CN102146411B - 新型双功能抗瘢痕和组织纤维化寡聚核苷酸药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种新型双功能抗瘢痕和组织纤维化寡聚核苷酸药物，所述核酸为包含既能与AP-1高亲和结合的AP-1顺式作用的元件，又能与Smad高亲和结合的Smad顺式作用的元件。

Description

新型双功能抗瘢痕和组织纤维化寡聚核苷酸药物

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种抗瘢痕和组织纤维化治疗用的诱骗寡聚核苷酸，更具体而言，涉及一种能够同时与转录因子活化蛋白-1(Activator protein-1，AP-1)和Smad3特异结合并抑制这两个转录因子活性的诱骗寡聚核苷酸。本发明还涉及这种寡聚核苷酸的制备及其在治疗瘢痕和组织纤维化疾病中的应用。

背景技术

病理性瘢痕是创面过度修复和组织纤维化的结果，不仅影响美观，且可导致组织和器官不同程度的功能障碍，甚至是某些疾病治疗失败的主要原因，如抗青光眼滤过术后，滤过泡瘢痕的形成是导致抗青光眼手术失败的主要原因。输卵管阻塞再通术后瘢痕形成、腹腔术后形成肠粘连致肠梗阻，以及因炎性等刺激因素所致的肾纤维化和肝纤维化等疾病的发生均与组织过度修复和纤维化相关。因此，针对受创后组织过度修复和组织纤维化的形成机制，设计、研发并制备治疗病理性瘢痕和组织纤维化疾病的药物成为本领域的研究热点之一。

目前用于治疗病理性瘢痕和组织纤维化的主要措施包括以下几个方面：(1)细胞因子抑制剂：如TGF-β2的单克隆抗体、TGF-β2受体阻滞剂、核心蛋白多糖(Decorin)、TGF-β2反义寡核苷酸(OGN)、IL-1受体阻断剂、整合素抗体等；(2)抑制成纤维细胞的增殖与迁移：如5-氟尿嘧啶(5-Fu)、丝裂霉素c(MMC)、伊洛马司他(ilomastat)、苏拉明(Suramin)、光动力疗法、β射线局部照射、P21基因转染等方法；(3)抑制早期炎症的发生：包括皮质类固醇及非激素类消炎药两类；(4)抑制胶原合成与收缩：如β氨基丙腈(βAPN)、D青霉胺等；(5)增加细胞外基质的降解：如组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、尿激酶、肝素等；(6)一些中药制剂抑制成纤维细胞的增殖：如丹参、苦参碱、川芎和积雪苷等。

上述抗瘢痕和组织纤维化药物对过渡性瘢痕形成和组织纤维化的治疗具有一定的疗效，但也存在一些无法回避的问题，如5-氟尿嘧啶和丝裂霉素是很强的细胞有丝分裂抑制剂，毒副作用较大，可造成伤口不愈合等一些严重并发症；而针对TGF-β2的抑制剂是抗瘢痕和纤维化的研究热点，虽然其也可减轻瘢痕的形成和组织纤维化，但也存在明显不足，首先，其不能抑制TGF-β1和TGF-β3介导的瘢痕化和纤维化作用；其次，我们知道瘢痕形成和纤维化是多个细胞因子综合作用的结果，阻断单一细胞因子的生物学效应并不能达到彻底减少瘢痕形成和纤维化的目的；此外，如针对胶原等细胞外基质的合成与降解的药物，由于其不能消除细胞外基质合成的始动因素，以及阻滞成纤维细胞的增殖效应，其抗瘢痕和纤维化的作用也就受到了限制。综上所述，为了预防病理性瘢痕的形成和组织纤维化，必须以病理性瘢痕形成和组织纤维化的关键环节为突破口，寻找特异高效的抗瘢痕和纤维化药物。

伤口愈合是一个错综复杂的生物学过程，包括炎症产生、细胞增生、纤维组织增生和组织重塑(瘢痕形成)四个阶段。细胞因子在伤口愈合过程中占有非常重要的作用，参与伤口愈合的全过程，众多的细胞因子(TGF-β、PDGF、EGF、bFGF、IL-1、TNF等)形成网络，共同调控成纤维细胞等各种效应细胞的增生和代谢活动，维持胶原等细胞外基质沉积与降解之间的动态平衡，并对表皮细胞和血管内皮细胞的增殖、迁移和凋亡活动进行有秩序地调节。正性和负性的细胞因子在调节伤口愈合的过程中保持平衡状态，一旦平衡被打破，则会出现增生性瘢痕或不愈合等病理性愈合。比如，伴有过渡炎症反应的伤口，由于IL-1、IL-6等炎症因子大量分泌，造成细胞因子之间的平衡失调，最终导致增生性瘢痕的形成。

