGC CGC TTT AAA CAC ACC GAC SSGPNELGRFKHTD

PL 192 016 B1

91/31 121/41

GCA

TGC

TGT

CGC

ACC

CAG

GAC

ATG

TGT CCG

GAC

GTC

ATG

TCT

A

C

R

T

Q

D

M

C P

D

V

M

S

151/51

GCT

GGT

GAA

TCT

AAA

CAC

GGG

TTA

ACT AAC

ACC

GCT

TCT

CAC

A

G

E

S

K

H

G

L

T N

T

A

S

H

181/61

ACG

CGT

CTC

AGC

TGC

GAC

TGC

GAC

AAA

TTC

TAC

GAC

TGC

T

R

L

S

C

D

C

D

K

F

Y

D

C

211/71 241/81

CTT

AAG

AAC

TCC

GCC

GAT

ACC

ATC

TCT

TAC

TTC

GTT

GGT

L

K

N

s

A

D

T

I

s

Y

F

V

G

271/91

AAA	ATG	TAT TTC	AAC	CTG	ATC	GAT	ACC	AAA	TGT	TAC	AAA CTG
K	M	Y F	N	L	I	D	T	K	C	Y	K L
		301/101									331/111
GAA	CAC	CCG GTA	ACC	GGC	TGC	GGC	GAA	CGT	ACC	GAA	GGT CGC
E	H	P V	T	G	C	G	E	R	T	E	G R

361/121

TGC C	CTG CAC	TAC ACC GTT GAC AAA TCT AAA CCG AAA GTT TAC
L	H	Y	T	V	D	K	S K P K V	Y
CAG	TGG	TTC	GAC	CTG	CGC	AAA	TAC	(sekwencja o numerze fikacyjnym: 43)	i identy-
Q	W	S	D	L	R	K	Y	(sekwencja o numerze	! identy-

fikacyjnym: 44)

Dla przeprowadzenia fuzji PLA z końcem N domeny dimeryzacji FOS, amplifikuje się region stosując oligonukleotydy PLA-FOR1 (CCATCATCTACCCAGGTAC) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 45) oraz PLA-REY1 (CCCACACCCAGCGGCCGCGTATTTGCGCAGGTCG) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 46). Produkt PCR trawi się Notl i liguje z wektorem pAVl uprzednio strawionym enzymami restrykcyjnymi StuI/Notl. Dla przeprowadzenia fuzji PLA z końcem C domeny dimeryzacji FOS, amplifikuje się region stosując oligonukleotydy PLA-FOR2 (CGGTGGTTCTGCGGCCGCTATCATCT ACCCAGGTAC) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 47) oraz PLA-REV2 (TTAGTATTTGCGCAGGTCG) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 48). Produkt PCR trawi się Notl i liguje z wektorem pAV2 uprzednio strawionym enzymami restrykcyjnymi NotI/EcoRV.

Przykład 10

Konstruowanie genu fuzyjnego FOS-owoalbumina (po stronie N- i C-końcowej)

PL 192 016 B1

W celu sklonowania sekwencji kodującej owoalbuminę, przygotowano mRNA z tkanki jajowodu kurzego stosując QuickPrep™ Micro mRNA Purification Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Stosując SuperScript™ One-step RT PCR Kit (Gibco BRL) syntetyzuje się cDNA kodujący dojrzałą część owoalbuminy (odpowiadającą nukleotydom 68-1222 mRNA (McReynolds i in., Naturę 273: 723-728 (1978)) stosując startery Ova-FORl (CCGGCTCCATCGGTGCAG) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 49) oraz OvaREVl (ACCACCAGAAGCGGCCGCAGGGGAAACACATCTGCC) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 50). Produkt PCR trawi się Notl i klonuje w strawionym StuI/Notl wektorze pVAl dla ekspresji białka fuzyjnego z domeną dimeryzacji FOSna końcu C. Do wytwarzania białka fuzyjnego z domeną dimeryzacji FOS na końcu N, region kodujący owoalbuminę amplifikuje się ze skonstruowanego wektora (pAVl::Ova) stosując startery Ova-FOR2 (CGGTGGTTCTGCGGCCGCTGGCTCCATCGGTGCAG) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 51) i Ova-REV2 (TTAAGGGGAAACACATCTGCC) (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 52). Produkt PCR trawi się Notl i klonuje w strawionym NotI/EcoRV wektorze pAV2. Sklonowane fragmenty weryfikuje się przez analizę sekwencji DNA.

Przykład 11

Wytwarzanie i oczyszczanie białek fuzyjnych FOS-PLA i FOS-owoalbumina

W celu cytoplazmatycznego wytwarzania białek fuzyjnych FOS, odpowiedni szczep E. coli transformowano wektorami pAV3::PLA, pAV4::PLA, pAV3::Ova lub pAV4::Ova. Hodowlę inkubowano w bogatym podłożu w obecności! ampicyliny, w temperaturze 37°C, z wytrząsaniem. Przy gęstości optycznej (550 nm) wynoszącej 1 dodawano 1mM IPTG i inkubację kontynuowano w ciągu dalszych 5 godzin. Komórki zbierano przez wirowanie, ponownie zawieszano w odpowiednim buforze (np. trisHCl, pH 7,2, 150 mM NaCl) zawierającym DNAzę, RNAzę i lizozym, i rozbijano w prasie Frencha. Po odwirowaniu (Sorvall RC-5C, rotor SS34, 15 000 obrotów na minutę, 10 minut, temperatura 4°C) osad ponownie zawieszano w 25 ml buforu do przemywania ciał inkluzyjnych (20 mM Tris-HCl, 23% sacharoza, 0,5% Triton X-100, 1mM EDTA, pH 8) w temperaturze 4°C i ponownie wirowano w sposób opisany powyżej. Procedurę tę powtarzano dotąd, aż supernatant po wirowaniu był zasadniczo klarowny. Ciała inkluzyjne ponownie zawieszano w 20 ml buforu do solubilizacji (5,5 M chlorowodorek guanidyny, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5) w temperaturze pokojowej i usuwano nierozpuszczalny materiał przez wirowanie, a następnie przepuszczanie supernatantu przez jałowy sączek (0,45 μm). Roztwór białka utrzymywano w temperaturze 4°C w ciągu co najmniej 10 godzin, w obecności 10 mM EDTA i 100 mM

DTT, a następnie dializowano trzy razy wobec 10 objętości 5,5 M chlorowodorku guanidyny, 25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 6. Następnie roztwór dializowano dwukrotnie wobec 5 litrów 2 M mocznika, 4 mM EDTA, 0,1 M NH4Cl, 20 mM boranu sodowego (pH 8,3), w obecności odpowiedniego układu regulującego stan oksydoredukcyjny (utleniony glutation/zredukowany glutation, cystyna/cysteina). Ufałdowane białko poddawano następnie chromatografii jonowymiennej. Białko przechowywano w odpowiednim buforze o pH powyżej 7 w obecności 2-10 mM DTT, aby utrzymywać reszty cystein flankujące domenę FOS w postaci zredukowanej. Przed sprzęganiem białka z cząstkami alfawirusa DTT usuwano przez przepuszczanie roztworu białka przez kolumnę do sączenie molekularnego z Sephadex G-25.

Przykład 12

Konstruowanie gp140-FOS

Gen gp140 (Swiss-Prot: P03375) bez wewnętrznego miejsca rozszczepiania przez proteazę zamplifikowano przez PCR z oryginalnego plazmidu pAbT4674 (ATCC 40829) zawierającego pełnej długości gen gp160, stosując następujące oligonukleotydy:

HIV-1:

5'-ACTAGTCTAGAatgagagtgaaggagaaatatc-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 53);

HIV-end:

5'-TAGCATGCTAGCACCGAAtttatctaattccaataattcttg-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 54);

PL 192 016 B1

HIV-Clev:

5'-gtagcacccaccaaggcaaagCTGAAAGCTACCCAGCTCGAGAAACTGgca-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 55); i

HIV-Clev2:

5'-caaagctcctattcccactgcCAGTTTCTCGAGCTGGGTAGCTTTCAG-3' (sek wencja o numerze identyfikacyjnym: 56)

Do 1 reakcji PCR zastosowano 100 pmoli oligonukleotydów HIV-1 i HIV-Cleav2 i 5 ng DNA matrycy w 75 μΐ mieszaniny reakcyjnej (4 jednostki polimerazy Taq lub Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 1,5 mM

MgSO4). Cykle temperatury przeprowadzono w następujący sposób: 30 cykli z temperaturą hybrydyzacji wynoszącą 60°C i czasem wydłużania wynoszącym 2 minuty w temperaturze 72°C.

Do II reakcji PCR zastosowano 100 pmoli oligonukleotydów HIV-end i HIV-Cleav i 5 ng DNA matrycy w 75 μl mieszaniny reakcyjnej (4 jednostki polimerazy Taq lub Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 1,5 mM MgSO4). Cykle temperatury przeprowadzono w następujący sposób: 30 cykli z temperaturą hybrydyzacji wynoszącą 60°C i czasem wydłużania wynoszącym 50 sekund w temperaturze 72°C.

Oba otrzymane przez PCR fragmenty oczyszczono, wyizolowano i zastosowano w reakcji PCR łączenia. Do reakcji PCR łączenia zastosowano 100 pmoli oligonukleotydów HIV-1 i HIV-end i 2 ng każdego z fragmentów otrzymanych w PCR (PCR I i PCR II) w objętości 75 μl (4 jednostki polimerazy Taq lub Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 1,5 mM MgSO4). Cykle temperatury przeprowadzono w następujący sposób: 30 cykli z temperaturą hybrydyzacji wynoszącą 60°C i czasem wydłużania wynoszącym 2,5 minuty w temperaturze 72°C. Produkt PCR łączenia strawiono Xbal i Nhel. Amfipatyczną helisą FOSpoddano fuzji w jednej ramce odczytu z końcem C gp-140.

Sekwencję DNA kodującą domenę amfipatycznej helisy FOSzamplifikowano przez PCR z wektora pJuFo (Crameri i Suter, Gene 137: 69 (1993)) stosując oligonukleotydy: FOS-HIV:

F0S-HIV:

5'-ttcggtgctagcggtggcTGCGGTGGTCTGACCGAC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 57); i

FOS-Apa:

5'-gatgctgggcccttaaccGCAACCACCGTGTGCCGCC-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 58).

Do reakcji PCR zastosowano 100 pmoli każdego z oligonukleotydów i 5 ng DNA matrycy w 75 μl mieszaniny reakcyjnej (4 jednostki polimerazy Taq lub Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 1,5 mM MgSO4). Cykle temperatury przeprowadzono w następujący sposób: temperatura 92°C w ciągu 2 minut, następnie 5 cykli temperatury 95°C (45 sekund), temperatury 60°C (30 sekund), temperatury 72°C (25 sekund), a następnie 25 cykli temperatury 95°C (45 sekund), temperatury 68°C (30 sekund) i temperatury 72°C (20 sekund). Otrzymany przez PCRfragment strawiono Nhel i Bsp120L.

Ostateczny wektor ekspresyjny dla GP140-FOS otrzymano przez ligację z użyciem 3 fragmentów - obu fragmentów otrzymanych przez PCR z pSinRep5. Otrzymany w wyniku wektor pSinRep5-GP140-FOS sprawdzono przez analizę restrykcyjną i sekwencjonowanie DNA.

GP140-FOS sklonowano również w pCYTts z zastosowaniem Xbal i Bsp120L w celu otrzymania stabilnej, indukowalnej linii, w której zachodziła ekspresja GP140-FOS.

