CN1333693A - 抗原的有序分子呈递,制备及使用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供有序的和重复的抗原或抗原决定簇排列的组合物及生产方法。本发明的组合物对于传染病预防、过敏反应治疗和癌症治疗疫苗的生产有用。本发明的各种实施方案提供了一种由于特异性相互作用而以高度有序和重复的方式用任何期望的抗原包被的病毒、病毒-样颗粒、病毒衣壳颗粒、噬菌体或其重组形式。在一个特定的实施方案中,一种多用途的基于盒-类型系统(Alpha疫苗技术,甲疫苗技术)的新技术允许被抗原包被的病毒颗粒的生产。其它特定的实施方案允许被抗原包被的乙型肝炎病毒-样颗粒或被抗原包被的麻疹病毒-样颗粒的生产。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供包括一种有序的和重复的抗原或抗原决定簇排列的一种组合物。本发明还提供一种生产在有序的和重复的排列中的抗原或抗原决定簇的方法。有序的和重复的抗原或抗原决定簇,在传染病治疗、过敏反应治疗疫苗的生产中,以及作为一种预防或治疗癌和产生规定的自身特异性抗体的药用疫苗(pharmaccine)是有用的。
相关技术
传染病预防疫苗的发展已经对人类的健康发挥了医学发明的最大影响。据估计,全世界每年有三百万例死亡通过接种而被避免(Hillemann,天然医学分册(Nature Medicine)4:507(1998))。最常见的接种策略—使用减毒(也就是说,毒性较低)的病原体或密切相关的生物体,最初由Edward Jenner在1796年作出证明,他通过给药一种危险较低的牛痘病毒来接种抗天花。虽然许多活减毒病毒(例如麻疹、腮腺炎、风疹、水痘、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒)和细菌(例如抗肺结核的卡介苗(BCG))被成功地给药用于接种,但是存在发展与毒性回复以及被“疫苗”生物体感染相关的严重并发症的危险,特别是在无免疫应答的个体中。
现在利用重组DNA技术(也就是说,遗传工程),通过产生缺失或突变变体,能够进行减毒病毒的特异性设计。例如,已经证明给药一种具有nef基因内部缺失的工程猴免疫缺陷病毒(SIV),将保护短尾猿抗致病性SIV菌株的继发性感染(Daniel等,科学(Science)258:1938-1941(1992))。然而,在给药减毒SIV的动物中,获得性免疫缺陷综合症(AIDS)一样症状的进展,提出了安全性忧虑(Babe等,科学(Science)267:1820-1825(1995))。
作为备选的方法,减毒的病毒或细菌可以作为那些被认为太不安全以致不能以减毒的形式给药的病原体的抗原编码基因的载体(例如,人免疫缺陷病毒(HIV))。一旦抗原编码基因被投递给宿主,此抗原就在原位合成。牛痘及相关的禽痘病毒已经在临床前及临床研究中被用作各种基因的载体(例如,Shen等,科学(Science)252:440(1991))。这种接种策略的一个不利之处是:它不能模拟病毒粒子的表面,因为重组蛋白在宿主细胞的表面表达。此外,正如威胁生命的散布性牛痘感染所证明的一样,在无免疫应答的个体中可能会发展并发症(Redfield,新英格兰医学杂志(N.Eng.J.Med.)316:673((1998))。
第四种接种方法涉及病原体的分离成分的使用,这些成分或者从体外培养的病原体纯化(例如,流感病毒凝集素或神经氨酸酶),或者在异源表达单个病毒蛋白之后纯化(例如,乙肝表面抗原)。例如,重组的、突变的毒素(已解毒)用于接种,抗白喉、破伤风、霍乱和百日咳毒素(Levine等,New generation vaccines,2nd edn.,MarcelDekker,Inc.,New York),并作为一种诱导抗HIV的中和抗体的手段对HIV重组蛋白(gp120和全长的gp160)做了评价,结果令人失望(Connor等,病毒学杂志(J.Virol.)72:1552(1998))。最近,用可溶性寡聚gp160获得了有希望的结果,这种寡聚gp160能够诱导CTL应答,并且引起具有中和活性的抗HIV-1分离物的抗体(Van Cortt等,病毒学杂志(L.Virol.)71:4319(1997))。此外,在其中将已知的抗原B-或T-细胞表位偶联到设计要通过刺激T-细胞辅助作用而增强此表位的免疫原性的载体分子上的肽疫苗,也可使用。然而,这种方法的一个重要问题是:总体上,它提供一个针对此蛋白的有限的免疫应答。而且,必须为不同的MHC单倍型单独设计疫苗。这类疫苗的最严重的忧虑是:保护性抗病毒抗体识别这些肽所不能模拟的复杂的三维结构。
一种更新的接种策略是DNA疫苗的使用(Donnelly等,免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)15:617(1997)),这种策略可以产生MHC-I限制性CTL应答(不使用活载体)。这种策略可通过将与相同病毒的许多毒株有关的保守性内部蛋白的表位作为靶位,提供抗一种病毒之不同毒株的更广泛的保护作用。因为所生产的蛋白具有哺乳动物的翻译后修饰、构象和寡聚反应,所以它更可能与病毒感染所产生的野生型蛋白相似或相同,而不是更可能与重组或化学修饰的蛋白相似或相同。然而,这种差别可能成为应用细菌抗原的不利之处,因为非天然的翻译后修饰可能导致免疫原性的降低。此外,病毒表面蛋白在缺少基质蛋白的条件下不是高度有组织的。
除了传染病预防的应用之外,疫苗技术现在正被用来解决与过敏反应相关的免疫问题。在过敏性个体中,IgE同种型的抗体在对特定抗原(过敏原)的不当体液免疫应答中产生。利用过敏反应免疫疗法对过敏反应进行治疗,必需每周给药持续地增大的剂量的特定过敏原长达3-5年时间。可能是产生了在过敏原与肥大细胞上的IgE抗体反应之前就在鼻或呼吸分泌液或在膜中截取过敏原的“封闭性”IgG抗体。然而,在IgG滴度和症状减轻之间不存在恒定的关系。目前,这是一种极其耗费时间和成本的方法,仅被考虑用于患有严重症状每年超过一段被延长的时期的患者。
非常确定的是:单独给药纯化的蛋白通常不足以引起一个强的免疫应答;分离的抗原通常必须与被称为佐剂的辅助物质一起给药。在这些佐剂中,已给药的抗原避免了快速降解,而佐剂提供抗原的一个低水平的膨胀-释放。
不同于分离的蛋白,病毒在缺乏任何佐剂的条件下无论有或没有T-细胞辅助,都诱导迅速而有效的免疫应答(Bachmann & Zinkernagel,免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)15:235-270(1997))。虽然病毒通常含有少数蛋白,但是它们能够触发比其分离成分强烈得多的免疫应答。对于B细胞应答,已知病毒免疫原性的一个至关紧要的因子,是表面表位的重复性和有序性(Bachmann & Zinkernagel,今日免疫学(Immunol.Today)17:553-558(1996))。许多病毒呈现准晶体表面,此表面呈现一个有效交联B细胞上表位-特异性免疫球蛋白的表位的规则排列。这种B细胞表面免疫球蛋白的交联,是一个直接诱导细胞周期进展和IgM产生的强活化信号。进一步地,这些被激活的B细胞能够活化辅助T细胞,这些活化的辅助T细胞然后又诱导B细胞中从IgM到IgG抗体生产的转变,以及长寿的记忆B细胞——这是接种的目标(Bachmann & Zinkernagel,免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)15:235-270(1997))。病毒的结构甚至与自身免疫疾病中抗-抗体的产生相联系,并作为对病原体天然应答的一部分(参见Fehr,T.,等,实验医学杂志(J.Exp.Med.)185:1785-1992(1997))。因此,病毒颗粒上组织在一个有序的和重复的排列中的抗原,具有高度免疫原性,因为它们能直接活化B细胞。
除了强的B细胞应答之外,病毒颗粒还能诱导细胞毒性T细胞应答的产生,这是免疫系统的另一个重要途径。这些细胞毒性T细胞对于非细胞病变性病毒,例如HIV或乙型肝炎病毒的消除,以及肿瘤的根除是特别重要的。细胞毒性T细胞不识别天然的抗原,而是识别它们的与MHCI类分子结合的降解产物(Townsend & Bodmer,免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)7:601-624(1989))。巨噬细胞和树突状细胞能够摄取和加工外源的病毒颗粒(而不是它们的可溶性分离成分),并将所产生的降解产物呈递给细胞毒性T细胞,导致其活化和增殖(Kovacsovics-Bankowski等,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:4942-4946(1993);Bachmann等,欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)26:2595-2600(1996))。
病毒颗粒作为抗原,相对于其分离成分表现出两个优势:(1)因为它们高度重复的表面结构,它们能够直接活化B细胞,产生高抗体滴度和持久的B细胞记忆;和(2)是病毒颗粒而不是可溶性蛋白,能够诱导细胞毒性T细胞应答,即使是病毒颗粒没有传染性而且缺乏佐剂。
数种新的疫苗策略使用病毒的固有的免疫原性。一些这样的方法集中于病毒颗粒的特定性质;例如,参见Harding,C.V.和Song,R.(免疫学杂志(J.Immunology)153:4925(1994)),公开了一种由乳胶珠子和抗原所组成的疫苗;Kovacscovics-Bankowski,M.,等,(美国国家科学院院刊(Proc.Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:4942-4946(1993)),公开了一种由氧化铁珠子和抗原所组成的疫苗;Kossovsky,N.,等的美国专利5,334,394号,公开了用抗原包被的核心颗粒;美国专利5,871,747号,公开了表面携带一个或多个共价结合于其上的蛋白的合成聚合物颗粒;和一个至少部分覆盖所说颗粒的表面、具有一个非共价结合的包被的核心颗粒,以及至少一个与所说的被包被的颗粒接触的生物活性物质。(例如,参见WO/94/15585)。
然而,这些病毒模拟系统的一个不利之处是:它们不能再造在病毒表面所发现的有序的抗原呈递。已经发现,以随机取向偶联到一个表面上的抗原诱导CTL应答,而没有或仅有微弱的B-细胞应答。对于一种有效的疫苗,免疫系统的两条途径都必须被强烈活化,正如上面及Bachmann & zinkernagel,免疫学年评(Ann.Rev.Immunol.)15:235(1997)所述。
在另一个实例中,重组病毒被用于抗原投递。已经发现,含有一种被融合到衣壳蛋白的抗原的丝状噬菌体病毒,是高度免疫原性的(参见Perham R.N.,等,欧洲微生物学会微生物学评论(FEMS Microbiol.Rev.)17:25-31(1995);Willis等,基因(Gene)128:835-844(1995))。然而,当融合蛋白以高水平表达时,此系统限制于非常小的肽(5或6个氨基酸残基)(Iannolo等,分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)248:835-844(1995)),或者限于大蛋白的低水平表达(de laCruz等,生物化学杂志(J.Biol.Chem.) 263:4318-4322(1998))。对于小肽,到目前为止仅观察到CTL应答,而没有或仅有微弱的B-细胞应答。