TGF-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是组织纤维化、创伤修复及瘢痕形成的关键调控分子之一。研究表明，活化的TGF-β可通过与细胞膜上具有丝/苏氨酸激酶活性的TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体结合，形成三聚体复合物，后诱导Ⅰ型受体磷酸化。磷酸化的Ⅰ型受体特异性地识别并磷酸化激活TGF-β信号通路的胞内信号分子-Smad蛋白家族中的受体调节型Smads(Receptor-regulated Smads，R-Smads)(包括Smad2和Smad3)，活化的R-Smads与Co-Smad(即Smad4)结合成为转录复合物，并进入细胞核内，直接与靶基因启动子或增强子内的一个回纹结构DNA序列(5′-GTCTAGAC-3′)顺式作用元件，即Smad结合元件(Smad-binding element，SBE)特异性结合，调节TGF-β反应性靶基因的转录和表达。已证实，许多参与伤口愈合和瘢痕形成的基因，如纤溶酶原激活剂抑制物-1(PAI-1)、血小板源性生长因子(PDGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、纤维结合素、Ⅰ型和Ⅲ型胶原等基因的增强子或启动子内，均含有SBE反应元件。Smad转录复合物可直接上调这些基因的转录和表达。另外，Smad转录复合物还可通过与AP-1(c-Fos和c-Jun)、FAST/FoxH、ATF2、VDR等DNA结合蛋白(即转录因子)结合，与这些转录因子的信号通路发生交互作用(Cross-talk)，以间接方式，调节TGF-β反应性基因的转录和表达，且这种间接方式是TGF-β信号通路的主要调节方式。研究发现，Smad3的抑制剂柚皮素(Naringenin)可明显减弱TGF-β诱导的鼠肝星形细胞合成I型胶原、纤维连接蛋白和PAI-1等细胞外基质的能力。此外，Smad3基因缺失小鼠肺泡纤维明显减少，肺泡腔呈现进行性扩大，且将TGF-β1转染入肺组织也不能诱导肺的纤维化。另外，值得注意的是，TGF-β信号通路除了通过Smad信号通路转导外，还可通过丝裂素蛋白活化激酶信号途径(MAPK)介导，活化AP-1等转录因子，调控靶基因的表达。

活化蛋白-1(activator protein-1，AP-1)是一类由Fos蛋白和Jun蛋白同源或异源二聚体组成的转录因子，能以许多基因启动子或增强子内顺式作用元件AP-1位点(5′-TGAGTGA-3′)，即佛波酯反应元件结合，参与介导多种与炎症、细胞增殖、组织纤维化和细胞外基质沉积等相关基因的转录和表达。在伤口愈合的过程中，许多细胞因子(TGF-β、PDGF、EGF、bFGF、IL-1、TNF等)都能通过MAPK信号通路激活AP-1，活化的AP-1进入细胞核内调节靶基因的表达。目前已证实，参与伤口愈合和瘢痕形成的许多基因，如TGF-β、IL-1β、IL-8、ICAM-1、丝状分裂控制蛋白-1(MCP-1)、细胞周期素D1、纤维连接蛋白、层粘连蛋白B、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)等基因的启动子或增强子内均含有AP-1位点，其可调控这些基因的转录和表达。抑制AP-1的信号通路，可明显减少增生性瘢痕的形成和组织纤维化。

综上所述，Smad信号通路和AP-1信号通路是两条与伤口愈合、瘢痕形成和组织纤维化关系最为密切的信号通路。Smad信号通路主要参与TGF-β诱导的应答反应，还可上调Ap-1的JunB亚基转录和表达，以及与c-Fos和c-Jun亚基结合，协助AP-1诱导与伤口愈合和瘢痕形成相关基因的表达。而AP-1信号通路则是许多刺激因素的共同信使传导分子，不仅介导伤口愈合早期的炎症反应相关基因的表达，还是伤口愈合和瘢痕形成相关基因的调控者。此外，AP-1是伤口愈合和瘢痕形成过程中信号放大效应的始动者，其可被TGF-β活化，而活化的AP-1又可上调TGF-β的表达，由此放大伤口愈合的信号。总之，Smad和AP-1两条信号通路相互协调，共同参与介导了伤口愈合和瘢痕的形成。由此，我们认为，如能同时成功抑制这两条信号通路，将能有效抑制伤口愈合过程中病理性瘢痕的形成和组织纤维化。目前，同时针对这两条信号通路的抑制剂国内外均未见报道。

