CN109394752A - 治疗慢性乙型肝炎病毒感染的sting激动剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及治疗慢性乙型肝炎病毒感染的STING激动剂的用途。本文提供治疗患有乙型肝炎病毒(HBV)感染的受试者的方法。更具体地说，本文公开了在巨噬细胞、树突细胞和/或肝脏非实质细胞中用小分子STING激动剂刺激先天细胞因子应答以便抑制HBV在肝细胞中的复制的方法。所述方法特别适用于治疗慢性HBV感染。本文还公开了鉴别适用于治疗HBV感染的化合物的方法。

Description

治疗慢性乙型肝炎病毒感染的STING激动剂的用途
本申请是分案申请，原申请的申请日为2014年10月21日、申 请号为201480057688.5、发明名称为“治疗慢性乙型肝炎病毒感染的 STING激动剂的用途”。
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年10月21日提交的美国临时申请号61/893,526 的优先权，所述申请的公开内容据此以引用的方式整体并入。
技术领域
本公开提供治疗患有乙型肝炎病毒(HBV)感染的受试者的方法。 更具体地说，本文公开了在巨噬细胞、树突细胞和/或肝脏非实质细 胞中用小分子STING激动剂刺激先天细胞因子应答以便抑制HBV在 肝细胞中的复制的方法。所公开的方法特别适用于治疗慢性HBV感 染。本文还公开了鉴别适用于治疗HBV感染的化合物的方法。
背景技术
病毒感染是由宿主模式识别受体(PRR)快速识别，如Toll样受体 (TLR)、RIG-I样受体(RLR)等等，它们激活细胞应答，从而产生I型 干扰素(IFN)、促炎性细胞因子及趋化因子。此早期细胞因子应答不 仅限制病毒复制和蔓延，而且协调更特异性和更强的适应性免疫应答 的发生，从而最终消除病毒。PRR介导的先天细胞因子应答在防御病 毒感染中的重要作用是由以下事实充分说明：缺乏编码PRR或其信 号传导元件的基因的人和小鼠易受病毒感染。
为了建立感染，致病性病毒已经进化出了多个机制以躲避和/或 对抗PRR介导的先天性免疫应答。实际上，PRR介导的细胞因子应 答的失败或不适当的激活经常在包括慢性乙型肝炎的许多慢性病毒 感染中观察到，用病毒DNA聚合酶抑制剂来治疗该种疾病的当前抗 病毒疗法未能提供治愈。
乙型肝炎病毒(HBV)是一种非致细胞病变嗜肝DNA病毒，其慢 性感染全世界超过3亿5千万人口。慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是 归因于宿主不能发动充分的免疫应答来清除病毒。HBV感染的结果 和发病机理主要通过宿主抗病毒免疫应答的种类和量级来确定，这通 常与感染时的年龄有关。虽然超过95％的成人获得性感染在6个月内 通过有力的和多克隆的HBV特异性T细胞应答自发地清除，但超过 90％暴露的新生儿和大约30％年龄在1-5岁的儿童发展成慢性感染， 这与较弱的和经常几乎检测不到的病毒特异性T细胞应答有关。
用长期的核苷类似物疗法或经由有限持续时间的聚乙二醇化α 干扰素(IFN-α)疗法实现的病毒复制的持续抑制与肝脏疾病的改善、肝 脏失代偿的阻止和肝细胞癌的发病率和死亡率减轻有关。然而，HBV 表面抗原(HBsAg)血清转化(具有完全和持久感染控制的对HBV的成 功免疫应答或“功能性治愈”的标志)很少能用当前疗法实现。
虽然TLR和RLR激动剂的抗病毒功效已在HBV转基因小鼠以 及感染了WHV或DHBV的动物中观察到，但全身性施用实现抗病 毒效果所必需的剂量的PRR激动剂通常与显著的副作用有关，这是 由于广泛的细胞应答的激活和促炎性细胞因子的大量产生。
发明内容
本文公开了治疗患有乙型肝炎病毒感染的受试者的方法，其包括 向所述受试者施用有效量的STING激动剂。
还提供了鉴别适用于治疗乙型肝炎病毒感染的化合物的方法，其 包括：用目标化合物处理肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细 胞或其任何组合；在条件培养基中孵育所述细胞；从所处理的细胞中 除去条件培养基或其部分；以及用条件培养基孵育乙型肝炎病毒感染 的肝细胞。
本文还提供了治疗患有乙型肝炎病毒感染的受试者的方法，其包 括：用目标化合物处理肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞 或其任何组合；在条件培养基中孵育所述细胞；从所处理的细胞中除 去条件培养基或其部分；以及向所述受试者施用所述条件培养基或其 部分。
附图说明
在结合附图阅读时，将进一步理解概述以及下面的详细描述。为 了说明所公开的方法，在附图中示出方法的示例性实施方案；然而， 所述方法不限于所公开的特定实施方案。在图中：
图1包括图1A-1C，示出了：A)测定策略的示例性表示；B)用 TLR激动剂(直接处理)或含有从TLR激动剂处理的RAW264.7细胞 收获的50％条件培养基的培养基(间接处理)处理AML12HBV10；以 及C)用从TLR激动剂处理的RAW264.7细胞收获的条件培养基间接 处理AML12HBV10细胞。
图2包括图2A-2B，表示：A)从MicroSource文库鉴别的作为先 天免疫增强物的示例性类黄酮的结构；以及B)用7,2'-二羟基黄酮化 合物直接处理的或用条件培养基间接处理的AMLHBV10细胞的分 析，所述条件培养基来自用7,2'-二羟基黄酮化合物处理的RAW264.7 细胞。
图3包括图3A-3D，表示：A)示例性小鼠IFN诱导物的结构； B)用DMXAA(上图)、CMA(中图)、泰洛伦(下图)(直接处理)直接处理 的或用从用每种化合物处理12h的RAW264.7细胞收获的50％条件 培养基间接处理的AML12HBV10细胞的示例性分析；C)模拟处理或 用125μM的DMXAA或1μg/ml的LPS处理的RAW264.7和 AML12HBV10细胞的示例性分析；以及D)用较低剂量的DMXAA 直接或间接处理的AML12HBV10细胞的示例性分析。
图4包括图4A-4E，表示用DMXAA、聚I:C、Pam3CSK4直接 处理的或用从用DMXAA或TLR激动剂处理的RAW264.7细胞收获 的50％条件培养基间接处理的AML12HBV10细胞的示例性分析。A) 通过RNA印迹测定细胞内HBV RNA；B)通过蛋白质印迹测定HBV 核心蛋白；C)通过天然琼脂糖凝胶测定法测定HBV衣壳；D)通过天 然琼脂糖凝胶测定法测定衣壳相关的HBV DNA；以及E)通过DNA 印迹杂交测定细胞质HBV核心DNA。
图5包括图5A-5E，表示用以下处理的RAW264.7细胞的示例性 蛋白质印迹分析：A)125μM的DMXAA，B)1μg/ml的Pam3CSK4 (TLR1/2激动剂)，C)3μM的gardiquimod(TLR7激动剂)，D)10μg/ml 的聚I:C(TLR3激动剂)，或E)1μg/ml的LPS(TLR4激动剂)，持续 所示的时间。
图6包括图6A-6G，表示用125μM的DMXAA、1μg/ml的 Pam3CSK4(TLR1/2激动剂)、10μg/ml的聚I:C(TLR3激动剂)或3μM 的gardiquimod(TLR7激动剂)处理(持续所示的时间)的RAW264.7细 胞的示例性RT-PCR分析。以下的分析：A)IFN-β，B)IL6，C)IL1， D)IL10，E)TNF-α，F)IL12，及G)CXCL10。数据(平均值±标准偏 差，N＝3)可表示为基因表达相对于未处理的对照的诱导倍数。