P rz yk ła d 13:

Ekspresja GP140FOS z zastosowaniem pSinRep5-GP140FOS

PL 192 016 B1

Wolny od RNAzy wektor (1,0 μg) (pSinRep5: :GP140-FOS) i 1,0 μg DHEB (Bredenbeek i in.,

J. Virol. 67: 6439-6446 (1993)) przeprowadzono w postać liniową przez trawienie restrykcyjne. Następnie przeprowadzono transkrypcję in vitro stosując zestaw do transkrypcji in vitro SP6 (InvitroscripCAP, InvitroGen, Invitrogen BV, NV Leek, Holandia). Otrzymany w wyniku mRNA z właściwie zmodyfikowanym końcem 5' analizowano w redukującym żelu agarozowym.

mRNA otrzymany przez transkrypcję in vitro (5 μg) wprowadzono przez elektroporację do komórek BHK21 (ATCC: CCL 10) zgodnie z podręcznikiem Invitrogen (Sindbis Expression system, Invitrogen BV, Holandia). Po inkubacji w ciągu 10 godzin w temperaturze 37°C, zawierające FCS podłoże wymieniono na podłoże HP-1 bez FCS, a następnie inkubowano w ciągu dodatkowych 10 godzin w temperaturze 37°C. Zebrano supernatant i analizowano poprzez blotting typu Western pod kątem wytwarzania rozpuszczalnego GP-140-FOS dokładnie w sposób opisany w przykładzie 2.

Przykład 14

Ekspresja GP140FOSz zastosowaniem pCYTts-GP140FOS μg pCYT-GP140 przeprowadzono w postać liniową przez trawienie restrykcyjne. Reakcję zatrzymano przez ekstrakcję fenolem/chloroformem, a następnie przeprowadzony w postać liniową DNA wytrącono izopropanolem. Trawienie restrykcyjne sprawdzono przez elektroforezę w żelu agarozowym. Do transfekcji, 5,4 μg przeprowadzonego w postać liniową pCYTtsGP140-FOS zmieszano z 0,6 μg przeprowadzonego w postać liniową pSV2Neo w 30 μΙ H₂O i dodano 30 μΙ 1 M roztworu CaCl₂. Po dodaniu 60 μl buforu fosforanowego (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,05), roztwór mieszano stosując Vortex w ciągu 5 sekund, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 25 sekund. Roztwór bezpośrednio dodano do 2 ml podłoża HP-1 zawierającego 2% FCS (podłoże z 2% FCS). Podłoże w 80% spójnej hodowli komórek BHK21 (6-studzierikowa płytka) zastąpiono następnie podłożem zawierającym DNA. Po inkubacji w ciągu 5 godzin w temperaturze 37°C w inkubatorze CO2, usunięto podłoże zawierające DNA i zastąpiono je 2 ml 15% glicerolu w podłożu z 2% FCS. Zawierające glicerol podłoże usunięto po fazie inkubacji w ciągu 30 sekund i komórki przemywano 5 ml podłoża HP-1 zawierającego 10% FCS. Ostatecznie dodano 2 ml świeżego podłoża HP-1 zawierającego 10% FCS.

Wyselekcjonowano stabilnie stransfekowane komórki i hodowano w podłożu selekcyjnym (podłoże HP-1 wzbogacone o G418) w temperaturze 37°C w inkubatorze CO2. Gdy mieszana populacja osiągnęła spójność, hodowlę podzielono między dwie szalki, po czym następował 12-godzinny okres wzrostu w temperaturze 37°C. Jedną szalkę z komórkami przenoszono do temperatury 30°C w celu indukcji ekspresji rozpuszczalnego GP140-FOS. Drugą szalkę utrzymywano w temperaturze 37°C.

Ekspresję rozpuszczalnego GP140-FOS określano przez analizę poprzez blotting typu Western. Podłoże hodowlane (0,5 ml) poddawano wytrącaniu metanolem/chloroformem i osad ponownie zawieszano w buforze do próbek do SDS-PAGE. Przed nałożeniem na 15% żel poliakryloamidowy próbki ogrzewano w ciągu 5 minut w temperaturze 95°C. Po SDS-PAGE białka przenoszono na membrany nitrocelulozowe Protan (Schleicher & Schuell, Niemcy), jak opisali Bass i Yang, w: Creighton, T.E., red., Protein Function: A Practical Approach, wyd. 2., IRL Press, Oxford (1997), str. 29-55. Membranę blokowano 1% albuminą bydlęcą (Sigma) w TBS (10 x TBS, na litr: 87,7 g NaCl, 66,1 g chlorowodorku Trizma (Sigma) i 9,7 g zasady Trizma (Sigma), pH 7,4) w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano w ciągu 1 godziny z przeciwciałem skierowanym przeciw GP140 lub GP-160. Blot 3 razy przemywano TBS-T (TBS z 0,05% Tween20) w ciągu 10 minut i inkubowano w ciągu 1 godziny z koniugatem alkaliczna fosfataza-przeciwciało skierowane przeciw IgG myszy/królika/małpy/człowieka. Po dwukrotnym przemywaniu TBS-T w ciągu 10 minut i dwukrotnym przemywaniu TBS w ciągu 10 minut, prowadzono wywoływanie reakcji stosując odczynniki do wykrywania alkalicznej fosfatazy (10 ml buforu AP (100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) z 50 μl roztworu NBT (7,7% błękit nitratetrazolowy (Sigma) w 70% dimetyloformamidzie) i 37 μl roztworu X-Phosphate (5% fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolilu w dimetyloformamidzie).

Przykład 15

Wytwarzanie i oczyszczanie GP140FOS

Przeciwciało skierowane przeciw gp120 sprzęgnięto kowalencyjnie z dekstranem aktywowanym NHS/EDC i upakowano w kolumnie chromatograficznej. Supernatant zawierający GP140FOS nałożono na kolumnę i, po wystarczającym przepłukaniu, GP140FOS1 eluowano stosując 0,1 M HCl. Eluat zobojętniano bezpośrednio podczas zbierania stosując 1 M Tris, pH 7,2, w probówkach do zbierania frakcji.

PL 192 016 B1

Podczas oczyszczania mogłoby zachodzić tworzenie mostków disiarczkowych, dlatego też zebraną próbkę traktuje się 10 mM DTT w 10 mM Tris, pH 7,5, w ciągu 2 godzin w temperaturze 25°.

DTT usuwa się przez późniejszą dializę wobec 10 mM Mes, 80 mM NaCl, pH 6,0. Ostatecznie GP140FOS miesza się z cząstkami alfawirusowymi zawierającymi zamek leucynowy JUNw E2, jak opisano w przykładzie 16.

Przykład 16

Przygotowanie cząstek szczepionki alfawirusowej

Cząstki wirusowe (patrz przykład 2 i 3) zagęszczono za pomocą Ultrafree Centrifugal Filter Devices, Millipore, o granicy przepuszczalności 100 kD, zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Alternatywnie, cząstki wirusowe zagęszczano przez wirowanie w gradiencie sacharozy, jak opisano w podręczniku Sindbis Expresion System (Invitrogen, San Diego, Kalifornia). pH zawiesiny wirusa doprowadzono do 7,5 i cząstki wirusowe inkubowano w ciągu kilka godzin w obecności 2-10 mM DTT. Cząstki wirusowe oczyszczono od zanieczyszczeń białkowych na kolumnie Sephacryl S-300 (Pharmacia) (cząstki wirusowe ulegają elucji w objętości pustek) w odpowiednim buforze.

Oczyszczone cząstki wirusowe inkubowano z przynajmniej 2400-krotnym nadmiarem molowym białka fuzyjnego FOS-antygen w odpowiednim buforze (pH 7,5-8,5) w obecności układu regulującego stan oksydoredukcyjny (utleniony glutation/zredukowany glutation; cystyna/cysteina) w ciągu co najmniej 10 godzin w temperaturze 42°C. Po zagęszczeniu cząstek z zastosowaniem Ultrafree Centrifugal Filter Device, Millipore, o granicy przepuszczalności 100 kD, mieszaninę przepuszczano przez kolumnę do sączenia molekularnego z Sephacryl S-300 (Pharmacia). Cząstki wirusowe ulegały elucji w objętości pustek.

Przykład 17

Fuzja amfipatycznej helisy JUN z końcem aminowym HBcAg(1-144)

Helisę JUN poddano fuzji z końcem aminowym sekwencji aminokwasów od 1do 144 HBcAg (konstrukt JUN-HBcAg). W celu skonstruowania sekwencji DNA kodującej JUN-HBcAg, zamplifikowano przez PCR oddzielnie sekwencje kodujące helisę JUNi HBcAg(1-144). Sekwencję JUN zamplifikowano z plazmidu pJuFo stosując startery EcoRI-JUN(s) i JUN-SacII(as). Starter EcoRI-JUN(s) wprowadził miejsce EcoRI, a za nim kodon start ATG. Starter JUN-SacII(as) wprowadził łącznik kodujący sekwencję aminokwasową GAAGS. Sekwencję HBcAg(1-144) zamplifikowano z plazmidu pEco63 (uzyskanego z ATCC, nr 31518) stosując startery JUN-HBcAg(s) i HBcAg(1-144)Hind(as). JUN-HBcAg(s) zawierał sekwencję odpowiadającą końcowi 3' sekwencji kodującej helisę JUN, a za nią sekwencję kodującą łącznik GAAGS i koniec 5' sekwencji HBcAg. HBcAg(1-144)Hind(as) wprowadził kodon stop i miejsce Hindllll za kodonem 144 genu HBcAg. Do reakcji PCR zastosowano 100 pmoli każdego oligonukleotydu i 50 ng DNA matrycy w 50 μΙ mieszaniny reakcyjnej z 2 jednostkami polimerazy Pwo, 0,1 mM każdym dNTP i 2 mM MgSO₄.

W obu reakcjach przeprowadzono następujące cykle temperatury: temperatura 94°C w ciągu 2 minut i 30 cykli temperatury 94°C (1 minuta), temperatury 50°C (1 minuta) i temperatury 72°C (2 minuty).

PL 192 016 B1

EcoRI-JUN(s):

(5'-CCGGAATTCATGTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 61);

JUN-SacII(as):

(5'-GTCGCTACCCGCGGCTCCGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3') (sekwencj a o numerze identyfikacyjnym: 62);

JUN-HBcAg(s):

(5'-GTTGGTTGCGGAGCCGCGGGTAGCGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGG-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 63);

HBcAg(1-144)Hind(as):

(5'-CGCGTCCCAAGCTTCTACGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3') (sekwencj a o numerze identyfikacyjnym: 64).

Fuzję dwóch fragmentów uzyskanych przez PCR przeprowadzono przez PCR stosując startery EcoRI-JUN(s) i HBcAg(1-144)Hind(as). Zastosowano 100 pmoli każdego z oligonukleotydów ze 100 ng oczyszczonych fragmentów otrzymanych przez PCR w 50 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 2 jednostki polimerazy Pwo, 0,1 mM każdego dNTP i 2 mM MgSO4. Warunki cykli temperatury PCR były następujące: temperatura 94°C w ciągu 2 minut i 35 cykli temperatury 94°C (1 minuta), temperatury 50°C (1 minuta) i temperatury 72°C (2 minuty). Ostateczny produkt PCR analizowano przez elektroforezę w żelu agarozowym, oczyszczono i trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hindlll w ciągu 16 godzin w odpowiednim buforze.

Fragment strawionego DNA zligowano z wektorem pKK strawionym EcoRI i Hindlll, tworząc wektor ekspresyjny pKK-JUN-HBcAg. Insercję produktu PCR analizowano przez analizę restrykcyjną EcoRI/Hindlll oraz przez zsekwencjonowanie DNA wstawki.