在又一个系统中,重组甲病毒被推荐作为一种抗原投递手段(参见美国专利5,766,602号;5,792,462号;5,739,026号;5,789,245号和5,814,482号)。到目前为止,所描述的重组病毒系统的问题,包括异源蛋白在病毒表面低密度表达和/或成功而重复地为不同的用途创造新而且不同的重组病毒的困难。
在一个进一步的发展中,病毒-样颗粒(VLP),因为它们的结构性质以及它们没有传染性的性质,正被用于疫苗生产领域。VLP是按对称方式,用许多一种或多种类型的蛋白分子构建的超分子结构。它们缺乏病毒基因组,因此没有传染性。VLP常可通过异源表达而大量生产,并且容易纯化。
VLP的实例包括乙型肝炎病毒(Ulrich,等,病毒研究(Virus Res.)50:141-182(1998)),麻疹病毒(Warnes,等,基因(Gene)160:173-178(1995)),辛德比斯病毒、轮状病毒(美国专利5,071,651和5,374,426号),口蹄疫病毒(Twomey等,疫苗(Vaccine)13:1603-1610,(1995)),诺沃克病毒(Jiang,X.,等,科学(Science)250:1580-1583(1990);Matusui,S.M.,等,临床研究杂志(J.Clin.Invest.) 87:1456-1461(1991))的衣壳蛋白,逆转录病毒GAG蛋白(PCT专利申请号WO96/30523),逆转录转座子Ty蛋白p1,乙肝病毒表面蛋白(WO92/11291)和人乳头瘤(WO98/15631)。在一些实例中,可以利用重组DNA技术将异源蛋白融合到一种VLP蛋白上(Kratz,P.A.,等,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)96:19151920(1990))。
因此,在本领域中有开发与天然的病原体同样有效地促进强烈的CTL和B细胞免疫应答的新的改进的疫苗的需要。
发明概括
本发明提供一种允许生产用所期望的抗原包被的颗粒的多用途的新技术。本技术允许抗传染病的高效疫苗的创造,以及过敏反应和癌症治疗疫苗的创造。
在第一个实施方案中,本发明提供一种包括(A)一种非天然的分子支架和(B)一种抗原或抗原决定簇的新组合物。
非天然的分子支架包括(i)一种核心颗粒,选自(1)非天然起源的核心颗粒(2)天然起源的核心颗粒;以及(ii)一种组织者,包括至少一个第一结合位点,其中所说的组织者通过至少一个共价键连接到所说的核心颗粒上。
此抗原或抗原决定簇具有至少一个第二结合位点,选自(i)一种非天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起出现的结合位点;和(ii)一种天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起出现的结合位点。
本发明通过将第二结合位点经过至少一个非-肽键结合到第一结合位点上提供一种有序的和重复的抗原排列。因此,抗原或抗原决定簇及非天然的分子支架通过这种第一和第二结合位点之间的结合被集合到一起,形成一种有序的和重复的抗原排列(assay)。
在另一个实施方案中,前面所提及的组合物的核心颗粒包括一种病毒、病毒-样颗粒、噬菌体、病毒衣壳颗粒或其一种重组形式。备选地,核心颗粒可以是一种合成聚合物或一种金属。
在一个特定的实施方案中,组织者可包括至少第一结合位点。第一和第二结合位点是本发明的组合物的特别重要的元件。在本发明的各种实施方案中,第一和/或第二结合位点可以是抗原和其抗体或抗体片段;生物素和亲合素;链亲合素和生物素;受体及其配基;配基结合蛋白及其配基;相互作用的亮氨酸拉链多肽;氨基及其化学反应基团;羧基及其化学反应基团;巯基及其化学反应基团;或其组合。
在一个更加优选的实施方案中,本发明提供几乎任何所选择的抗原与一种病毒、噬菌体、病毒-样颗粒或病毒衣壳颗粒之间的偶联。通过将一种抗原组织成一种准晶体的“病毒-样”结构,本发明利用宿主强烈的抗病毒免疫反应来产生一种抗所显示抗原的高度有效的免疫应答,也就是说,接种。
在一个优选的实施方案中,核心颗粒可以选自:轮状病毒的重组蛋白、诺沃克病毒的重组蛋白、甲病毒的重组蛋白、口蹄疫病毒的重组蛋白、逆转录病毒的重组蛋白、乙型肝炎病毒的重组蛋白、烟草花叶病毒的重组蛋白、Flock House Virus的重组蛋白,以及人乳头瘤病毒的重组蛋白。
在另一个优选的实施方案中,抗原可选自:(1)一种适于诱导抗癌症细胞免疫应答的蛋白;(2)一种适于诱导抗传染病免疫应答的蛋白;(3)一种适于诱导抗过敏原免疫应答的蛋白;(4)一种适于在家畜中诱导免疫应答的蛋白。
在本发明的一个特别优选的实施方案中,第一结合位点和/或第二结合位点包括一条相互作用的亮氨酸拉链多肽。在最优选的实施方案中,第一结合位点和/或第二结合位点选自:(1)JUN亮氨酸拉链蛋白结构域;和(2)FOS亮氨酸拉链蛋白结构域。
在另一优选的实施方案中,该第一结合位点和/或第二结合位点选自:(1)遗传工程赖氨酸残基和(2)遗传工程半胱氨酸残基,可化学连接在一起的两个残基。
本发明的其它实施方案包括本发明的组合物的生产方法及一种使用所说的组合物进行医学治疗的方法。
应该理解:以上的一般描述和以下的详细描述仅仅是示例性和解释性的,并且意欲提供所要求保护的发明的进一步解释。
附图简述
图1.Western印迹,证明利用pCYTs∷E2JUN表达载体进行含有E2-JUN融合蛋白的病毒颗粒的生产。
图2.Western印迹,证明自pTE5’2J∷E2JUN表达载体表达的含有E2-JUN融合蛋白的病毒颗粒的生产。
图3.Western点印迹,证明细菌及真核表达的FOS-hgh抗原。
图4.HBcAg-JUN在大肠杆菌细胞中的表达。
图5.Western印迹,证明HBcAg-JUN在大肠杆菌裂解物中是可溶
的。
图6.HBcAg-JUN衣壳颗粒在蔗糖密度梯度上富集的SDS-PAGE分析。
图7.hGH-FOS与HBcAg-JUN颗粒偶联的非还原SDS-PAGE分析。
优选实施方案的详述1.定义
提供以下定义来阐明发明人认为是本发明的主题。
甲病毒:当在本文使用时,术语“甲病毒”是指包括在甲病毒属(the genus Alphavirus)内的任何RNA病毒。该属成员的描述包括在Strauss和Strauss,微生物评论(Micro.Rev.),58:49-562(1994)中,甲病毒的实例包括Aura virus(奥拉病毒),Bebaru virus,Cabassou Virus,Chikungunya virus(基孔贡亚病毒),Easter equineencephalomyelitis virus(东部马脑脊髓炎病毒),Fort morganVirus,Getah Virus(盖塔病毒),Kyzylagach virus,Mayoaro virus,Middleburg Virus,Mucambo virus,Ndumu virus,Pixuna virus,Tonate virus,Triniti virus,Una virus(乌纳病毒),Western equineencephalomyelitis virus(西部马脑脊髓炎病毒),Whataroa virus,Sindibis Virus(SIN)(辛德比斯病毒),Semliki virus(SFV)(塞姆利基森林病毒),Venezuelan equine encephalomyelitisVirus(VEE)(委内瑞拉马脑脊髓炎病毒),Ross River virus。
抗原:当在本文使用时,术语“抗原”是一种能够被抗体结合的分子。抗原还能够诱导产生B-和/或T-细胞的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。抗原可具有一个或多个表位(B-和T-表位)。以上所提及的特异性应答,意在说明,抗原将会以高度选择性的方式与其对应抗体反应,而不会与其它抗原所激发的其它大量抗体反应。
抗原决定簇:当在本文使用时,术语“抗原决定簇”是指一种抗原上能被B或T淋巴细胞特异识别的部分。B淋巴细胞通过产生抗体对外源的抗原决定簇应答,而T淋巴细胞介导细胞免疫。因此,抗原决定簇或表位是抗原上被各种抗体识别的或者是在MHC的背景下被T细胞受体识别的那些部分。
结合:当在本文使用时,术语“结合”当它用于第一和第二结合位点时,是用来指至少一个非-肽键。结合的实质可以是共价的、离子的、疏水的、极性的、或者其任何组合。
结合位点,第一:当在本文使用时,术语“第一结合位点”是指“组织者”的一种元件,它自身按随机的方式结合到核心颗粒上,定位在抗原或抗原决定簇的第二结合位点可以结合到其上。第一结合位点可以是蛋白、多肽、肽、糖、多聚核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢产物或化合物(生物素、荧光素、维生素A、地高辛配基、金属离子、苯甲基磺酰氟),或其一种组合,或其一种化学反应基团。多个第一结合位点以重复的构型存在于非天然的分子支架的表面。
结合位点,第二:当在本文使用时,术语“第二结合位点”是指一种与抗原或抗原决定簇结合的元件,定位于非天然的分子支架表面上的“组织者”的第一结合位点可以结合到其上。抗原或抗原决定簇的第二结合位点可以是蛋白、多肽、肽、糖、多聚核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢产物或化合物(生物素、荧光素、维生素A、地高辛配基、金属离子、苯甲基磺酰氟),或其中一种组合,或其中一种化学反应基团。抗原或抗原决定簇上存在至少一个第二结合位点。
核心颗粒:当在本文使用时,术语“核心颗粒”是指提供“组织者”结合的基础、具有固有的重复性组织的刚性结构。核心颗粒当在本文使用时,可以是合成过程的产物,或者是生物过程的产物。
顺式作用:当在本文使用时,“顺式作用”序列是指复制酶通过与其结合从而催化RNA分子的RNA依赖性复制的核酸序列。这些复制事件导致全长及部分RNA分子的复制,因而,甲病毒亚基因组启动子也是“顺式作用”序列。顺式作用序列,可以定位在或接近于一个核酸分子的5′端、3′端,或两端,以及定位在其内部。
融合:当在本文使用时,术语“融合”是指不同来源的氨基酸序列,通过其编码核酸序列的符合阅读框的组合,在一条多肽链中的组合。术语“融合”明确包括内部融合,也就是说,除了融合到它的一个末端之外,不同起源的序列在一条多肽链内部的插入。
异源序列:当在本文使用时,术语“异源序列”是指存在于本发明的载体中的另一个核苷酸序列。术语“异源序列”还指由本发明的一种载体中所含有的一个异源DNA序列所编码的任何氨基酸或RNA序列。异源核酸序列可以编码通常在其所存在的细胞类型表达的蛋白或RNA分子,或者在其中通常不表达的分子(例如,辛德比斯病毒结构蛋白)。
分离的:当在本文使用时,当术语“分离的”用来指一种分子时,此术语是指被从其天然环境中移出的分子。例如,天然存在于活动物中的多聚核苷酸或多肽不是“分离的”,但是从天然状态的共存的物质中分离出的相同的多聚核苷酸或多肽是“分离的”。进一步地,就本发明而言,一种载体中所含有的重组DNA分子被认为是“分离的”。分离的RNA分子包括DNA和RNA分子体内或体外的RNA复制产物。分离的核酸分子进一步包括合成生产的分子。另外,重组宿主细胞中所含有的载体分子也是分离的。因此,不是所有“分离的”分子都需要纯化。
