KR20160065858A - 만성 b형 간염 바이러스 감염을 치료하기 위한 스팅 효능제의 사용 - Google Patents

만성 b형 간염 바이러스 감염을 치료하기 위한 스팅 효능제의 사용 Download PDF

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Abstract

B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 보다 특히, 스팅(STING)의 소분자 효능제로 대식세포, 수지상 세포 및/또는 간 비실질 세포에서 선천적 사이토킨 반응을 자극하여 간세포에서 HBV 복제를 억제하는 방법이 본원에 기재된다. 방법은 특히 만성 HBV 감염의 치료에서 사용하기에 적합하다. 또한 HBV 감염의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법이 본원에 기재된다.

Description

만성 B형 간염 바이러스 감염을 치료하기 위한 스팅 효능제의 사용{USE OF STING AGONISTS TO TREAT CHRONIC HEPATITIS B VIRUS INFECTION}
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 2013년 10월 21일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/893,526호에 대한 우선권을 주장하고, 이는 그 전문이 본원에 참고로 편입된다.
정부 권리
본원에 기재된 작업은 닥터 티모시 엠 블록(Dr. Timothy M. Block)에게 보조된 국립 보건원 보조 AI104636에 의해 지원되었다. 정부는 본원에 기재된 내용에 특정한 권리를 갖는다.
기술분야
본 기재내용은 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법을 제공한다. 보다 특히, 스팅(STING)의 소분자 효능제로 대식세포, 수지상 세포 및/또는 간 비실질 세포(non-parenchymal cell)에서 선천적 사이토킨 반응을 자극하여 간세포에서 HBV 복제를 억제하는 방법이 본원에 기재된다. 기재된 방법은 만성 HBV 감염의 치료에서 사용하기에 특히 적합하다. 또한 HBV 감염의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법이 본원에 기재된다.
바이러스성 감염은 I형 인터페론(IFN), 전염증성 사이토킨 및 케모킨의 생성을 야기하는 세포성 반응을 활성화시키는, 호스트 패턴 인식 수용체(PRR), 예를 들면, 톨-유사 수용체(TLR), RIG-I-유사 수용체(RLR) 및 기타 다수에 의해 즉시 인식된다. 이러한 초기 사이토킨 반응은 바이러스 복제 및 확산을 제한할 뿐만 아니라, 궁극적으로 바이러스를 제거하는, 보다 특이적이고 강력한 적응 면역 반응의 개시를 조정한다. 바이러스성 감염의 방어에서 PRR-매개된 선천적 사이토킨 반응의 필수적인 역할은 PRR 인코딩 유전자 또는 이들의 신호전달 구성원이 결핍된 인간 및 마우스가 바이러스성 감염에 취약하다는 사실에 의해 설명된다.
감염을 설정하기 위하여, 병원성 바이러스는 PRR-매개된 선천적 면역 반응을 회피 및/또는 역탐지하는 다중 메커니즘을 진화시켰다. 사실, PRR-매개된 사이토킨 반응의 실패 또는 부적절한 활성화는 만성 B형 간염을 포함한 많은 만성 바이러스성 감염에서 빈번하게 관찰되고, 이에 대하여 바이러스성 DNA 폴리머라제 억제제에 의한 최근 항바이러스 요법은 치료를 제공하는데 실패하였다.
B형 간염 바이러스(HBV)는 전세계적으로 3억5천만명 이상의 사람들을 만성적으로 감염시키는 비세포변성 헤파드나바이러스이다. 만성 B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 호스트가 면역 반응을 바이러스를 제거하기에 충분하도록 증가시키는데 실패했기 때문에 발생한다. HBV 감염의 결과 및 발병은 호스트 항바이러스성 면역 반응의 성질 및 규모에 따라 크게 결정되고, 이는 일반적으로 감염 시 연령과 관련된다. 성인-획득 감염의 95% 이상이 활발한 다클론성 HBV-특이적 T 세포 반응에 의해 6개월 이내에 자발적으로 제거되는 반면, 노출된 신생아의 90% 이상 및 연령 1-5세의 어린이의 약 30%가 만성 감염으로 발달하고, 이는 더 약하고 종종 거의 검출가능하지 않은 바이러스 특이적 T 세포 반응과 관련된다.
장기간 뉴클레오사이드(뉴클레오타이드) 아날로그 요법 또는 한정된 기간의 페길화된 알파 인터페론(IFN-α) 요법을 통한 바이러스 복제의 지속된 억제는 간 질환의 개선, 간 대상부전의 예방 및 간세포 암종의 이병률 및 사망률의 감소와 관련되었다. 그러나, HBV 표면 항원(HBsAg) 혈청변환, 감염의 완전하고 지속가능한 제어를 갖는 HBV에 대한 성공적인 면역학적 반응의 특징, 또는 "기능적 치료(functional cure)"는 최근 요법에 의해 좀처럼 달성되지 않는다.
TLR 및 RLR 효능제의 항바이러스성 효능이 HBV 형질전환 마우스뿐만 아니라 WHV 또는 DHBV에 의해 감염된 동물들에서 관찰되었음에도 불구하고, 세포 반응의 광범위한 활성화 및 전염증성 사이토킨의 대량 생산으로 인하여 항바이러스 효과를 달성하는데 필요한 양으로 PRR 효능제를 전신적으로 투여하는 것은 일반적으로 상당한 부작용과 연관된다.
B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법으로서, 스팅 효능제의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
B형 간염 바이러스 감염의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법으로서, 간 상주 수지상 세포(liver resident dendritic cell), 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 관심 대상 화합물로 처리하는 단계; 세포를 조건 조절된 배지(conditioned medium)에서 배양하는 단계; 조건 조절된 배지 또는 이의 일부분을 처리된 세포로부터 제거하는 단계; 및 B형 간염 바이러스 감염된 간세포를 조건 조절된 배지와 함께 배양하는 단계를 포함하는 방법이 또한 제공된다.
B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상의 치료 방법으로서, 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 관심 대상 화합물로 처리하는 단계; 세포를 조건 조절된 배지에서 배양하는 단계; 조건 조절된 배지 또는 이의 일부분을 처리된 세포로부터 제거하는 단계; 및 조건 조절된 배지 또는 이의 일부분을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 또한 본원에서 제공된다.
발명의 개요뿐만 아니라 하기 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 읽는 경우, 더욱 잘 이해된다. 기재된 방법을 설명하기 위한 목적으로, 방법의 예시적인 양태를 도면에 도시하지만, 방법은 기재된 특정 양태로서 한정되지 않는다. 도면에서:
도 1a 내지 도 1c를 포함하는 도 1에는 a) 검정 전략의 예시적인 묘사; b) TLR 효능제에 의한 AML12HBV10 세포의 처리(직접 처리) 또는 TLR 효능제 처리된 RAW264.7 세포로부터 수확된 조건 조절된 배지의 50%를 함유하는 배지(간접 처리); 및 c) TLR 효능제 처리된 RAW264.7 세포로부터 수확된 조건 조절된 배지에 의한 AML12HBV10 세포의 간접 처리가 도시된다.
도 2a 내지 도 2b를 포함하는 도 2에는 a) 선천적 면역 증강제로서 마이크로소스(MicroSource) 라이브러리로부터 확인된 예시적인 플라보노이드의 구조; 및 b) 7,2'-다이하이드록시플라본 화합물로 직접 처리되거나, 7,2'-다이하이드록시플라본 화합물로 처리된 RAW264.7 세포로부터의 조건 조절된 배지로 간접적으로 처리된 AMLHBV10 세포의 분석이 도시된다.
도 3a 내지 도 3d를 포함하는 도 3에는 a) 예시적인 마우스 IFN 유도제의 구조; b) DMXAA(상부 패널), CMA(중간 패널), 틸로론(하부 패널)으로 직접적으로 처리되거나(직접 처리), 각각의 화합물로 12시간 동안 처리된 RAW264.7 세포로부터 수확된 조건 조절된 배지의 50%로 간접적으로 처리된 AML12HBV10 세포의 예시적인 분석; c) 모의-처리되거나 DMXAA 125μM 또는 LPS 1㎍/ml로 처리된 RAW264.7 및 AML12HBV10 세포의 예시적인 분석; 및 d) DMXAA의 저용량으로 직접적으로 또는 간접적으로 처리된 AML12HBV10 세포의 예시적인 분석이 도시된다.
도 4a 내지 도 4e를 포함하는 도 4에는 DMXAA, 폴리 I:C, Pam3CSK4으로 직접적으로 처리되거나, DMXAA 또는 TLR 효능제로 처리된 RAW264.7 세포로부터 수확된 조건 조절된 배지의 50%로 간접적으로 처리된 AML12HBV10 세포의 예시적인 분석이 도시된다. a) 세포내 HBV RNA를 노던 블롯(Northern blot)으로 측정하고; b) HBV 코어 단백질을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 측정하고; c) HBV 캡시드를 천연 아가로스 겔 검정으로 측정하고; d) 캡시드-연관된 HBV DNA를 천연 아가로스 겔 검정으로 측정하고; e) 세포질 HBV 코어 DNA는 서던 블롯(Southern blot) 혼성화로 측정하였다.
도 5a 내지 도 5e를 포함하는 도 5에는 지시된 시간 동안 a) DMXAA 125μM, b) Pam3CSK4(TLR1/2 효능제) 1㎍/ml, c) 가르디퀴모드(TLR7 효능제) 3μM, d) 폴리 I:C(TLR3 효능제) 10㎍/ml, 또는 e) LPS(TLR4 효능제) 1㎍/ml로 처리된 RAW264.7 세포의 예시적인 웨스턴 블롯 분석이 도시된다.