Przykład 18

Fuzja amfipatycznej helisy JUNz końcem karboksylowym HBcAg(1-144)

Helisę JUNpoddano fuzji z końcem karboksylowym sekwencji aminokwasów od 1do 144 HB-cAg (konstrukt HBcAg-JUN). W celu skonstruowania sekwencji DNA HBcAg-JUN, zamplifikowano oddzielnie przez PCR sekwencje kodujące helisę JUNi HBcAg(1-144). Sekwencję JUNzamplifikowano z plazmidu pJuFo stosując startery SacII-JUN(s) i JUN-Hindlll(as). SacII-JUN(s) wprowadził łącznik kodujący aminokwasy LAAG. Sekwencja ta zawiera również miejsce SacII. JUN-Hindlll(as) wprowadził kodon stop (TAA), a za nim miejsce Hindlll. Sekwencję kodującą HBcAg(1-144) zamplifikowano z plazmidu pEco63 stosując startery EcoRI-HBcAg(s) i HBcAg(1-144)-JUN(as). EcoRI-HBcAg(s) wprowadził miejsce EcoRI przed kodonem start (ATG) sekwencji kodującej HBcAg. HBcAg(1-144)-JUN(as) wprowadził sekwencję kodującą peptyd łącznikowy (LAAG), który zawiera również miejsce Sacll. Do reakcji PCR używano 100 pmoli każdego z oligonukleotydów i 50 ng DNA matrycy w 50 μl mieszaniny reakcyjnej z 2 jednostkami polimerazy Pwo, 0,1 mM każdym dNTP i 2 mM MgSO4. Cykle temperaturowe przeprowadzono w następujący sposób: temperatura 94°C w ciągu 2 minut i 30 cykli temperatury 94°C (1minuta), temperatury 50°C (1minuta) i temperatury 72°C (2 minuty).

PL 192 016 B1

SacII-JUN(s):

(5'-CTAGCCGCGGGTTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 65);

JUN-Hindlll(as):

(5'-CGCGTCCCAAGCTTTTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3') (sekwenc ja o numerze identyfikacyjnym: 66);

EcoRI-HBcAg(s):

(5'-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 67);

HBcAg-JUN(as) :

(5'-CCGACCACCGCAACCCGCGGCTAGCGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 68).

Fuzję dwóch fragmentów otrzymanych przez PCR przeprowadzono przez PCR, stosując startery EcoRI-HBcAg(s) i JUN-Hindlll(as). Do fuzji przez PCR użyto 100 pmoli każdego z oligonukleotydów ze 100 ng oczyszczonych fragmentów otrzymanych przez PCR w 50 pl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 2 jednostki polimerazy Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 2 mM MgSO4. Warunki cykli PCR były następujące: temperatura 94°C w ciągu 2 minut i 35 cykli temperatury 94°C (1 minuta), temperatury 50°C (1 minuta) i temperatury 72°C (2 minuty). Ostateczny produkt PCR analizowano przez elektroforezę w żelu agarozowym i trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hindlll w ciągu 16 godzin w odpowiednim buforze. Fragment DNA oczyszczono z żelu i zligowano z wektorem pKK strawionym Eco -RI/Hindlll, tworząc wektor ekspresyjny pKK-HBcAg-JUN. Insercję produktu PCR analizowano przez analizę restrykcyjną EcoRI/Hindlll i zsekwencjonowania DNA wstawki.

P rzykła d 19

Wstawianie amfipatycznej helisy JUNdo epitopu c/el HbcAgd-144)

Wiadomo, że epitop c/el HBcAg (reszty od 72 do 88) położony jest w regionie wypustki na powierzchni kapsydu wirusa zapalenia wątroby typu B. Część tego regionu białka (reszty od 76 do 82) zastąpiono genetycznie helisą JUN, zapewniając miejsca przyłączenia antygenów (konstrukt HBcAgJUNIns). Sekwencję DNA HBcAg-JUNIns utworzono przez PCR: sekwencję helisy JUN i dwie sekwencje kodujące fragmenty HBcAg (reszty aminokwasowe od 1 do 75 i od 83 do 144) zamplifikowano oddzielnie przez PCR. Sekwencję JUN zamplifikowano z plazmidu pJuFo z zastosowaniem starterów BamHI-JUN(s) i JUN-SacII(as). BamHI-JUN(s) wprowadził również sekwencję łącznika, kodującą sekwencję peptydową GSGGG, która zawiera także miejsce BamHI. JUN-SacII(as) wprowadził sekwencję kodującą peptyd łącznikowy GAAGS, a za nim sekwencję komplementarną do końca 3' sekwencji kodującej JUN. Sekwencję DNA HBcAg(1-75) zamplifikowano z plazmidu pEco63 przy użyciu starterów EcoRIHBcAg(s) i HbcAg75-JUN(as). EcoRIHBcAg(s) wprowadził miejsce EcoRI, a za nim sekwencję odpowiadającą sekwencji końca 5' HBcAg. HBcAg75-JUN(as) wprowadził łącznik kodujący peptyd GSGGG za aminokwasem 75 HBcAg, a za nim sekwencję komplementarną do końca 5' sekwencji kodującej helisę JUN. Fragment HBcAg (83-144) zamplifikowano przy użyciu starterów JUN-HBcAg83(s) i HBcAg(1-144)Hind(as). JUN-HBcAg83(s) zawierał sekwencję odpowiadającą końcowi 3' sekwencji kodującej JUN, a za nią łącznik kodujący peptyd GAAGS i sekwencję odpowiadającą końcowi 5' sekwencji kodującej HBcAg(83-144). HBcAg(1-144)Hind(as) wprowadził kodon stop i miejPL 192 016 B1 sce Hindlll za kodonem 144 genu HBcAg. W reakcjach PCR stosowano 100 pmoli każdego z oligonukleotydu i 50 ng DNA matrycy w 50 pl mieszanin reakcyjnych (2 jednostki polimerazy Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 2 mM MgSO4). Cykle temperatury przeprowadzono w następujący sposób: temperaturą

94- przez 2 minuty i 35 cykli temperatury 94°C (1 minuta), temperatury 50°C (1 minuta) i temperatury

72°C (2 minuty).

Sekwencje starterów:

BamHI-JUN(s):

(5'-CTAATGGATCCGGTGGGGGCTGCGGTGGTCGGATCGCCCGGCTCGAG-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 69);

JUN-SacII(as):

(5'-GTCGCTACCCGCGGCTCCGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 70) ;

EcoRIHBcAg(s):

(5'-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 71);

HBcAg75-JUN(as):

(5'-CCGACCACCGCAGCCCCCACCGGATCCATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 72);

JUN-HBcAg83(s):

(5'-GTTGGTTGCGGAGCCGCGGGTAGCGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 73); i

HBcAg(1-144)Hind(as):

(5'-CGCGTCCCAAGCTTCTACGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3') (sekwencj a o numerze identyfikacyjnym: 74).

Fuzję trzech fragmentów otrzymanych przez PCR przeprowadzono w sposób następujący. Najpierw fragment kodujący HBcAg 1-75 poddano fuzji z sekwencją kodującą JUN przez PCR przy użyciu starterów EcoRIHBcAg(s) i JUN-SacII(as). Następnie uzyskany produkt poddano fuzji z fragmentem HBcAg(83-144) przez przy użyciu starterów EcoRIHBcAg(s) i HBcAgHindlll(as). Do fuzji przez PCR używano 100 pmoli każdego z oligonukleotydów i 100 ng oczyszczonych fragmentów uzyskanych przez PCR w 50 pl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 2 jednostki polimerazy Pwo, 0,1 mM każdy

PL 192 016 B1 dNTP i 2 mM MgSO4. Zastosowano takie same cykle PCR, jak przy tworzeniu poszczególnych fragmentów. Ostateczny produkt PCR trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hindlll w ciągu 16 godzin w odpowiednim buforze. Fragment DNA zligowano z wektorem pKK strawionym EcoRI/Hindlll, uzyskując wektor pKK-HbcAg-JUNIns. Insercję produktu PCR analizowano przez analizę restrykcyjną Eco-RI/Hindlll i sekwencjonowanie wstawki.

Przykład 20

Fuzja amfipatycznej helisy JUNz końcem karboksylowym białka nukleokapsydu (N) wirusa odry

Helisę JUN poddano fuzji z końcem karboksylowym skróconego białka N wirusa odry, zawierającego reszty aminokwasowe od 1 do 473 (konstrukt N473-JUN). W celu skonstruowania sekwencji DNA kodującej N473-JUN, zamplifikowano przez PCR oddzielnie sekwencje DNA kodującą helisę JUN i sekwencję kodującą N473-JUN. Sekwencję JUN zamplifikowano z plazmidu pJuFo stosując startery SacII-JUN(s) i JUN-Hindlll(as). SacII-JUN(s) wprowadził sekwencję kodującą łącznik peptydowy LAAG. Sekwencja ta zawierała również miejsce SacII. Starter antysensowny JUN-Hindlll(as) wprowadził kodon stop (TAA) za miejscem Hindlll. Sekwencję kodującą N(1-473) zamplifikowano z plazmidu pSC-N zawierającego pełną sekwencję kodującą białka N wirusa odry (otrzymaną od M. Billeter, Zurich) przy użyciu starterów EcoRI-Nmea(s) i Nmea-JUN(as). EcoRI-N(mea)(s) wprowadził miejsce EcoRI poprzedzające kodon start (ATG) sekwencji kodującej białko N. N(mea)-JUN(as) był komplementarny do końca 3' sekwencji kodującej N(1-473), a dalej zawierał sekwencję komplementarną do sekwencji kodującej łącznik peptydowy (LAAG). Do reakcji PCR używano 100 pmoli każdego z oligonukleotydów i 50 ng matryc DNA w 50 μ! mieszanin reakcyjnych z 2 jednostkami polimerazy

Pwo, 0,1 mM każdym dNTP i 2 mM MgSO4. Cykle temperatury przeprowadzono w następujący sposób: temperatura 94°C w ciągu 2 minut i 35 cykli temperatury 94°C (1 minuta), temperatury 55°C (1minuta) i temperatury 72°C (2 minuty).

Sekwencje starterów:

SacII-JUN(s):

(5'-CTAGCCGCGGGTTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 75);

JUN-Hindll(as):

(5'-CGCGTCCCAAGCTTTTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 76) ;

EcoRI-Nmea(s):

(5'-CCGGAATTCATGGCCACACTTTTAAGGAGC-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 77); i

Nmea-JUN(as):

(5'-CGCGTCCCAAGCTTTTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3') (sekwencj a o numerze identyfikacyjnym: 78).

Fuzję dwóch fragmentów otrzymanych przez PCR przeprowadzono przez następną PCR przy użyciu starterów EcoRI-Nmea(s) i Nmea-JUN (as). Do fuzji przez PCR użyto 100 pmoli każdego z oligonukleotydów i 100 ng oczyszczonych fragmentów otrzymanych przez PCR w 50 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 2 jednostki polimerazy Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 2 mM MgSO4. Cykle temperatury przeprowadzono w następujący sposób: temperatura 94°Cw ciągu 2 minut i 35 cykli temperatury

PL 192 016 B1

94-C (1 minuta), temperatury 50°C (1 minuta) i temperatury 72°C (2 minuty). Produkt PCR trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hindlll w ciągu 16 godzin w odpowiednim buforze. Fragment DNA oczyszczono z żelu i zligowano z wektorem pKK strawionym EcoRI/Hindlll, uzyskując plazmid pKK-N473-JUN. Insercję produktu PCR analizowano przez analizę restrykcyjną EcoRI/Hindlll i sekwencjonowanie wstawki.

Przykład 21

Ekspresja i częściowe oczyszczanie HBcAg-JUN Sczep E. coli XL-1 stransformowano pKK-HbcAg-JUN.