免疫治疗剂:当在本文使用时,术语“免疫治疗剂”是一种治疗疾病或紊乱的组合物。更明确地,此术语用来指一种过敏反应治疗方法或一种癌症治疗方法。
个体:当在本文使用时,术语“个体”是指多细胞生物体,并且包括植物和动物,更优选地是脊椎动物,甚至更优选地是哺乳动物,最优选地是人。
低或不可检测的:当在本文使用时,术语“低或不可检测的”,当它用来指基因表达水平时,是指显著低于该基因被最大诱导时所看到的表达水平的表达水平(例如,至少低5倍),或者是利用以下实施例部分所用的方法不容易检测到的表达水平。
植物凝集素:当在本文使用时,不仅特别地从豆科植物的种子获取,也从许多其它植物和动物来源获取,具有特定的单糖或寡糖的结合位点的蛋白。实例包括在糖蛋白的研究中被广泛用作分析和制备试剂的伴刀豆球蛋白A和麦芽凝集素。
天然起源:当在本文使用时,术语“天然起源”是指全部或其部分不是合成的,而是在自然界中存在或产生的。
非天然的:当在本文使用时,此术语一般是指并不是来自于自然界,更明确的,此术语是指来自于人工。
非天然起源:当在本文使用时,术语“非天然起源”一般是指合成的而不是来自于自然界;更明确地,此术语是指来自于人工。
非天然的分子支架:当在本文使用时,术语“非天然的分子支架”是指作用是用来提供第一结合位点的一种刚性的和重复的排列的利用人工制造的任何产物。理想的而不是必要地,这些结合位点成几何级。非天然的分子支架,其全部或者部分,可以是有机的或者无机的,并可以是化学合成的或者是生物合成的。非天然的分子支架由以下组成(a)一种核心颗粒,是天然起源的或者非天然起源的;及(b)一种组织者,自身包括至少一个第一结合位点,并通过至少一个共价键结合到一种核心颗粒上。在一个特别优选的实施方案中,非天然的分子支架可以是病毒、病毒样颗粒、病毒衣壳颗粒、噬菌体、其中一种重组形式或合成颗粒。
有序的和重复的抗原或抗原决定簇排列:当在本文使用时,术语“有序的(ordered)和重复的抗原或抗原决定簇排列”一般是指一种以抗原或抗原决定簇关于支架的统一的空间排列为特征的、抗原或抗原决定簇的重复模式。在本发明的一个实施方案中,重复模式可以是几何模式。一种理想的有序的和重复的抗原或抗原决定簇排列,将拥有一种间距为5到15纳米的抗原或抗原决定簇的严格重复的类晶体秩序。
组织者:当在本文使用时,术语“组织者”用来指一种以非随机的方式结合到核心颗粒上的为创造一种有序的和重复的抗原排列提供成核位点的元件。组织者是包括至少一个通过至少一个共价键结合到一种核心颗粒上的第一结合位点的任何元件。组织者可以是蛋白、多肽、肽、氨基酸(也就是说,一种蛋白、多肽或肽的一个残基)、糖、多聚核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢产物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、地高辛配基、金属离子、苯甲基磺酰氟),或其一种组合,或其一种化学反应基团。
允许温度:当在本文使用时,术语“允许温度”是指一种酶在此温度下具有相对高水平的催化活性的温度。
纯化的:当在本文使用时,当术语“纯化的”用来指一种分子时,它的意思是被纯化的分子的浓度相对于在其天然的环境中与其相关的分子已被提高。天然相关的分子包括蛋白、核酸、脂和糖,但是一般不包括水、缓冲液,以及被加入以维持正在纯化的分子的完整性或帮助正在纯化的分子的纯化的试剂。例如,即使mRNA在寡脱氧胸苷酸(oligo dT)层析期间被一种水性溶剂稀释了,如果天然相关的核酸和其它生物分子不结合到柱子上,而是与所研究的mRNA分子分离,那么mRNA分子就可以利用这种层析方法纯化。
受体:当在本文使用时,术语“受体”是指能与另一种被称为配基的分子相互作用的蛋白或糖蛋白或其片段。配基可以属于任何种类的生化或化学化合物。受体不必是膜结合蛋白。可溶性蛋白,例如,麦芽糖结合蛋白或视黄醇结合蛋白也是受体。
残基:当在本文使用时,术语“残基”意在指多肽主链或侧链中的一个特定的氨基酸。
温度敏感:当在本文使用时,术语“温度敏感”是指一种酶在一个温度容易地催化一种反应,但在另一种温度缓慢地催化同样的反应或根本不催化这种反应。温度敏感性酶的一个实例是由pCYTts载体所编码的在低于34℃的温度有容易检测到的复制酶活性而在37℃具有低的或不可检测的活性的复制酶蛋白。
转录:当在本文使用时,术语“转录”是RNA聚合酶催化从DNA模板生产RNA分子。
重组宿主细胞:当在本文使用时,术语“重组宿主细胞”是指向其中导入了本发明的一种或多种核酸分子的宿主细胞。
重组病毒:当在本文使用时,术语“重组病毒”是指一种利用人工被遗传修饰过的病毒。此术语包括本领域中公知的任何病毒。更特定地,术语是指通过人工被遗传修饰过的甲病毒,最特定地,此术语是指被人工遗传修饰过的辛德比斯病毒。
限制性温度:当在本文使用时,术语“限制性温度”是指一种酶在此温度具有低或不可检测的水平的催化活性的温度。“热”和“冷”敏感的突变体都是公知的,因此,一种限制性温度可以低于或高于允许温度。
RNA依赖性RNA复制事件:当在本文使用时,术语“RNA依赖的RNA复制事件”是指使用一种RNA分子作为模板,导致一种RNA分子形成的方法。
RNA依赖性RNA聚合酶:当在本文使用时,术语“RNA依赖性RNA聚合酶”是指催化从一种RNA分子生产另一种RNA分子的聚合酶。此术语在这里与术语复制酶”同义使用。
非翻译的RNA:当在本文使用时,术语“非翻译的RNA”是指一种不编码开放阅读框,或编码开放阅读框或其部分、但却是按照一种不会产生氨基酸序列的方式(例如,不存在启始密码子)的RNA序列或分子。这些分子的实例是tRNA分子、rRNA分子,和核酶。
载体:当在本文使用时,术语“载体”是指一种用来将遗传物质转移进宿主细胞的物质。载体可以包括DNA或RNA。
一(one,a或an):当术语“一”被用于本公开时,它们的意思是“至少一种/个”或“一种/个或多种/个”,除非另有说明。2.有序的和重复的抗原或抗原决定簇排列的组合物以及制备同样的组合物的方法
所公开的发明提供包括一种有序的和重复的抗原或抗原决定簇的组合物。进一步地,本发明方便地使实施者能够构建用于包括传染病预防、过敏反应治疗及癌症治疗的各种治疗目的的、有序的和重复的抗原或抗原决定簇排列。
本发明的组合物基本上包括两个元件:(1)一种非天然的分子支架;及(2)具有至少一个能够通过至少一个非-肽键结合到所说的第一结合位点上的所说的第二结合位点的抗原或抗原决定簇。
非天然的分子支架包括(a)一种核心颗粒,选自(1)一种非天然起源的核心颗粒和(2)一种天然起源的核心颗粒;及(b)一种包括至少一个第一结合位点的组织者,其中所说的组织者通过至少一个共价键连接到所说的核心颗粒上。
抗原或抗原决定簇具有至少一个第二结合位点,选自(a)一种非天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起出现的的结合位点;(b)一种天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起出现的结合位点。
本发明通过第二结合位点与第一结合位点之间经过至少一个非-肽键的结合而规定一种有序的和重复的抗原排列。因此,抗原或抗原决定簇和非天然的分子支架通过第一和第二结合位点间的结合而被集合到一起,形成一种有序的和重复的抗原决定簇排列。
实施者可以特定地设计抗原或抗原决定簇及第二结合位点,从而使所有结合到非天然的分子支架上的抗原或抗原决定簇的排列是相同的。例如,可以将单个第二结合位点放置在抗原或抗原决定簇的羧基端或氨基端,从而通过设计确保所有结合到非天然的分子支架上的抗原或抗原决定簇分子按照均一的方式安排位置。因此,本发明提供一种方便的、按规定的秩序和重复性将任何抗原或抗原决定簇放置于一种非天然的分子支架的手段。
如同本领域的熟练人员会清楚的一样,本发明的特定实施方案涉及重组核酸技术,例如克隆、聚合链式反应、DNA和RNA纯化,重组蛋白在原核及真核生物细胞中表达等技术的使用。这些方法对于本领域的熟练人员是公知的,可以方便地在已公开的实验室方法手册中找到(例如,Sambrook,J.等编,分子克隆实验室手册(MolecularCloning,A Laboratory Manual)2nd edition,Cold Spring HarborPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989);Ausubel,F.等,当代分子生物学操作(CURRENT PROTOCALS IN MOLECULAR BIOLOGY),JohnH.Wiley & Sons,Inc.(1997)。组织培养细胞系的基本实验室技术(Celis,J.ed.,细胞生物学(CELL BIOLOGY),Academic Press,2ndedition(1998)及基于抗体的技术(Harlow,E.和Lane,D.“抗体:实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)”,Cold SpringHarbor,N.Y.(1988);Deutscher,M.P.,蛋白质纯化指导(Guideto Protein Purification)”,酶学方法(Meth.Enzymol.),128,Academic Press San Diego(1990);Scopes,R.K.,“蛋白质纯化原理与实践(Protein Purificaton Principles and Pratice)”,3rdediton,Springer-Verlag,New York(1994))在文献中也有充分阐述,所有这些均作为参考文献完整地并入本发明。A. 非天然的分子支架的构建
在本发明的组合物的一种元件是一种包括一种核心颗粒和一种组织者的非天然的分子支架。当在本文使用时,术语“非天然的分子支架”是指任何作用是提供第一结合位点的一种刚性的重复的排列的、人工生产的产物。更明确地,非天然的分子支架包括(a)一种核心颗粒,选自(1)一种非天然起源的核心颗粒,及(2)一种天然起源的核心颗粒;以及(b)一种包括至少一个第一结合位点的组织者,其中所说的组织者通过至少一个共价键连接到所说的核心颗粒上。
正如本领域的熟练人员所显而易见的,本发明的非天然分子支架的核心颗粒不限定于任何特定形式。核心颗粒,可以是有机的或者非有机的,并可以是化学合成的或通过生物过程合成的。