도 6a 내지 도 6g를 포함하는 도 6에는 지시된 시간 동안 DMXAA 125μM, Pam3CSK4(TLR1/2 효능제) 1㎍/ml, 폴리 I:C(TLR3 효능제) 10㎍/ml 또는 가르디퀴모드(TLR7 효능제) 3μM으로 처리된 RAW264.7 세포의 예시적인 RT-PCR 분석이 도시된다. a) IFN-β, b) IL6, c) IL1, d) IL10, e) TNF-α, f) IL12, 및 g) CXCL10의 분석. 데이터(평균±표준 편차, N=3)는 미처리 대조군에 대하여 유전자 발현의 유도 배율로서 표현되었다.
도 7a 내지 도 7c를 포함하는 도 7에는 I형 인터페론 수용체 IFNAR1에 대항하는 단클론 항체(Ab INFAR)의 존재 하에(원형) 또는 부재 하에(사각형) 전배양된 후, a) mIFN-α 또는 b) DMXAA로 처리된 RAW264.7 세포로부터 수확된 조건 조절된 배지의 50%로 처리된 AML12HBV10 세포의 예시적인 RT-PCR 분석이 도시된다. 데이터(평균±표준 편차, N=4)는 모의-처리된 대조군(NT)의 퍼센트로서 표시된다. c) IL-1, IL-6 또는 TNF-α로 처리된 AML12HBV10 세포. 세포질 HBV 코어 DNA는 서던 블롯 혼성화에 의해 분석되었다.
도 8a 내지 도 8d를 포함하는 도 8에는 a) 스크램블드 shRNA(sh대조군) 또는 shRNA 표적화 마우스 스팅 mRNA(sh스팅)를 발현하는 부모 RAW264.7 세포(WT) 및 RAW264.7-유래 안정한 세포주로부터 추출된 전체 RNA의 예시적인 분석이 도시된다. 스팅 mRNA 레벨은 실시간 RT-PCR에 의해 측정되고, 데이터(평균±표준 편차, N=3)는 WT RAW264.7 세포에서 스팅 mRNA의 퍼센트로서 표현된다. b) sh대조군 또는 sh스팅을 발현하는 RAW264.7 세포주를 모의-처리하거나 DMXAA 125μM로 30분 동안 처리하였다. 스팅 및 TBK1의 발현 및 활성화를 웨스턴 블롯 검정으로 측정하였다. LPS 1㎍/ml로 처리된 세포를 대조군으로서 제공하였다. β-액틴을 로딩 대조군으로서 제공하였다. c) 스팅의 녹다운(knockdown)은 DMXAA-유도된 IFN-β 유전자 발현을 폐기하였다. RAW264.7-유래 sh대조군 및 sh스팅 세포주를 DMXAA 125μM으로 3시간 동안 처리하였다. IFN-β mRNA를 실시간 RT-PCR 검정으로 정량하였다. 데이터(평균±표준 편차, N=3)는 미처리 대조군에 대하여 유전자 발현의 유도 배율로서 표현되었다. d) 스팅의 녹다운은 DMXAA-유도된 항바이러스성 활성을 손상시켰다. 테트라사이클린의 부재 하에 1일 동안 배양된 AML12HBV10 세포를 모의-처리하거나, DMXAA, LPS 또는 가르디퀴모드로 12시간 동안 처리된 RAW264.7-유래 sh대조군 또는 sh스팅 세포로부터 수확된 조건 조절된 배지의 50%로 2일 동안 처리하였다. 세포질 HBV 코어 DNA를 추출하고 실시간 PCR 검정으로 정량하였다. 모의 처리된 RAW267.4 세포로부터의 조건 조절된 배지로 처리된 AML12HBV10 세포를 대조군(NT)으로서 제공하였다. HBV DNA 레벨(평균±표준 편차, N=3)는 NT 대조군에 대한 퍼센트로서 표현되었다. 데이터는 스튜던트 t-시험으로 통계적으로 분석하였다. *는 P<0.05를 나타낸다.
도 9a 내지 도 9c를 포함하는 도 9에는 HBV 유체역학적 마우스 모델에서 DMXAA의 예시적인 생체내 분석이 도시된다. HBV 1.3mer 플라스미드의 유체역학적 주사 7일 후, 마우스를 복강내 주사를 통해 단일 25 mg/kg 용량의 DMXAA 또는 비히클로 처리하였다. a) 처리 24시간 후, HBV 코어 DNA를 간으로부터 추출하고 실시간 PCR 검정으로 분석하였다. 대조군 그룹(10마리 마우스) 및 처리 그룹(9마리 마우스). 플롯은 투입 플라스미드로부터의 카피 공제 후 각각의 동물로부터 HBV DNA 카피/ml를 나타낸다. b) OAS1b 및 c) 마우스 간으로부터의 비페린의 mRNA 레벨. 모든 데이터는 중간값, 사분위수뿐만 아니라 범위(최소, 최대)를 나타내는 박스플롯으로 표시되고, 스튜던트 t-시험으로 통계적으로 분석되었다(P<0.05).
도 10a 내지 도 10b를 포함하는 도 10에는 THP-1 세포에서 인간 스팅 경로 유도된 사이토킨 반응의 활성화 및 인간 간암 세포에서 항바이러스 효과의 예시적인 분석이 도시된다. a) DMXAA로 2시간 동안 처리된 인간 스팅의 S162A 돌연변이 형태를 발현하는 THP-1h스팅S162 세포로부터의 IFN-β의 mRNA 발현 레벨. 데이터(평균±표준 편차, N=3)는 미처리 대조군에 대하여 정규화 후, 상대적인 유전자 발현으로서 표현된다(배율). b) DMXAA로 12시간 동안 처리된 THP-1h스팅S162 세포로부터의 상청액으로 처리된 DES19 세포. HBV DNA 발현 레벨(평균±표준 편차, N=3)은 모의 처리된 대조군에 대한 퍼센트로서 표현되었다. IFN-α로 처리된 DES19 세포는 양성 대조군으로서 제공되었다.
기재된 방법은 첨부된 도면과 관련하여 하기 상세한 설명을 참조하여 더 용이하게 이해될 수 있고, 이는 본 개시내용의 일부분을 형성한다. 기재된 방법은 본원에 기재되고/기재되거나 도시된 특정한 방법으로 한정되지 않으며, 본원에 사용된 용어는 오직 예시의 방식으로 특정 양태를 설명할 목적을 위한 것이고 청구된 방법의 한정을 의도하지 않는다는 것이 이해된다.
명확성을 위하여, 개별적인 양태의 내용으로 본원에 기재된 기재 방법의 특정한 특징은 또한 단일 양태에서 조합으로 제공될 수 있다는 것이 인식된다. 간결성을 위하여, 단일 양태의 내용으로 본원에 기재된 기재 방법의 다양한 특징은 또한 개별적으로 제공되거나 임의의 하위조합으로 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 단일 형태는 복수 형태를 포함한다.
하기 약칭은 명세서 전반에 걸쳐 사용된다: HBV(B형 간염 바이러스 감염); 스팅(인터페론 유전자의 자극인자); PRR(패턴 인식 수용체); CMA(10-(카복시메틸)-9(10H)아크리돈); DMXAA(5,6-다이메틸잔테논-4-아세트산); h스팅S162(S162A 돌연변이를 갖는 인간 스팅).
본원에서 사용되는 바, "치료" 및 유사한 용어는 만성 HBV 증상의 중증도 및/또는 빈도의 감소, HBV 증상 및/또는 상기 증상의 근본 원인의 제거, HBV 증상 및/또는 이의 근본 원인의 빈도 또는 가능성의 감소, 및 HBV에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 유발된 손상의 개선 및 교정을 의미한다.
본원에서 사용되는 바, "상기 환자에게 ...를 투여" 및 유사한 용어는 대상 신체의 표적 세포, 조직, 또는 세그먼트가 조건 조절된 배지로부터의 활성 구성분과 접촉하도록 스팅 효능제 또는 조건 조절된 배지 또는 이의 일부분을 환자에게 제공하는 과정을 의미한다. 스팅 효능제 또는 조건 조절된 배지 또는 이의 일부분을 투여하는 적합한 방법은 주사 또는 경구 전달을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "대상"은 임의의 동물, 특히, 포유동물을 의미하는 것으로 의도된다. 마우스에서 HBV 복제의 스팅 효능제 유도된 억제가 본원에 예시화되어 있음에도 불구하고, 임의의 유형의 포유동물이 기재된 방법을 사용하여 치료될 수 있다. 따라서, 바람직하게는 마우스 및 인간, 가장 바람직하게는 인간에게 사용됨에도 불구하고, 방법은 인간 및 비인간 동물에 적용가능하다. "대상" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "조건 조절된 배지"는 배양된 세포로부터 수확된 배지를 의미한다.