图7包括图7A-7C，表示有(圆形)或没有(正方形)针对I型干扰素 受体IFNAR1的单克隆抗体(Ab INFAR)下预孵育，然后用A)mIFN-α 或B)从用DMXAA处理的RAW264.7细胞收获的50％条件培养基处 理的AML12HBV10细胞的示例性RT-PCR分析。数据(平均值±标准 偏差，N＝4)表示为模拟处理的对照的百分比(NT)。C)用IL-1、IL-6 或TNF-α处理的AML12HBV10细胞。通过DNA印迹杂交分析细胞 质HBV核心DNA。
图8包括图8A-8D，表示以下的示例性分析：A)从亲代RAW264.7 细胞(WT)和表达乱序shRNA(sh对照)或靶向小鼠STING mRNA的 shRNA(shSTING)的源自RAW264.7的稳定细胞系提取的总RNA。 STING mRNA水平通过实时RT-PCR来测定并且数据(平均值±标准 偏差，N＝3)可表示为STING mRNA在WT RAW264.7细胞中的百分 比。B)表达sh对照或shSTING的RAW264.7细胞系是模拟处理的或 用125μM的DMXAA处理30min。STING和TBK1的表达和激活通过蛋白质印迹测定法来测定。用1μg/ml的LPS处理的细胞充当对 照。β-肌动蛋白充当上样对照。C)STING的敲除消除了DMXAA诱 导的IFN-β基因表达。用125μM的DMXAA处理源自RAW264.7的 sh对照和shSTING细胞系3h。通过实时RT-PCR测定量化IFN-β mRNA。数据(平均值±标准偏差，N＝3)表示为基因表达相对于未处 理的对照的诱导倍数。D)STING的敲除损害了DMXAA诱导的抗病 毒活性。将在四环素不存在下培养1天的AML12HBV10细胞模拟处 理或用从源自RAW264.7的sh对照或shSTING细胞(用DMXAA、 LPS或Gardiquimod处理12h)收获的50％条件培养基处理2天。提 取细胞质HBV核心DNA并且通过实时PCR测定进行量化。用来自 模拟处理的RAW267.4细胞的条件培养基处理的AML12HBV10细胞 充当对照(NT)。HBVDNA水平(平均值±标准偏差，N＝3)表示为相 对于NT对照的百分比。数据通过student t检验在统计上进行分析。 *表示P<0.05。
图9包括图9A-9C，表示在HBV流体动力小鼠模型中的DMXAA 的示例性体内分析。HBV 1.3聚体质粒的流体动力注射后七天，用单 次25mg/kg剂量的DMXAA或媒介物经由腹膜内注射治疗小鼠。A) 治疗后24小时，从肝脏中提取HBV核心DNA并且通过实时PCR 测定进行分析。对照组(10只小鼠)和治疗组(9只小鼠)。曲线图表示 在减去来自输入质粒的拷贝数之后来自每个动物的HBV DNA拷贝 数/ml。来自小鼠肝脏的B)OAS1b和C)蝰毒素的mRNA水平。所有 数据都以盒图表示以指示中值、四分位数以及间距(min，max)，并且 通过studentt检验在统计上进行分析(P<0.05)。
图10包括图10A-10B，表示人STING途径诱导的细胞因子应答 在THP-1细胞中的激活以及在人肝细胞瘤细胞中的抗病毒效果的示 例性分析。A)来自用DMXAA处理2小时的表达S162A突变形式的 人STING的THP-1hSTINGS162细胞的IFN-β的mRNA表达水平。 数据(平均值±标准偏差，N＝3)表示为在针对未处理的对照归一化之 后的相对基因表达(倍数)。B)用来自用DMXAA处理12小时的 THP-1hSTINGS162细胞的上清液处理的DES19细胞。HBVDNA表 达水平(平均值±标准偏差，N＝3)表示为相对于模拟处理对照的百分 比。用IFN-α处理的DES19细胞充当阳性对照。
具体实施方式
所公开的方法可通过参考结合这些附图(它们形成本公开的一部 分)给出的以下详细说明更容易地理解。应理解的是，所公开的方法 不限于本文描述和/或展示的特定方法，而且本文所用的术语仅仅是 用于举例描述具体的实施方案且不旨在限制要求保护的方法。
应当理解，为清楚起见在参照不同实施方案的上下文中所本文所 述的的所公开方法的某些特点也可在单个实施方案中以组合方式提 供。相反，为简洁起见在参照单个实施方案的上下文中所描述的所公 开方法的不同特点也可单独地或以任何变形方式提供。
如本文所用，单数形式“一(a/an)”及“所述”包括复数。
以下缩写在说明书通篇中使用：HBV(乙型肝炎病毒感染)； STING(干扰素基因的刺激物)；PRR(模式识别受体)；CMA(10-(羧甲 基)-9(10H)吖啶酮)；DMXAA(5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸)； hSTINGS162(具有S162A突变的人STING)。
如本文所用，“治疗”及类似术语是指降低慢性HBV症状的严重 性和/或频率、消除HBV症状和/或所述症状的潜在原因、降低HBV 症状和/或其潜在原因的频率或可能性、以及改善或补救由HBV直接 或间接地引起的损伤。
如本文所用，“向所述患者施用”及类似术语表示一项操作，通过 此操作向患者提供STING激动剂或条件培养基或其部分以使得受试 者的靶细胞、组织或身体的部分与来自条件培养基的活性组分接触。 施用STING激动剂或条件培养基或其部分的合适的方法包括注射或 口服递送。
如本文所用的术语“受试者”意图是指任何动物，具体说来哺乳动 物。虽然在小鼠中的STING激动剂诱导的HBV复制抑制在本文中例 示，但可使用所公开的方法治疗任何类型的哺乳动物。因此，所述方 法适用于人和非人动物，不过优选与小鼠和人，且最优选与人一起使 用。“受试者”与“患者”在本文中可互换使用。
如本文所用的术语“条件培养基”是指从培养细胞中收获的培养 基。
本文提供了治疗患有乙型肝炎病毒感染的受试者的方法，其包括 向所述受试者施用有效量的STING激动剂。
本领域技术人员已知STING(干扰素基因的刺激物)是多个细胞 质DNA受体与模式识别受体(PRR)的衔接子，PRR识别细菌第二信 使环状二腺苷一磷酸(c-二-AMP)和环状二鸟苷一磷酸(c-二-GMP)。胞 质DNA结合至环状鸟苷一磷酸-腺苷一磷酸(cGAMP)合酶(cGAS)，以 产生环状鸟苷一磷酸-腺苷一磷酸(环状GMP-AMP，或cGAMP)，其 随后结合至并激活衔接子蛋白STING并诱导IFN。STING包含五个 推定的跨膜区，主要存在于内质网中，并且能够激活NF-κB和IRF3 转录途径以诱导I型干扰素(IFN-α和IFN-β)的表达并且发挥表达之后 的有效抗病毒状态。
STING激动剂可以刺激巨噬细胞、树突细胞、肝脏非实质细胞 或其任何组合中的先天细胞因子应答。因此，在一些实施方案中， STING激动剂可以刺激巨噬细胞中的先天细胞因子应答。在其他实 施方案中，STING激动剂可以刺激树突细胞中的先天细胞因子应答。在其他实施方案中，STING激动剂可以刺激肝脏非实质细胞中的先 天细胞因子应答。在另外其他实施方案中，STING激动剂可以刺激 上述细胞的任何组合中的先天细胞因子应答。
STING激动剂刺激的先天细胞因子应答是经由细胞因子介导的。 在一些实施方案中，例如，先天细胞因子应答可经由1型干扰素来介 导。