在一个实施方案中,一种非天然的核心颗粒可以是一种合成聚合物、脂微胶粒或一种金属离子。这样的核心颗粒在本领域是公知的,这为用它来构建本发明的新的非天然的分子支架提供了基础。举例来说,在美国专利5,770,380号中描述了合成聚合物或金属核心颗粒,此专利公开了连接到一种“抗体模拟物”的发明中的许多肽环上的一种calixarene有机支架的使用,而美国专利5,334,394号描述了由许多种包括金属、陶瓷在内的无机材料组成的用作病毒引诱物的纳米晶体(nanocrystalline)颗粒。本实施方案中优选的金属包括铬、铷、铁、锌、硒、镍、金、银及铂。本实施方案中优选的陶瓷材料包括二氧化硅、二氧化钛、氧化铝、氧化铷及氧化锡。本实施方案的核心颗粒可以用包括碳(钻石)在内的有机材料制造。优选的聚合物包括聚苯乙烯、尼龙及硝基纤维素。对于这种纳米晶体颗粒,用氧化锡、二氧化钛或碳(钻石)制造的颗粒是特别优选的。一种脂微胶粒可以利用本领域之中任何公知的方法制备。例如微胶粒可以根据Baiselle和Millar的方法制备(Baiselle,C.J.和Millar,D.B.,生物物理化学(Biophys.Chem.)4:355-361(1975))或Corti等(Corti,M.,Degriorgio,V.,Sonnino,S.,Ghidoni R.,Masserini,M.和Tettamanti,G.,脂肪化学物理学(Chem.Phys.Lipids)38:197-214(1981))或Lopez等(Lopez,O de 1a Maza,A.,Coderch,L,Lopez-Iglesias,C.,Wehrli,E.和Parra,J.L.,欧洲生物化学联合会快报(FEBS Lett.)426:314-318(1998))或Topchieva和Karezin(Topchieva,I.,和Karazezin,K.,J.,胶体界面科学(Colloid Interface Sci.)213:29-35(1999))或Norein等,(Morein,B.,Sundquist,B.,Hoglund,S.,Dalsgaard K.和Osterhaus,A.,天然(Nature)308:457-60(1984)),这些文章在此作为参考文献并入本发明。
核心颗粒还可以通过生物过程制备,可以是天然的或者非天然的。举例来说,这种类型的实施方案可以包括一种包括一种病毒、病毒-样颗粒、噬菌体、病毒衣壳颗粒或其一种重组形式的核心颗粒。在一个更加特定的实施方案中,核心颗粒可以包括轮状病毒的重组蛋白、诺沃克病毒的重组蛋白、甲病毒的重组蛋白、口蹄疫病毒的重组蛋白、逆转录病毒的重组蛋白、乙型肝炎病毒的重组蛋白、烟草花叶病毒的重组蛋白、Flock House Virus的重组蛋白及人乳头瘤病毒的重组蛋白。
无论是天然的还是非天然,本发明的核心颗粒以包括通过至少一个共价键结合到天然的或非天然的核心颗粒的组织者为特征。此组织者是一种按照非随机方式结合到一种核心颗粒上的、为创造一种有序的和重复的排列提供一个成核位点的元件。理想地但不是必要地,组织者按几何秩序(geometric order)与核心颗粒结合。最低限度地,组织者包括一个第一结合位点。
如前所述,组织者可以是任何包括至少一个通过至少一个共价键结合到一种核心颗粒的第一结合位点的元件。组织者可以是蛋白、多肽、肽、氨基酸(也就是说,一种蛋白、多肽或肽的一个残基)、糖、多聚核苷酸、天然或合成聚合物,次级代谢产物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、地高辛配基、金属离子、苯甲基磺酰氟),或其一种组合,或其一种化学反应基团。在一个更加特定的实施方案中,组织者可以包括一个包括抗原,抗体或其抗体片段、生物素、亲合素、链亲合素、受体、受体配基、配基、结合配基的蛋白、相互作用的亮氨酸拉链多肽、氨基、与氨基反应的化学基团;羧基、与羧基反应的化学基团、巯基、与巯基反应的化学基团,或其一种组合的第一结合位点。
在优选的实施方案中,非天然的分子支架的核心颗粒包括一种病毒、噬菌体、病毒-样颗粒、病毒衣壳颗粒或其一种重组形式。具有有序的和重复的包被和/或核心蛋白结构的本领域中所公知的任何病毒可以被选作本发明的非天然支架;合适的病毒的实例包括:辛德比斯病毒及其它甲病毒;水泡性口炎病毒;弹状病毒-,(例如水泡性口炎病毒),细小核糖核酸病毒-,披膜病毒-,正粘病毒-,polyoma-,微细小病毒、轮状病毒、诺沃克病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒、烟草花叶病毒、Flock House virus、人乳头瘤病毒、(例如,参见Bachman,M.F.,和Zinkernagel,R.M,当代免疫学(Immunol.Today)17:553-558(1996)中的表1)。
在一个实施方案中,本发明利用一种病毒的遗传工程,创造一种有序的和重复的病毒包膜蛋白与一种包括异源蛋白、肽、抗原决定簇或所选的反应性氨基酸残基的组织者之间的融合。其它为本领域中人员所公知的遗传操作可以包括在非天然支架的构建中;例如,可能期望通过遗传突变来限制重组病毒的复制能力。选择用来与组织者(也就是说,第一结合位点)蛋白融合的病毒蛋白应该具有一种有组织的重复的结构,更优选地,在此病毒表面优化地具有5-15nm间距类晶体组构。这种融合蛋白的创造将在此病毒表面产生多个有序的和重复的组织者。因此,由此所产生的第一结合位点的、有序的和重复的组构将反映此天然病毒蛋白的正常组构。
正如将要更加深入地进行讨论的一样,在本发明的一个优选实施方案中,支架是一种重组甲病毒,更加明确地,是一种重组辛德比斯病毒。甲病毒是一种在被感染细胞的细胞浆内完整地复制其基因组RNA而且没有DNA中间体的正链RNA病毒(Strauss,J.和Strauss,E.,微生物学评论(Microbiol.Rev.)58:491-562(1994))。数种甲病毒科成员、辛德比斯病毒(Xiong,C.等,科学(Science)243:1188-1191(1989);Schlesinger,S.,生物技术趋势(TrendsBiotechnol.)11:18-22(1993)),塞姆利基森林病毒(SemlikiForest Virus)(Liljestrm,P.,& Garoff,H.,生物技术(Bio/Technology)9:1356-1361(1991))及其它病毒(Dayis,N.L.等,病毒学(Virology)171:189-204(1989)),作为各种以病毒为基础的、各种不同蛋白的表达载体(Lundsrom,K.,当代生物技术评论(Curr.Opin.Biotechnol.)8:578-582(1997);Liljestrom K.,当代生物技术评论(Curr.Opin.Biotechnol.)5:495-500(1994)及作为疫苗开发的候选者已受到相当关注。最近,许多专利已经被颁布,针对甲病毒用于异源蛋白表达和疫苗开发的用途(参见美国专利5,766,602号;5,792,462号;5,739,026号;5,789,245号及5,814,482号)。本发明的甲病毒支架的构建,可以利用重组DNA技术领域中公知的方法完成,正如上述文章所描述的一样,在此作为参考文献将这些文章并入本发明。
可以使用各种不同的重组宿主细胞来生产以病毒为基础的用于抗原或抗原决定簇结合的核心颗粒。例如,公知甲病毒有广泛的宿主范围;辛德比斯病毒感染培养的哺乳动物、爬行动物及两栖动物细胞,以及一些昆虫细胞(Clark,H.,国立癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.)51:645(1973);Leake,C.,普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)35:335(1997);Stollar,V.,in囊膜病毒(THE TOGAVIRUS),R.W.SCHLESINGER,ed.,Academic Press,(1980),pp583-621)。因此,许多重组宿主细胞可以用于本发明的实施。BHK、COS、Vero、HeLa及CHO细胞特别适合异源蛋白的生产,因为(它们)具有按照与人细胞相似的方式糖基化异源蛋白的潜力(Waston,E.等,糖生物学(Glycobiology)4:227,(1994)),并且可被选择(Zang,M.等,生物技术(Bio/Technology)13:389(1995))或遗传设计(Renner W.等,生物技术生物工程(Biotech.Bioeng)4:476(1995);Lee K.等生物技术生物工程(Biotech.Bioeng.)50(1996))从而在无血清培养基和悬液中培养。
将多聚核苷酸载体导入宿主细胞可以利用标准的实验室手册中所描述的方法来实施(例如,参见Sambrook,J.,等,分子克隆:实验室手册(MOLECULAR CLONING:A LABRORORY MANNUAL)2nd edition,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998),Chapter 9;及Ausubel,F.,等,当代分子生物学操作手册,eds.,CURRUNT PROTOCALS In MOLECULAR BIOLOGY,John H.Wiley & Sons,Inc(1997),Chapter 16),包括这些方法,例如电穿孔、DEAE-右旋糖苷介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂-介导的转染、转导、刮伤加载(scrape loading)、冲击导入(ballisticintroduction)及感染。Felgner,P.等,在美国专利5,580,859号中讨论了将外源DNA序列导入宿主细胞的方法。
包装的RNA序列也能用来感染宿主细胞。可通过将这些包装的RNA序列加入培养基而将其导入宿主细胞。例如,在许多来源包括“辛德比斯病毒表达系统”,Version C,(Invitrogen Catalog No.K750-1)在内,描述了没有感染性的甲病毒颗粒的制备。
当哺乳动物细胞被用作生产以病毒为基础的核心颗粒的重组宿主细胞时,这些细胞通常在组织培养中培养。培养细胞的方法在本领域中是公知的(例如,参见Celis,J.,ed.,CELL BIOLOGY,AcademicPress,2nd edition,(1998);Sambrook,J.,等,分子克隆:实验室手册(MOLECULAR CLONING:A LABRORORY MANNUAL.2nd edition,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998),Chapter 9);及Ausubel,F.,等,ed.s,当代分子生物学操作手册,(CURRUNT PROTOCALS In MOLECULAR BIOLOGY,John H.Wiley & Sons,Inc(1997));Freshney,R.,动物细胞培养(CULTURE OFANIMAL CELLS),Alan R.Liss,Inc.(1983))。
正如本领域的人员将会理解的一样,第一结合位点可以是任何合适的、能够将所选的抗原或抗原决定簇特异性地结合到支架上的蛋白、多肽、糖,多核苷酸肽(氨基酸)、天然或合成聚合物、次级代谢产物,或其一种组合或其一部分。在一个实施方案中,结合位点是选自本领域中所公知的物质的蛋白或肽。例如,第一结合位点可以选自:配基、受体、植物凝集素、亲合素、链亲合素、生物素、表位,例如HA或T7标记(T7 tag)、Myc、Max、免疫球蛋白结构域以及在本领域中所公知的能够用作第一结合位点的其它任何氨基酸序列。
本领域中的人员可以进一步理解,利用本发明的另一个实施方案,第一结合位点可继生于在构建与衣壳蛋白符合阅读框的融合中所使用的组织者(例如,蛋白或多肽)。例如,一种蛋白可被用来与具有已知按照特定方式被糖基化的氨基酸序列的包膜蛋白融合,然后,结果所加上的糖部分(moiety)可以通过结合到作为抗原的第二结合位点的植物凝集素上,从而在病毒支架的第一结合位点发挥作用。或者,组织者序列可以在体内被生物素化,生物素部分可以作为本发明的第一结合位点,或者组织者序列可以受到不同氨基酸残基的体外化学修饰,这种修饰作为第一结合位点。