B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상의 치료 방법으로서, 스팅 효능제의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
당해 분야의 숙련가는 스팅(인터페론 유전자의 자극인자)가 다중 세포질 DNA 수용체의 아답터이며, 박테리아성 제2 메신저 사이클릭 다이-아데노신 모노포스페이트(c-다이-AMP) 및 사이클릭 다이-구아노신 모노포스페이트(c-다이-GMP)를 인식하는 패턴 인식 수용체(PRR)인 것을 알고 있다. 사이토졸 DNA는 사이클릭 구아노신 모노포스페이트-아데노신 모노포스페이트(cGAMP) 합성효소(cGAS)에 결합하여 사이클릭 구아노신 모노포스페이트-아데노신 모노포스페이트(사이클릭 GMP-AMP, 또는 cGAMP)를 생성시키고, 이는 후속적으로 아답터 단백질 스팅에 결합하여 이를 활성화하고 IFN를 유도한다. 스팅는 5개의 추정 막횡단 영역을 포함하고, 주로 소포체에 거주하며, NF-카파B 및 IRF3 전사 경로를 둘 다 활성화시켜 I형 인터페론(IFN-알파 및 IFN-베타)의 발현을 유도하고 발현에 따른 강력한 항바이러스성 상태를 행사할 수 있다.
스팅 효능제는 대식세포, 수지상 세포, 간 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합에서 선천적 사이토킨 반응을 자극할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 스팅 효능제는 대식세포에서 선천적 사이토킨 반응을 자극할 수 있다. 다른 양태에서, 스팅 효능제는 수지상 세포에서 선천적 사이토킨 반응을 자극할 수 있다. 다른 양태에서, 스팅 효능제는 간 비실질 세포에서 선천적 사이토킨 반응을 자극할 수 있다. 다른 양태에서, 스팅 효능제는 상기 열거된 세포의 임의의 조합에서 선천적 사이토킨 반응을 자극할 수 있다.
스팅 효능제 자극딘 선천적 사이토킨 반응은 사이토킨을 통해 매개된다. 일부 실시형태에서, 예를 들면, 선천적 사이토킨 반응은 1형 인터페론을 통해 매개될 수 있다.
기재된 방법에서 사용되기 위한 적합한 스팅 효능제는 플라보노이드를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 스팅 효능제는 플라보노이드를 포함할 수 있다. 기타 양태에서, 스팅 효능제는 플라보노이드로 이루어질 수 있다. 적합한 플라보노이드는 10-(카복시메틸)-9(10H)아크리돈(CMA), 5,6-다이메틸잔테논-4-아세트산(DMXAA), 메톡시본, 6,4'-다이메톡시플라본, 4'-메톡시플라본, 3',6'-다이하이드록시플라본, 7,2'-다이하이드록시플라본, 다이드제인, 포르모노네틴, 레투신 7-메틸 에터, 잔톤, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 10-(카복시메틸)-9(10H)아크리돈(CMA)일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 5,6-다이메틸잔테논-4-아세트산(DMXAA)일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 메톡시본일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 6,4'-다이메톡시플라본일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 4'-메톡시플라본일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 3',6'-다이하이드록시플라본일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 7,2'-다이하이드록시플라본일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 다이드제인일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 포르모노네틴일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 레투신 7-메틸 에터일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 잔톤일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 상기 플라보노이드의 임의의 조합일 수 있다. 따라서, 예를 들면, 일부 실시형태에서, 플라보노이드는 DMXAA를 포함한다.
HBV를 갖는 대상에게 스팅 효능제의 투여는 감염된 간세포에서 HBV 복제를 억제할 수 있다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 스팅 효능제는 B형 간염 바이러스 캡시드 레벨을 감소시킬 수 있다.
또한 B형 간염 바이러스 감염의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법이 본원에서 제공된다. 세포 배양 시스템은 HBV 감염의 치료에 유용한 화합물을 확인하기 위해서 설정되었다. 도 1a에 설명된 바와 같이, 예시적인 세포 배양 시스템은 대식세포에서 사이토킨 반응을 활성화시키고, 그 결과 간세포에서 HBV 복제를 억제하는 화합물을 확인하기 위한 마우스 대식세포-간세포 커플링된 세포 배양 시스템을 포함한다. 이러한 세포 배양 시스템을 사용하여, 스팅 효능제, 예를 들면, DMXAA가 주로 I형 IFN에 의해 매개되고, 바이러스 캡시드를 감소시킴으로써 HBV 복제를 억제하는 강력한 항바이러스성 반응을 유도한다는 것을 입증하였다.
따라서, 일부 실시형태에서, HBV 감염의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법은 1) 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 관심 대상 화합물로 처리하는 단계; 2) 세포를 조건 조절된 배지에서 배양하는 단계; 3) 조건 조절된 배지 또는 이의 일부분을 처리된 세포로부터 제거하는 단계; 및 4) B형 간염 바이러스 감염된 간세포를 조건 조절된 배지와 함께 배양하는 단계를 포함한다.
일부 측면에서, 방법은 간 상주 수지상 세포를 관심 대상 화합물로 처리하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 방법은 대식세포를 관심 대상 화합물로 처리하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 방법은 비실질 세포를 관심 대상 화합물로 처리하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 방법은 상기 세포 유형의 임의의 조합을 관심 대상 화합물로 처리하는 단계를 포함한다.
다양한 세포 유형을 배양하기 위한 조건 및 배지는 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있다. 예를 들면, 대식세포는 소태아 혈청(FBS)으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 배양할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 조건 조절된 배지는 배양된 대식세포로부터 수확된 FBS를 갖는 DMEM를 포함한다.
일부 실시형태에서, 방법은 B형 간염 바이러스 복제를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. HBV 복제를 측정하기 위한 많은 기술들이 당해 분야에 공지되어 있고, 이는 세포질 HBV 코어 DNA 복제 중간체(RC, DSL 및 SS)를 서던 블롯 혼성화 또는 전체 HBV 코어 DNA를 실시간 PCR로 측정하는 것; 세포내 HBV RNA(HBV 엔벨로프 단백질에 특이적인 pgRNA 및 mRNA)를 노던 블롯으로 측정하는 것; HBV 코어 단백질을 웨스턴 블롯 검정으로 측정하는 것; HBV 캡시드 및 캡시드 연관된 바이러스 DNA를 천연 아가로스 겔 전기영동 후, 니트로셀룰로스 막으로 이동시킴으로써 측정하는 것; 캡시드-연관된 HBV DNA를 서던 블롯 혼성화로 측정하는 것; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
일부 실시형태에서, 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합의 처리는 선천적 사이토킨 면역 반응을 자극할 수 있고, 이는 간세포에서 B형 간염 바이러스 복제를 억제할 수 있다. 예를 들면, 처리 단계는 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합에서 선천적 사이토킨 면역 반응을 자극하고, 사이토킨을 조건 조절된 배지 내로 방출시킬 수 있다. 일부 측면에서, 사이토킨은 I형 IFN을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 조건 조절된 배지는 그 결과 감염된 간세포에서 B형 간염 복제를 억제할 수 있다.
간세포가 HBV의 주요 호스트 세포임에도 불구하고, 간 비실질 세포(NPC)가 효과적인 HBV-특이적 항바이러스성 면역의 프라이밍(priming)에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 예를 들면, 간 대식세포의 활성화는 마우스의 간에서 HBV에 대항하는 성공적인 면역 반응의 프라이밍을 조절하는 사이토킨/케모킨의 개별적인 프로파일의 발현을 유도한다.
또한 B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법으로서, 1) 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 관심 대상 화합물로 처리하는 단계; 2) 세포를 조건 조절된 배지에서 배양하는 단계; 3) 조건 조절된 배지 또는 이의 일부분을 처리된 세포로부터 제거하는 단계; 및 4) 조건 조절된 배지 또는 이의 일부분을 상기 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
일부 측면에서, 방법은 간 상주 수지상 세포를 관심 대상 화합물로 처리하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 방법은 대식세포를 관심 대상 화합물로 처리하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 방법은 비실질 세포를 관심 대상 화합물로 처리하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 방법은 상기 세포 유형의 임의의 조합을 관심 대상 화합물로 처리하는 단계를 포함한다.
본 발명에서 사용을 위한 관심 대상 화합물은 하나 이상의 스팅 효능제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, 일부 실시형태에서, 스팅 효능제는 플라보노이드를 포함할 수 있다. 적합한 플라보노이드는 10-(카복시메틸)-9(10H)아크리돈(CMA), 5,6-다이메틸잔테논-4-아세트산(DMXAA), 메톡시본, 6,4'-다이메톡시플라본, 4'-메톡시플라본, 3',6'-다이하이드록시플라본, 7,2'-다이하이드록시플라본, 다이드제인, 포르모노네틴, 레투신 7-메틸 에터, 잔톤, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 10-(카복시메틸)-9(10H)아크리돈(CMA)일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 5,6-다이메틸잔테논-4-아세트산(DMXAA)일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 메톡시본일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 6,4'-다이메톡시플라본일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 4'-메톡시플라본일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 3',6'-다이하이드록시플라본일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 7,2'-다이하이드록시플라본일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 다이드제인일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 포르모노네틴일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 레투신 7-메틸 에터일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 잔톤일 수 있다. 일부 측면에서, 스팅 효능제는 상기 플라보노이드의 임의의 조합일 수 있다. 따라서, 예를 들면, 일부 실시형태에서 플라보노이드는 DMXAA를 포함한다.
기재된 방법에서 사용을 위한 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 및/또는 비실질 세포는 임의의 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 및/또는 비실질 세포는 포유동물 세포이다. 일부 측면에서, 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 및/또는 비실질 세포는 마우스 세포일 수 있다. 일부 측면에서, 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 및/또는 비실질 세포는 인간 세포일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합은 인간 세포이다.