用于所公开的方法中的合适的STING激动剂包括但不限于类黄 酮。在一些实施方案中，STING激动剂可包括类黄酮。在其他实施 方案中，STING激动剂可由类黄酮组成。合适的类黄酮包括但不限 于10-(羧甲基)-9(10H)吖啶酮(CMA)、5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)、异氧黄酮(methoxyvone)、6,4’-二甲氧基黄酮、4’-甲氧基 黄酮、3’,6’-二羟基黄酮、7,2’-二羟基黄酮、大豆黄素、芒柄花黄素、 凹猪屎豆碱7-甲醚(retusin 7-methylether)、氧杂蒽酮或其任何组合。 在一些方面中，STING激动剂可以是10-(羧甲基)-9(10H)吖啶酮 (CMA)。在一些方面中，STING激动剂可以是5,6-二甲基呫吨酮-4- 乙酸(DMXAA)。在一些方面中，STING激动剂可以是异氧黄酮。在 一些方面中，STING激动剂可以是6,4’-二甲氧基黄酮。在一些方面 中，STING激动剂可以是4’-甲氧基黄酮。在一些方面中，STING激 动剂可以是3’,6’-二羟基黄酮。在一些方面中，STING激动剂可以是7,2’-二羟基黄酮。在一些方面中，STING激动剂可以是大豆黄素。 在一些方面中，STING激动剂可以是芒柄花黄素。在一些方面中， STING激动剂可以是凹猪屎豆碱7-甲醚。在一些方面中，STING激 动剂可以是氧杂蒽酮。在一些方面中，STING激动剂可以是以上类 黄酮的任何组合。因此，例如，在一些实施方案中，所述类黄酮包括 DMXAA。
向患有HBV的受试者施用STING激动剂可以抑制受感染的肝细 胞中的HBV复制。例如，在一些实施方案中，STING激动剂可以降 低乙型肝炎病毒衣壳水平。
本文还提供了鉴别适用于治疗乙型肝炎病毒感染的化合物的方 法。已经建立了细胞培养系统用于鉴别适用于治疗HBV感染的化合 物。如图1A所示，示例性细胞培养系统可包括小鼠巨噬细胞-肝细胞 偶联的细胞培养系统，用于鉴别激活巨噬细胞中的细胞因子应答的化 合物，该细胞因子应答又抑制肝细胞中的HBV复制。使用此细胞培 养系统，已经证明了STING激动剂(例如DMXAA)诱导有效的抗病毒 应答，该应答主要由I型IFN介导并且通过减少病毒壳体抑制HBV 复制。
因此，在一些实施方案中，鉴别适用于治疗HBV感染的化合物 的方法包括：1)用目标化合物处理肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、 非实质细胞或其任何组合；2)在条件培养基中孵育所述细胞；3)从所 处理的细胞中除去条件培养基或其部分；以及4)用条件培养基孵育乙 型肝炎病毒感染的肝细胞。
在一些方面中，所述方法包括用目标化合物处理肝脏定居的树突 细胞。在其他方面中，所述方法包括用目标化合物处理巨噬细胞。在 其他方面中，所述方法包括用目标化合物处理非实质细胞。在另外其 他方面中，所述方法包括用目标化合物处理上述细胞类型的任何组 合。
用于培养各种细胞类型的条件和培养基为本领域技术人员所知。 巨噬细胞例如可以在补充有胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培 养基(DMEM)中培养。因此，在一些实施方案中，条件培养基包含从 培养的巨噬细胞收获的具有FBS的DMEM。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括测量乙型肝炎病毒复 制。用于测量HBV复制的许多技术是在本领域中已知的，包括但不 限于：通过DNA印迹杂交测量细胞质HBV核心DNA复制中间体 (RC、DSL及SS)或通过实时PCR测量总HBV核心DNA；通过RNA 印迹测量细胞内HBV RNA(pgRNA和指定HBV包膜蛋白的mRNA)； 通过蛋白质印迹测定测量HBV核心蛋白；通过天然琼脂糖凝胶电泳 然后转移到硝化纤维膜上测量HBV衣壳及衣壳相关病毒DNA；通过 DNA印迹杂交测量衣壳相关HBV DNA；或其任何组合。
在一些实施方案中，肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细 胞或其任何组合的处理可刺激先天细胞因子免疫应答，该免疫应答可 抑制肝细胞中的乙型肝炎病毒复制。例如，处理步骤可刺激肝脏定居 的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组合内的先天细胞因子 免疫应答，并且释放细胞因子到条件培养基中。在一些方面中，细胞 因子包括但不限于I型IFN。条件培养基又可抑制受感染的肝细胞中 的乙型肝炎复制。
虽然肝细胞是HBV的主要宿主细胞，但已显示肝脏非实质细胞 (NPC)在引发有效的HBV特异性抗病毒免疫中发挥重要作用。例如， 肝脏巨噬细胞的活化诱导不同类型的细胞因子/趋化因子的表达，这 些因子调节小鼠肝脏中针对HBV的成功免疫应答的引发。
本文还提供了治疗患有乙型肝炎病毒感染的受试者的方法，其包 括：1)用目标化合物处理肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细 胞或其任何组合；2)在条件培养基中孵育所述细胞；3)从所处理的细 胞中除去条件培养基或其部分；以及4)向所述受试者施用所述条件培 养基或其部分。
在一些方面中，所述方法包括用目标化合物处理肝脏定居的树突 细胞。在其他方面中，所述方法包括用目标化合物处理巨噬细胞。在 其他方面中，所述方法包括用目标化合物处理非实质细胞。在另外其 他方面中，所述方法包括用目标化合物处理上述细胞类型的任何组 合。
用于本发明方法中的目标化合物包括但不限于一种或多种 STING激动剂。例如，在一些实施方案中，STING激动剂可包含类 黄酮。合适的类黄酮包括但不限于10-(羧甲基)-9(10H)吖啶酮(CMA)、 5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)、异氧黄酮、6,4’-二甲氧基黄酮、 4’-甲氧基黄酮、3’,6’-二羟基黄酮、7,2’-二羟基黄酮、大豆黄素、芒 柄花黄素、凹猪屎豆碱7-甲醚、氧杂蒽酮或其任何组合。在一些方面 中，STING激动剂可以是10-(羧甲基)-9(10H)吖啶酮(CMA)。在一些 方面中，STING激动剂可以是5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)。 在一些方面中，STING激动剂可以是异氧黄酮。在一些方面中，STING 激动剂可以是6,4’-二甲氧基黄酮。在一些方面中，STING激动剂可 以是4’-甲氧基黄酮。在一些方面中，STING激动剂可以是3’,6’-二 羟基黄酮。在一些方面中，STING激动剂可以是7,2’-二羟基黄酮。 在一些方面中，STING激动剂可以是大豆黄素。在一些方面中，STING 激动剂可以是芒柄花黄素。在一些方面中，STING激动剂可以是凹 猪屎豆碱7-甲醚。在一些方面中，STING激动剂可以是氧杂蒽酮。 在一些方面中，STING激动剂可以是以上类黄酮的任何组合。因此， 例如，在一些实施方案中，所述类黄酮包括DMXAA。
用于所公开的方法中的肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞和/或非 实质细胞可以从任何合适的来源获得。优选地，肝脏定居的树突细胞、 巨噬细胞和/或非实质细胞是哺乳动物。在一些方面中，肝脏定居的 树突细胞、巨噬细胞和/或非实质细胞可以是小鼠细胞。在一些方面 中，肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞和/或非实质细胞可以是人细胞。 因此，在一些实施方案中，肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质 细胞或其任何组合是人细胞。
肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞和/或非实质细胞可以是野生型 细胞或可以是修饰的细胞。如本文所用，“修饰的细胞”是指含有非天 然、非野生型、突变或更改水平的DNA和/或蛋白的细胞。在一些实 施方案中，人肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何 组合被修饰以表达突变STING。在一些实施方案中，突变STING可 以是STINGS162A。