Do zaszczepienia 100 ml podłoża LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny użyto 1 ml nocnej hodowli bakterii. Hodowlę tę prowadzono w ciągu 4 godzin do uzyskania OD przy długości fali 600 nm wynoszącej około 0,8. Indukcję syntezy HBcAg-JUN przeprowadzono przez dodanie IPTG do 1 mM stężenia końcowego. Po indukcji bakterie wytrząsano w temperaturze 37°C w ciągu dalszych 16 godzin. Bakterie zebrano przez wirowanie przy 5000 x g w ciągu 15 minut. Osad zamrożono w temperaturze -20°C. Osad rozmrożono i ponownie zawieszono w buforze do lizy bakterii (10 mM Na2HPO4, pH 7,0, 30 mM NaCl, 0,25% Tween-20, 10 mM EDTA, 10 mM DTT) wzbogaconym o 200 μg/ml lizozymu i 10 μl Benzonase (Merck). Komórki inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej i rozbijano stosując prasy Frencha. Do lizatu dodano Triton X-100 do 0,2% stężenia końcowego i lizat inkubowano w lodzie w ciągu 30 minut, wstrząsając go od czasu do czasu. Figura 4 przedstawia ekspresję białka HBcAg-JUN w E. coli po indukcji IPTG. Komórki E. coli zawierające plazmid ekspresyjny pKK-HbcAg-JUN lub plazmid kontrolny wykorzystano do indukcji ekspresji HbcAg-JUN przez IPTG. Przed dodaniem IPTG pobrano próbkę z hodowli bakterii zawierających plazmid pKK-HbcAg-JUN (ścieżka 3) i z hodowli zawierającej plazmid kontrolny (ścieżka 1). 16 godzin po dodaniu IPTG ponownie pobrano próbki z hodowlizawierającej pKK-HbcAg-JUN (ścieżka 4) i z hodowli kontrolnej (ścieżka 2). Ekspresję białka monitorowano przez SDS-PAGE, a następnie wybarwianie błękitem Coomassie'go.

Następnie lizat wirowano w ciągu 30 minut przy 12.000 x g, aby usunąć nierozpuszczalne pozostałości komórkowe. Supernatant i osad analizowane przez blotting typu Western, stosując monoklonalne przeciwciało skierowane przeciw HBcAg (YVS1841, zakupione w Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY, USA) i stwierdzono, że znaczące ilości białka HbcAg-JUN są rozpuszczalne (fig. 5). W skrócie, lizaty komórek E. coli, w których zachodziła ekspresja HbcAg-JUN i komórek kontrolnych wirowano przy 14.000 x g w ciągu 30 minut. Supernatant (= frakcja rozpuszczalna) i osad (= frakcja nierozpuszczalna) rozdzielono i rozcieńczono w buforze do próbek z SDS do tych samych objętości. Próbki analizowano przez SDS-PAGE, a następnie blotting typu Western z przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przed HbcAg, YVS 1841. Ścieżka 1: frakcja rozpuszczalna, komórki kontrolne; ścieżka 2: frakcja nierozpuszczalna, komórki kontrolne; ścieżka 3: frakcja rozpuszczalna, komórki, w których zachodziła ekspresja HbcAg-JUN; ścieżka 4: frakcja nierozpuszczalna, komórki w których zachodziła ekspresja HBcAg-JUN.

Klarowany lizat zastosowano do wirowania w skokowym gradiencie sacharozy, składającym się z 4 ml 65% roztworu sacharozy nawarstwionego 3 ml 15% roztworu sacharozy, a następnie 4 ml lizatu bakteryjnego. Próbkę wirowano w ciągu 3 godzin przy 100.000 x g w temperaturze 4°C. Po wirowaniu zebrano 1 ml frakcje od góry gradientu i analizowano przez SDS-PAGE, a następnie wybarwianie błękitem Coomassie'go (fig. 6). Ścieżka 1: całkowity lizat E. coliprzed wirowaniem.

Ścieżka 112: frakcje 1i 2 z wierzchu gradientu. Ścieżki 4 do 7: frakcje od 5 do 8 (15% sacharoza). Białko HBcAg-JUN wykrywano przez wybarwianie błękitem Coomassie'go.

Białko HBcAg-JUN ulegało wzbogaceniu w interfazie między 15% i 65% sacharozą, co wskazuje, że utworzyło cząstki kapsydu. Ponieważ większość białek bakteryjnych pozostała w górnej warstwie gradientu niezawierającej sacharozy, wirowanie w skokowym gradiencie cząstek HBcAg-JUN doprowadziło zarówno do wzbogacenia próbki w cząstki, jak i do częściowego ich oczyszczenia.

Przykład 22

Kowalencyjne sprzęganie hGH-FOS z HBcAG-JUN

W celu wykazania wiązania białka z cząstkami HBcAg-JUN, jako białko modelowe wybraliśmy ludzki hormon wzrostu (hGH) połączony końcem karboksylowym z helisą FOS (hGH-FOS). Cząstki HBcAg-JUN zmieszano z częściowo oczyszczonym hGH-FOS i inkubowano w temperaturze 4°C w ciągu 4 godzin, aby umożliwić wiązanie białek. Następnie mieszaninę dializowano wobec 3000 objętości buforu dializacyjnego (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) w celu usunięcia DTT obecnego zarówno w roztworze HBcAg-JUN, jak i w roztworze hGH-FOS i w ten sposób umożliwić sprzęganie białek przez utworzenie wiązań disiarczkowych. Jako kontrole, wobec buforu dializacyjnego dializowano również

PL 192 016 B1 roztwory HBcAg-JUN i hGH-FOS. Próbki ze wszystkich trzech dializowanych roztworów białek analizowano przez SDS-PAGE w warunkach nieredukujących. Sprzęganie hGH-FOS z HBcAg-JUN wykrywano stosując blotting z przeciwciałem skierowanym przeciw hGH (fig. 7). hGH-FOS związany z HBcAG-JUNpowinien migrować z pozorną masą cząsteczkową 53 kDa, podczas gdy niezwiązany hGH-FOS migruje z pozorną masą cząsteczkową 31 kDa. Dializowaną próbkę analizowano przez SDS-PAGE w nieobecności (ścieżka 3) i w obecności (ścieżka 2) czynnika redukującego i wykrywano przez wybarwianiem błękitem Coomassie'go. Jako kontrolę, na żel nałożono również, w obecności czynnika redukującego, hGH-FOS, którego nie zmieszano z cząstkami kapsydu (ścieżka 1).

Zaobserwowano zmianę masy cząsteczkowej hGH-FOS na około 53 kDa w obecności białka kapsydu HBcAg-JUN, co sugeruje że nastąpiło wydajne wiązanie hGH-FOS z HBcAg-JUN.

Przykład 23

Insercja peptydu zawierającego resztę lizynową w epitop c/e 1 HBcAg(1 -1 49)

Epitop c/e1 (reszty od 72 do 88) HBcAg położony jest w regionie wypustki na powierzchni kapsydu wirusa zapalenia wątroby typu B (HBcAg). Część tego regionu (prolinę 79 i alaninę 80) zastąpiono genetycznie na peptyd Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (konstrukt HBcAg-Lys). Wprowadzona reszta lizyny zawiera reaktywną grupę aminową w swoim łańcuchu bocznym, którą można wykorzystać do międzycząsteczkowego sprzęgania chemicznego cząstek HBcAg z dowolnym antygenem zawierającym wolną grupę cysteinową.

Sekwencję DNA HBcAg-Lys utworzono przez PCR: Dwa fragmenty kodujące fragmenty HBcAg (reszty aminokwasowe od 1do 78 i od 81 do 149) zamplifikowano oddzielnie przez PCR. Startery zastosowane w tych w PCRwprowadziły również sekwencję DNA kodującą peptyd Gly-Gly-Lys-Gly-Gly. Fragment HBcAg (od 1do 78) zamplifikowano z pEco63 wykorzystując Startery EcoRIHBcAg(s) i Lys-HBcAg(as). Fragment HBcAg (od 81do 149) zamplifikowano z pEco63 przy użyciu starterów Lys-HBcAg(s) i HBcAg(1-149)Hind(as). Startery Lys-HBcAg(as) i Lys-HBcAg(s) wprowadziły na końcach dwu produktów PCR komplementarne sekwencje DNA umożliwiając połączenie dwu produktów PCR w późniejszej PCR łączącej. Połączone fragmenty zamplifikowano przez PCR przy użyciu starterów EcoRIHBcAg(s) i HBcAg(1-149Hind(as).

Do PCR stosowano 100 pmoli każdego z oligonukleotydów i 50 ng DNA matrycy w 50 μΙ mieszaniny reakcyjnej z 2 jednostkami polimerazy Pwo, 0,1 mM każdym dNTP i 2 mM MgSO4. Wobu reakcjach cykle temperaturowe prowadzono w następujący sposób: temperatura 94°C w ciągu 2 minuty; 30 cykli temperatury 94°C (1 minuta), temperatury 50°C (1minuta) i temperatury 72°C (2 minuty).

PL 192 016 B1

Sekwencje starterów:

EcoRIHBcAg(s):

(5'-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 79) ;

Lys-HBcAg(as):

(5'-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 80);

Lys-HBcAg(s):

(5'-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3') (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 81);

HBcAg(1-149)Hind(as):

(5'-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3') (sekwencj a o numerze identyfikacyjnym: 82).

Do fuzji dwóch fragmentów otrzymanych przez PCR użyto 100 pmoli starterów EcoRIHBcAg(s) i HBcAg(1-149)Hind(as) ze 100 ng dwóch oczyszczonych fragmentów otrzymanych przez PCR w 50 pl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 2 jednostki polimerazy Pwo, 0,1 mM każdy dNTP i 2 mM MgSO4.

Warunki cykli PCR były następujące: temperatura 94°C w ciągu 2 minut, 30 cykli temperatury 94°C (1 minuta), temperatury 50°C (1minuta) i temperatury 72°C (2 minuty). Połączony produkt PCR analizowano przez elektroforezę w żelu agarozowym, oczyszczono i trawiono w ciągu 19 godzin enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Hindlll w odpowiednim buforze. Fragment strawionego DNA zligowano z wektorem pKK strawionym EcoRI/Hindlll, tworząc wektor ekspresyjny pKK-HBcAg-Lys. Insercję produktu PCR analizowano przez analizę restrykcyjną EcoRI/Hindlll i sekwencjonowania DNA wstawki.

Przykład 24

Ekspresja i częściowe oczyszczanie HBcAg-Lys

Szczep E. coli XL-1 blue stransformowano pKK-HBcAg-Lys. 1 ml nocnej hodowli bakterii użyto do zaszczepienia 100 ml podłoża LB zawierającego 100 pg/ml ampicyliny. Hodowlę tę prowadzono w ciągu 4 godzin w temperaturze 37°C, aż do uzyskania OD przy długości fali 600 nm wynoszącej około 0,8. Indukcję syntezy HBcAg-Lys przeprowadzono dodając IPTG do 1 mM stężenia końcowego. Po indukcji bakterie wytrząsano dalej w ciągu 16 godzin w temperaturze 37°C. Bakterie zebrano za przez wirowanie przy 5000 x g w ciągu 15 minut. Osad zamrożono w temperaturze -20°C. Osad rozmrożono i zawieszono w buforze do lizy (10 mM Na2HPO4, pH 7,0, 30 mM NaCl, 0,25% Tween-20, 10 mM EDTA, 10 mM DTT) wzbogaconym o 200 pg/ml lizozymu i 10 pl Benzonase (Merck). Komórki inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej i rozbito przy użyciu prasy Frencha. Do lizatu dodano Triton X-100 do 0,2% stężenia końcowego i lizat inkubowano w ciągu 30 minut w lodzie, wstrząsając go od czasu do czasu. Do indukcji ekspresji HBcAg-Lys za pomocą IPTG użyto komórek E. coli zawierających plazmid ekspresyjny pKK-HBcAg-Lys lub plazmid kontrolny. Przed dodaniem IPTG pobrano próbki z hodowli bakterii zawierającej plazmid pKK-HbcAg-Lys i z hodowli kontrolnej. Ekspresję białka monitorowano przez SDS-PAGE, a następnie wybarwianie błękitem Coomassie'go.