간 상주 수지상 세포, 대식세포, 및/또는 비실질 세포는 야생형 세포 또는 변형된 세포일 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "변형된 세포"는 비천연, 비야생형, 돌연변이, 또는 DNA 및/또는 단백질의 변경된 레벨을 함유하는 세포를 의미한다. 일부 실시형태에서, 인간 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합은 돌연변이 스팅를 발현하도록 변형된다. 일부 실시형태에서, 돌연변이 스팅은 스팅 S162A일 수 있다.
변형된 세포를 발생시키는 많은 기술들이 당해 분야에 공지되어 있고, 이는 형질감염 또는 형질전환을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 인간 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합은 처리 단계 전에 돌연변이 스팅로 형질감염되거나 형질전환된다.
간 상주 수지상 세포, 대식세포, 및/또는 비실질 세포는 다수의 적합한 공급원으로부터 유래될 수 있다. 일부 측면에서, 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합은 자가조직 세포이다. 다른 측면에서, 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합은 동종 세포이다. 또 다른 측면에서, 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합은 상이한 종으로부터의 세포이다.
실시예
물질 및 방법
세포 배양
뮤린 대식세포 세포주 RAW264.7(ATCC TIB-71) 및 GP2-293 세포(Clontech)를 10% 소태아 혈청(FBS)으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 중에 유지하였다. 테트라사이클린(tet)-유도성 방식으로 높은 레벨의 HBV 복제를 지지하는 AML12HBV10, 불멸화된 뮤린 간세포(AML12)-유래 세포주를 문헌[참조: Xu C, et al. Interferons accelerate decay of replication-competent nucleocapsids of hepatitis B virus. J Virol 2010;84:9332-40, and Campagna MR, et al. Sulfamoylbenzamide Derivatives Inhibit the Assembly of Hepatitis B Virus Nucleocapsids. J Virol 2013]에 기재된 바와 같이 유지하였다.
시약
DMXAA, CMA 및 2,7-비스[2-(다이에틸아미노)에톡시]-9-플루오레논(틸로론)은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 구입하였다. TLR1/2 효능제 Pam3CSK4, TLR3 효능제 폴리 I:C, TLR4 효능제 리포다당류(LPS), 및 TLR7 효능제 가르디퀴모드는 인비보겐(Invivogen)으로부터 구입하였다. 재조합 뮤린 IFN-α, IL-1, IL-6 및 TNF-α는 PBL 인터페론소스(PBL InterferonSource)로부터 구입하였다. HBV 코어 단백질의 카복실 말단 14 아미노산에 대항하는 항체는 이전에 문헌[참조: Xu C, et al. Interferons accelerate decay of replication-competent nucleocapsids of hepatitis B virus. J Virol 2010;84:9332-40]에 기재되었다. β-액틴 및 마우스 IFNAR-1에 대항하는 항체는 시그마-알드리치 및 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)로부터 각각 구입하였다. 마우스 스팅, TBK1, S172-인산화된 TBK1, IkBα, p38, 인산화된-p38, JNK, 인산화된-JNK, ERK, 인산화된-ERK에 대항하는 항체는 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)로부터 구입하였다. 플라스미드 pTmcs-HBV1.3 및 pCMV-SB는 닥터 프란시스 브이 카이사리(Dr. Francis V. Chisari)(The Scripps Research Institute, La Jolla, California, USA)로부터의 증정품이었다.
HBV DNA, RNA 및 뉴클레오캡시드의 분석
AML12HBV10 세포로부터의 HBV 코어 DNA 추출뿐만 아니라 서던 블롯 혼성화 및 실시간 PCR 검정에 의한 분석은 이전에 문헌[참조: Xu C, et al. Interferons accelerate decay of replication-competent nucleocapsids of hepatitis B virus. J Virol 2010;84:9332-40, and Campagna MR, et al. Sulfamoylbenzamide Derivatives Inhibit the Assembly of Hepatitis B Virus Nucleocapsids. J Virol 2013]에 기재된 바와 같았다. TRIzol 시약(인비트로젠사(Invitrogen))을 사용하여 전체 세포 RNA를 추출하였다. HBV RNA를 α-32P-UTP-표식된 완전한 길이의 음성 가닥 RNA 프로브로 노던 블롯 혼성화에 의해 부석하였다. HBV 캡시드 및 캡시드 연관된 바이러스 DNA를 천연 아가로스 겔 전기영동 후, 니트로셀룰로스 막으로 이동시킴으로써 분석하였다. HBV 캡시드를 HBV 코어 단백질에 대항하는 항체로 막에 프로빙(probing)한 후, LI-COR 오디세이(Odyssey) 시스템으로 가시화하여 검출하였다. 캡시드-연관된 DNA를 방사능 표식된 HBV 리보프로브로 혼성화함으로써 검출하였다.
실시간 PCR 및 RT-PCR 검정
사이토킨 유전자 발현 분석을 위하여, TRIzol 시약을 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 수퍼스크립트 III(SuperScript III, 인비트로젠사)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 라이트사이클러 480 II(LightCycler 480 II, 로슈사(Roche))를 사용하여 정량적 실시간 PCR 분석을 수행하였다. RT-PCR 검정에서 사용된 프라이머를 표 1에 나타낸다. HBV DNA를 검출하기 위하여 실시간 PCR에서 사용된 프라이머를 또한 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
스팅 녹다운 세포주의 발생
뮤린 스팅를 특이적으로 표적화하는 shRNA를 발현하는 플라스미드는 하기 cDNA 서열을 pRS 벡터(오리젠사(Origene)) 내로 삽입함으로서 건설되었다: tcaatcagctacataacaactcgagttgttatgtagctgattga. pRS 벡터로부터의 스크램블드 shRNA를 발현하는 대조군 플라스미드는 오리젠사로부터 구입하였다. 스크램블드 shRNA 또는 스팅 특이적 shRNA를 발현하는 pCMV/VSV-G 및 pRS 벡터-유래 플라스미드를 사용하는 GP2-293 세포에서 VSV G 단백질 슈도타입화된 레트로바이러스의 팩키지는 이전에 문헌[참조; Zhao X, et al. Interferon induction of IFITM proteins promotes infection by human coronavirus OC43. Proc Natl Acad Sci U S A 2014]에 보고된 바와 본질적으로 같았다. 이전에 문헌[참조: Zhao X, et al]에 기재된 바와 같이, RAW264.7 세포는 각각의 shRNA를 발현하는 슈도타입화된 레트로바이러스로 형질도입하였다.
HBV DNA 유체역학적 마우스 모델에서 DMXAA의 항바이러스 효능
10주 연령의 암컷 NOD/SCID 마우스를 바이탈 리버 라보라토리 애니멀 테크놀로지 코 엘티디(Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd)로부터 구입하였다. 모든 실험은 동물 실험 윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee) 승인하에 수행되었다. HBV 유체역학적 모델을 설정하기 위하여, 1.3mer HBV 게놈을 발현하는 플라스미드 pTmcsHBV1.3 13.5㎍ 및 잠자는 미녀 전위효소(Sleeping Beauty transposase)를 발현하는 pCMV-SB 4.5㎍을 이전에 기재된 과정에 따라 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. DMXAA 생체내 효능을 시험하기 위하여, 주사 후 7일에, 마우스를 복강내 주사를 통해 DMXAA(7.5% 중탄산나트륨의 PBS 중) 25mg/kg 또는 비히클로 처리하였다. 마우스를 처리 24시간 후, 희생시켰다. 간내 HBV 코어 DNA를 추출하고, 실시간 PCR 검정을 사용하여 정량하였다. 간내 전체 RNA를 추출하고, 인터페론 자극된 유전자(ISG) OAS1b 및 비페린 mRNA를 실시간 RT-PCR 검정으로 측정하였다. 처리 전 및 24시간 후에 개별적인 마우스의 중량을 모니터링하였다.
실시예 1 - HBV에 대항하는 PRR 효능제-유도된 항바이러스성 반응을 평가하기 위한 세포 배양 시스템의 설정
많은 유형의 체세포에서 아주 흔하게 발현되는 RIG-I-유사 수용체와 달리, 다른 PRR, 예를 들면, TLR 및 cGAS의 발현은 일반적으로 대식세포, 수지상 세포 및 소수의 다른 세포 유형으로 한정된다. PRR, 예를 들면, TLR에서 발현 부족 또는 소량의 발현으로 인하여, 간세포의 처리는 일반적으로 활발한 사이토킨 반응을 유도하지 않는다. 예를 들면, TLR 효능제에 의한 간세포의 직접 처리는 무시할 수 있을 정도의 사이토킨 반응을 유도한다. 그러나, 간 상주 수지상 세포, 대식세포(쿠퍼 세포) 및 다른 간 비실질 세포(NPC)는 높은 레벨의 TLR을 발현하고, 따라서 TLR 효능제에 반응하며 염증성 사이토킨을 생성한다.
만성 B형 간염의 치료를 위한 소분자 PRR 효능제를 선별하기 위하여, 간내 환경을 모방한 세포 기반의 검정을 개발하였다. 도 1a에 도시된, 이러한 독특한 세포 배양 시스템은 HBV 감염된 간의 상태를 모방한다. 특히, 마우스 대식세포(RAW 264.7)를 시험 화합물로 처리한 다음, 처리된 대식세포의 조건 조절된 배지를 HBV가 잠복된 불멸화된 마우스 간세포(AML12HBV10)에 적용하여 대식세포에서 화합물-유도된 항바이러스성 사이토킨 반응을 시험하였다.