用于产生修饰的细胞的许多技术在本领域中是已知的，包括但不 限于转染或转化。在一些实施方案中，人肝脏定居的树突细胞、巨噬 细胞、非实质细胞或其任何组合在处理步骤之前用突变STING转染 或转化。
肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞和/或非实质细胞可以来自许多 合适的来源。在一些方面中，肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实 质细胞或其任何组合是自体细胞。在其他方面中，肝脏定居的树突细 胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组合是同种异体细胞。在另外其 他方面中，肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组 合是来自不同物种的细胞。
实施例
材料和方法
细胞培养
将鼠巨噬细胞细胞系RAW264.7(ATCC TIB-71)和GP2-293细胞 (Clontech)维持在补充有的10％胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格 尔培养基(DMEM)中。将AML12HBV10，一种以四环素(tet)诱导型方 式支持高水平的HBV复制的源自永生鼠肝细胞(AML12)的细胞系如 Xu C等人Interferons accelerate decay of replication-competentnucleocapsids of hepatitis B virus.J Virol 2010；84:9332-40，及 Campagna MR等人Sulfamoylbenzamide Derivatives Inhibit the Assembly of Hepatitis B VirusNucleocapsids.J Virol 2013中所述来维 持。
试剂
DMXAA、CMA及2,7-双[2-(二乙基氨基)乙氧基]-9-芴酮(泰洛伦) 购自Sigma-Aldrich。TLR1/2激动剂Pam3CSK4、TLR3激动剂聚I:C、 TLR4激动剂脂多糖(LPS)及TLR7激动剂gardiquimod来自于 Invivogen。重组鼠IFN-α、IL-1、IL-6及TNF-α来自于PBLInterferonSource。针对HBV核心蛋白的羧基末端14个氨基酸的抗体 先前描述于Xu C等人Interferons accelerate decay of replication-competent nucleocapsids ofhepatitis B virus.J Virol 2010；84:9332-40中。针对β-肌动蛋白和小鼠IFNAR-1的抗体分别从 Sigma-Aldrich和Santa Cruz Biotechnology获得。针对小鼠STING、 TBK1、S172-磷酸化TBK1、IkBα、p38、磷酸化-p38、JNK、磷酸化-JNK、 ERK、磷酸化-ERK的抗体购自CellSignaling Technology。质粒 pTmcs-HBV1.3和pCMV-SB是Francis V.Chisari博士(TheScripps Research Institute,La Jolla,California,USA)的馈赠。
HBV DNA、RNA及核衣壳的分析
从AML12HBV10细胞进行的HBV核心DNA提取以及通过DNA 印迹杂交和实时PCR测定的分析如先前描述于Xu C等人Interferons accelerate decay of replication-competent nucleocapsids of hepatitis B virus.J Virol 2010；84:9332-40，及Campagna MR等人 Sulfamoylbenzamide Derivatives Inhibit the Assembly ofHepatitis B Virus Nucleocapsids.J Virol 2013中。使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总细胞RNA。通过RNA印迹杂交，用α-32P-UTP标记的全长负链 RNA探针分析HBV RNA。通过天然琼脂糖凝胶电泳然后转移到硝化 纤维膜来分析HBV衣壳及衣壳相关病毒DNA。通过用针对HBV核 心蛋白的抗体探测膜然后用LI-COR Odyssey系统可视化来检测HBV 衣壳。通过与放射性标记的HBV核糖核酸探针杂交来检测衣壳相关 DNA。
实时PCR和RT-PCR测定
对于细胞因子基因表达分析，使用TRIzol试剂提取总RNA。使 用SuperScript III(Invitrogen)合成cDNA。使用LightCycler 480 II(Roche)进行定量实时PCR分析。用于RT-PCR测定中的引物示于表 1中。用于实时PCR中以检测HBV DNA的引物也示于表1中。
表1
STING敲除细胞系的产生
表达特异性地靶向鼠STING的shRNA的质粒通过插入以下 cDNA序列到pRS载体(Origene)中来构建： tcaatcagctacataacaactcgagttgttatgtagctgattga。从pRS载体表达乱序 shRNA的对照质粒购自Origene。使用pCMV/VSV-G和表达乱序 shRNA或STING特异性shRNA的源自pRS载体的质粒在GP2-293 细胞中包装VSV G蛋白假型化的逆转录病毒基本上如先前Zhao X等 人Interferon induction of IFITM proteins promotes infection byhuman coronavirus OC43.Proc Natl Acad Sci U S A 2014中所报道。RAW264.7 细胞用表达每个shRNA的假型化逆转录病毒转导，如先前Zhao X等 人中所述。
DMXAA在HBV DNA流体动力小鼠模型中的抗病毒功效
十周龄的雌性NOD/SCID小鼠购自Vital River Laboratory Animal TechnologyCo.Ltd。所有实验都是在Institutional Animal Care and Use Committee批准下进行。为了建立HBV流体动力模型，根据先前描 述的操作，经由尾静脉注射13.5μg表达1.3聚体HBV基因组的质粒 pTmcsHBV1.3和4.5μg表达睡美人(Sleeping Beauty)转座酶的 pCMV-SB。为了测试DMXAA的体内功效，注射后7天，将小鼠用 25mg/kg的DMXAA(在具有7.5％碳酸氢钠的PBS中)或媒介物经由 腹膜内注射治疗。治疗之后24h处死小鼠。提取肝内HBV核心DNA 并且通过使用实时PCR测定进行量化。提取肝内总RNA并且通过实 时RT-PCR测定法测定干扰素刺激的基因(ISG)OAS1b和蝰毒素 mRNA。在治疗之前和之后24h监测个别小鼠的体重。
实施例1-建立细胞培养系统以评估针对HBV的PRR激动剂诱导的抗病毒应答
不同于在许多类型的体细胞中普遍表达的RIG-I样受体，其他 PRR如TLR和cGAS的表达通常限于巨噬细胞、树突细胞及几种其 他细胞类型。由于缺乏表达或仅有少量PRR如TLR的表达，故肝细 胞的处理通常不诱导稳固的细胞因子应答。例如，用TLR激动剂直 接处理肝细胞诱导可忽略的细胞因子应答。然而，肝脏定居的树突细 胞、巨噬细胞(枯氏细胞)及其他肝脏非实质细胞(NPC)表达高水平的 TLR，且因此对TLR激动剂做出应答并产生炎性细胞因子。