从Smads和AP-1的活化途径不难看出，Smads和AP-1与靶基因启动子或增强子内的DNA顺式作用元件结合是特异性的，只有直接干预Smads和AP-1与DNA顺式作用元件相结合，才能达到真正意义上的特异性控制瘢痕的形成和组织纤维化，有效阻滞增生性瘢痕形成和组织纤维化过程中的信号放大效应和成纤维细胞的过度增殖，减少细胞外基质的过度合成，同时加强细胞外基质的降解速度。而对Smads和AP-1活化的上下游途径进行干预则难以达到这一目的。此外，在寻找阻断Smads和AP-1的活化策略时，应把握“适度抑制”原则，而不是“完全封闭/永久阻断”。故研制特异性的Smads和AP-1抑制剂(而不是阻断剂)将为最终获得高效、低副作用的理想抗瘢痕药物提供可能。而应用转录因子“诱骗”策略可达到同时拮抗Smads和AP-1活化的目的，且这一策略是实现这一理想治疗病理性瘢痕形成和组织纤维化的最佳选择之一。

自1996年第一个经美国FDA批准的转录因子E2F“诱骗”策略(decoy strategy)用于治疗血管旁路移植术后新生内膜增生(neointimal hyperplasia in vein bypass grafts)病人以来，许多研究已经报道了该策略作为体内基因治疗的效果。其基本原理是：合成与顺式作用元件相一致的双链寡聚脱氧核苷酸(被称为诱骗ODNs)，转染入细胞，竞争性抑制转录因子与顺式作用元件的结合，干扰转录因子的DNA结合活性及其后续基因的表达。由于该策略具有以下优点：(1)潜在的药物靶点(转录因子)；(2)诱骗ODNs的合成相对简单且可靶向特异的组织；(3)不必弄清转录因子靶分子的精确分子结构；(4)诱骗ODNs可阻断与同一顺式作用元件结合的多种转录因子的效应，且也可阻断同一转录因子所调控的多个靶基因的表达，其作用能力比反义ODNs更强。因此国外众多学者一致认为该策略可作为治疗某些人类疾病一种有效的手段。目前，有关单独靶向Smad或者AP-1的“诱骗”策略，已应用于探讨Smad和AP-1在癌症、心血管和肾脏等相关疾病中的作用机制，以及对这些疾病的治疗性研究，体外实验和动物试验结果已显示出确切而诱人的结果。这与该策略具有拮抗Smad或AP-1活性的特异性、竞争抑制性(不是完全阻断)、使用时间及剂量的可控性等特性有关。

为此，我们以介导瘢痕形成和组织纤维化的关键调控分子Smads和AP-1为靶点，应用核转录因子的诱骗策略，设计并合成可同时与Smad和AP-1结合，并具有同时抑制两种转录因子转录活性的双功能诱骗寡核苷酸，同时证实此寡核苷酸能高效抑制成纤维细胞的增殖，胶原的合成，有效阻止瘢痕的形成和组织纤维化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗瘢痕和组织纤维化的核酸药物。

本发明所述药物包含既能与AP-1高亲和结合的AP-1顺式作用元件，又能与Smad高亲和结合的Smad顺式作用元件的双链诱骗寡核苷酸。

其中，所述双链诱骗寡核苷酸包括核心序列TGACXTCAGACA或CAGACATGACXTCA或GTCTAGACTGACXTCA或其功能等价物，其中所述核苷酸序列中，X代表G或者缺失。

其中，所述双链诱骗寡核苷酸包括序列TGACGTCAGACA或TGACTCAGACA或其功能等价物。

其中，所述双链诱骗寡核苷酸包括序列CAGACATGACGTCA或CAGACATGACTCA或其功能等价物。

其中，所述双链诱骗寡核苷酸包括序列GTCTAGACTGACGTCA或GTCTAGACTGACTCA或其功能等价物。

优选的核酸，序列如下：ASCES101A：序列2；ASCES101B：序列3；ASCES101C：序列4；ASCES101D：序列5；ASCES102A：序列7和序列8；ASCES102B：序列9；ASCES103A：序列11和序列12；ASCES103B：序列13。