本发明的一个特定的实施方案使用辛德比斯病毒。辛德比斯病毒RNA基因组被包装进包围着一个含有三种被称为E1、E2和E3的蛋白的脂双层的衣壳蛋白中。这些所谓的包膜蛋白是糖蛋白,被糖基化的部分在脂双层的外部,在这里,这些蛋白的复合物形成在电子显微照片中可见的从病毒表面向外突出的“刺突”。在本发明的一个优选实施方案中,第一结合位点选择是符合阅读框地与E2包膜蛋白融合的JUN或FOS亮氨酸拉链蛋白结构域。然而,本领域的所有人员都将清楚的是,其它的包膜蛋白可以被用于将第一结合位点定位到本发明的支架上的融合蛋白构建体。
在本发明的一个最优选的实施方案中,第一结合位点选择是符合阅读框地与乙型肝炎病毒衣壳(核心)蛋白融合的JUN-FOS亮氨酸拉链蛋白结构域。然而,对本领域的所有人员都将清楚的是,其它病毒衣壳蛋白可被用于将第一结合位点定位到本发明的支架上的融合蛋白构建体。
在本发明的另一个优选实施方案中,第一结合位点选择是符合阅读框地与肝炎核心(衣壳)蛋白融合的赖氨酸或半胱氨酸残基。然而,对本领域的所有人员都将清楚的是,其它病毒衣壳或病毒-样颗粒可被用于将第一结合位点定位到本发明的支架上的融合蛋白构建体。
提供实施例1,说明使用Hahn等(美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad. Sci.USA)89:2679-2683(1992))的pTE5′2J载体构建辛德比斯病毒E2包膜蛋白和JUN亮氨酸拉链蛋白结构域之间符合阅读框的融合蛋白。用于第一结合位点的JUN氨基酸序列如下:CGGRIARLEEKVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQLKQKVMNHVGC(第59号序列(SEQ ID NO:59))。在这个实例中,抗原上预期的第二结合位点将是FOS亮氨酸拉链蛋白结构域,而氨基酸序列将会是如下的序列:CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC(第60号序列)。
这些序列从转录因子JUN和FOS衍生而来,每个在侧翼都具有在两端含有一个半胱氨酸残基的短序列。已知这些序列彼此相互作用。JUN-FOS二聚体的最初假定的结构设想了一个单体的疏水性侧链与另一个单体相应的侧链以拉链的方式交错对插(Landschulz等,科学(Science) 240:1759-1764(1998))。然而,这种假设证明是错误的,已知这些蛋白形成α-螺旋卷曲螺旋(α-helix coiled coil)(O′Shea等,科学(Science) 243:538-542(1989));Cohen & Parry,生物化学科学趋势(Trends Biochem.Sci.)11:245-248(1986)),因此,术语“亮氨酸拉链”经常用来指这些蛋白结构域,更多地是因为历史原因而不是结构原因。贯穿本发明之中地,术语“亮氨酸拉链”用于指以上所描述的序列,以及与以上所描述的序列基本相似的序列。术语JUN和FOS被用于分别的亮氨酸拉链结构域,而不是整个JUN和FOS蛋白。
在一个实施方案中,本发明提供使用pCYTts表达系统(美国专利申请,申请号60/79,562;申请日:1998年3月27日)生产辛德比斯病毒E2-JUN支架。PCYTts表达系统提供了允许在真核细胞中进行基因表达的严谨控制的新表达载体。本系统的DNA载体被转录,从而形成RNA分子,然后此RNA分子又被一种温度敏感型复制酶复制从而形成额外的RNA分子。复制所产生的RNA分子含有一个可以被翻译从而产生感兴趣的蛋白或者编码一个或多个不被翻译的RNA分子的核苷酸序列。因此,此表达系统可以进行重组辛德比斯病毒颗粒的生产。
实施例2提供了本发明的E2-JUN辛德比斯病毒(sinbis)非天然的分子支架生产的细节。另外在实施例3中还提供了另一种使用实施例1中所产生的pTE5′2JE2:JUN载体生产重组E2-JUN辛德比斯病毒支架的方法。因此本发明提供了两种方法—pCYTts表达系统(实施例2)和pTE5′2J载体系统(实施例3)—利用这些方法可以生产重组辛德比斯病毒E2-JUN非天然的分子支架。在图1和图2中证明了在各系统中所产生的病毒颗粒的分析。
如前所述,本发明包括一种以病毒为基础的、包括一种病毒、病毒-样颗粒、噬菌体、病毒衣壳颗粒或其一种重组形式的核心颗粒。熟练的技术人员具有生产这样的核心颗粒以及将其与组织者结合的知识。通过提供其它实施例,本发明在此提供了作为核心颗粒的乙型肝炎病毒-样颗粒及麻疹病毒衣壳颗粒的生产(实施例17到22)。在这样的一个实施方案中,JUN亮氨酸拉链蛋白结构域或FOS亮氨酸拉链蛋白结构域可被用作组织者,从而作为本发明的非天然的分子支架的第一结合位点。
实施例23-29提供分别作为第一和第二结合位点的、携带与一个反应性赖氨酸残基符合阅读框地融合的肽的乙型肝炎核心颗粒,和携带遗传上融合的半胱氨酸残基的抗原的生产的细节。B. 具有第二结合位点的抗原或抗原决定簇的构建
本发明的组合物的第二个元件是一种拥有至少一个能够通过至少一个非-肽键结合到非天然的分子支架的第一结合位点的第二结合位点的抗原或抗原决定簇。本发明提供了根据考虑所期望的治疗效果所选择的抗原或抗原决定簇而变化的组合物。其它组合物通过变化为第二结合位点所选择的分子来提供。
本发明的抗原可选自:(a)适于诱导抗癌细胞免疫应答的蛋白;(b)适于诱导抗传染病免疫应答的蛋白;(c)适于诱导抗过敏原免疫应答的蛋白,及(d)适于在家畜动物中诱导免疫应答的蛋白。
在本发明的一个特定的实施方案中,抗原或抗原决定簇是对传染病预防有用的抗原或抗原决定簇。这样的治疗方法对于治疗大量影响范围广泛的宿主,例如人、奶牛、羊、猪、狗、猫、其它物种哺乳动物以及非-哺乳动物的传染病将会是有用的。可以治疗的疾病对本领域中熟练人员是公知的,这些实例包括病毒性感染,例如HIV、流感、疱疹、病毒性肝炎、Epstein Bar,脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘,等;或细菌性感染,例如肺炎、肺结核、梅毒,等;或寄生虫性感染,例如疟疾、锥虫病、利什曼病、trichomoniasis、阿米巴病,等。因此,为本发明的组合物所选择的抗原或抗原决定簇对于医学领域的人员将会是公知的;抗原或抗原决定簇的实例包括:HIV抗原gp140和gp160;流感病毒抗原红细胞凝集素和神经胺酸酶;乙型肝炎表面抗原、疟疾的环子孢子蛋白。
在另一个特定的实施方案中,本发明的组合物是可以用于过敏反应或癌症治疗的免疫治疗剂。
用于治疗过敏反应的组合物及方法的抗原或抗原决定簇的选择对于医学领域中治疗这样的疾病的熟练人员是公知的;这种类型的抗原或抗原决定簇的代表性实例包括:蜂毒磷脂酶A2、BetvI(桦木花粉过敏原(birch pollen allergen))、5Dol m V(white-faced hornetvenom a1lergen)、Der p I(House dust mite allergen)。
用于癌症治疗的组合物及方法的抗原及抗原决定簇的选择对于医学领域中治疗这样的疾病的熟练人员是公知的;这种类型的抗原或抗原决定簇的代表性实例包括:Her2(乳腺癌)、GD2(成神经细胞瘤)、EGF-R(恶性成胶质细胞瘤)、CEA(甲状腺髓样癌)、CD52(白血病)。
在本发明的一个特别的实施方案中,抗原或抗原决定簇选自:(a)HIV的一种重组蛋白,(b)流感病毒的一种重组蛋白,(c)丙型肝炎病毒的一种重组蛋白,(d)弓形虫的一种重组蛋白,(e)恶性疟原虫的一种重组蛋白,(f)间日疟原虫的一种重组蛋白,(g)卵形疟原虫的一种重组蛋白,(h)三日疟原虫的一种重组蛋白,(i)乳腺癌细胞的一种重组蛋白,(j)一种肾癌细胞的重组蛋白,(k)一种前列腺癌细胞的重组蛋白,(l)皮肤癌细胞的一种重组蛋白,(m)脑癌细胞的一种重组蛋白,(n)白血病细胞的一种重组蛋白,(o)一种重组的profiling,(p)蜂螫(bee sting)过敏反应一种的重组蛋白,(q)坚果过敏反应的一种重组蛋白,(r)食物过敏反应的一种重组蛋白、哮喘的重组蛋白及衣原体的一种重组蛋白。
一旦选定本组合物的抗原或抗原决定簇,在准备要构建与本发明非天然的分子支架结合的、有组织的重复的排列时,可以给此分子加上至少一个第二结合位点。什么将会构成一个适合的第二结合位点的知识对于本领域的熟练人员将会是公知的。第二结合位点的代表性实例包括,但是不限制于:抗原、抗体或其抗体片段、生物素、亲合素、链亲合素、受体、受体的配基、配基、配基结合蛋白、相互作用的亮氨酸拉链多肽、氨基、与氨基反应的化学基团、羧基、与羧基反应的化学基团、巯基、与巯基反应的化学基团,或其一种组合。
第一和第二结合位点之间的结合将利用所选择的各个分子的特征来确定,但是,将会包括至少一个非肽-键。决定于第一和第二结合位点之间的组合,结合的实质可以是共价的、离子的、疏水的、极性的,或其组合。
在本发明的一个实施方案中,第二结合位点可以是FOS亮氨酸拉链蛋白结构域或JUN亮氨酸拉链蛋白结构域。
在最具体的实施方案中,所选的该第二结合位点是FOS亮氨酸拉链蛋白结构域,FOS亮氨酸拉链蛋白结构域与本发明的非天然的分子支架的JUN亮氨酸拉链蛋白结构域特异性地结合。JUN和FOS亮氨酸拉链蛋白结构域之间的结合提供了一个在此支架表面形成有组织的重复的抗原或抗原决定簇排列的基础。FOS亮氨酸拉链蛋白结构域可以符合阅读框地与所选的抗原或抗原决定簇在氨基端、羧基端融合,或者如果希望的话定位于蛋白质内部。
出于示范意图,提供数个FOS融合构建体。人生长激素(实施例4)、蜂毒磷脂酶A2(PLA)(实施例9)、卵清蛋白(实施例10)和HIVgp140(实施例12)。
为了简化FOS融合蛋白构建体的生成,公开了数种载体为抗原或抗原决定簇的设计和构建提供选择的载体(参见实施例6)。载体pAV1-4是为FOS融合蛋白在E.coli中表达而设计的;载体pAV5和pAV6是为FOS融合蛋白在真核细胞中表达而设计的。这些载体的性质简述如下:
1.pAV1:此载体是为将FOS位于C-末端的融合蛋白分泌到E.coli周质间隙而设计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以连接到此载体的Stu I/Not I位点。
2.pVA2:此载体是为将FOS位于N-末端的融合蛋白分泌到E.coli周质间隙而设计的。感兴趣(g.o.i)的基因可以连接到此载体的Not I/EcoRV位点(或Not I/HindIII)。
3.pAV3:此载体是在E.coli中细胞质生产FOS位于C-末端的融合蛋白而设计的。感兴趣(g.o.i)的基因可以连接到此载体的EcoRV/Not I位点。
4.pAV4:此载体是在E.coli中细胞质产生FOS位于N-末端的融合蛋白而设计的。感兴趣(g.o.i)的基因可以连接到此载体的Not I/EcoRV位点(或Not I/HindIII)。基于蛋白质被合成即通过蛋白质水解除去N-末端的甲硫氨酸残基(Hirel等,美国国家科学院院刊(ProcNatl.Acad Sci.USA)86:8247-8251(1989)).