실시예 2 - TLR 효능제는 대식세포에서 강한 사이토킨 반응을 유도하여 간세포에서 HBV 복제를 억제한다: 개념 증명 실험
검정 시스템은 공지된 TLR 효능제로 먼저 인증하였다. AML12HBV10 세포를 1×105 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에 접종하고, 테트라사이클린의 부재 하에 배양하였다. 24시간 후, 세포를 지시된 농도의 TLR 효능제로 처리하였다(직접 처리)(도 1b). 대안적으로, AML12HBV10 세포를 RAW264.7 세포로 처리된(5×105 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에서 배양하고, 지시된 농도의 TLR 효능제로 12시간 동안 처리함) TLR 효능제로부터 수확된 조건 조절된 배지의 50% 함유 배지로 처리하였다(간접 처리). 세포질 HBV 코어 DNA를 처리 2일 후에 서던 블롯 혼성화로 분석하였다. RC, 이완된 환형 DNA. DSL, 이중 가닥 선형 DNA. SS, 단일 가닥 DNA. 모의 처리된 AML12HBV10 세포(직접 처리 대조군) 또는 모의 처리된 RAW264.7 세포로부터의 50% 매지로 처리된 AML12HBV10 세포(간접 처리 대조군)로부터의 샘플인 NT, 미처리 대조군. 도 1b에 도시된 바와 같이, TLR1/2(Pam3CSK4), TLR3(폴리 I:C), TLR4(LPS) 또는 TLR7(가르디퀴모드)의 효능제에 의한 AML12HBV10 세포의 직접 처리가 HBV DNA 복제를 명백하게 억제하지 않는 반면, TLR 효능제-처리된 대식세포로부터 수확된 조건 조절된 배지에 의한 AML12HBV10 세포 처리(간접 처리)는 HBV DNA 복제를 강력하게 억제하였다.
또 다른 예시적인 분석에서, DMEM 배지 중의 RAW264.7 세포를 5×105 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에 밤새 접종하고, 지시된 용량의 TLR 효능제로 12시간 동안 처리하였다(도 1c). 테트라사이클린 1㎍/ml를 함유한 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)/F12 배지에서 성장한 AMLHBV10 세포를 1×105 세포/웰의 밀도로 12-웰 플레이트에 1일 동안 테트라사이클린 부재 하에 접종하여 HBV 복제를 방출하였다. 그 다음, 처리된 RAW264.7 세포로부터의 상청액의 동일한 용적을 AML12HBV10 세포로 이동시켰다. 처리 2일 후, HBV 코어 DNA를 AML12HBV10 세포로부터 추출하고, 서던 블롯 검정으로 검출하였다. 대조군 AML12HBV10 세포는 신선한 DMEM 배지(모의) 또는 12시간 동안 모의 처리된(DMEM로 모의 처리된) RAW264.7 세포로부터 이동된 DMEM 배지의 동일한 용적을 수용하였다. TLR 효능제의 패널에 의한 AML12HBV10의 직접 처리는 HBV DNA 복제에 대한 어떠한 효과도 갖지 않았다(데이터는 도시되지 않음). 그러나, TLR 효능제로 처리된 대식세포로부터의 조건 조절된 배지에 의한 AML12HBV10 세포의 배양은, 아마도 대식세포에서 TLR 효능제에 의한 가용성 사이토킨의 유도된 분비를 통하여, HBV DNA 복제를 강력하게 억제하였다(도 1c).
따라서, TLR 효능제가 간세포에서 항바이러스성 반응을 직접적으로 활성화시키는데 실패했음에도 불구하고, TLR 효능제는 간세포에서 HBV 복제를 억제하는 가용성 인자를 생성하는 대식세포를 유도한다.
실시예 3 - 대식세포에서 항바이러스성 반응을 유도하여 간세포에서 HBV 복제를 억제하는 선택된 플라보노이드
대식세포에서 선천적 항바이러스성 사이토킨 반응의 활성화를 가능하게 하는 분자의 확인을 위한 초기 노력은 2320 마이크로소스(MicroSource) 화합물(MicroSource Discovery Systems, Inc.)에 집중하였다. 이러한 컬렉션은 합성 및 천연 유래 화합물의 화학적 분류 및 구조적 다양성을 나타내는 스펙트럼 집합이었다. TLR3-발현 HEK293 세포에서 IFN-β 프로모터 활성을 증강하는 9종의 화합물이 확인되었다. 흥미롭게도, 이러한 9종의 모든 화합물은 플라본, 플라보놀 또는 아이소플라본이고, 이는 플라보노이드 구조 패밀리에 속한다(도 2a).
대표적인 화합물 7,2' 다이하이드록시플라본을 시험하기 위하여, 테트라사이클린의 부재 하에 1일 동안 배양된 AMLHBV10 세포를 지시된 용량(μM)의 7,2'-다이하이드록시플라본 화합물로 직접 처리하거나(도 2b), 2일 동안 (화합물 용량으로 12시간 동안 처리된 RAW264.7 세포로부터 이동된 조건 조절된 배지와 함께 배양함으로써) 간접 처리하였다. 노던 블롯으로 세포내 HBV RNA를 측정하였다(리보솜 RNA가 로딩 대조군으로 제공되었다). HBV 코어 단백질의 카복실 말단 14 아미노산에 대항하는 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 검정으로 HBV 코어 단백질을 측정하였다(β-액틴이 로딩 대조군으로서 제공되었다). 입자 겔 검정으로 HBV 뉴클레오캡시드를 시험하여 온전한 뉴클레오캡시드 및 캡시드-연관된 HBV DNA 둘 다를 검출하였다. 서던 블롯 검정으로 캡시드화된 HBV(코어 DNA) 복제 중간체(RC, DSL 및 SS)를 측정하였다.
도 2b에서 입증된 바와 같이, 대표적인 화합물, 7,2' 다이하이드록시플라본에 의한 RAW264.7 세포 처리는 AML12HBV10 세포에서 HBV에 대항하는 항바이러스성 활성을 유도한다. 이론과 결부됨을 의도하지 않고, 관찰된 반응은 아마도 항바이러스성 사이토킨에 의해 매개되는 것 같다.
실시예 4 - 대식세포에서 DMXAA-유도된 항바이러스성 반응은 간세포에서 HBV 복제를 강력하게 억제하였다
상기 기재된 검정 시스템을 사용하여, 마이크로소스 화합물 컬렉션(MicroSource Discovery Systems, Inc.)에서 75 플라보노이드를 다시 시험하였다. 플라보노이드, 7,2'-다이하이드록시플라본은 HBV에 대항하는 간접적인 항바이러스성 활성을 입증하였지만 직접적인 항바이러스성 활성은 입증하지 못했다. 마우스에서 강력한 IFN 반응 유도제로서 확인된 3종의 플라보노이드 또는 플라보노이드 유래 화합물(틸로린, CMA 및 DMXAA)(도 3a)을 추가로 분석하였다. 간략하게, 실시예 2, 도 1b에 기재된 바와 같이 접종되고 배양된 AML12HBV10 세포를 지시된 농도의 DMXAA(상부 패널), CMA(중간 패널), 틸로론(하부 패널)으로 2일 동안 처리하거나(직접 처리), RAW264.7 세포(각각의 화합물로 12시간 동안 처리됨)로부터 수확된 조건 조절된 배지의 50%로 처리하였다(간접 처리). 세포질 HBV 코어 DNA를 서던 블롯 혼성화로 분석하였다. NT 대조군은 도 1b에 기재된 바와 같았다(도 3b). RAW264.7 및 AML12HBV10 세포를 모의 처리하거나, DMXAA 125μM 또는 LPS 1㎍/ml로 30분 및 60분 동안 처리하였다. 스팅의 발현 및 활성화를 웨스턴 블롯 검정으로 측정하였다. 화살표는 스팅 인산화의 결과로서 겔 이동성에서 이동을 나타낸다. β-액틴이 로딩 대조군으로서 제공되었다(도 3c). 테트라사이클린의 부재 하에 배양된 AML12HBV10 세포를, 저용량의 DMXAA를 사용한 것을 제외하고 패널 B에 기재된 바와 같이, 직접 또는 간접 처리하였다. 2일 동안 지시된 용량의 마우스 알파 IFN(mIFN-α)로 처리된 AML12HBV10 세포가 양성 대조군으로서 제공되었다. 세포질 HBV 코어 DNA를 서던 블롯 혼성화로 분석하였다(도 3d).
틸로린이 직접적으로 또는 간접적으로 HBV 복제를 억제하지 않았지만, CMA 및 DMXAA는 둘 다 강한 간접 항-HBV 활성을 입증하였다(도 3b). 도 3c에 도시된 바와 같이, DMXAA는 RAW264.7 세포에서 스팅의 인산화를 효율적으로 유도하였고 LPS는 그렇지 않았다. AML12HBV10 세포가 스팅의 검출불가능한 레벨을 발현한다는 사실과 일치하게도(도 3c), DMXAA에 의한 간세포 직접 처리는 HBV DNA 복제를 억제하지 않는다. 그러나, DMXAA-처리된 RAW264.7 세포로부터 수확된 조건 조절된 배지는 용량 의존 방식으로 마우스 간세포에서 HBV DNA 복제를 억제한다(도 3d).