Następnie lizat wirowano w ciągu 30 minut przy 12 000 x g w celu usunięcia nierozpuszczalnych pozostałości komórkowych. Supernatant i osad analizowano przez blotting typu Western przy

PL 192 016 B1 użyciu przeciwciała monoklonalnego skierowanego przeciw HBcAg (YVS1841, zakupione w Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, NY, USA) i stwierdzono, że znacząca ilość białka HBcAgLys jest rozpuszczalna. Wskrócie, lizaty komórek E. coli, w których zachodziła ekspresja HBcAg-Lys, i komórek kontrolnych wirowano w ciągu 30 minut przy 14 000 x g. Supernatant (= frakcja rozpuszczalna) i osad (= frakcja nierozpuszczalna) rozdzielono i rozcieńczono buforem do próbek z SDS do równych objętości. Próbki analizowano przez SDS-PAGE, a następnie blotting typu Western przy użyciu skierowanego przeciw HBcAg przeciwciała monoklonalnego YVS 1841.

Klarowany lizat komórkowy użyto do wirowania w skokowym gradiencie sacharozy składającym się z 4 ml 65% roztworu sacharozy nawarstwionego 3 ml 15% roztworu sacharozy i 4 ml lizatu bakteryjnego. Próbkę wirowano w ciągu 3 godzin przy 100 000 x g w temperaturze 4°C. Po wirowaniu zbierano 1ml frakcje z wierzchu gradientu i analizowano SDS-PAGE, a następnie wybarwiania błękitem Coomassie'go. Białko HBcAg-Lys wykrywano przez wybarwianie błękitem Coomassie'go.

Interfaza między 15% i 65% sacharozą była wzbogacona w HBcAg-Lys, co wskazuje, że białko to utworzyło cząstki kapsydu. Ponieważ większość białek bakteryjnych pozostała w niezawierającej sacharozy górnej warstwie gradientu, wirowanie w skokowym gradiencie doprowadziło zarówno do wzbogacenia, jak i do częściowego oczyszczenia cząstek.

Przykład 25

Chemiczne sprzęganie peptydu FLAG z HBcAg-Lys za pomocą heterobifunkcjonalnego czynnika sprzęgającego SPDP W celu wywołania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw peptydowi FLAG, syntetyczny peptyd FLAG z resztą cysteinową na końcu aminowym (sekwencja aminokwasowa CGGDYKDD DDK) sprzęgnięto chemicznie z oczyszczonymi cząstkami HBcAg- Lys. 600 μΙ roztworu HBcAg-Lys (2 mg/ml) o czystości 95% inkubowano w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej z heterobifunkcjonalnym czynnikiem sprzęgającym N-succinimidyl 3-(2-pirydylotio)propionianem (SPDP) (0,5 mM). Po zakończeniu reakcji, mieszaninę dializowano przez noc wobec 1litra 50 mM buforu fosforanowego (pH 7,2) ze 150 mM NaCl, w celu usunięcia niezwiązanegoSPDP.Następnie 500 μΙ zmodyfikowanego kapsydu HBcAg-Lys (2 mg/ml) zmieszano z 0,1 mM peptydem FLAG (zawierającym cysteinę na końcu aminowym) w obecności 10 mM EDTA, dla zapobiegnięcia katalizowanemu przez metal utlenianiu grup sulhydrylowych. Reakcję monitorowano poprzez wzrost gęstości optycznej przy długości fali 343 nm, powodowany uwalnianiem pyridine-2-thione z SPDP po reakcji z wolną cysteiną peptydu. Reakcja zmodyfikowanych reszt Lys z peptydem uległa zakończeniu po około 30 minutach. Udekorowane FLAG cząstki wstrzyknięto myszom.

Przykład 26

Konstruowanie pMPSV-gp140cys

Gen gp140 zamplifikowano przez PCR z pCytTSgp140FOS stosując oligonukleotydy gp140CysEcoRI

Sallgp140. Do PCR używano 100 pmoli każdego z oligonukleotydów i 50 ng DNA matrycy w 50 μl mieszaniny reakcyjnej z 2 jednostkami polimerazy Pwo, 0,1 mM każdym dNTP i 2 mM MgSO4. Wobu reakcjach cykle temperatury przeprowadzono w następujący sposób: temperatura 94°C w ciągu minut, 30 cykli temperatury 94°C (0,5 minuty), temperatury 55°C (0,5 minuty) i temperatury 72°C (2 minuty).

Produkt PCR oczyszczono stosując zestaw QiaEXII, strawiono Sali i EcoRI i zligowano z wektorem pMPSYHE strawionym tymi samymi enzymami.

Sekwencje oligonukleotydów:

Gpl40CysEcoRI:

5'-GCCGAATTCCTAGCAGCTAGCACCGAATTTATCTAA-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 83);

SalIIgpl40

5'-GGTTAAGTCGACATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 84).

PL 192 016 B1

P r z y k ł a d 27

Ekspresja pMPSVgp140Cys pMPSVgp140Cys przeprowadzono w postać liniową przez trawienie restrykcyjne. Reakcję zatrzymano przez ekstrakcją fenolem/chloroformem, a następnie wytrącanie przeprowadzonego w postać liniową DNA izopropanolem. Trawienie restrykcyjne oceniano przez elektroforezę w żelu agarozowym. Do transfekcji zmieszano 5,4 pg przeprowadzonego w postać liową pMPSVgp140-Cys z 0,6 pg przeprowadzonego w postać liniową pSV2Neo w 30 pl H₂O i dodano 30 pl 1 M roztworu CaCl₂. Po dodaniu 60 pl buforu fosforanowego (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na₂HPO₄, pH 7,05), roztwór mieszano stosując Vortex w ciągu 5 sekund, po czym inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 25 sekund. Roztwór bezpośrednio dodano do 2 ml podłoża HP-1 zawierającego 2% FCS (podłoże 2% FCS). Następnie podłoże w 80% spójnej hodowli komórek BHK21 (płytka 6-studzienkowa) wymieniono na podłoże zawierające DNA. Po inkubacji w ciągu 5 godzin w inkubatorze z COa w temperaturze 37°C, podłoże zawierające DNA usunięto i wymieniono na 2 ml 15% glicerolu w podłożu z 2% FCS. Po inkubacji w ciągu 30 sekund usunięto podłoże zawierające glicerol i komórki przemyto 5 ml podłoża HP-1 zawierającego 10% FCS. Ostatecznie dodano 2 ml świeżego podłoża HP-1 zawierającego 10% FCS.

Stabilnie transfekowane komórki selekcjonowano i hodowano w podłożu selekcyjnym (podłoże HP-1 wzbogacone o G418) w temperaturze 37°C w inkubatorze CO2. Gdy mieszana populacja osiągnęła spójność, hodowlę podzielono pomiędzy dwie szalki, po czym hodowano w ciągu 12 godzin w temperaturze 37°C. Jedną z szalek przeniesiono do temperatury 302C w celu indukcji ekspresji rozpuszczalnego GP140-FOS. Drugą szalkę utrzymywano w temperaturze 37°C.

Ekspresję rozpuszczalnego GP140-Cys określano przez analizę poprzez blotting typu Western. Podłoża hodowlane (0,5 ml) poddawano wytrącaniu metanolem/chloroformem i osad ponownie zawieszano w buforze do próbek do SDS-PAGE. Przed nałożeniem na 15% żel akryloamidowy próbki ogrzewano w ciągu 5 minut w temperaturze 95°C. Po SDS-PAGE białka przenoszono na membrany nitrocelulozowe Protan (Schleicher & Schuell, Niemcy), jak opisali Bass i Yang, w: Creighton, T.E., red., Protein Function: A Practical Approach, wyd.. 2., IRL Press, Oxford (1997), str. 29-55. Membranę blokowano 1% albuminą bydlęcą (Sigma) w TBS (10 x TBS, na litr: 87,7 g NaCl, 66,1 g chlorowodorku Trizma (Sigma) i 9,7 g zasady Trizma (Sigma), pH 7,4) w ciągu 1 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano w ciągu 1 godziny z przeciwciałem skierowanym przeciw GP140 lub GP-160. Błot 3 razy przemywano TBS-T (TBS z 0,05% Tween20) w ciągu 10 minut i inkubowano w ciągu 1 godziny z koniugatem alkaliczna fosfataza-przeciwciało skierowane przeciw IgG myszy/kró-lika/małpy/człowieka. Po dwukrotnym przemywaniu TBS-T w ciągu 10 minut i dwukrotnym przemywaniu TBS w ciągu 10 minut, prowadzono wywoływanie reakcji stosując odczynniki do wykrywania alkalicznej fosfatazy (10 ml buforu AP (100 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) z 50 pl roztworu NBT (7,7% błękit nitrotetrazolowy (Sigma) w 70% dimetyloformamidzie) i 37 pl roztworu X-Phosphate (5% fosforan 5-bromo-4-chloro-3-indolilu w dimetyloformamidzie).

P r z y k ł a d 28

Oczyszczanie gp140Cys

Przeciwciało skierowane przeciw gp120 sprzęgnięto kowalencyjnie z dekstranem aktywowanym NHS/EDC i upakowano w kolumnie chromatograficznej. Na kolumnę nałożono supernatant zawierający GP140Cys i po dostatecznym przemyciu eluowano GP140Cys stosując 0,1 M HCl. Eluat zobojętniano bezpośrednio podczas zbierania stosując 1 M Tris, pH 1,2, w probówkach do zbierania frakcji.

DTT usuwa się przez późniejszą dializę wobec 10 mM Mes, 80 mM NaCl, pH 6.0. Ostatecznie GP140Cys miesza się z cząstkami alfawirusowymi zawierającymi zamek leucynowy JUN w E2, jak opisano w przykładzie 16.

PL 192 016 B1

Przykład 29

Konstruowanie PLA2-Cys

Gen PLA2 zamplifikowano przez PCR z pAV3PLAfos stosując oligonukleotydy EcoRIPLA i PLA-Cys-hind. Do PCR używano 100 pmoli każdego z oligonukleotydów i 50 ng DNA matrycy w 50 μl mieszaniny reakcyjnej z 2 jednostkami polimerazy Pwo, 0,1 mM każdym dNTP i 2 mM MgSO4. Wobu reakcjach cykle temperatury prowadzono w następujący sposób: temperatura 94°C w ciągu 2minut, 30 cykli temperatury 94°C (0,5 minuty), temperatury 55°C (0,5 minuty) i temperatury 72°C (2 minuty).

Produkt PCR oczyszczono przy użyciu zestawu QiaEXII, strawiono EcoRI/Hindlll i zligowano z wektorem pAV3 strawionym tymi samymi enzymami.