5.pAV5:此载体是为FOS位于C-末端的融合蛋白的真核生产而设计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以通过将其连接到此载体的EcoR47III/Not I位点而插入编码hGH信号序列及FOS结构域的序列之间。或者,一种含有其自身信号序列的基因,可以通过连接到Stu I/Not I位点而融合到FOS编码序列。
6.pAY6:此载体是为N一末端具有FOS的融合蛋白的真核生产而设计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以连接到此载体的Not I/Stu I(或NotI/HindIII)位点。
正如本领域的熟练人员将会理解的,一种FOS-抗原或抗原决定簇融合蛋白的构建可以包括便于重组蛋白生产的特定遗传元件的加入。实施例4为特定的E.coli转录调控元件的加入提供指导,实施例7为真核信号序列的加入提供指导。其它遗传元件可根据实施者的特定需要而加以选择。
还可见本发明包括FOS-抗原或FOS-抗原决定簇融合蛋白在细菌(实施例5)或真核细胞(实施例8)中的生产。选择在何种细胞类型中表达此融合蛋白是熟练技术人员知识之内的事情,取决于这些因子,例如翻译后修饰在此组合物的设计中是否是一项重要的考虑。
正如先前提到的,本发明公开各种通过使用pAY载体构建FOS-抗原或FOS-抗原决定簇融合蛋白的各种方法。除了能进行原核和真核表达之外,这些载体允许实施者选择-和C-末端加入到FOS亮氨酸拉链结构域的抗原。提供了特定实施例,其中将-和C-末端FOS融合进行到PLA(实施例9)及卵清蛋白(实施例10)上。实施例11说明PLA和卵清蛋白融合蛋白的纯化。
在一个最特定的实施方案中,本发明描述一种由HIV基因组所编码的抗原或抗原决定簇。更特别的,此HIV抗原是gp140。正如实施例11-15中所提供的一样,可以创造HIV gp140,具有FOS亮氨酸拉链结构域和为结合本发明的非天然的分子支架所合成和纯化的融合蛋白。正如本领域的熟练人员将会知道的,其它HIV抗原或抗原决定簇可被用于本发明的组合物的创造。
在本发明的一个最特定的实施方案中,所选择的第二结合位点是一个半胱氨酸残基,此半胱氨酸残基特异性地结合本发明的非天然的分子支架的赖氨酸残基。赖氨酸残基(Lys)与半胱氨酸(Cys)的化学结合提供了一个在支架的表面形成有组织的重复的抗原或抗原决定簇排列的基础。半胱氨酸残基可以符合读框地改造到所选抗原或抗原决定簇,在氨基端、羧基端的或者如果期望的话位于此蛋白的内部。例如,提供PLA和HIVgp140用于连接到赖氨酸残基第一结合位点的半胱氨酸残基。
C.甲疫苗(AlphaVaccine)颗粒的制备
本发明提供有序的和重复的抗原排列的新组合物和构建方法。正如本领域的熟练人员将会知道的一样,有序的和重复的抗原排列的组装条件在很大程度上取决于非天然支架的第一结合位点的特定选择及抗原或抗原决定簇的第二结合位点的特定选择。因此,在此组合物设计中实施者的选择(也就是说,第一及第二结合位点、抗原及非天然支架的选择)将会决定甲疫苗(AlphaVaccine)颗粒(有序的和重复的抗原排列及所结合非天然的分子支架)组装的特定条件。与甲疫苗(AlphaVaccine)颗粒组装有关的信息正好属于实施者的工作知识之内,而且存在许多参考资料帮助实施者(例如,参见Sambrook,J.,等,编著的分子克隆:实验室手册第2版(MOLECULAR CLONING:ALABRORORY MANNUAL.2nd edition),Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998);及Ausubel,F.,等,当代分子生物学操作手册(CURRUNT PROTOCALS In MOLECULAR BIOLOGY),John H.Wiley & Sons,Inc.(1997);Celis,J.编著,细胞生物学(CELL BIOLOGY),Academic Press,2nd edition(1998);及Harlow,E.和Lane,D.“抗体:实验室手册(Antibodies:A LaboratoryManual)”,Cold Spring Harbor,N.Y.)(1988)),所有这些文献在此作为参考文献并入本发明。
在一个特定实施方案中,分别将JUN和FOS亮氨酸拉链蛋白结构域用于本发明的第一和第二结合位点。在AlphaVaccine(甲疫苗)的制备中,抗原必须在促进有序的和重复的抗原排列到非天然支架之上的条件下生产和纯化。在这个特别的JUN/FOS亮氨酸拉链蛋白结构域实施方案中,FOS-抗原或FOS-抗原决定簇应该用还原剂(例如二硫苏糖醇(DTT))进行处理从而减少或消除二硫键形成的发生率(实施例15)。
对于JUN/FOS亮氨酸拉链蛋白结构域实施方案的非天然支架(也就是说,重组辛德比斯病毒)的制备,重组E2-JUN病毒颗粒应该浓缩、中和并用还原剂处理(实施例16)。
在这个JUN/FOS实施方案中有序的和重复的抗原排列的组装,是在存在redox shuffle的存在下完成的。E2-JUN病毒颗粒与240倍摩尔过量的FOS-抗原或FOS-抗原决定簇在4℃结合10小时。随后,AlphaVaccine(甲疫苗)颗粒通过层析方法浓缩及纯化(实施例16)。
在另一个实施方案中,非天然的分子支架偶联到抗原或抗原决定簇上可以通过化学交联来完成。在一个最优选的实施方案中,化学试剂是异双功能交联试剂,例如ε-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Tanimori等,药物药效学杂志(J.Phar.Dyn.)4:812(1981);Fujiwara等,免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)45:195(1981)),此酯含有(1)与氨基反应的琥珀酰亚胺基团和(2)与SH基团反应的马来酰亚胺基团。第一结合位点的一种异源蛋白或多肽可以加工成含有一个或多个作为此异双功能交联试剂的琥珀酰亚胺部分的反应部分的赖氨酸残基。一旦被化学偶联到非天然的分子支架的第一结合位点上,此异双功能交联试剂的马来酰亚胺基团将可与抗原或抗原决定簇上半胱氨酸残基的SH基团反应。在这个实例中,抗原或抗原决定簇制备可能需要将半胱氨酸加工到被选为第二结合位点的蛋白或多肽中,从而使其可以与结合到非天然的分子支架第一结合位点的交联试剂上自由的马来酰亚胺功能反应。
C.组合物、疫苗及其给药,与治疗的方法
在一个实施方案中,本发明提供在广泛的物种,特别是哺乳动物例如人、猴、奶牛、狗、马、猪等当中预防传染病的疫苗。可以设计疫苗来治疗病毒性感染,例如HIV、流感、疱疹、病毒性肝炎、EpsteinBar、脊髓灰质炎、病毒性脑炎、麻疹、水痘等;或细菌性传染病,例如肺炎、肺结核、梅毒等;或寄生虫性感染,例如疟疾、锥虫病、利什曼病、滴虫病、阿米巴病等。
在另一个实施方案中,本发明提供在广泛的物种,特别是哺乳动物例如人、猴、奶牛、狗、马、猪等当中预防癌症的疫苗。可以设计疫苗来治疗所有类型癌症:淋巴溜、细胞癌、肉瘤、黑色素瘤等。
在本发明的又一个实施方案中,本发明的组合物可用于治疗过敏反应的疫苗的设计。IgE同种型的抗体是过敏反应中的重要成分。肥大细胞在其表面结合IgE抗体,而且一旦特异性抗原结合到结合在肥大细胞表面的IgE抗体,就释放组织胺和其它的过敏反应介质。因此,抑制IgE抗体的生产,是一个有希望的抗过敏反应的靶。通过获得一种期望的T辅助细胞应答,这应该是可能的。T辅助细胞应答可以分成1型(TH1)和2型(TH2)辅助细胞应答(Ramagnani,当代免疫学(Immunol.Today)18:263-266(1997))。TH1细胞分泌干扰素-γ及其它触发B细胞产生IgG1-3抗体的细胞因子。相反地,TH2细胞所分泌的一种至关重要的细胞因子是IL-4,此细胞因子驱使B细胞产生IgG4及IgE抗体。在许多实验系统中,TH1和TH2应答的发展是相互排斥的,因为TH1细胞抑制TH2细胞的诱导,反之亦然。因此,触发强烈TH1应答的抗原同时抑制TH2细胞应答的发展,以及IgE抗体的产生。有趣地,事实上所有的病毒在宿主中诱导TH1应答而不能触发IgE抗体的产生(Coutelie等,实验医学杂志(J.Exp.Med.)165:64-69(1987))。此同种型模式并不仅仅限定于活病毒,在灭活的或重组病毒颗粒上也被观察到(Lo-Man等,欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)28:1401-1407(1998))。因此,通过使用本发明的方法(例如,AlphaVaccine Technology(甲疫苗技术)),可用各种过敏原点缀病毒颗粒并用于免疫。因为所产生的过敏原的“病毒结构:将会引起一个TH1应答,将会产生“保护性”IgG1-3抗体,而引起过敏反应的IgE抗体的产生将会被避免。因为过敏原是以被不同组的辅助T细胞识别的病毒颗粒而不是以过敏原自身被呈递的,所以在即使定居有已经存在的对此过敏原特异的TH2细胞的过敏性个体中也可能诱导过敏原特异性IgG1-3抗体。高浓度IgG抗体的存在,可以避免过敏原结合到结合着肥大细胞的IgE上,从而抑制组织胺的释放。因此,IgG抗体的存在可以保护(肌体)抗IgE介导的过敏反应。引起过敏反应的典型物质包括:草、豚草、桦(birch)或高山雪松花粉(mountain cedarpollen)、屋尘(house dust)、螨(mites)、动物毛发皮屑(animaldanders)、霉菌(mold)、昆虫毒素(insect venom)或药物(例如青霉素)。因此,给个体用过敏原修饰的病毒颗粒免疫不仅在过敏反应发病之前,而且在发病之后,都应该是有益的。
正如本领域的具有普通技能的人员将会理解的一样,当给个体给药本发明的组合物时,它们可以是一种含有盐、缓冲液、佐剂或其它改善组合物之效能的物质的组合物。在包括REMIGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCE(Osol,A,ed.,Mack Publishing Co.,(1980))在内的许多来源中,提供了适用于制备药用组合物的材料的实例。
本发明的组合物,如果其给药能够被接受药物的个体耐受,那么就说其是“药理上接受的”。进一步地,本发明的组合物将按一个“治疗有效的量”给药(也就是说,一个产生所期望的生理效应的量)。
本发明的组合物可用本领域公知的各种方法给药,但是通常将会通过注射、灌输、吸入、口服或其它适合的物理方法给药。此外,此组合物还可以通过肌肉内、静脉内或皮下注射给药。给药的组合物的成分包括无菌的水溶液(例如生理盐水)、非水溶液以及悬浮液。非水性溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、以及可以注射的有机酯例如油酸乙酯。载体或密闭包装可用来提高皮肤通透性及增强抗原吸收。
除疫苗技术之外,本发明的其它实施方案描述癌症和过敏反应的医学治疗。
在此所引用的全部专利及公开明确地作为参考文献并入本发明。
实施例