실시예 5 - DMXAA-유도된 항바이러스성 반응은 세포질 HBV 캡시드의 양을 감소시켰다
대식세포에서 DMXAA-유도된 항바이러스성 반응에 의해 억제되는 HBV 복제 단계(들)를 맵핑하기 위하여, AML12HBV10 세포를 TLR 효능제- 또는 DMXAA-처리된 RAW264.7 세포로부터 수확된 조건 조절된 배지로 처리하였다. 간략하게, 테트라사이클린의 부재 하에 1일 동안 배양된 AML12HBV10 세포를 지시된 농도의 DMXAA, 폴리 I:C, Pam3CSK4으로 직접적으로 처리하거나, RAW264.7 세포(지시된 농도의 DMXAA 또는 TLR 효능제로 12시간 동안 처리됨)로부터 수확된 조건 조절된 배지의 50%로 간접적으로 처리하였다. AML12HBV10 세포를 하기 분석을 위하여 처리 2일 후에 수확하였다: (도 4A) 세포내 HBV RNA를 노던 블롯으로 측정하고(pgRNA, 프리-게놈 RNA, envRNAs, 바이러스성 mRNAs 특이화 엔벨로프 단백질, 로딩 대조군으로서 제공된 18S 리보솜 RNA(rRNA)); (도 4B) 전체 세포 용해물을 사용하여 웨스턴 블롯 검정으로 HBV 코어 단백질을 측정하고(β-액틴이 로딩 대조군으로서 제공되었다); HBV 캡시드(도 4C) 및 캡시드-연관된 HBV DNA(도 4D)의 양을 천연 아가로스 겔 검정으로 측정하고; (도 4E) 세포질 HBV 코어 DNA를 서던 블롯 혼성화로 측정하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, DMXAA에 의해 항바이러스성 반응이 유도되고, 대식세포에서 TLR1/2 및 TLR3 효능제에 의해 더 적은 정도로, HBV 캡시드 단백질의 양을 전사-후 감소시키고, 더 많은 양으로, 조립된 캡시드(도 4A, B 및 C). 결과적으로, HBV DNA 복제 중간체의 양도 감소하였다(도 4D 및 E).
실시예 6 - DMXAA는 개별적인 프로파일의 사이토킨 반응을 유도한다
DMXAA-처리된 RAW264.7로부터 수확된 조건 조절된 배지의 항바이러스성 메커니즘을 측정하기 위하여, 처리된 RAW264.7에서 DMXAA뿐만 아니라 대표적인 TLR 효능제에 의해 유도된 신호전달 경로 활성화 및 사이토킨 프로파일을 분석하였다.
RAW264.7 세포를 DMXAA 125μM, Pam3CSK4(TLR1/2 효능제) 1㎍/ml, 폴리 I:C(TLR3 효능제) 10㎍/ml, LPS(TLR4 효능제) 1㎍/ml 또는 가르디퀴모드(TLR7 효능제) 3μM로 지시된 시간 동안 처리하였다(도 5). 전체 세포성 단백질을 SDS-PAGE로 분획화하고, PVDF 막으로 이동시켰다. 전체 인산화된 스팅, TBK1, p38, JNK 및 Erk뿐만 아니라 IkB-α를 이의 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 검정으로 검출하였다. β-액틴이 로딩 대조군으로서 제공되었다.
도 5에 도시된 바와 같이, 오직 DMXAA만이 스팅 인산화를 유도하였고, TLR1/2, TLR7, TLR3 또는 TLR4의 효능제는 그렇지 않았으며, 이는 DMXAA로 처리된 세포에서 30분 이상 동안 검출가능하였다. 그러나, DMXAA뿐만 아니라 모든 시험된 TLR 효능제는 효과적으로 TBK1의 인산화, IRF3 인산화에 필수적인 키나제 및 스팅 및 TLR 경로 둘 다에서 IFN-β의 유도를 유도하였다. 또한, DMXAA 및 모든 시험된 TLR 효능제는 IкBα의 분해를 유도하였다. 흥미롭게도, 인산화된 p38α, JNK 및 ERK의 증가에 의해 입증된 바와 같이, 모든 3종의 MAPK 경로의 활성화는 4종의 TLR 효능제 중 임의의 하나로 처리된 세포에서 15분만큼 이른 것이 증명된 반면, MAPK 경로의 활성화는 지연되었고 DMXAA 처리 후 90분에 겨우 검출가능해졌다.
RAW264.7 세포에서 DMXAA 및 TLR 효능제에 의해 유도된 사이토킨 프로파일을 qRT-PCR 검정으로 측정하였다(도 6). RAW264.7 세포를 DMXAA 125μM, Pam3CSK4(TLR1/2 효능제) 1㎍/ml, 폴리 I:C(TLR3 효능제) 10㎍/ml 또는 가르디퀴모드(TLR7 효능제) 3μM로 지시된 시간 동안 처리하였다(도 6a 내지 도 6g). 특이적 사이토킨 및 케모킨을 특이화하는 mRNA의 양을 실시간 RT-PCR 검정으로 정량하였다. 데이터(평균±표준 편차, N=3)를 미처리 대조군에 대한 유전자 발현의 유도 배율로서 표시하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, qRT-PCR 검정에 의해, 대표적인 TLR 효능제와 비교하여, DMXAA는 뚜렷한 IFN 반응을 유도하지만 덜 활발한 염증성 사이토킨 반응을 유도한다는 것이 드러났다. DMXAA는 처리 2시간 후, TLR1/2, TLR3 또는 TLR7 효능제의 것보다 약 100배 이상의 IFN-β mRNA 발현을 유도하였다(도 6a). 대조적으로, DMXAA와 비교하여, 시험된 TLR 효능제는 일반적으로 더 강한 전염증성 사이토킨(도 6b 내지 도 6f) 발현 및 케모킨(도 6g) 발현을 유도하였다. DMXAA에 의한 더 약한 사이토킨 반응은, 적어도 부분적으로, 이의 MAPK 경로의 더 느리고 더 약한 활성화로 인한 것일 수 있다. 흥미롭게도, TLR 효능제- 및 DMXAA-유도된 IFN-β 반응 둘 다는 처리 2시간에 최고점이지만, 염증성 사이토킨 반응(IL-1 및 IL-10)은 처리 6시간 또는 심지어 그 후에 최고점이다.
실시예 7 - I형 IFN은 HBV에 대항하는 DMXAA-유도된 항바이러스성 반응의 주요 매개체이다
상기 기재된 결과들은 TLR 효능제 및 DMXAA가 별개의 동역학으로 정량적으로 상이한 사이토킨 반응을 유도한다는 것을 나타낸다. DMXAA-유도된 항바이러스성 반응에서 I형 IFN 및 다른 사이토킨의 역할을 측정하기 위하여, I형 IFN 수용체를 특이적으로 인식하는 단클론 항체에 의한 I형 IFN 반응의 차단이 대식세포에서 DMXAA에 의해 유도된 항바이러스성 활성을 약화시키는지 여부를 조사하였다.
테트라사이클린의 부재 하에 1일 동안 배양된 AML12HBV10 세포를 37℃에서 1시간 동안 I형 인터페론 수용체 IFNAR1(Ab INFAR)에 대항하는 단클론 항체 10㎍/ml의 존재 하에 또는 부재 하에 배양한 다음, 2일 동안 지시된 농도의 mIFN-α로 처리하거나(도 7a), RAW264.7 세포(지시된 농도의 DMXAA로 12시간 동안 처리됨)로부터 수확된 조건 조절된 배지의 50%로 처리하였다(도 7b). 세포질 HBV DNA를 실시간 PCR 검정으로 정량하고, 데이터(평균±표준 편차, N=4)를 모의 처리된 대조군(NT)의 퍼센트로서 표시하였다. 테트라사이클린의 부재 하에 배양된 AML12HBV10 세포를 지시된 농도의 IL-1, IL-6 또는 TNF-α로 4일 동안 처리하였다(도 7c). 세포질 HBV 코어 DNA를 서던 블롯 혼성화로 분석하였다.
도 7a에 도시된 바와 같이, AML12HBV10 세포에서 I형 IFN 수용체의 차단은 IFN-α에 의한 항바이러스성 반응을 상당히 감소시켰다. I형 IFN 수용체 항체에 의한 AML12HBV10 세포 처리는 또한 DMXAA-처리된 RAW264.7 세포로부터의 조건 조절된 배지에 의한 항바이러스성 반응을 상당히 약화시켰고(도 7b), 이는 I형 IFN이 HBV에 대항하는 DMXAA-유도된 항바이러스성 반응의 주요 매개체일 수 있음을 제시한다.
DMXAA-유도된 항바이러스성 반응에서 다른 사이토킨의 역할을 측정하기 위하여, IL-1, IL-6 및 TNF-α의 항바이러스 효과를 시험하였다. 도 7c에 도시된 바와 같이, 오직 TNF-α만이 HBV DNA 복제를 억제하였고, 따라서 또한 HBV에 대항하는 DMXAA-유도된 항바이러스성 반응에서 중요한 역할을 할 수 있다. 이러한 결과는 류머티스성 관절염, 염증성 장 질환 및 건선의 항-TNF 요법이 비활성 캐리어에서 HBV 감염을 재활성화한다는 사실과 일치하고, TNF-α가 인간에서 HBV 감염의 면역 조절에서 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다.