Oligonukleotydy

EcoRIPLA:

5'-TAACCGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATGG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyj nym: 85)

PLACys-hind:

5'-GAAGTAAAGCTTTTAACCACCGCAACCACCAGAAG-3' (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 86)

Przykład 30

Ekspresja i oczyszczanie PLA-cys

W celu cytoplazmatycznego wytwarzania białek ze znacznikiem Cys, szczep XL-1 Blue E. coli stransformowano wektorami pAV3::PLA i pPLA-Cys. Hodowlę inkubowano w bogatym podłożu w obecności ampicyliny, w temperaturze 37°C, z wytrząsaniem. Przy gęstości optycznej (550 nm) wynoszącej 1dodawano 1mM IPTG i inkubację kontynuowano w ciągu następnych 5 godzin. Komórki zbierano przez wirowanie, ponownie zawieszano w odpowiednim buforze (np. Tris-HCl, pH 7,2, 150 mM NaCl) zawierającym DNAzę, RNAzę i lizozym, i rozbijano stosując prasę Frencha. Po odwirowaniu (Sorvall RC-5C, rotor SS34, 15 000 obrotów na minutę, 10 minut, temperatura 4°C) osad ponownie zawieszano, w 25 ml buforu do przemywania ciał inkluzyjnych (20 mM Tris-HCl, 23% sacharoza, 0,5% Triton X-100, 1mM EDTA, pH 8) w temperaturze 4°C i ponownie wirowano w sposób opisany powyżej. Procedurę tę powtarzano dotąd, aż supernatant po wirowaniu był zasadniczo klarowny. Ciała inkluzyjne ponownie zawieszano w 20 ml buforu do solubilizacji (5,5 M chlorowodorek guanidyny, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5) w temperaturze pokojowej i usuwano nierozpuszczalny materiał przez wirowanie, a następnie przepuszczanie supernatantu przez jałowy sączek (0,45 μm). Roztwór białka utrzymywano w temperaturze 4°C w ciągu co najmniej 10 godzin, w obecności 10 mM EDTA i 100 mM DTT, a następnie dializowano trzy razy wobec 10 objętości 5,5 M chlorowodorku guanidyny, 25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 6. Następnie roztwór dializowano dwukrotnie wobec 5 litrów 2 M mocznika, 4 mM EDTA, 0,1 M NH4Cl, 20 mM boranu sodowego (pH 8,3), w obecności odpowiedniego układu regulującego stan oksydoredukcyjny (utleniony glutation/zredukowany glutation, cystyna/cysteina). Ufałdowane białko poddawano następnie chromatografii jonowymiennej. Białko przechowywano w odpowiednim buforze o pH powyżej 7 w obecności 2-10 mM DTT, aby utrzymywać reszty cystein flankujące domenę FOS w postaci zredukowanej. Przed sprzęganiem białka z cząstkami alfawirusowymi DTT usuwano przez przepuszczanie roztworu białka przez kolumnę do sączenie molekularnego z Sephadex G-25.

PL 192 016 B1

LISTA SEKWENCJI <110> Cytos Biotechnology AG <120> Uporządkowana molekularna prezentacja antygenów, sposób przygotowywania i stosowania <130> 1700.003PL02 <140> PCT/IB99/01925 <141> 1999-11-30 <150> US 60/110,414 <151> 1998-11-30 <150> US 60/142,788 <151> 1999-07-08 <160> 88 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 1 ggggacgcgt gcagcaggta accaccgtta aagaaggcac c 41 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 2 cggtggttac ctgctgcacg cgttgcttaa gcgacatgta gcgg 44 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 3 ccatgaggcc tacgataccc 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 192 016 B1 <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 4 ggcactcacg gcgcgcttta caggc 25 <210> 5 <211> 47 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 5 ccttctttaa cggtggttac ctgctggcaa ccaacgtggt tcatgac 47 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 6 aagcatgctg cacgcgtgtg cggtggtcgg atcgcccggc 40 <210> 7 <211> 90 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 7 gggtctagat tcccaaccat tcccttatcc aggctttttg acaacgctat gctccgcgcc 60 catcgtctgc accagctggc ctttgacacc 90 <210> 8 <211> 108 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 8 gggtctagaa ggaggtaaaa aacgatgaaa aagacagcta tcgcgattgc agtggcactg 60 gctggtttcg ctaccgtagc gcaggccttc ccaaccattc ccttatcc 108 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter

PL 192 016 B1 <400> 9 cccgaattcc tagaagccac agctgccctc c 31 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 10 cctgcggtgg tctgaccgac accc 24 <210> 11 <211> 41 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 11 ccgcggaaga gccaccgcaa ccaccgtgtg ccgccaggat g 41 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 12 ctatcatcta gaatgaatag aggattcttt aac 33 <210> 13 <211> 15 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Zmodyfikowane miejsce wiazania rybosomu <400> 13 aggaggtaaa aaacg 15 <210> 14 <211> 21 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: peptyd sygnałowy <400> 14

PL 192 016 B1

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 15 10 15

Thr Val Ala Gin Ala 20 <210> 15 <211> 46 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: zmodyfikowany konstrukt Fos <400> 15

Cys

Gly

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu

Thr

Asp

Gin

Val

Glu

1

5

10

15

Asp

Glu

Lys

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile

Ala

Asn

Leu

Lys

Glu

20

25

30

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

His

Gly

Cys

35

40

45

<210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: łącznik peptydowy <400> 16

Ala Ala Ala Ser Gly Gly 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: łącznik peptydowy <400> 17 Gly Gly Ser Ala Ala Ala
1	5
<210> <211> <212> <213>	18 256 DMA Sekwencja sztuczna
<220> <223>	Opis sekwencji sztucznej:	konstrukt fuzyjny Fos

<400> 18 gaattcagga ggtaaaaaac gatgaaaaag acagctatcg cgattgcagt ggcactggct 60 ggtttcgcta ccgtagcgca ggcctgggtg ggggcggccg cttctggtgg ttgcggtggt 120

PL 192 016 B1 ctgaccgaca ccctgcaggc ggaaaccgac caggtggaag acgaaaaatc cgcgctgcaa 180 accgaaatcg cgaacctgct gaaagaaaaa gaaaagctgg agttcatcct ggcggcacac 240 ggtggttgct aagctt 256 <210> 19 <211> 52 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: konstrukt fuzyjny Fos <400> 19

Ala

Ser

Gly 5

Gly

Cys

Gly

Leu 10

Thr

Asp

Thr

Leu

Gin 15

Ala

Glu

Thr

Asp

Gin 20

Val

Glu

Asp

Glu

Lys 25

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr 30

Glu

Ile

Ala

Asn

Leu 35

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu 40

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile 45

Leu

Ala

His

Gly

Cys

<210> 20 <211> 261 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: konstrukt fuzyjny Fos <220>

<221> CDS <222> (22)..(240) <400> 20

gaattcagga ggtaaaaaac g atg Met	aaa aag aca gct	atc Ile	gcg att Ala Ile	gca Ala	gtg Val 10	51
Lys Lys	Thr Ala 5
	1
gca ctg gct ggt	ttc gct acc	gta gcg	cag gcc	tgc	ggt ggt	ctg	acc	99
Ala Leu Ala Gly	Phe Ala Thr	Val Ala	Gin Ala	Cys	Gly Gly	Leu	Thr
	15		20			25
gac acc ctg cag	gcg gaa acc	gac cag	gtg gaa	gac	gaa aaa	tcc	gcg	147
Asp Thr Leu Gin	Ala Glu Thr	Asp Gin	Val Glu	Asp	Glu Lys	Ser	Ala
30		35			40
ctg caa acc gaa	atc gcg aac	ctg ctg	aaa gaa	aaa	gaa aag	ctg	gag	195
Leu Gin Thr Glu	Ile Ala Asn	Leu Leu	Lys Glu	Lys	Glu Lys	Leu	Glu
45		50			55
ttc atc ctg gcg	gca cac ggt	ggt tgc	ggt ggt	tct	gcg gcc	gct		240
Phe Ile Leu Ala	Ala His Gly	Gly Cys	Gly Gly	Ser	Ala Ala	Ala
60	65			70
gggtgtgggg atatcaagct t							261

PL 192 016 B1 <210> 21 <211> 73 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: konstrukt fuzyjny Fos <400> 21

Met 1

Lys

Thr

Ala 5

Ile

Ala

Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe

Ala

10

15

Thr

Val

Ala

Gin

Ala

Cys

Gly

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu

20

25

30

Thr

Asp

Gin

Val

Glu

Asp

Glu

Lys

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile

Ala

35

40

45

Asn

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

His

50

55

60

Gly

Cys

Gly

Ser

Ala

65

70

<210> 22 <211> 196 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: konstrukt fuzyjny Fos <220>

<221> CDS <222> (34) .. (189) <400> 22 gaattcagga ggtaaaaaga tatcgggtgt ggg gcg gcc gct tct ggt ggt tgc 54 Ala Ala Ala Ser Gly Gly Cys

1

5

ggt

ctg

acc

gac

acc

ctg

cag

gcg

gaa

acc

gac

cag

gtg gaa

gac

102

Gly

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu

Thr

Asp

Gin

Val Glu

Asp

10

15

20

gaa

aaa

tcc

gcg

ctg

caa

acc

gaa

atc

gcg

aac

ctg

aaa gaa

aaa

150

Glu

Lys

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile

Ala

Asn

Leu

Lys Glu

Lys

25

30

35

gaa

aag

Ctg

gag

ttc

atc

ctg

gcg

gca

cac

ggt

tgc

taagctt

196

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

His

Gly

Cys

40

45

50

<210> 23 <211> 52 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: konstrukt fuzyjny Fos <400> 23

PL 192 016 B1

Ala 1

Ala

Ser

Gly 5

Gly

Cys

Gly

Leu 10

Thr

Asp

Thr

Leu

Gin 15

Ala

Glu

Thr

Asp

Gin

Val

Glu

Asp

Glu

Lys

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile

20

25

30

Ala

Asn

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

His Gly Gly Cys 50 <210> 24 <211> 204 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: konstrukt fuzyjny Fos <400> 24 gaattcagga ggtaaaaaac gatggcttgc ggtggtctga ccgacaccct gcaggcggaa 60 accgaccagg tggaagacga aaaatccgcg ctgcaaaccg aaatcgcgaa cctgctgaaa 120 gaaaaagaaa agctggagtt catcctggcg gcacacggtg gttgcggtgg ttctgcggcc 180 gctgggtgtg gggatatcaa gett 204 <210> 25 <211> 56 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: konstrukt fuzyjny Fos

<400> 25

Lys Thr Met

Ala

Cys

Gly

Leu

Thr

Asp

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu

Thr

1

5

10

15

Asp Gin Val

Glu

Asp

Glu

Lys

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu

ile

Ala

Asn

20

25

30

Leu Leu Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

His

Gly

35

40

45

Gly Cys Gly

Gly

Ser

Ala

50

55

<210> 26 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26

Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu 15 10 15

Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala 20 25 <210> 27

PL 192 016 B1 <211> 262 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: konstrukt fuzyjny Fos <400> 27 gaattcaggc ctatggctac aggctcccgg acgtccctgc tcctggcttt tggcctgctc 60 tgcctgccct ggcttcaaga gggcagcgct gggtgtgggg cggccgcttc tggtggttgc 120 ggtggtctga ccgacaccct gcaggcggaa accgaccagg tggaagacga aaaatccgcg 180 ctgcaaaccg aaatcgcgaa cctgctgaaa gaaaaagaaa agctggagtt catcctggcg 240 gcacacggtg gttgctaagc tt <210> 28 <211> 52 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: konstrukt fuzyjny Fos <400> 28

Ala

Ser

Gly 5

Gly

Cys

Gly

Leu 10

Thr

Asp

Thr

Leu

Gin 15

Ala

Glu

Thr

Asp

Gin

Val

Glu

Asp

Glu

Lys

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile

20

25

30

Ala

Asn

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

35

40

45

His

Gly

Cys

<210> 29 <211> 261 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: konstrukt fuzyjny Fos <220>

<221> CDS <222> (7)..(240) <400> 29 gaattc atg gct aca ggc tcc cgg acg tcc ctg ctc ctg gct ttt ggc Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly

1

5

10

ctg

ctc

tgc

ctg

ccc

tgg

ctt

caa

gag

ggc

agc

gct

tgc

ggt

ctg

Leu

Cys

Leu

Pro

Trp

Leu

Gin

Glu

Gly

Ser

Ala

Cys

Gly

Leu

15

20

25

30

acc

gac

acc

ctg

cag

gcg

gaa

acc

gac

cag

gtg

gaa

gac

gaa

a aa

tcc

Thr

Asp

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu

Thr

Asp

Gin

Val

Glu

Asp

Glu

Lys

Ser

35

40

45

144

PL 192 016 B1

gcg ctg Ala Leu

caa acc Gin Thr 50

gaa atc

gcg aac Ala Asn

ctg Leu 55

ctg aaa gaa aaa

gaa Glu 60

aag Lys

ctg Leu

192

Glu

Ile

Leu

Lys

Glu Lys

gag

ttc

atc

ctg

gcg

gca

cac

ggt

tgc

ggt

tct

gcg

gcc

gct

240

Glu

Phe

ile

Leu

Ala

His

Gly

Cys

Gly

Ser

Ala

65

70

75

gggtgtggga ggcctaagct t 261 <210> 30 <211> 78 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej: konstrukt fuzyjny Fos <400> 30