用于以下实验的酶或试剂包括:从New England Biolabs获得的T4DNA连接酶;从QIAGEN获得的Taq DNA聚合酶、QIAprep Spin PlamidKit试剂盒,QIAGEN Plasmid Midi Kit试剂盒、QiaExIIGel ExtractionKit试剂盒、QIAquick PCR Purification Kit试剂盒;从Pharmacia获得的QuickPrep Micro mRNA Purification Kit试剂盒;从Gibco BRL获得的Superscript One-step RT-PCR Kit试剂盒、胎牛血清(FCS)、胰化蛋白胨及酵母提取物;从Microsynth(Switzerland)获得的寡聚核苷酸;从Boehringer Mannheim、New England Biolabs或MBIFermentas获得的限制性内切酶;从Boehringer Mannheim获得的Pwo聚合酶及dNTPs。从Cell culture technologies(Glattbrugg,Switzerland)获得HP-1培养基。所有的标准化学品从Fluka-Sigma-Aldrich获得,而所有的细胞培养材料从TPP获得。
DNA操作使用标准的技术实施。根据生产商的使用说明使用QIAprep Spin Plamid Kit试剂盒用2ml细菌培养或使用QIAGENPlasmid Midi Kit试剂盒用50ml培养物制备了DNA。为了进行限制性内切酶消化,在生产商推荐的条件(缓冲液和温度)下,将DNA与适当的限制性内切酶以每毫克DNA 5-10单位(U)酶的浓度温育了至少2小时。如果反应条件对所有的酶都合适,则同时进行多于一个酶的消化,否则进行顺序消化。为进一步操作而分离的DNA片段在0.7-1.5%琼脂糖凝胶上利用电泳分离,从凝胶上切除并根据生产商所提供的使用说明利用QiaExII Gel Extration Kit试剂盒纯化。为了DNA片段的连接,将100到200pg已纯化的载体DNA与三倍摩尔过量的插入片段在生产商所提供的缓冲液(总体积10-20μl)中存在1U T4 DNA连接酶的条件下,在16℃温育过夜。等份(0.1-0.5μl)连接反应液被用于E.coli XL 1-Blue(Stratagene)的转化。转化使用一个Gene Pulser(BioRAD)和0.1cm Gene Pulser Cuvettes(BioRAD)在200Ω,25μF,1.7kV条件下通过电穿孔完成。电穿孔之后,将此细胞在1ml S.O.B.培养基(Miller,1972)中摇动温育1小时。
实施例1:
JUN两亲性螺旋结构域在E2中的插入
在载体pTE5′2J(Hanh等,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:2679-2683(1992))中,在结构蛋白E2编码序列的密码子71(Gln)和密码子74(Thr)之间引进了MluI及BstEII限制性内切酶切位点,产生载体pET5′2IBM。这些限制性内切酶切位点的引进是使用以下寡聚核苷酸通过PCR(聚合酶链式反应)完成的:
Oligo 1:
E2insBstEII/BssHII:
5′-ggggACGCGTGCAGCAggtaaccaccgTTAAAGAAGGCACC-3′(SEQ ID
NO:1)
Oligo 2:
E2insMluIStuI:
5′-cggtggttaccTGCTGCACGCGTTGCTTAAGCGACATGTAGCGG-3′(SEQ
ID NO:2)
Oligo 3:
E2insStuI:5′-CCATGAGGCCTACGATACCC-3′(SEQ ID NO:3)
Oligo 4:
E2insBssHII:5′-GGCACTCACGGCGCGCTTIACAGGC-3′(SEQID NO:4)
为了PCR反应,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol与5ng模板DNA在100μl含有4单位Taq或Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和1.5mMMgSO4的反应混合物中进行反应。所有的DNA浓度都使用GeneQuant装置(Pharmacia)利用光度测定法测定。聚合酶在开始PCR反应之前直接加入(起点是95℃)。温度循环以如下方式和次序完成:95℃2分钟;5个95℃(45秒)、53℃(60秒)、72℃(80秒)循环;及25个95℃(45秒)、57℃(60秒)、72℃(80秒)循环。
分析了这两个PCR片段,并利用琼脂糖电泳纯化。使用寡聚核苷酸3和4(oligo3和4)进行这两个PCR片段的装配PCR(Assembly PCR)扩增从而获得最终的构建体。
为了装配PCR反应,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol与2ng已纯化的PCR片段在100μl含有4单位Taq或Pwo聚合酶、0.1mMdNTPs和1.5mM MgSO4的反应混合物中进行反应。所有的DNA浓度都使用GeneQuant装置(Pharmacia)利用光度测定法测定。聚合酶在开始PCR反应之前直接加入(起点是95℃)。温度循环以如下方式和次序完成:95℃2分钟;5个95℃(45秒)、57℃(60秒)、72℃(90秒)循环;及25个95℃(45秒)、59℃(60秒)、72℃(90秒)循环。
最终的PCR产物使用Qia Spin PCR柱(Qiagen)纯化,并用BssHII及StuI限制性核酸内切酶各10单位在一种合适的缓冲液中在37℃消化12小时。DNA片段进行凝胶纯化,并连接到已用BssHII及StuI消化和凝胶纯化的pTE5′2J载体上(Hanh等,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89:2679-2683)。首先利用BstEII及MluI限制性分析,此后又通过PCR产物的DNA序列测定,分析了PCR产物的正确插入。
使用如下寡聚核苷酸从载体pJuFo(Crameri和Suter,基因(Gene)137:69(1993))PCR-扩增编码JUN两亲性螺旋结构域的DNA序列:
Oligo 5:
JUNBstEII:
5′-CCTTCTTTAAcggtggttaccTGCTGGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′
(SEQ ID NO:5)
Oligo 6:
MluIJUN:5′-AAGCATGCTGCacgcgtgTGCGGTGGTCGGATCGCCCGGC-3′
(SEQ ID NO:6)
为了这个PCR反应,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol与5ng已经纯化的DNA模板在100μl含有4单位Taq或Pwo聚合酶、0.1mMdNTPs和1.5mM MgSO4的反应混合物中进行反应。所有的DNA浓度都使用GeneQuant装置(Pharmacia)利用光度测定法测定。聚合酶在开始PCR反应之前直接加入(起点是95℃)。温度循环以如下方式和次序完成:95℃2分钟;5个95℃(45秒)、60℃(30秒)、72℃(25秒)循环;及25个95℃(45秒)、68℃(30秒)、72℃(20秒)循环。
最终的PCR产物进行凝胶纯化,并连接到已用EcoRV消化和凝胶纯化的pBluecsript(KS-)上。通过使用MluI和BstEII切割从所产生的载体中分离了JUN序列,用QiaExII纯化,并将其连接到载体pTE5′2JBM上(先前用相同的限制性内切酶切割),从而获得载体pTE5′2J:E2JUN。
实施例2
使用pCYTts系统生产含有E2-JUN的病毒颗粒
使用pTE5′2J:E2JUN作为模板和寡聚核苷酸XgalStruct(ctatcaTCTAGAATGAATAGAGGATTCTTTAAC)和StructBsp1201(tcgaatGGGCCCTCATCTTCGTGTGCTAGTCAG)PCR-扩增此结构蛋白。为了这个PCR,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和5ng已纯化的DNA模板在100μl含有4单位Taq或Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4的反应混合物中进行反应。所有的DNA浓度都使用GeneQuant装置(Pharmacia)利用光度测定法测定。聚合酶在开始PCR反应之前直接加入(起点是95℃)。温度循环如下:95℃3分钟,随后是5个95℃(30秒)、54℃(35秒)、72℃(270秒)循环;随后又是25个95℃(30秒)、63℃(35秒)、72℃(270秒)循环。PCR产物经凝胶纯化,并使用限制性内切酶Xbal I/Bsp1201消化,连接到以前已用相同的酶切割过的载体pCYTts上(美国专利申请,申请号60/079,562;1998年3月27日提交)。
20μg pCYTtsE2:JUN与30单位ScaI在一种合适的缓冲液中在37℃温育至少4小时。利用酚/氯仿抽提终止反应,随后利用异丙醇沉淀线性DNA。利用琼脂糖电泳检查了限制性酶切反应。为了转染,将5.4μg线性化pCYTtsE2:JUN与0.6μg线性pSV2Neo在30μl H2O中混合,并加入30μl 1M CaCl2溶液。加入60μl磷酸缓冲液(50mM HEPES,280mM NaCl,1.5mM Na2PO4,pH7.05)之后,涡旋溶液5秒钟,随后在室温温育25秒钟。立即将此溶液加入2ml含有2%FCS的HP-1培养基(2%FCS培养基)中。使用含有DNA的培养基替换6-孔板中80%铺满的BHK21细胞培养的培养基。在CO2培养箱中在37℃温育5小时之后,除去含有DNA的培养基并用2ml内含15%甘油的2%FCS培养基替换。在30秒的温育期之后除去含有甘油的培养基,使用5ml含有10%FCS的HP-1培养基漂洗而洗涤细胞。最后,加入含有2ml含有10%FCS的新鲜的HP-1培养基。
选择被稳定转染的细胞,并在37℃在CO2培养箱中在选择培养基(补充了G418的HP-1培养基)中培养。当此混合细胞群生长到铺满时,将此培养物分入2个平皿,随后在37℃培养12小时。将一平皿细胞转移到30℃从而诱导病毒颗粒的表达;另一平皿细胞在37℃保存。
病毒颗粒的表达利用Western印迹测定(图1)。用培养基(0.5ml)进行甲醇/氯仿沉淀,沉淀物在SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)上样缓冲液中重新悬浮。样品在95℃加热5分钟,然后上样到15%丙烯酰胺凝胶上。在SDS-PAGE之后,如Bass和Yang,在Creighton,T.E.编著的蛋白质功能:一种实用方法(Protein Function:A PracticalApproch,2nd edn.,),IRL Press,Oxford(1997),29-55页所述,将蛋白转移到Protan硝酸纤维膜(Schleicher & Schuell,Germany)上。用1%牛血清白蛋白的TBS溶液(10x TBS/升:87.7g NaCl,66.1gTrima hydrochloride(Sigma)和9.7g Tris base(Sigma)pH7.4)在室温封闭1小时,此后与抗-El/E2抗体(多克隆抗体)温育1小时。印迹斑点用TBS-T(含有0.05%Tween20的TBS)洗涤3次10分钟,并与碱性磷酸酶-抗-兔IgG偶联物(0.1μg/ml,Amersham LifeScience,England)温育1小时。用TBS-T洗涤2次10分钟和TBS洗涤2次10分钟之后,使用碱性磷酸酶检测试剂和50μl NBT(内含7.7%氮蓝四唑(Sigma)的70%二甲基甲酰胺)及37μl X-Phosphate溶液(内含5%5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸的二甲基甲酰胺)进行显色反应。