本发明是一系列序列特异的诱骗核酸，可特异性结合转录调控因子。本发明的药物通过下调smad和AP-1的转录活性，从而抑制成纤维细胞的过度增殖，以及细胞外胶原等基质的分泌，达到治疗病理性瘢痕和组织纤维化的目的。

为此，本发明另一个目的在于，本发明的核酸在制备抗AP-1和Smad转录活性的药物中的应用。所述抗AP-1和Smad转录活性的药物是治疗AP-1和Smad异常表达或活化引起的瘢痕化和组织纤维化相关疾病的药物；所述药物是治疗纤维化疾病、异常伤口愈合、异常骨生成、免疫/炎症相关疾病或抗青光眼滤过性手术后抗愈合的药物。

本发明的目的可通过以下措施来达到：

抗瘢痕和组织纤维化药物的设计是将转录因子特异结合的序列作为药物诱骗核酸的核心序列，并适当增加核心序列的侧翼长度，使其易形成空间结构，以加强药物的稳定性及与靶因子的亲和力。

药物ASCES101、ASCES102和ASCES103系列是为调控AP-1和Smads的过度活化而设计。将转录因子AP-1顺式作用元件和转录因子Smads顺式作用元件以不同的先后顺序融合成交错重叠的寡核苷酸TGA(C/G)TCAGACA(序列1)、CAGACATGACGTCA(序列6)和GTCTAGACTGACGTCA(序列10)，以这些寡核苷酸作为药物诱骗核酸的核心序列，竞争结合AP-1和Smads，抑制AP-1和Smads的转录活性，下调含AP-1和Smads增强子基因的表达，从而抑制成纤维细胞的增殖、生长和细胞外基质的分泌，达到治疗病理性瘢痕和组织纤维化的目的。例如：药物ASCES101A由30个核苷酸的序列2组成，含上述核心序列1，并能通过自身配对形成双链线性DNA结构。药物ASCES101B由28个核苷酸的序列3组成，含上述核心序列1，并能通过自身配对形成双链线性DNA结构。药物ASCES101C由44个核苷酸组成的序列4组成，含上述核心序列1，通过自身环化配对形成一个双链DNA发夹结构。药物ASCES101D由42个核苷酸组成的序列5形成，含上述核心序列1，通过自身环化配对形成一个双链DNA发夹结构。药物ASCES102A由24个核苷酸的序列7和8组成，含上述核心序列6，两个序列配对结合成双链线性DNA结构。药物ASCES102B由44个核苷酸的序列9组成，含上述核心序列6，通过自身环化成双链DNA发夹结构。药物ASCES103A由26个核苷酸组成的序列11和序列12组成，含上述核心序列10，两个序列配对结合成双链线性DNA结构。药物ASCES103B由46个核苷酸组成的序列13形成，含上述核心序列10，通过自身环化配对形成一个双链DNA发夹结构。总之，这些诱骗核酸药物，可以设计为以AP-1和Smads顺式作用元件交错形成的序列为核心序列，核苷酸总数为12-46个，并易形成线性、发夹、假结、茎环、哑铃等多种结构的双链寡聚DNA分子。

诱骗核酸药物经DNA全自动合成仪合成，硫代化，脱保护，纯化和冻干，溶于水中，定性定量测定分析后，进行体外筛选和药效试验，用L929成纤维细胞作为筛选体系，将细胞加入96孔培养板，用RPMI1640完全培养液培养24h后，加入脂质体和上述诱骗核酸，继续于37℃，5％CO₂中培养48h。用ATP生物素荧光法测定细胞的增殖。筛选结果表明8种诱骗核酸对L929细胞均有不同程度的抑制作用，其中ASCES101D的抑制作用最大。这些诱骗核酸均可开发成为抗瘢痕和组织纤维化药物。

具有上述核苷酸核心序列结构的寡聚诱骗DNA可同时与AP-1和Smads结合，并抑制AP-1和Smads与其顺式作用元件的结合，从而抑制AP-1和Smads的转录活性，即抑制AP-1和Smads调控各种含其顺式作用元件的靶基因表达。此种结构寡聚诱骗DNA既可以以DNA形式单独存在，也可与其它核酸和多肽融和，或被甲基化、硫代化、锁核酸化和硼烷磷酸酯化等修饰，或进行个别碱基的突变、缺失或替代，或与其它物质连接。无论以什么形式存在，含此结构DNA的物质可能表现出与AP-1和Smads结合，并抑制AP-1和Smads生物学活性的作用。