Met

Ala

Thr

Gly

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Ala

Phe

Gly

Leu

1

5

10

15

Cys

Leu

Pro

Trp

Leu

Gin

Glu

Gly

Ser

Ala

Cys

Gly

Leu

Thr

Asp

20

25

30

Thr

Leu

Gin

Ala

Glu

Thr

Asp

Gin

Val

Glu

Asp

Glu

Lys

Ser

Ala

Leu

35

40

45

Gin

Thr

Glu

Ile

Ala

Asn

Leu

Lys

Glu

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

50

55

60

Ile

Leu

Ala

His

Gly

Cys

Gly

Ser

Ala

65

70

75

<210> 31 <211> 44 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 31 cctgggtggg ggcggccgct tctggtggtt gcggtggtct gacc 44 <210> 32 <211> 44 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 32 ggtgggaatt caggaggtaa aaagatatcg ggtgtggggc ggcc 44 <210> 33 <211> 47 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 192 016 B1 <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 33 ggtgggaatt caggaggtaa aaaacgatgg cttgcggtgg tctgacc <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 34 gcttgcggtg gtctgacc <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 35 ccaccaagct tagcaaccac cgtgtgc <210> 36 <211> 54 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 36 ccaccaagct tgatatcccc acacccagcg gccgcagaac caccgcaacc accg <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 37 ccaccaagct taggcctccc acacccagcg gc <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter

PL 192 016 B1 <400> 38 ggtgggaatt caggaggtaa aaaacgatg 29 <210> 39 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 39 ggtgggaatt caggcctatg gctacaggct cc 32 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 40 ggtgggaatt catggctaca ggctccc 27 <210> 41 <211> 59 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 41 gggtctagaa tggctacagg ctcccggacg tccctgctcc tggcttttgg cctgctctg 59 <210> 42 <211> 58 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 42 cgcaggcctc ggcactgccc tcttgaagcc agggcaggca gagcaggcca aaagccag 58 <210> 43 <211> 402 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Zmodyfikowana fosfolipaza A2 jadu pszczoły <220>

<221> CDS <222> (1) .. (402)

PL 192 016 B1 <400> 43

atc Ile 1

atc Ile

tac Tyr

cca Pro

ggt Gly 5

act Thr

ctg Leu

tgg Trp

tgt Cys

ggt Gly 10

cac His

ggc Gly

aac Asn

aaa Lys

tct Ser 15

tct Ser

48

ggt

ccg

aac

gaa

ctc

ggc

cgc

ttt

aaa

cac

acc

gac

gca

tgc

tgt

cgc

96

Gly

Pro

Asn

Glu

Leu

Gly

Arg

Phe

Lys

His

Thr

Asp

Ala

Cys

Arg

20

25

30

acc

cag

gac

atg

tgt

ccg

gac

gtc

atg

tct

gct

ggt

gaa

tct

aaa

cac

144

Thr

Gin

Asp

Met

Cys

Pro

Asp

Val

Met

Ser

Ala

Gly

Glu

Ser

Lys

His

35

40

45

ggg

tta

act

aac

acc

gct

tct

cac

acg

cgt

ctc

agc

tgc

gac

tgc

gac

192

Gly

Leu

Thr

Asn

Thr

Ala

Ser

His

Thr

Arg

Leu

Ser

Cys

Asp

Cys

Asp

50

55

60

gac

aaa

ttc

tac

gac

tgc

ctt

aag

aac

tcc

gcc

gat

acc

atc

tct

240

Asp

Lys

Phe

Tyr

Asp

Cys

Leu

Lys

Asn

Ser

Ala

Asp

Thr

Ile

Ser

65

70

75

80

tac

ttc

gtt

ggt

aaa

atg

tat

ttc

aac

ctg

atc

gat

acc

aaa

tgt

tac

288

Tyr

Phe

Val

Gly

Lys

Met

Tyr

Phe

Asn

Leu

Ile

Asp

Thr

Lys

Cys

Tyr

85

90

95

aaa

ctg

gaa

cac

ccg

gta

acc

ggc

tgc

ggc

gaa

cgt

acc

gaa

ggt

cgc

336

Lys

Leu

Glu

His

Pro

Val

Thr

Gly

Cys

Gly

Glu

Arg

Thr

Glu

Gly

Arg

100

105

110

tgc

ctg

cac

tac

acc

gtt

gac

aaa

tct

aaa

ccg

aaa

gtt

tac

cag

tgg

384

Cys

Leu

His

Tyr

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Lys

Pro

Lys

Val

Tyr

Gin

Trp

115

120

125

ttc

gac

ctg

cgc

aaa

tac

402

Phe

Asp

Leu

Arg

Lys

Tyr

130 <210> 44 <211> 134 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <223> Opis sekwencji sztucznej:

jadu pszczoły <400> 44

Zmodyfikowana fosfolipaza A2

ile 1	Ile	Tyr	Pro	Gly 5	Thr	Leu	Trp
Gly	Pro	Asn	Glu 20	Leu	Gly	Arg	Phe
Thr	Gin	Asp 35	Met	Cys	Pro	Asp	Val 40
Gly	Leu 50	Thr	Asn	Thr	Ala	Ser 55	His
Asp 65	Lys	Phe	Tyr	Asp	Cys 70	Leu	Lys
Tyr	Phe	Val	Gly	Lys 85	Met	Tyr	Phe

Cys Gly His Gly Asn Lys Ser 10 15

Lys His Thr Asp Ala Cys Cys 25 30

Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys 45

Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys 60

Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser 75

Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys 90 95

Ser

Arg

His

Asp

Ser

Tyr

PL 192 016 B1

Lys

Leu

Glu

His

Pro

Val

Thr

Gly

Cys

Gly Glu

Arg

Thr

Glu

Gly Arg

100

105

110

Cys

Leu

His

Tyr

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Lys Pro

Lys

Val

Tyr

Gin Trp

115

120

125

Phe

Asp

Leu

Arg

Lys

Tyr

130 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 45 ccatcatcta cccaggtac 19 <210> 46 <211> 34 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 46 cccacaccca gcggccgcgt atttgcgcag gtcg 34 <210> 47 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 47 cggtggttct gcggccgcta tcatctaccc aggtac 36 <210> 4B <211> 19 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 48 ttagtatttg cgcaggtcg 19 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 192 016 B1 <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 49 ccggctccat cggtgcag <210> 50 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 50 accaccagaa gcggccgcag gggaaacaca tctgcc 36 <210> 51 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 51 cggtggttct gcggccgctg gctccatcgg tgcag <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 52 ttaaggggaa acacatctgc c 21 <210> 53 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 53 actagtctag aatgagagtg aaggagaaat atc <210> 54 <211> 42 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter

PL 192 016 B1 <400> 54 tagcatgcta gcaccgaatt tatctaattc caataattct tg 42 <210> 55 <211> 51 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 55 gtagcaccca ccaaggcaaa gctgaaagct acccagctcg agaaactggc a 51 <210> 56 <211> 48 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <4Q0> 56 caaagctcct attcccactg ccagtttctc gagctgggta gctttcag 48 <210> 57 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 57 ttcggtgcta gcggtggctg cggtggtctg accgac 36 <210> 58 <211> 37 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 58 gatgctgggc ccttaaccgc aaccaccgtg tgccgcc 37 <210> 59 <211> 46 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja aminokwasowa JUN <400> 59

Cys Gly Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys 15 10 15

PL 192 016 B1

Ala Gin Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gin 20 25 30

Val Ala Gin Leu Lys Gin Lys val Met, Asn His Val Gly Cys 35 40 45 <210> 60 <211> 46 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: sekwencja aminokwasowa FOS <400> 60

Cys Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gin Ala Glu Thr Asp Gin Val

Glu

1

5

10

15

Asp

Glu

Lys

Ser

Ala

Leu

Gin

Thr

Glu

Ile

Ala

Asn

Leu

Lys

Glu

20

25

30

Lys

Glu

Lys

Leu

Glu

Phe

Ile

Leu

Ala

His

Gly

Cys

40 45 <210> 61 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 61 ccggaattca tgtgcggtgg tcggatcgcc cgg 33 <210> 62 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 62 gtcgctaccc gcggctccgc aaccaacgtg gttcatgac 39 <210> 63 <211> 50 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 63 gttggttgcg gagccgcggg tagcgacatt gacccttata aagaatttgg 50

PL 192 016 B1 <210> 64 <211> 38 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 64 cgcgtcccaa gcttctacgg aagcgttgat aggatagg 38 <210> 65 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 65 ctagccgcgg gttgcggtgg tcggatcgcc cgg 33 <210> 66 <211> 38 <212> DNA <2L3> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 66 cgcgtcccaa gcttttagca accaacgtgg ttcatgac 38 <210> 67 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 67 ccggaattca tggacattga cccttataaa g 31 <210> 68 <211> 45 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 68 ccgaccaccg caacccgcgg ctagcggaag cgttgatagg atagg 45 <210> 69 <211> 47 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 192 016 B1 <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 69 ctaatggatc cggtgggggc tgcggtggtc ggatcgcccg gctcgag 47 <210> 70 <211> 39 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 70 gtcgctaccc gcggctccgc aaccaacgtg gttcatgac 39 <210> 71 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 71 ccggaattca tggacattga cccttataaa g 31 <210> 72 <211> 48 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 72 ccgaccaccg cagcccccac cggatccatt agtacccacc caggtagc 48 <210> 73 <211> 45 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 73 gttggttgcg gagccgcggg tagcgaccta gtagtcagtt atgtc 45 <210> 74 <211> 38 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter

PL 192 016 B1 <400> 74 cgcgtcccaa gcttctacgg aagcgttgat aggatagg 38 <210> 75 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 75 ctagccgcgg gttgcggtgg tcggatcgcc cgg 33 <210> 76 <211> 38 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 76 cgcgtcccaa gcttttagca accaacgtgg ttcatgac 38 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 77 ccggaattca tggccacact tttaaggagc 30 <210> 78 <211> 38 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 78 cgcgtcccaa gcttttagca accaacgtgg ttcatgac 38 <210> 79 <211> 31 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 79 ccggaattca tggacattga cccttataaa g 31

PL 192 016 B1 <210> 80 <211> 51 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 80 cctagagcca cctttgccac catcttctaa attagtaccc acccaggtag c 51 <210> 81 <211> 48 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 81 gaagatggtg gcaaaggtgg ctctagggac ctagtagtca gttatgtc 48 <210> 82 <211> 38 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 82 cgcgtcccaa gcttctaaac aacagtagtc tccggaag 38 <210> 83 <211> 36 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 83 gccgaattcc tagcagctag caccgaattt atctaa 36 <210> 84 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 84 ggttaagtcg acatgagagt gaaggagaaa tat 33 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna

PL 192 016 B1 <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 85 taaccgaatt caggaggtaa aaagatatgg 30 <210> 86 <211> 35 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 86 gaagtaaagc ttttaaccac cgcaaccacc agaag 35 <210> 87 <211> 33 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: Starter <400> 87 tcgaatgggc cctcatcttc gtgtgctagt cag 33 <210> 88 <211> 4 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>

<223> Opis sekwencji sztucznej: konstrukt fuzyjny Fos <400> 88

Glu Phe Arg Arg

PL 192 016 B1

Claims

1. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera:

a) sztuczne rusztowanie molekularne obejmujące:

(i) cząstkę rdzenia którą jest cząstka wirusopodobna; (ii) organizator zawierający co najmniej jedno pierwsze miejsce przyłączania, przy czym ten organizator jest połączony z cząstką rdzenia co najmniej jednym wiązaniem kowalencyjnym i organizator jest polipeptydem lub jego resztą aminokwasową; oraz

(i) sztuczne miejsce przyłączania antygenu lub determinanty antygenowej; i (ii) naturalne miejsce przyłączania antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym drugie miejsce przyłączania jest zdolne do połączenia poprzez co najmniej jedno wiązanie niepeptydowe z pierwszym miejscem przyłączania;

oraz pierwsze i/lub drugie miejsce przyłączania obejmuje

a) antygen,

b) przeciwciało lub fragment przeciwciała,

c) biotynę,

d) awidynę,

e) streptawidynę,

f) receptor,

g) ligand receptora,

h) ligand,

i) białko wiążące ligand,

j) oddziałujące polipeptydy zamka leucynowego;

k) grupę aminową

l) grupę chemiczną reaktywną z grupą aminową,

m) grupę karboksylową.

n) grupę chemiczną reaktywną z grupą karboksylową,

o) grupę sulfhydrylową,

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że drugie miejsce przyłączania jest polipeptydem lub jego resztą aminokwasową.