실시예 8 - DMXAA 유도된 사이토킨 및 항바이러스성 반응은 스팅-의존적이다
상기 나타낸 바와 같이, RAW264.7 세포의 DMXAA 처리는 스팅를 활성화시키고, 마우스 간세포에서 HBV 복제를 억제하는 항바이러스성 사이토킨 반응을 유도하였다. DMXAA-유도된 항바이러스성 사이토킨 반응에서 스팅의 역할을 추가로 측정하기 위하여, 스크램블 shRNA 또는 스팅 mRNA를 특이적으로 표적화하는 shRNA를 발현하는 RAW264.7-유래 안정성 세포주를 설정하였다.
전체 RNA를 스크램블드 shRNA(sh대조군) 또는 마우스 스팅 mRNA를 표적화하는 shRNA(sh스팅)를 발현하는 부모 RAW264.7 세포(WT) 및 RAW264.7-유래 안정성 세포주로부터 추출하였다. 스팅 mRNA 레벨을 실시간 RT-PCR로 측정하고, 데이터(평균±표준 편차, N=3)를 WT RAW264.7 세포에서 스팅 mRNA의 퍼센트로서 표시하였다(도 8a). sh대조군 또는 sh스팅를 발현하는 RAW264.7 세포주를 모의 처리하거나, DMXAA 125μM로 30분 동안 처리하였다. 스팅 및 TBK1의 발현 및 활성화를 웨스턴 블롯 검정으로 측정하였다. LPS 1㎍/ml로 처리된 세포가 대조군으로서 제공되었다. β-액틴이 로딩 대조군으로서 제공되었다(도 8b). 스팅의 녹다운은 DMXAA-유도된 IFN-β 유전자 발현을 폐기하였다. RAW264.7-유래 sh대조군 및 sh스팅 세포주를 DMXAA 125μM로 3시간 동안 처리하였다. IFN-β mRNA를 실시간 RT-PCR 검정으로 정량하였다. 데이터(평균±표준 편차, N=3)를 미처리 대조군에 대한 유전자 발현의 유도 배율로서 표시하였다(도 8c). 스팅 의 녹다운은 DMXAA-유도된 항바이러스성 활성을 면역손상시켰다. 테트라사이클린의 부재 하에 1일 동안 배양된 AML12HBV10 세포를 모의 처리하거나, 지시된 농도의 DMXAA, LPS 또는 가르디퀴모드로 12시간 동안 처리된 RAW264.7-유래 sh대조군 또는 sh스팅 세포로부터 수확된 조건 조절된 배지의 50%로 2일 동안 처리하였다. 세포질 HBV 코어 DNA를 추출하고, 실시간 PCR 검정으로 정량하였다. AML12HBV10 세포를 대조군(NT)으로서 제공된 모의 처리된 RAW267.4 세포로부터의 조건 조절된 배지로 처리하였다. HBV DNA 레벨(평균±표준 편차, N=3)은 NT 대조군에 대한 퍼센트로서 표시하였다(도 8d). 데이터는 스튜던트 t-시험으로 통계적으로 분석하였다. *는 P<0.05를 나타낸다.
스팅-특이적 shRNA를 발현하는 세포에서 스팅 mRNA 및 단백질 발현의 감소는 qRT-PCR(도 8a) 및 웨스턴 블롯 검정에 의해 각각 증명되었다(도 8b). DMXAA-유도된, LPS-유도되지 않은, TBK-1 활성화는 스팅 mRNA-특이적 shRNA를 발현하는 RAW264.7 세포를 상당히 면역손상시켰다(도 8b). 게다가, DMXAA-유도된 IFN-β 발현(도 8c) 및 HBV에 대항하는 항바이러스성 활성(도 8d)은 스팅 녹다운 세포에서 상당히 약화되었다. 이러한 결과들은 따라서 DMXAA-유도된 항바이러스성 사이토킨 반응이 정말로 스팅 의존적임을 제시한다.
실시예 9 - DMXAA는 마우스에서 HBV 복제를 강력하게 억제한다
생체내 DMXAA의 항바이러스 효과를 추가로 입증하기 위하여, NOD/SCID 마우스에 유체역학적으로 HBV 1.3mer 플라스미드를 주사하여 간세포에서 HBV 복제를 설정하였다. HBV 1.3mer 플라스미드의 유체역학적 주사 7일 후, 마우스를 복강내 주사를 통해 25mg/kg의 DMXAA 단일 용량 또는 비히클로 처리하였다(도 9a). 처리 24시간 후, HBV 코어 DNA를 간으로부터 추출하고, 실시간 PCR 검정으로 분석하였다. 10마리의 마우스가 대조군 그룹에 포함되고, 9마리의 마우스가 처리 그룹에 포함되었다. 플롯은 투입 플라스미드로부터의 카피 공제 후, 각각의 동물로부터 HBV DNA 카피/ml를 나타낸다(도 9b 및 9C). 전체 RNA를 간으로부터 추출하고, OAS1b 및 비페린의 mRNA 레벨을 실시간 RT-PCR 검정으로 분석하였다. 플롯은 각각의 동물로부터의 mRNA 레벨을 나타낸다. 모든 데이터는 중간값, 사분위수뿐만 아니라 범위(최소, 최대)를 나타내는 박스플롯으로 표시되고, 스튜던트 t-시험으로 통계적으로 분석되었다(P<0.05).
도 9a에 도시된 바와 같이, 비히클-처리된 대조군 그룹과 비교하여, 단일 용량 DMXAA 처리는 처리 24시간 후, 1.3-로그로 간내 HBV 코어 DNA를 감소시켰다. 예상된 항바이러스성 메커니즘과 일치하여, 대표적인 IFN-자극된 유전자(ISG), 예를 들면, OAS1b 및 비페린의 발현은 DMXAA 처리된 동물의 간에서 상당히 유도되었다(도 9b 및 9C). 현저하게, DMXAA-처리된 마우스의 평균 체중은 약 8% 감소하였다(데이터는 표시되지 않음).
실시예 10 - 인간 간암 세포에서 인간 스팅 경로의 활성화 및 항바이러스 효과
마우스 대식세포-간세포 시스템에서 수득된 결과를 증명하기 위하여, S162A 돌연변이(h스팅/S162)를 갖는 인간 스팅을 발현하는 인간 단핵구 THP1-유래 세포주를 설정하여 DMXAA에 민감성을 부여하였다. THP-1 세포에서 사이토킨 반응에 대한 인간 스팅 경로의 활성화 및 인간 간암 세포에서 항바이러스 효과를 분석하기 위하여, 인간 스팅의 S162A 돌연변이 형태를 발현하는 THP-1h스팅S162 세포를 DMXAA로 2시간 동안 처리하였다. 전체 세포 RNA를 추출하여 실시간 RT-PCR으로 IFN-β의 mRNA 발현 레벨을 검출하였다. 데이터(평균±표준 편차, N=3)를 미처리 대조군에 대한 정규화 후 상대적인 유전자 발현(배율)으로서 표시하였다(도 10a). 추가로, THP-1h스팅S162 세포를 DMXAA로 12시간 동안 처리한 다음, 지시된 바와 같이 희석된 조건 조절된 배지를 DES19, HBV 복제 잠복 인간 간암 세포주로 이동시켰다. HBV 코어 DNA를 처리 6일 후 추출하고, 실시간 PCR 검정으로 정량하였다. HBV DNA 발현 레벨(평균±표준 편차, N=3)을 모의 처리된 대조군에 대한 퍼센트로서 표시하였다. IFN-α로 처리된 DES19 세포가 양성 대조군으로 제공되었다(도 10b).
THP1-h스팅/S162 세포의 DMXAA 처리는 강력한 IFN-β 발현을 유도하였다(도 10a). 게다가, DMXAA-처리된 THP1-h스팅/S162 세포로부터의 조건 조절된 배지는 HBV 복제를 지지하는 인간 간암 세포(HepDES19)에서 HBV 복제를 효과적으로 억제하였다(도 10b). 따라서, 인간 단핵구에서 인간 스팅의 활성화는 강력한 사이토킨 반응을 유도하여 인간 간암 세포에서 HBV 복제를 억제한다.
본원에 기재된 작업은 처음으로 스팅 효능제를 갖는 스팅 경로의 활성화가 대식세포(및 또한 잠재적으로 간 NPC)에서 사이토킨 반응을 유도하고, 그 결과, 간세포에서 HBV 복제를 강력하게 억제하는 것을 입증한다.
TLR 및 스팅 효능제에 의해 유도된 항바이러스성 사이토킨 반응의 상세한 특성화는 개별적인 특성들을 드러냈다. 특히, DMXAA는 MAPK 경로의 지연된 활성화를 유도하였다. DMXAA는 IFN-β에 의하여 지배된 대식세포에서 사이토킨 반응을 유도하였고, 간세포에서 HBV에 대항하는 더 강력한 항바이러스성 활성을 입증하였다. 추가로, DMXAA는 TLR 효능제와 비교하여 덜 활발한 전염증성 사이토킨 반응을 유도하였다. 따라서, 비세포용해 항바이러스성 사이토킨 반응을 유도하는 성질만을 고려하는 경우, 스팅 경로의 간내 활성화는 TLR 경로의 활성화보다 뛰어난 것으로 보인다. 스팅 효능제의 더 강력한 항바이러스성 반응 및 더 적은 전염증성 사이토킨 반응의 유도는 더 적은 염증 및 조직 손상을 야기할 수 있다. 따라서, 스팅의 간내 활성화는 만성 B형 간염을 치료하는 이상적인 치료학적 접근일 수 있다. 이러한 치료학적 접근은 HBV의 더 효과적이고 지속된 억제를 제공하여야 하고, 잠재적으로 치유적일 수 있고, 이는 B형 간염에 대항하는 최근 FDA 승인 치료법에 의해 거의 달성되지 않는다. 이는 만성 B형 간염의 신규한 치료적 개념 및 접근을 의미한다.