为了筛选用于治疗慢性乙型肝炎的小分子PRR激动剂，开发一 种模拟肝内环境的基于细胞的测定。图1A中描绘的这个独特的细胞 培养系统模拟HBV感染的肝脏中的条件。具体来说，用测试化合物 处理小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)，然后将所处理的巨噬细胞的条件培 养基施用于载有HBV(AML12HBV10)的永生小鼠肝细胞以测试巨噬 细胞中的化合物诱导的抗病毒细胞因子应答。
实施例2-TLR激动剂诱导巨噬细胞中的强细胞因子应答以抑制肝细胞中的HBV复 制：概念证明实验
首先用已知的TLR激动剂验证测定系统。将AML12HBV10细 胞以1×105个细胞/孔的密度接种于12孔平板中并且在四环素不存在 下培养。二十四小时后，用所示浓度的TLR激动剂处理细胞(直接处 理)(图1B)。或者，用含有50％从TLR激动剂处理的RAW264.7细胞收获的条件培养基的培养基处理AML12HBV10细胞(在12孔平板中 以5×105个细胞/孔的密度培养并且用所示浓度的TLR激动剂处理12 h)(间接处理)。处理后两天，通过DNA印迹杂交分析细胞质HBV核 心DNA。RC：松环DNA。DSL：双链线性DNA。SS：单链DNA。 NT：无处理对照，其是来自模拟处理的AML12HBV10细胞(直接处 理对照)或来自用来自模拟处理的RAW264.7细胞的50％培养基处理 的AML12HBV10细胞(间接处理对照)的样品。如图1B所示，虽然 用TLR1/2(Pam3CSK4)、TLR3(聚I:C)、TLR4(LPS)或TLR7 (gardiquimod)的激动剂直接处理AML12HBV10细胞没有明显抑制 HBV DNA复制，但用从TLR激动剂处理的巨噬细胞收获的条件培养 基处理AML12HBV10细胞(间接处理)有效抑制HBV DNA复制。
在另一示例性分析中，将DMEM培养基中的RAW264.7细胞以 5×105个细胞/孔的密度接种于12孔平板中过夜并且用所示剂量的 TLR激动剂处理12小时(图1C)。将生长在达尔伯克改良伊格尔培养 基(DMEM)/具有1μg/ml四环素的F12培养基中的AMLHBV10细胞 在四环素不存在下以1×105个细胞/孔的密度接种于12孔平板中1天 以释放HBV复制。然后将相等体积的来自所处理的RAW264.7细胞 的上清液转移到AML12HBV10细胞。处理后2天，从AML12HBV10 细胞中提取HBV核心DNA，并且通过DNA印迹测定来检测。对照 AML12HBV10细胞接受相等体积的新鲜DMEM培养基(模拟的)或从 模拟处理12小时的RAW264.7细胞(用DMEM模拟)转移的DMEM 培养基。用一组TLR激动剂直接处理AML12HBV10不会对HBV DNA复制有任何影响(数据未示出)。然而，用来自用TLR激动剂处 理的巨噬细胞的条件培养基培养AML12HBV10细胞有效抑制HBV DNA复制(图1C)，大概是经由通过巨噬细胞中的TLR激动剂诱导分 泌可溶性细胞因子实现。
因此，虽然TLR激动剂未能直接激活肝细胞中的抗病毒应答， 但TLR激动剂诱导巨噬细胞产生抑制肝细胞中的HBV复制的可溶性 因子。
实施例3-选择的类黄酮诱导巨噬细胞中的抗病毒应答以抑制肝细胞中的HBV复 制。
针对鉴别能够激活巨噬细胞中的先天抗病毒细胞因子应答的分 子的最初努力是集中于2320 MicroSource化合物(MicroSource Discovery Systems,Inc.)。此收集是一种光谱选择以表示合成和天然来 源的化合物的化学类别和结构多样性。鉴别表达TLR3的HEK293细 胞中提高IFN-β启动子活性的九种化合物。有趣的是，所有这9种化 合物是黄酮、黄酮醇或异黄酮，它们属于类黄酮结构家族(图2A)。
为了测试代表性化合物7,2'二羟基黄酮，将在四环素不存在下培 养1天的AMLHBV10细胞用所示剂量(以μM计)(图2B)的7,2'二羟 基黄酮化合物直接处理或间接处理2天(通过用从RAW264.7细胞转 移的条件培养基培养，将其用若干剂量的化合物处理12小时)。通过 RNA印迹(核糖体RNA充当上样对照)测定细胞内HBV RNA。通过 蛋白质印迹测定，使用针对HBV核心蛋白的羧基末端14个氨基酸的 抗体(β-肌动蛋白充当上样对照)测定HBV核心蛋白。通过颗粒凝胶测 定检查HBV核衣壳以检测完整的核衣壳及衣壳相关HBV DNA。通过DNA印迹测定法测定核壳包裹的HBV(核心DNA)复制中间体 (RC、DSL及SS)。
如图2B中所证明，用代表性化合物7,2'二羟基黄酮处理 RAW264.7细胞诱导AML12HBV10细胞中针对HBV的抗病毒活性。 不希望受理论约束，观察到的应答很可能通过抗病毒细胞因子介导。
实施例4-在巨噬细胞中的DMXAA诱导的抗病毒应答有效抑制肝细胞中的HBV复制
使用如上所述的测定系统，再次测试MicroSource化合物收集 (MicroSourceDiscovery Systems,Inc.)中的75种类黄酮。类黄酮7,2’- 二羟基黄酮显示了针对HBV的间接而非直接的抗病毒活性。进一步 分析在小鼠中经鉴定为有效的IFN应答诱导物的三种类黄酮 (flavonoid或flavonoied)来源的化合物(tilorine、CMA及DMXAA)(图 3A)。简言之，将如实施例2、图1B中所述接种和培养的AML12HBV10 细胞用所示浓度的DMXAA(上图)、CMA(中图)、泰洛伦(下图)(直接 处理)、或从RAW264.7细胞收获的50％条件培养基(用每种化合物处 理12h)(间接处理)处理2天。通过DNA印迹杂交分析细胞质HBV 核心DNA。NT对照如图1B中所述(图3B)。将RAW264.7和 AML12HBV10细胞模拟处理或用125μM的DMXAA或1μg/ml的 LPS处理30和60min。STING的表达和激活通过蛋白质印迹测定法 来测定。箭头表示因STING磷酸化所致的凝胶迁移率的变动。β-肌 动蛋白充当上样对照(图3C)。将在四环素不存在下培养的 AML12HBV10细胞如对于组B所述来直接或间接地处理，例外的是 使用较低剂量的DMXAA。用所示浓度的小鼠αIFN(mIFN-α)处理2 天的AML12HBV10细胞充当阳性对照。通过DNA印迹杂交分析细 胞质HBV核心DNA(图3D)。
虽然tilorine既不直接也不间接抑制HBV复制，但CMA和 DMXAA两者显示了强烈的间接抗HBV活性(图3B)。如图3C所示， DMXAA而不是LPS有效地诱导RAW264.7细胞中的STING的磷酸 化。与AML12HBV10细胞表达不可检测水平的STING的事实一致(图 3C)，用DMXAA直接处理肝细胞不抑制HBV DNA复制。然而，从 DMXAA处理的RAW264.7细胞收获的条件培养基以剂量依赖性方式 抑制小鼠肝细胞中的HBV DNA复制(图3D)。
实施例5-DMXAA诱导的抗病毒应答减少细胞质HBV衣壳的量
为了绘制通过巨噬细胞中的DMXAA诱导的抗病毒应答抑制的 HBV复制步骤，用从TLR激动剂或DMXAA处理的RAW264.7细胞 收获的条件培养基处理AML12HBV10细胞。简言之，将在四环素不 存在下培养1天的AML12HBV10细胞用所示浓度的DMXAA、聚I:C、 Pam3CSK4直接处理或用从RAW264.7细胞收获的50％条件培养基 (用所示浓度的DMXAA或TLR激动剂处理12h)间接处理。处理之 后2天收获AML12HBV10细胞用于以下分析：(图4A)通过RNA印 迹测定细胞内HBV RNA(pgRNA、前基因组RNA、envRNA、病毒 mRNA指定包膜蛋白。18S核糖体RNA(rRNA)充当上样对照)；(图 4B)通过蛋白质印迹测定，使用总细胞溶解产物测定HBV核心蛋白(β- 肌动蛋白充当上样对照)；通过天然琼脂糖凝胶测定法测定HBV衣壳 (图4C)及衣壳相关HBV DNA(图4D)的量；以及(图4E)通过DNA印 迹杂交测定细胞质HBV核心DNA。