本发明通过细胞增殖试验筛选，获得的DNA不仅能够竞争性阻断AP-1与其顺式作用元件的结合，也能够抑制Smad与其顺式作用元件的结合，进而抑制含AP-1和Smads顺式作用元件的靶基因的表达，具有抗瘢痕和组织纤维化的功能，因而可以成为新的靶向AP-1和Smads的抗瘢痕和组织纤维化药物或药物前体。本发明的DNA可以用于治疗各种瘢痕和组织纤维化相关疾病。可以将其作为药物活性成分制备成药物组合物，该组合物根据需要可以加入一些药物可接受的载体，可以采用制剂学常规技术制备该组合物，本发明的组合物可以口服，也可以非胃肠道给药，优选的组合物是单位剂量的纳米型喷雾剂、注射剂和软膏形式。本发明的诱骗DNA可通过化学方式合成，也可将含此序列的核苷酸与其它核酸或多肽融合或进行化学修饰，用于抑制AP-1和Smads活性为目的的各种瘢痕相关疾病、各种纤维化疾病以及其它相关疾病的治疗，这对于设计和研制同时靶向AP-1和Smads的高效特异抗瘢痕和组织纤维化药物具有重要意义。

本发明的优点：

与反义核酸和siRNA相比，无论是作用机理还是作用效率，诱骗核酸均有着明显的差异：结构存在明显差异，反义核酸和siRNA为单链线性寡聚核酸，诱骗核酸是具有二级结构的双链DNA；作用位点也存在明显的差异，反义核酸和siRNA互补于靶基因的转录产物mRNA的某段序列，而诱骗核酸则直接结合于转录因子(蛋白质)上；另外，用量上也存在明显的差异，一个拷贝基因可转录出200-300条mRNA，且mRNA具有瞬时性，需要大量的反义核酸和siRNA才能达到抑制靶基因表达的目的。相反，一种转录因子可控制多种效应基因的转录，且可被循环利用转录生成多拷贝的效应基因mRNA，然而一个拷贝的转录因子仅需要一个拷贝诱骗分子即能封阻转录因子的活性，因此相对而言，诱骗核酸药的用量较反义核酸和siRNA的用量将少1-2个数量级。

值得注意的是，因诱骗核酸的核心序列一般在6-12个碱基对之间，链短易降解，双链不稳定，常温下易解链。而无二级空间结构的诱骗核酸则不易与转录因子蛋白结合，因此设计药物时需要适当增加碱基，加长链长，增强稳定性及与转录因子的亲和性，其中以回文结构、发夹、十字、茎环和哑铃状等结构最佳。本发明将靶向AP-1和Smads的诱骗核酸有机融合成一个核酸分子，如此一定程度上增加了诱骗核酸的长度，且这种长度的增加并不是为了增加诱骗核酸长度，进而添加无效核酸序列，而是在增加长度的同时，赋予了诱骗核酸的新功能。与若各自设计并合成AP-1和Smads的诱骗核酸，后将其混合成组合药相比，一方面减少了无效碱基的参入量，节约了药物合成的成本。另一方面又能避免两种诱骗核酸间可能相互交错配对形成无效二聚体，而降低诱骗核酸的效用。另外，本发明在设计上也充分考虑诱骗核酸的二级结构及其稳定性，因此诱骗核酸被设计成含有上述核心序列的14-46碱基之间，可合成出单链，自交形成双链及其二级结构，也可各合成两条单链，杂交形成双链。另外，因核酸在细胞内极易被核酸酶降解失去活性，因此需修饰保护，以增强其抗降解能力，提高稳定性。硫代修饰为最常见的保护基团。

本发明的另一目的是提供一种含有本发明诱骗核酸药物的药物组合物。

本发明的诱骗核酸药物可以将其作为药物活性成分制备成药物组合物，该组合物根据需要可以加入一些药物可接受的药用载体，制备成任何药用的剂型。其中，所述药物活性成分占制剂总重量的0.1-99.9％，所述药学上可接受的载体以重量计可以是制剂总重量的0.1-99.9％。所述药用载体包括生理盐水等常用载体和缓冲液、脂质体、聚合物等，可以采用制剂学常规技术制备该组合物。本发明的组合物可以口服，也可以非胃肠道给药，优选的组合物是单位剂量的纳米型喷雾剂、注射剂和软膏形式。本发明所述的靶向AP-1和Smad的诱骗核酸药物对纤维细胞的增殖、生长和胞外基质分泌均有抑制作用，在制造抗瘢痕和组织纤维化药物中具有广泛的应用价值及广阔的市场前景。