상기 결과는 스팅가 만성 B형 간염의 면역요법의 잠재적인 표적임을 입증하였다. TLR 효능제 면역치료제의 전신 투여와 연관된 부작용은 스팅 효능제의 리포솜 전달을 통해 간 대식세포 또는 다른 비실질 세포에서 스팅 경로의 표적화된 활성화에 의해 회피되고, 이는 쿠퍼 세포의 순환으로부터 주로 제거된다.
당해 분야의 숙련가는 방법의 바람직한 양태에 대한 다수의 변화 및 변형이 만들어질 수 있고, 이러한 변화 및 변형은 기재된 방법의 취지를 벗어나는 일 없이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 첨부된 청구항은 방법의 진정한 취지 및 범위 내에 속하는 바와 동일한 모든 이러한 변이를 포함함을 의도한다.
각각의 특허, 특허 출원, 및 당해 문서에 언급되거나 기재된 문헌의 기재내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
실시형태
하기 실시형태 목록은 상기 기재내용을 대체 또는 대신하기보다는 보완하는 것을 의도한다.
실시형태 1. B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법으로서, 스팅 효능제의 유효량을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 상기 스팅 효능제가 대식세포, 수지상 세포, 간 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합에서 선천적 사이토킨 반응을 자극하는 방법.
실시형태 3. 실시형태 2에 있어서, 상기 선천적 사이토킨 반응이 사이토킨을 통해 매개되는 방법.
실시형태 4. 실시형태 3에 있어서, 상기 선천적 사이토킨 반응이 1형 인터페론을 통해 매개되는 방법.
실시형태 5. 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 상기 스팅 효능제가 플라보노이드를 포함하는 방법.
실시형태 6. 실시형태 5에 있어서, 상기 플라보노이드가 10-(카복시메틸)-9(10H)아크리돈(CMA), 5,6-다이메틸잔테논-4-아세트산(DMXAA), 메톡시본, 6,4'-다이메톡시플라본, 4'-메톡시플라본, 3',6'-다이하이드록시플라본, 7,2'-다이하이드록시플라본, 다이드제인, 포르모노네틴, 레투신 7-메틸 에터, 잔톤, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
실시형태 7. 실시형태 6에 있어서, 상기 플라보노이드가 DMXAA를 포함하는 방법.
실시형태 8. 앞서의 실시형태들 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 상기 스팅 효능제가 감염된 간세포에서 B형 간염 바이러스 복제를 억제하는 방법.
실시형태 9. 실시형태 8에 있어서, 상기 스팅 효능제가 B형 간염 바이러스 캡시드 레벨을 감소시키는 방법.
실시형태 10. B형 간염 바이러스 감염의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법으로서, 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 관심 대상 화합물로 처리하는 단계; 처리된 세포를 조건 조절된 배지에서 배양하는 단계; 조건 조절된 배지 또는 이의 일부분을 처리된 세포로부터 제거하는 단계; B형 간염 바이러스 감염된 간세포를 조건 조절된 배지와 함께 배양하는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 11. 실시형태 10에 있어서, B형 간염 바이러스 복제를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
실시형태 12. 실시형태 10 또는 11에 있어서, 처리 단계가 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합 내에서 선천적 사이토킨 면역 반응 및 조건 조절된 배지로의 사이토킨의 방출을 자극하는 방법.
실시형태 13. 실시형태 12에 있어서, 사이토킨이 I형 인터페론을 포함하지만 이에 한정되지 않는 방법.
실시형태 14. 실시형태 10 내지 13 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 조건 조절된 배지가 감염됨 간세포에서 B형 간염 복제를 억제하는 방법.
실시형태 15. B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법으로서, 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 관심 대상 화합물로 처리하는 단계; 처리된 세포를 조건 조절된 배지에서 배양하는 단계; 조건 조절된 배지 또는 이의 일부분을 처리된 세포로부터 제거하는 단계; 및 조건 조절된 배지 또는 이의 일부분을 상기 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
실시형태 16. 실시형태 15에 있어서, 상기 관심 대상 화합물이 하나 이상의 스팅 효능제를 포함하는 방법.
실시형태 17. 실시형태 16에 있어서, 상기 스팅 효능제가 플라보노이드를 포함하는 방법.
실시형태 18. 실시형태 17에 있어서, 상기 플라보노이드가 10-(카복시메틸)-9(10H)아크리돈(CMA), 5,6-다이메틸잔테논-4-아세트산(DMXAA), 메톡시본, 6,4'-다이메톡시플라본, 4'-메톡시플라본, 3',6'-다이하이드록시플라본, 7,2'-다이하이드록시플라본, 다이드제인, 포르모노네틴, 레투신 7-메틸 에터, 잔톤, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
실시형태 19. 실시형태 18에 있어서, 상기 플라보노이드가 DMXAA를 포함하는 방법.
실시형태 20. 실시형태 15 내지 19 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합이 인간 세포인 방법.
실시형태 21. 실시형태 15 내지 20 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 인간 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합이 돌연변이 스팅를 발현하도록 변형되는 방법.
실시형태 22. 실시형태 21에 있어서, 인간 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합이 처리 단계 전에 돌연변이 스팅로 형질감염되거나 형질전환되는 방법.
실시형태 23. 실시형태 21 또는 22에 있어서, 돌연변이 스팅가 스팅 S162A인 방법.
실시형태 24. 실시형태 15 내지 23 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합이 자가조직 세포인 방법.

Claims (24)

  1. B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법으로서, 유효량의 스팅 효능제(STING agonist)를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 스팅 효능제가 대식세포, 수지상 세포, 간 비실질 세포(liver non-parenchymal cell), 또는 이들의 임의의 조합에서 선천적 사이토킨 반응을 자극하는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 선천적 사이토킨 반응이 사이토킨을 통해 매개되는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 선천적 사이토킨 반응이 1형 인터페론을 통해 매개되는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스팅 효능제가 플라보노이드를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 플라보노이드가 10-(카복시메틸)-9(10H)아크리돈(CMA), 5,6-다이메틸잔테논-4-아세트산(DMXAA), 메톡시본, 6,4'-다이메톡시플라본, 4'-메톡시플라본, 3',6'-다이하이드록시플라본, 7,2'-다이하이드록시플라본, 다이드제인, 포르모노네틴, 레투신 7-메틸 에터, 잔톤, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 플라보노이드가 DMXAA를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스팅 효능제가 감염된 간세포에서 B형 간염 바이러스 복제를 억제하는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 스팅 효능제가 B형 간염 바이러스 캡시드 레벨을 감소시키는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  10. B형 간염 바이러스 감염의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법으로서,
    간 상주 수지상 세포(liver resident dendritic cell), 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 관심 대상 화합물로 처리하는 단계;
    상기 처리된 세포를 조건 조절된 배지(conditioned medium)에서 배양하는 단계;
    상기 조건 조절된 배지 또는 이의 일부분을 상기 처리된 세포로부터 제거하는 단계; 및
    B형 간염 바이러스 감염된 간세포를 상기 조건 조절된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, B형 간염 바이러스 복제를 측정하는 단계를 추가로 포함하는, B형 간염 바이러스 감염의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 처리하는 단계가 상기 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합 내에서 선천적 사이토킨 면역 반응 및 상기 조건 조절된 배지로의 사이토킨의 방출을 자극하는, B형 간염 바이러스 감염의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 사이토킨이 I형 인터페론을 포함하지만 이에 한정되지 않는, B형 간염 바이러스 감염의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조건 조절된 배지가 감염된 상기 간세포에서 B형 간염 복제를 억제하는, B형 간염 바이러스 감염의 치료에 유용한 화합물을 확인하는 방법.
  15. B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법으로서,
    간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 관심 대상 화합물로 처리하는 단계;
    상기 처리된 세포를 조건 조절된 배지에서 배양하는 단계;
    상기 조건 조절된 배지 또는 이의 일부분을 상기 처리된 세포로부터 제거하는 단계; 및
    상기 조건 조절된 배지 또는 이의 일부분을 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 관심 대상 화합물이 하나 이상의 스팅 효능제를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 스팅 효능제가 플라보노이드를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 플라보노이드가 10-(카복시메틸)-9(10H)아크리돈(CMA), 5,6-다이메틸잔테논-4-아세트산(DMXAA), 메톡시본, 6,4'-다이메톡시플라본, 4'-메톡시플라본, 3',6'-다이하이드록시플라본, 7,2'-다이하이드록시플라본, 다이드제인, 포르모노네틴, 레투신 7-메틸 에터, 잔톤, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 플라보노이드가 DMXAA를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합이 인간 세포인, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합이 돌연변이 스팅를 발현하도록 변형되는, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 인간 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합이 처리 단계 전에 돌연변이 스팅로 형질감염되거나 형질전환되는 방법.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 돌연변이 스팅가 스팅 S162A인, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
  24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간 상주 수지상 세포, 대식세포, 비실질 세포, 또는 이들의 임의의 조합이 자가조직 세포인, B형 간염 바이러스 감염을 갖는 대상을 치료하는 방법.
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