如图4所示，在巨噬细胞中通过DMXAA诱导的抗病毒应答及 通过TLR1/2和TLR3激动剂诱导的较小程度的抗病毒诱导转录后减 少HBV衣壳蛋白的量且以更大程度减少装配衣壳的量(图4A、B及 C)。因此，HBV DNA复制中间体的量也减少(图4D和E)。
实施例6-DMXAA诱导不同类型的细胞因子应答
为了确定从DMXAA处理的RAW264.7收获的条件培养基的抗 病毒机制，分析在所处理的RAW264.7中通过DMXAA以及代表性 TLR激动剂诱导的信号传导途径激活及细胞因子增殖。
将RAW264.7细胞用125μM的DMXAA、1μg/ml的Pam3CSK4 (TLR1/2激动剂)、10μg/ml的聚I:C(TLR3激动剂)、1μg/ml的LPS (TLR4激动剂)或3μM的gardiquimod(TLR7激动剂)处理，持续所示 的时间(图5)。通过SDS-PAGE对总细胞蛋白分级并且转移到PVDF 膜上。通过蛋白质印迹测定，用其特异性抗体检测总的和磷酸化的 STING、TBK1、p38、JNK及Erk以及IkB-α。β-肌动蛋白充当上样 对照。
如图5所示，仅仅DMXAA而不是TLR1/2、TLR7、TLR3或TLR4 的激动剂诱导STING磷酸化，这在用DMXAA处理超过30min的细 胞中是可检测的。然而，DMXAA以及所有测试的TLR激动剂有效 地诱导TBK1的磷酸化，TBK1是一种在STING和TLR途径两者中 IRF3磷酸化及IFN-β的诱导所必需的激酶。DMXAA及所有测试的 TLR激动剂还诱导IκBα的降解。有趣的是，虽然如通过磷酸化的 p38α、JNK及ERK的增加证明的所有三个MAPK途径的激活在用四 种TLR激动剂的任一种处理的细胞中的15分钟的早期是明显的，但 MAPK途径的激活延迟并且仅在DMXAA处理之后90min时变得可 检测。
通过qRT-PCR测定法测定RAW264.7细胞中由DMXAA和TLR 激动剂诱导的细胞因子概况(图6)。将RAW264.7细胞用125μM的 DMXAA、1μg/ml的Pam3CSK4(TLR1/2激动剂)、10μg/ml的聚I:C (TLR3激动剂)或3μM的gardiquimod(TLR7激动剂)处理，持续所示 的时间(图6A-G)。通过实时RT-PCR测定量化指定特异性细胞因子和 趋化因子的mRNA的量。数据(平均值±标准偏差，N＝3)表示为基因 表达相对于未处理的对照的诱导倍数。
如图6所示，qRT-PCR测定显示与代表性TLR激动剂相比， DMXAA诱导主要的IFN应答，但较不强的炎性细胞因子应答。在处 理后2小时，DMXAA诱导比TLR1/2、TLR3或TLR7激动剂多大约 100倍的IFN-βmRNA表达(图6A)。相反，与DMXAA相比，测试 的TLR激动剂通常诱导更强的促炎性细胞因子表达(图6B至6F)和趋 化因子(图6G)表达。由DMXAA诱导的较弱细胞因子应答可能至少 部分是由于MAPK途径的减慢和较弱的激活。有趣的是，TLR激动 剂和DMXAA诱导的IFN-β应答在处理的2h时达到峰值，但炎性细 胞因子应答(IL-1和IL-10)在处理的6h或甚至更晚达到峰值。
实施例7-I型IFN是针对HBV的DMXAA诱导的抗病毒应答的主要介质
上述结果表明TLR激动剂和DMXAA在不同的动力学下定量地 诱导不同的细胞因子应答。为了确定I型IFN及其他细胞因子在 DMXAA诱导的抗病毒应答中的作用，探究用特异性地识别I型IFN 受体的单克隆抗体阻断I型IFN应答是否将削弱巨噬细胞中由 DMXAA诱导的抗病毒活性。
将在四环素不存在下培养1天的AML12HBV10细胞在37℃下在 有或没有10μg/ml的针对I型干扰素受体IFNAR1的单克隆抗体(Ab INFAR)下孵育1h，然后用所示浓度的mIFN-α(图7A)或从RAW264.7 细胞(用所示浓度的DMXAA处理12h)收获的50％条件培养基处理2 天(图7B)。通过实时PCR测定量化细胞质HBV DNA并且数据(平均 值±标准偏差，N＝4)表示为模拟处理的对照的百分比(NT)。将在四 环素不存在下培养的AML12HBV10细胞用所示浓度的IL-1、IL-6或 TNF-α处理4天(图7C)。通过DNA印迹杂交分析细胞质HBV核心 DNA。
如图7A所示，在AML12HBV10细胞中I型IFN受体的阻断显 著地减轻由IFN-α的抗病毒应答。用I型IFN受体抗体处理 AML12HBV10细胞还显著地削弱由来自DMXAA处理的RAW264.7 细胞的条件培养基的抗病毒应答(图7B)，表明I型IFN很可能是针对 HBV的DMXAA诱导的抗病毒应答的主要介质。
为了确定其他细胞因子在DMXAA诱导的抗病毒应答中的作用， 测试IL-1、IL-6及TNF-α的抗病毒效果。如图7C所示，仅TNF-α 抑制HBV DNA复制并且可因此还在针对HBV的DMXAA诱导的抗 病毒应答中起作用。这结果与类风湿性关节炎、炎性肠病及牛皮癣的 抗TNF疗法重新激活非活性携带者中的HBV感染的事实一致并且表 明TNF-α在人的HBV感染的免疫控制中起重要作用。
实施例8-DMXAA诱导的细胞因子和抗病毒应答是STING依赖性的
如上所示，RAW264.7细胞的DMXAA处理激活STING并且诱 导抑制小鼠肝细胞中的HBV复制的抗病毒细胞因子应答。为了进一 步确定STING在DMXAA诱导的抗病毒细胞因子应答中的作用，建 立源自RAW264.7的稳定细胞系，其表达乱序shRNA或特异性地靶 向STINGmRNA的shRNA。
总RNA是从亲代RAW264.7细胞(WT)及表达乱序shRNA(sh对 照)或靶向小鼠STINGmRNA的shRNA(shSTING)的源自RAW264.7 的稳定细胞系中提取。通过实时RT-PCR测定STINGmRNA水平并 且数据(平均值±标准偏差，N＝3)表示为STING mRNA在WT RAW264.7细胞中的百分比(图8A)。将表达sh对照或shSTING的 RAW264.7细胞系模拟处理或用125μM的DMXAA处理30min。 STING和TBK1的表达和激活通过蛋白质印迹测定法来测定。用1 μg/ml的LPS处理的细胞充当对照。β-肌动蛋白充当上样对照(图8B)。 STING的敲除消除了DMXAA诱导的IFN-β基因表达。用125μM的 DMXAA处理源自RAW264.7的sh对照和shSTING细胞系3h。通 过实时RT-PCR测定量化IFN-βmRNA。数据(平均值±标准偏差，N＝ 3)表示为基因表达相对于未处理的对照的诱导倍数(图8C)。STING的 敲除损害了DMXAA诱导的抗病毒活性。将在四环素不存在下培养1 天的AML12HBV10细胞模拟处理或用从源自RAW264.7的sh对照 或shSTING细胞(用所示浓度的DMXAA、LPS或Gardiquimod处理 12h)收获的50％条件培养基处理2天。提取细胞质HBV核心DNA 并且通过实时PCR测定进行量化。用来自模拟处理的RAW267.4细 胞的条件培养基处理的AML12HBV10细胞充当对照(NT)。HBV DNA 水平(平均值±标准偏差，N＝3)表示为相对于NT对照的百分比(图 8D)。数据通过student t检验在统计上进行分析。*表示P<0.05。