附图说明

图1为ASCES系列诱骗核酸对TGF-1和TGF-2诱导的L929成纤维细胞的生长抑制结果。

图2A为ELISA方法检测ASCES系列诱骗核酸对AP-1与其顺式作用元件结合竞争性抑制实验的结果。

图2B为ELISA方法检测ASCES系列诱骗核酸对Smad与其顺式作用元件结合竞争性抑制实验的结果。

表1为流式细胞仪检测ASCES系列诱骗核酸对TGF-1诱导的成纤维细胞细胞周期影响的实验结果

表2为流式细胞仪检测ASCES系列诱骗核酸对TGF-2诱导的成纤维细胞细胞周期影响的实验结果

图3A荧光素酶报告基因实验检测诱骗核酸对Ap-1反应性荧光素酶报告基因表达的抑制效应。

图3B荧光素酶报告基因实验检测诱骗核酸对Ap-1反应性荧光素酶报告基因表达的抑制效应。

具体实施方式

实施例1、诱骗核酸药物的制备和分析

合成八种下述硫代诱骗核酸药物：ASCES101A：序列2；ASCES101B：序列3；ASCES101C：序列4；ASCES101D：序列5；ASCES102A：序列7和序列8；ASCES102B：序列9；ASCES103A：序列11和序列12；ASCES103B：序列13。

阴性对照序列：正义：5′-TGTGGTCATGTGGTCATGTGGTCA-3′

              反义：5′-TGACCACATGACCACATGACCACA-3′

AP-1阳性对照序列：5′-TGACGTCATGACGTCATGACGTCA-3′

Smad阳性对照序列：正义：5′-ATGCAGACAATGCAGACAATGCAGACA-3′

                  反义：5′-TGTCTGCATTGTCTGCATTGTCTGCAT-3′

应用美国PE公司391型DNA合成仪，以亚磷酰胺固相合成法合成所设计的硫代诱骗核酸。主要原料有：四种二异丙基β-氰乙基亚磷酰胺单体：腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)和胸苷(T)；四种控制孔径玻璃粉(CPG)固相合成柱(A、G、C、T)。盖帽试剂分别为：乙酸酐/二甲基吡啶/四氢呋喃和1-甲基咪唑/四氢呋喃；硫代反应试剂：Beaucage试剂/乙腈；脱三苯甲基试剂：三氯乙酸/二氯甲烷；液体溶剂：乙腈和三氯甲烷。合成规模为10OD。碱基单体溶于无水乙腈中，浓度为100豪摩尔，其它试剂浓度及用量按照仪器操作手册进行。合成过程由仪器程序自动控制。合成产物置于装有29％浓氨水的密封耐压玻璃瓶中，于55℃处理15小时，脱去核酸分子上各种碱基保护基团和氨基保护基团。脱保护结束后，挥发脱去大部分氨气，冻干得白色粉末状粗制品，重溶于缓冲液中，用Pharmacia Source 30 Q层析及AKTA层析系统进行纯化。纯化样品经G-15分子筛葡聚糖凝胶层析柱除盐，后冻干得到白色絮状核酸纯品，储存于-20℃，并取少量样品进行纯度和分子量分析。用毛细管电泳法和高效液相层析法测其纯度及分子量，要求纯度均大于90％，DNA测序法测定序列完全正确，核磁共振法测硫代化程度大于98.5％。