3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że pierwszym miejscem przyłączania jest grupa aminowa, a drugim miejscem przyłączania jest grupa sulfhydrylowa.

4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że cząstką wirusopodobną jest białko kapsydu wirusa zapalenia wątroby typu B.

5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że każde z wymienionych pierwsze miejsce przyłączania i drugie miejsce przyłączania obejmuje oddziałujący polipeptyd zamka leucynowego.

6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że pierwszym miejscem przyłączania jest polipeptyd JUN, a drugim miejscem przyłączania jest polipeptyd FOS.

7. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że pierwszym miejscem przyłączania jest reszta lizyny, a drugim miejscem przyłączania jest reszta cysteiny.

8. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że cząstką wirusopodobną jest białko kapsydu wirusa odry.

9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że każde z wymienionych pierwsze miejsce przyłączania i drugie miejsce przyłączania obejmuje oddziałujący polipeptyd zamka leucynowego.

10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że pierwszym miejscem przyłączania i drugim miejscem przyłączania są polipeptydy zamka leucynowego JUN i/lub FOS.

11. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że cząstka rdzenia zawiera zrekombinowane białka alfawirusa,

12. Kompozycja według zastrz. 2, znamienna tym, że cząstka rdzenia zawiera białka wybrane z grupy składającej się z:

PL 192 016 B1

a) zrekombinowanych białek rotawirusa,

b) zrekombinowanych białek wirusa Norwalk,

c) zrekombinowanych białek wirusa choroby pyska i racic,

d) zrekombinowanych białek retrowirusa,

e) zrekombinowanych białek wirusa zapalenia wątroby typu B,

f) zrekombinowanych białek wirusa mozaiki tytoniu,

g) zrekombinowanych białek wirusa choroby stad, i

h) zrekombinowanych białek ludzkiego wirusa brodawczaka.

13. Kompozycja według zastrz. 11 albo 12, znamienna tym, że każde z wymienionych pierwsze miejsce przyłączania i drugie miejsce przyłączania obejmuje oddziałujący polipeptyd zamka leucynowego.

14. Kompozycja według zastrz. 11 albo 12, znamienna tym, że pierwszym miejscem przyłączania jest grupa aminowa, a drugim miejscem przyłączania jest grupa sulfhydrylowa.

15. Kompozycja według zastrz.11 albo 12, znamienna tym, że pierwszym miejscem przyłączania i drugim miejscem przyłączania są polipeptydy zamka leucynowego JUNi/lub FOS.

16. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że antygen lub determinantę antygenową wybiera się z grupy składającej się z:

c) białek odpowiednich do indukcji odpowiedzi immuno logicznej skierowanej przeciw alergenom.

17. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że antygen lub determinantę antygenową stanowią białka odpowiednie do indukcji odpowiedzi immunologicznej u zwierząt hodowlanych.

18. Kompozycja według zastrz.16 albo 17, znamienna tym, że białko odpowiednie do indukcji odpowiedzi immunologicznejskierowanej przeciw komórkom raka jest wybrane z grupy obejmującej:

a) zrekombinowane białko komórek raka gruczołu sutkowego,

b) zrekombinowane białko komórek raka nerki,

c) zrekombinowanego białka komórek raka gruczołu krod) zrekombinowane białko komórek raka skóry,

e) zrekombinowane białko komórek raka mózgu,

f) zrekombinowane białko komórek białaczkowych.

19. Kompozycja według zastrz. 16 albo 17, znamienna tym, że każde z wymienionych pierwsze miejsce przyłączania i drugie miejsce przyłączania obejmuje oddziałujący polipeptyd zamka leucynowego.

20. Kompozycja według zastrz. 16, znamienna tym, że białko odpowiednie do wywołania odpowiedzi skierowanej przeciw chorobom infekcyjnym, jest wybrane z grupy obejmującej:

a) zrekombinowane białko HIV, i

b) zrekombinowane białko wirusa grypy.

21. Kompozycja według zastrz. 17, znamienna tym, że białko odpowiednie do wywołania odpowiedzi skierowanej przeciw chorobom infekcyjnym, jest wybrane z grupy obejmującej:

a) zrekombinowane białko HIV, i

b) zrekombinowane białko wirusa grypy.

22. Kompozycja według zastrz. 16 albo 17, znamienna tym, że białko odpowiednie do wywołania odpowiedzi skierowanej przeciw chorobom infekcyjnym, jest wybrane z grupy obejmującej:

c) zrekombinowanebiałkozapalenia wątroby typu C,

d) zrekombinowanebiałko Toxoplasma,

e) zrekombinowanebiałko Plasmodium falciparum,

f) zrekombinowane białko Plasmodium vivax,

g) zrekombinowane białko Plasmodium ovale, oraz

h) zrekombinowane białko Plasmodium malariae.

23. Kompozycja według zastrz. 16 albo 17, znamienna tym, że białko odpowiednie do wywołania odpowiedzi skierowanej przeciw chorobom infekcyjnym, jest:

i) zrekombinowanym białkiem Chlamydia.

24. Kompozycja według zastrz. 16 albo 17, znamienna tym, że białko odpowiednie do wywołania odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciw alergenom jest wybrane z grupy obejmującej:

PL 192 016 B1

d) zrekombinowane białko odpowiednie do wywołania odpowiedzi immunologicznej przeciw astmie.

25. Sposób wytwarzania sztucznego, uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenu, znamienny tym, że:

a) zapewnia się sztuczne rusztowanie molekularne zawierające:

(i) sztuczne miejsce przyłączania wymienionego antygenu lub determinanty antygenowej; i (ii) naturalne miejsce przyłączania wymienionego antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym pierwsze i/lub drugie miejsce przyłączania obejmuje:

a) antygen,

b) przeciwciało lub fragment przeciwciała,

c) biotynę,

d) awidynę,

e) streptawidynę,

f) receptor,

g) ligand receptora,

h) ligand,

i) białko wiążące ligand,

j) oddziałujący polipeptyd zamka leucynowego;

k) grupę aminową

l) grupę chemiczną reaktywną z grupą aminową,

m) grupę karboksylową,

n) grupę chemiczną reaktywną z grupą karboksylową,

o) grupę sulfhydrylową,

p) grupę chemiczną reaktywną z grupą sulfhydrylową, r)ich kombinację, i wymienione drugie miejsce przyłączania jest zdolne do łączenia się poprzez co najmniej jedno wiązanie niepeptydowe z pierwszym miejscem przyłączania; oraz

c) łączy się wymienione sztuczne rusztowanie molekularne z wymienionym antygenem lub determinantą antygenową, przy czym antygen lub determinanta antygenowa i sztuczne rusztowanie molekularne oddziaływują ze sobą poprzez to połączenie tworząc uporządkowany i powtarzalny układ antygenu.

26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że drugie miejsce przyłączania jest polipeptydem lub jego resztą aminokwasową.

27. Zastosowanie kompozycji z zastrz. 1do wytwarzania leku do leczenia chorób infekcyjnych, alergii lub raka.

28. Zastosowanie kompozycji zawierającej:

a) sztuczne rusztowanie molekularne obejmujące:

(i) sztuczne miejsce przyłączania wymienionego antygenu lub determinanty antygenowej; i (ii) naturalne miejsce przyłączania wymienionego antygenu lub determinanty antygenowej,

PL 192 016 B1 przy czym pierwsze i/lub drugie miejsce przyłączania obejmuje a) antygen,

b) przeciwciało lub fragment przeciwciała,

c) biotynę,

d) awidynę,

e) streptawidynę,

f) receptor,

g) ligand receptora,

h) ligand,

i) białko wiążące ligand,

j) oddziałujące polipeptydy zamka leucynowego;

k) grupę aminową

l) grupę chemiczną reaktywną z grupą aminową,

m) grupę karboksylową,

n) grupę chemiczną reaktywną z grupą karboksylową,

o) grupę sulfhydrylową,

p) grupę chemiczną reaktywną z grupą sulfhydrylową, r) ich kombinację, i przy czym drugie miejsce przyłączania jest zdolne do łączenia się poprzez co najmniej jedno wiązanie niepeptydowe z pierwszym miejscem przyłączania; oraz przy czym antygen lub determinanta antygenowa i rusztowanie oddziaływują ze sobą poprzez to połączenie tworząc uporządkowany i powtarzalny układ antygenu, do wytwarzania leku do immunizacji.

29. Kompozycja szczepionki, znamienna tym, że zawiera: a) sztuczne rusztowanie molekularne obejmujące:

(i) cząstkę rdzenia, która jest cząstką wirusopodobną, (ii) organizator zawierający co najmniej jedno pierwsze miejsce przyłączania, przy czym co najmniej jeden z organizatorów jest połączony z cząstką rdzenia co najmniej jednym wiązaniem kowalencyjnym; i organizator jest polipeptydem lub jego resztą amionokwasową, oraz

(i) sztuczne miejsce przyłączania wymienionego antygenu lub determinanty antygenowej; i (ii) naturalne miejsce przyłączania wymienionego antygenu lub determinanty antygenowej, przy czym drugie miejsce przyłączania jest zdolne do łączenia się poprzez co najmniej jedno wiązanie niepeptydowe z pierwszym miejscem przyłączania; oraz przy czym pierwsze i/lub drugie miejsce przyłączania obejmuje a) antygen,

b) przeciwciało lub fragment przeciwciała,

c) biotynę,

d) awidynę,

e) streptawidynę,

f) receptor,

g) ligand receptora,

h) ligand,

i) białko wiążące ligand,

j) oddziałujące polipeptydy zamka leucynowego;

k) grupę aminową

l) grupę chemiczną reaktywną z grupą aminową,

m) grupę karboksylową,

n) grupę chemiczną reaktywną z grupą karboksylową,

o) grupę sulfhydrylową,

p) grupę chemiczną reaktywną z grupą sulfhydrylową, r) ich kombinację, oraz przy czym wymienione antygen lub determinanta antygenowa i rusztowanie oddziaływują ze sobą poprzez to połączenie tworząc uporządkowany i powtarzalny układ antygenu.

30. Kompozycja szczepionki według zastrz. 29, znamienna tym, że zawiera ponadto adiuwant.

PL 192 016 B1

31. Kompozycja szczepionki według zastrz. 29, znamienna tym, że drugie miejsce przyłączania jest polipeptydem lub jego resztą aminokwasową.

32. Kompozycja szczepionki według zastrz. 29, znamienna tym, że cząstka rdzenia obejmuje cząstkę wirusopodobną wirusa zapalenia wątroby typu B.

33. Kompozycja szczepionki według zastrz. 29, znamienna tym, że cząstka rdzenia obejmuje cząstkę wirusopodobną wirusa odry.