分别通过qRT-PCR(图8A)和蛋白质印迹测定(图8B)验证了STING mRNA及蛋白表达在表达STING特异性shRNA的细胞中减 少。DMXAA诱导而不是LPS诱导的TBK-1激活在表达STING mRNA特异性shRNA的RAW264.7细胞中显著地被破坏(图8B)。此 外，DMXAA诱导的IFN-β表达(图8C)和针对HBV的抗病毒活性(图 8D)在STING敲除细胞中被显著地削弱。这些结果因此表明DMXAA 诱导的抗病毒细胞因子应答实际上是STING依赖性的。
实施例9-DMXAA有效抑制小鼠中的HBV复制
为了进一步验证DMXAA的体内抗病毒效果，用HBV 1.3聚体 质粒流体动力地注射NOD/SCID小鼠以在肝细胞中建立HBV复制。 HBV 1.3聚体质粒的流体动力学注射后七天，用25mg/kg的单次剂量 的DMXAA或媒介物经由腹膜内注射治疗小鼠。(图9A)治疗后二十 四小时，从肝脏中提取HBV核心DNA并且通过实时PCR测定进行 分析。十只小鼠被纳入对照组中且九只小鼠被纳入治疗组中。曲线图 表示在减去来自输入质粒的拷贝数之后来自每个动物的HBV DNA 拷贝数/ml。(图9B和9C)从肝脏中提取总RNA并且通过实时RT-PCR 测定分析OAS1b和蝰毒素的mRNA水平。曲线图代表来自每个动物 的mRNA水平。所有数据都以盒图表示以指示中值、四分位数以及 间距(min，max)，并且通过student t检验在统计上进行分析(P<0.05)。
如图9A所示，与媒介物治疗的对照组相比，单次剂量的DMXAA 治疗在治疗之后24h使肝内HBV核心DNA减少了1.3-log。与预期 的抗病毒机制一致，代表性IFN刺激的基因(ISG)如OAS1b和蝰毒素 的表达在DMXAA治疗动物的肝脏中显著被诱导(图9B和9C)。显然，DMXAA治疗小鼠的平均体重减轻了大约8％(数据未示出)。
实施例10-人STING途径的激活及在人肝细胞瘤细胞中的抗病毒效果
为了验证在小鼠巨噬细胞-肝细胞系统中获得的结果，建立表达 具有S162A突变的人STING(hSTING/S162)的源自人单核细胞THP1 的细胞系以便赋予对DMXAA的敏感性。为了分析在THP-1细胞中 细胞因子应答上的人STING途径的激活及人肝细胞瘤细胞中的抗病毒效果，用DMXAA处理表达S162A突变形式的人STING的 THP-1hSTINGS162细胞2小时。提取总细胞RNA以通过实时RT-PCR 检测IFN-β的mRNA表达水平。数据(平均值±标准偏差，N＝3)表示 为在针对未处理的对照归一化之后的相对基因表达(倍数)(图10A)。 另外，用DMXAA处理THP-1hSTINGS162细胞12小时，然后将具 有所示稀释度的条件培养基转移到DES19上，DES19是一种载有 HBV复制的人肝细胞瘤细胞系。处理后6天提取HBV核心DNA， 并且通过实时PCR测定进行量化。HBV DNA表达水平(平均值±标准 偏差，N＝3)表示为相对于模拟处理对照的百分比。用IFN-α处理的 DES19细胞充当阳性对照(图10B)。
THP1-hSTING/S162细胞的DMXAA处理诱导稳固的IFN-β表达 (图10A)。此外，来自DMXAA处理的THP1-hSTING/S162细胞的条 件培养基有效地抑制支持HBV复制的人肝细胞瘤细胞(HepDES19) 中的HBV复制(图10B)。因此，人单核细胞中的人STING的激活诱 导稳固的细胞因子应答以抑制人肝细胞瘤细胞中的HBV复制。
本文所示的工作首次证明了用STING激动剂激活STING途径诱 导巨噬细胞(以及潜在地肝脏NPC)中的细胞因子应答，而该细胞因子 应答又有效抑制肝细胞中的HBV复制。
由TLR和STING激动剂诱导的抗病毒细胞因子应答的详细表征 显示了不同的特性。具体来说，DMXAA诱导MAPK途径的延迟激 活。DMXAA诱导巨噬细胞中由IFN-β支配的细胞因子应答并且显示 针对肝细胞中的HBV更有效的抗病毒活性。另外，DMXAA与TLR 激动剂相比诱导较不强烈的促炎性细胞因子应答。因此，如果仅考虑 诱导非溶细胞的抗病毒细胞因子应答的性质，那么STING途径的肝 内激活似乎强于TLR途径的激活。更有力的抗病毒应答和较弱的促 炎性细胞因子应答的STING激动剂诱导可能造成较轻的炎症及组织 损伤。因此，STING的肝内激活可以是治疗慢性乙型肝炎的理想治 疗方法。此治疗方法应提供HBV的更有效的持续抑制并且可以是潜 在治疗性的，这很少能通过针对乙型肝炎的当前FDA批准的治疗剂 实现。这代表一种用于慢性乙型肝炎的新型治疗观点和方法。
上述结果证明STING是用于慢性乙型肝炎的免疫治疗的潜在靶 标。与TLR激动剂免疫治疗的全身性施用有关的副作用可通过经由 脂质体递送STING激动剂的肝脏巨噬细胞或其他非实质细胞中的 STING途径的靶向激活来规避，STING激动剂主要通过枯氏细胞从 循环中清除。
本领域技术人员将理解，可对方法的优选实施方案做出许多改变 和修改并且可在不背离所公开方法的精神下做出所述改变和修改。因 此，目的在于所附的权利要求覆盖落入方法的的真实精神和范围之内 的所有这种等同变形。
在本文中所引用或描述的各专利、专利申请和出版物的公开内容 均据此以引用的方式整体并入本文。
实施方案
以下实施方案列表旨在补充而非替换或代替先前所描述的。
实施方案1.一种治疗患有乙型肝炎病毒感染的受试者的方法， 其包括向所述受试者施用有效量的STING激动剂。
实施方案2.如实施方案1的方法，其中所述STING激动剂刺激 巨噬细胞、树突细胞、肝脏非实质细胞或其任何组合中的先天细胞因 子应答。
实施方案3.如实施方案2的方法，其中所述先天细胞因子应答 是经由细胞因子介导的。
实施方案4.如实施方案3的方法，其中所述先天细胞因子应答 是经由1型干扰素介导的。
实施方案5.如前述实施方案中任一项的方法，其中所述STING 激动剂包括类黄酮。
实施方案6.如实施方案5的方法，其中所述类黄酮包括10-(羧 甲基)9(10H)吖啶酮(CMA)、5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)、异 氧黄酮、6,4’-二甲氧基黄酮、4’-甲氧基黄酮、3’,6’-二羟基黄酮、7,2’- 二羟基黄酮、大豆黄素、芒柄花黄素、凹猪屎豆碱7-甲醚、氧杂蒽酮 或其任何组合。
实施方案7.如实施方案6的方法，其中所述类黄酮包括 DMXAA。
实施方案8.如前述实施方案中任一项的方法，其中所述STING 激动剂抑制受感染的肝细胞中的乙型肝炎病毒复制。
实施方案9.如实施方案8的方法，其中所述STING激动剂降低 乙型肝炎病毒衣壳水平。
实施方案10.一种鉴别适用于治疗乙型肝炎病毒感染的化合物 的方法，所述方法包括：用目标化合物处理肝脏定居的树突细胞、巨 噬细胞、非实质细胞或其任何组合；在条件培养基中孵育所处理的细 胞；从所处理的细胞中除去条件培养基或其部分；以及用条件培养基 孵育乙型肝炎病毒感染的肝细胞。
实施方案11.如实施方案10的方法，进一步包括测量乙型肝炎 病毒复制。
实施方案12.如实施方案10或11中任一项的方法，其中所述处 理步骤刺激肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组 合内的先天细胞因子免疫应答，并且释放细胞因子到条件培养基中。
实施方案13.如实施方案12的方法，其中所述细胞因子包括但 不限于I型干扰素。
实施方案14.如实施方案10至13中任一项的方法，其中所述条 件培养基抑制受感染的肝细胞中的乙型肝炎复制。