实施例2、八种ASCES系列诱骗核酸对L929成纤维细胞的生长抑制

复苏并接种L929成纤维细胞于细胞培养瓶，在37℃、5％CO₂条件下，用含10％FBS的RPMI 1640完全培养液培养细胞；待细胞汇合至70％-80％时，胰酶消化细胞，活细胞计数后并将细胞浓度调整至2×10⁵个/ml；于96孔板以每孔100μL细胞悬液接种细胞，培养12小时；后更换成无血清培养液，将细胞随机分成空白对照组、阳性对照组、阴性对照组和八种ASCES药物组，且每组设3复孔，其中空白对照组仅加入0.6μl/孔脂质体，其余均加入0.6μl/孔脂质体和终浓度为100nM的不同诱骗核酸；转染5小时后，更换成含10％FBS的RPMI 1640完全培养液100μL，同时加入终浓度5ng/ml的TGF-β1或TGF-β2诱导细胞增殖，在37℃、5％CO₂条件下培养72h；每孔加入ATP提取液100μL，混匀后室温下放置30min，取50μL细胞提取液于检测板中，加入荧光素-荧光素酶50μL，混匀后置于荧光分析仪进行检测，测定每孔样品的荧光值。并计算细胞生长抑制率，作为诱骗核酸抑制L929细胞增殖的评价指标，细胞生长抑制率＝(空白对照组荧光值-药物组荧光值)/空白对照组荧光值。

细胞生长抑制实验结果表明，较随机诱骗核酸相比，本发明的八种ASCES序列药物以及AP-1和Smad阳性对照诱骗核酸均对L929细胞的生长均有明显的抑制作用，其中ASCES102A和ASCES102B对L929细胞的生长的抑制作用最强，明显强于AP-1和Smad阳性对照诱骗核酸，见图1。

实施例3、ELISA方法检测诱骗核酸对AP-1和Smad与其顺式作用元件结合的竞争 抑制实验

分别将10pmol的ASCES系列药物稀释于30μl完全结合缓冲液，并以每孔30μl量加入包被了Ap-1或Smad顺式作用元件的96孔酶联板(购自美国Active Motif公司的TransAM^TM Transcription factor assay kits)中；再将5μg TPA诱导的K-562细胞核抽提物(针对Smad则用TGF-β1诱导的L929成纤维细胞核抽提物)稀释于20μl完全结合缓冲液中，后依次加入96孔酶联板中混匀，室温孵育1h。注以3复孔进行各种样品的检测，实验分组如下：空白阴性对照仅加入不含ASCES药物和细胞核抽提物的50μl完全结合缓冲液；空白阳性对照则为加入不含ASCES药物，只含5μg核抽提物的50μl完全结合缓冲液；阴性对照则为加入同等浓度阴性对照诱骗核酸和5μg细胞核抽提物的50μl完全结合缓冲液；阳性对照则为加入同等浓度阳性对照诱骗核酸和5μg细胞核抽提物的50μl完全结合缓冲液；实验组则为加入含10pmol的ASCES系列药物，以及5μg细胞核抽提物的50μl完全结合缓冲液。以200μl/孔加入洗脱液洗涤3次，每次4min，去除洗涤液；以1∶500稀释度用抗体结合缓冲液稀释c-fos抗体或Smad3抗体，后以100μl/孔加入稀释的抗体，室温孵育1h；再以200μl/孔加入洗脱液洗涤3次，每次4min，去除洗涤液；以1∶1000稀释度用抗体结合缓冲液稀释羊抗兔IgG-HRP二抗，后以100μl/孔加入稀释的二抗，室温孵育1h；再以200μl/孔加入洗脱液洗涤4次，每次4min，去除洗涤液；以100μl/孔加入底物反应液，室温孵育2-20min，待阳性对照液变深蓝色后，以100μl/孔加入终止液终止反应；于450nm和655nm双波长检测OD值。ASCES系列药物对AP-1或Smad与其顺式作用元件结合的抑制百分数计算公式为：(空白阳性对照OD-ASCES药物OD)/空白阳性对照OD。

结果表明，与随机诱骗核酸对照相比，本发明的ASCES系列诱骗药物均能明显抑制AP-1的DNA结合活性。但对Smad的DNA结合活性的抑制作用，除ASCES102A和ASCES102B外，本发明的其它诱骗核酸对Smad的DNA结合活性虽也有一定的抑制作用，但抑制效应不甚明显，如图2A和2B所示。

实施例4、流式细胞仪检测诱骗核酸对成纤维细胞细胞周期的影响

将L929细胞以1×10⁵个/平板接种于6CM平板中，在37℃、5％CO₂条件下，用含10％FBS的RPMI 1640完全培养液培养细胞12小时；后更换成无血清培养液，将细胞随机分成空白对照组、阳性对照组、随机诱骗核酸对照组以及ASCES102A和ASCES102B药物组，且每组设3复孔，其中空白对照组仅加入12μl/孔脂质体，其余均加入12μl/孔脂质体和终浓度为100nM的不同诱骗核酸；转染5小时后，更换成含10％FBS的RPMI1640完全培养液，同时加入终浓度5ng/ml的TGF-β1或TGF-β2诱导细胞，在37℃、5％CO₂条件下培养24h；收获细胞，300g离心5min，弃上清，后将细胞团重悬于残留液体中；缓慢滴加200μl 70％的乙醇进行细胞固定，在滴加乙醇的同时注意旋涡震荡细胞。后将细胞于4℃放置30min；用2ml含2％BSA的PBS洗细胞一次，300g离心5min，弃上清，后将细胞团重悬于残留液体中；于细胞悬液中加入0.5ml的PI/Rnase溶液，混匀，分析前室温孵育15min。最后进行流式细胞仪分析。

如表1和表2显示，与随机诱骗核酸相比，AP-1阳性诱骗核酸、Smad阳性诱骗核酸、ASCES102A和ASCES102B药物处理的细胞，无论是TGF-β1还是TGF-β2诱导细胞均被明显阻滞于S期，特别是对TGF-β2诱导细胞阻滞效应最为明显。与AP-1和Smad的阳性诱骗核酸相比，ASCES102A和ASCES102B药物对细胞的阻滞效应得到明显的增强。相比较而言，虽没有统计学差异，ASCES102B药物对细胞的阻滞效应强于ASCES102A。

表1 诱骗核酸对TGF-β1诱导的L929细胞细胞周期的影响

表2 诱骗核酸对TGF-β2诱导的L929细胞细胞周期的影响

实施例5、诱骗核酸对AP-1和Smad反应性报告基因表达的抑制实验。

复苏并接种L929成纤维细胞于细胞培养瓶，在37℃、5％CO2条件下，用含10％FBS的RPMI 1640完全培养液培养细胞，待细胞汇合至70％-80％时，胰酶消化细胞，活细胞计数后并将细胞浓度调整至0.5×105个/mL；以1mL/孔或以0.5×105个细胞/孔细胞量将细胞接种于24孔培养板，继续用含10％FBS的RPMI 1640完全培养液培养12小时，后将培养液更换成无血清RPMI 1640培养液；取4μL Polyjet转染试剂加入100μL无血清1640培养基中，旋涡混匀，室温放置5min；取终浓度为100nM的诱骗核酸和0.3μg pAP-1-Luc报告质粒(针对Smad则用pSmad-Luc报告质粒)以及0.05μg pRL-TK海肾荧光素酶报告质粒一起加入到Polyjet/1640培养基混合物中，轻轻吹打混匀，室温放置5-15min；将上述转染混合物逐滴加入完全培养基中，轻轻震荡，使混合物和细胞充分混匀；在37℃，5％CO2培养条件下培养细胞，转染5h后，将培养基更换成含10％FBS的RPMI 1640完全培养液，同时加入TGF-β1和TGF-β2刺激细胞，于37℃，5％CO2条件下继续培养细胞24h后，弃细胞培养液，并用PBS洗涤细胞一次，去除PBS上清后，以100μl/孔量加入1×CCLR细胞裂解缓冲液，冰上放置5min，将细胞裂解液转移到1.5mL的EP管中，涡旋EP管10-15s，4℃，12000rpm离心2min，取上清，-70℃保存或直接检测荧光素酶的活性；取50μL细胞裂解上清转移于96孔检测板中，后再加入50μL/孔荧光素酶检测试剂后，立刻于化学发光检测仪采集数据，打印或记录保存数据，并进行分析。

结果表明，本发明的ASCES102A和ASCES102B药物对AP-1反应性荧光素酶报告基因和Smad反应性荧光素酶报告基因的表达均具有明显的抑制作用，其抑制效应与AP-1和Smad阳性诱骗核酸的抑制效应相当。相比较而言，虽无统计学差异，但ASCES102B的抑制效用好于ASCES102A，见图3A和3B。

Claims (7)

1.一种具有治疗作用的核酸，其特征在于，所述核酸序列如下：ASCES102A：序列7和序列8；ASCES102B：序列9。

2.权利要求1所述的核酸在制备抗AP-1和Smad转录活性的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗AP-1和Smad转录活性的药物是治疗AP-1和Smad异常表达或活化引起的瘢痕化和组织纤维化相关疾病的药物。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物是治疗纤维化疾病的药物。

5.一种含有权利要求1所述的核酸的药物组合物。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，含有药物可接受的载体。

7.一种权利要求1所述的核酸的制备方法，其特征在于，使用DNA合成仪合成。

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