实施方案15.一种治疗患有乙型肝炎病毒感染的受试者的方法， 所述方法包括：用目标化合物处理肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、 非实质细胞或其任何组合；在条件培养基中孵育所处理的细胞；从所 处理的细胞中除去条件培养基或其部分；以及向所述受试者施用所述 条件培养基或其部分。
实施方案16.如实施方案15的方法，其中所述目标化合物包括 一种或多种STING激动剂。
实施方案17.如实施方案16的方法，其中所述STING激动剂包 括类黄酮。
实施方案18.如实施方案17的方法，其中所述类黄酮包括10-(羧 甲基)9(10H)吖啶酮(CMA)、5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)、异 氧黄酮、6,4’-二甲氧基黄酮、4’-甲氧基黄酮、3’,6’-二羟基黄酮、7,2’- 二羟基黄酮、大豆黄素、芒柄花黄素、凹猪屎豆碱7-甲醚、氧杂蒽酮 或其任何组合。
实施方案19.如实施方案18的方法，其中所述类黄酮包括 DMXAA。
实施方案20.如实施方案15至19中任一项的方法，其中所述肝 脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组合是人细胞。
实施方案21.如实施方案15至20中任一项的方法，其中所述人 肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组合被修饰以 便表达突变STING。
实施方案22.如实施方案21的方法，其中所述人肝脏定居的树 突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组合在所述处理步骤之前用 突变STING转染或转化。
实施方案23.如实施方案21或22中任一项的方法，其中所述突 变STING是STINGS162A。
实施方案24.如实施方案15-23中任一项的方法，其中所述肝脏 定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组合是自体细胞。

Claims (24)

1.一种治疗患有乙型肝炎病毒感染的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的STING激动剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述STING激动剂刺激巨噬细胞、树突细胞、肝脏非实质细胞或其任何组合中的先天细胞因子应答。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述先天细胞因子应答是经由细胞因子介导的。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述先天细胞因子应答是经由1型干扰素介导的。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述STING激动剂包括类黄酮。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述类黄酮包括10-(羧甲基)9(10H)吖啶酮(CMA)、5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)、异氧黄酮、6,4’-二甲氧基黄酮、4’-甲氧基黄酮、3’,6’-二羟基黄酮、7,2’-二羟基黄酮、大豆黄素、芒柄花黄素、凹猪屎豆碱7-甲醚、氧杂蒽酮或其任何组合。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述类黄酮包括DMXAA。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述STING激动剂抑制受感染的肝细胞中的乙型肝炎病毒复制。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述STING激动剂降低乙型肝炎病毒衣壳水平。
10.一种鉴别适用于治疗乙型肝炎病毒感染的化合物的方法，其包括：
用目标化合物处理肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组合；
在条件培养基中孵育所处理的细胞；
从所处理的细胞中除去条件培养基或其部分；以及
用条件培养基孵育乙型肝炎病毒感染的肝细胞。
11.如权利要求10所述的方法，进一步包括测量乙型肝炎病毒复制。
12.如权利要求10或11中任一项所述的方法，其中所述处理步骤刺激肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组合内的先天细胞因子免疫应答，并且释放细胞因子到条件培养基中。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述细胞因子包括但不限于I型干扰素。
14.如权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述条件培养基抑制受感染的肝细胞中的乙型肝炎复制。
15.一种治疗患有乙型肝炎病毒感染的受试者的方法，所述方法包括：
用目标化合物处理肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组合；
在条件培养基中孵育所处理的细胞；
从所处理的细胞中除去条件培养基或其部分；以及
向所述受试者施用所述条件培养基或其部分。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述目标化合物包括一种或多种STING激动剂。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述STING激动剂包括类黄酮。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述类黄酮包括10-(羧甲基)9(10H)吖啶酮(CMA)、5,6-二甲基呫吨酮-4-乙酸(DMXAA)、异氧黄酮、6,4’-二甲氧基黄酮、4’-甲氧基黄酮、3’,6’-二羟基黄酮、7,2’-二羟基黄酮、大豆黄素、芒柄花黄素、凹猪屎豆碱7-甲醚、氧杂蒽酮或其任何组合。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述类黄酮包括DMXAA。
20.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中所述肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组合是人细胞。
21.如权利要求15至20中任一项所述的方法，其中所述人肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组合被修饰以便表达突变STING。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述人肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组合在所述处理步骤之前用突变STING转染或转化。
23.如权利要求21或22中任一项所述的方法，其中所述突变STING是STING S162A。
24.如权利要求15-23中任一项所述的方法，其中所述肝脏定居的树突细胞、巨噬细胞、非实质细胞或其任何组合是自体细胞。
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