病毒颗粒的产生在图1说明。Western印迹模式说明,与野生型E2(栏2)比较,E2-JUN(栏1)在SDS-PAGE上迁移到更高的分子量处,而BHK21宿主细胞系没有显示出任何背景。
实施例3:
使用pTE5′2JE2:JUN载体生产含有E2-JUN的病毒颗粒
无RNase载体(1.0μg)利用PvuI消化使其线性化。此后,使用一种SP6体外转录试剂盒(InvitroscriptCAP,Invitrogen,Invitrogen BV,NV Leek,Netherlands)进行体外转录。所产生的5′-加帽的mRNA在还原性琼脂糖凝胶上进行分析。
根据Invitrogen的使用手册(辛德比斯病毒表达系统,Invitrogen BV,Netherlands),将体外转录的mRNA(5μg)电穿孔导入BHK21细胞(ATCC:CCL10)。在37℃温育10小时之后,使用不合有FCS的HP-1培养基替换含有FCS的培养基,此后又在37℃温育10小时。收获悬液,并完全按照实施例2中所述,利用Western印迹分析法分析病毒颗粒的产生。
所获结果与图2所示的用pCYTtsE2:JUN获得的结果相同。
实施例4
人生长激素(hGH)与FOS亮氨酸拉链结构域(OmpA信号序列)的融
合
利用PCR从原始质粒(ATCC31389)扩增没有人源前导序列的hGH基因。具有内部XbaI位点的寡聚核苷酸7(Oligo7)是为在hGH基因的5′末端退火而设计的,而具有内部EcoRI位点的寡聚核苷酸9(Oligo9)在hGH基因的3′末端引发。为了这个PCR反应,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和5ng已纯化的模板DNA在75μl含有4单位Taq或Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4的反应混合物中进行反应。
PCR循环按如下方式进行:30循环,退火温度是60℃而延伸时间是37℃1分钟。
经凝胶纯化和分离的PCR产物被用作第二次PCR反应的模板,从而引进ompA信号序列及Shine-Dalgarno序列。为了这个PCR反应,使用寡聚核苷酸8和9(oligo8和9)各100pmol和1ng模板PCR产物在75μl反应混合液中进行反应(4单位Taq或Pwo聚合酶,o.1mMdNTPs和1.5mM MgSO4)。最初5个循环的退火温度55℃,延伸时间是72℃60秒;使用65℃的退火温度和72℃60秒的延伸时间进行另25个循环。
Oligo7:
gggtctagattcccaaccattcccttatccaggctttttgacaacgctatgctccgcgcccatcgtctgcaccagct
ggcctttgacacc(SEQ ID NO:7)
Oligo8:
gggtctagaaggaggtaaaaaacgatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctac
cgtagcgcaggccttcccaaccattcccttatcc(SEQ ID NO:8)
Oligo9:
cccgaattcctagaagccacagctgccctcc(SEQID NO:9)
所产生的重组hGH基因经过Xba I/EcoR I被亚克隆到pBluescript上。利用DNA测序证明了两条链的正确序列。
使用下列寡聚核苷酸从载体pJuFo(Crameri & Suter基因(Gene)137:69(1993))PCR-扩增了编码FOS两亲性螺旋结构域的DNA序列:omp-FOS:5′-ccTGCGGTGGTCTGACCGACACCC-3′(SEQ ID NO:10)FOS-hgh:5-ccgcggaagagccaccGCAACCACCGTGTGCCGCCAGGATG-3′(SEQ IDNO:11)
为了这个PCR反应,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和5ng模板DNA在75μl反应混合液(4单位Taq或Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4)中进行反应。温度循环如下:95℃2分钟;此后是5个95℃(45秒)、60℃(30秒)、72℃(25秒)循环;此后是25个95℃(45秒)、68℃(30秒)、72℃(20秒)循环。
PCR产物被纯化和分离,并被克隆到用Stu I消化的pBluecript-ompA-hGH中。然后将杂合基因克隆到pKK223-3质粒上(Pharmacia)。
实施例5:
FOS-hGH的细菌表达
pkk223-3中的omp-FOS-hGH使用JM101作为E.coli宿主菌,在可诱导的IPTG-依赖性启动子的控制之下表达。表达在摇瓶中进行。细胞在OD600为0.5时用1mM IPTG诱导。表达在37℃持续10小时。通过在10℃3600rpm离心10分钟而收获细胞。冰冻(-20℃或液氮)细胞沉淀物并贮存16小时。然后在4℃使此沉淀物解冻,并在10ml含有600mM蔗糖的10mM Tris-HCl,pH7.4中重新悬浮。在4℃搅拌15分钟之后,细胞周质蛋白通过渗透压休克程序将蛋白释放。加入冷却(4℃)的去离子H2O,然后在4℃搅拌30分钟。将污泥稀释,重新悬浮,并加入溶菌酶从而降解细菌的细胞壁。通过在4℃ 11000g离心20分钟将细胞和细胞周质球芽分离。利用含有还原性和非还原性SDS-PAGE及斑点印迹(Dot Bolt)分离了含有FOS-hGH上清。使用一种抗-hGH抗体(Sigma)作为第一抗体及碱性磷酸酶(AP)-抗-小鼠抗体偶联物作为第二抗体,如实施例8中所述进行斑点杂交。
全长的、被正确加工的FOS-hGH在还原性及非还原性条件下可以检测到。由于FOS两亲性螺旋中所存在的自由的半胱氨酸,FOS-hGH的一部分结合到其它没有被鉴定的蛋白上。然而,超过50%的表达的FOS-hGH以其天然的单体构象存在(图3)。
将使用已纯化的FOS-hGH,进行使用含有JUN的病毒颗粒的最初的添加实验(doping experiment)。
实施例6:
表达FOS融合蛋白的pAV载体系列的构建
构建一种多用途的载体系统从而允许在E.coli中进行-或C-末端FOS融合蛋白的细胞质生产或分泌,或者在真核细胞中进行-或C-末端FOS融合蛋白的生产。为在E.coli中生产FOS融合蛋白而设计的载体pAV1-pAV4,包括以下所列的DNA盒,其含有按不同次序排列的下列遗传元件:(a)一个从E.coliompA基因衍生而来的强的核糖体结合位点和5′不翻译区(aggaggtaaaaaacg)(第13号序列);(b)一个编码E.coli外膜蛋白OmpA的信号肽的序列(MKKTAIAIAVALAGFATVAQA)(第14号序列)的序列;(c)一个编码两侧具有两个甘氨酸残基和一个半胱氨酸残基的FOS二聚化结构域的序列(CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC)(第15号序列);及(d)一个编码一种连接感兴趣蛋白与FOS二聚化结构域的短肽接头(AAASGG(第16号序列)或GGSAAA(第17号序列))的区域。有关的编码区域以大写字母列出。限制性内切酶酶切位点的排列使得具有或不具有信号信号序列的FOS融合蛋白的构建容易。将此盒式组件克隆到在强tac启动子控制下表达此融合蛋白的表达载体pKK223-3(Pharmacia)中的EcoR I/HindIII限制性位点处。pAV1
此载体是为将FOS位于C-末端的融合蛋白分泌到E.coli细胞周质间隙而设计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以连接到此载体的StuI/NotI位点处。EcoRI 31/11gaa ttc agg agg taa aaa acg ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT
M K K T A I A I A V A L A6/21 StuI NotIGGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC tgg gtg ggg GCG GCC GCT TCT GGT GGT TGC GGT GGTG F A T V A Q A (goi) A A A S G G C G G121/41 151/51CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAAL T D T L Q A E T D Q V E D E K S A L Q181/61 211/71ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CACT E I A N L L K E K E K L E F I L A A H241/51 HindIIIGGT GGT TGC taa gct t (SEQ ID NO:18)G G C * A (SEQ ID NO:19)pAV2
此载体是为将FOS位于N-末端的融合蛋白分泌到E.coli细胞周质间隙而设计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以连接到此载体的NotI/EcoRV(或NotI/HindIII)位点处。EcoRI 31/11gaa ttc agg agg taa aaa acg ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT
M K K T A I A I A V A L A61/21 StuI 91/31GGT TTC GCT ACC GTA GCG CAG GCC TGC GGT GGT CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACCG F A T V A Q A C G G L T D T L Q A E T121/41 151/51GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAA ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAAD Q V E D E K S A L Q T E I A N L L K E181/61 211/71 NotIAAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CAC GGT GGT TGC GGT GGT TCT GCG GCC GCTK E K L E F I L A A H G G C G G S A A A241/81 EcoRV HindIIIggg tgt ggg gat atc aag ctt (SEQ ID NO:20)(goi) (SEQ ID NO:21)pAV3
此载体是为在E.coli细胞质生产FOS位于C-末端的融合蛋白而设计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以连接到此载体的EcoRV/NotI位点处。EcoRI EcoRV NotIgaa ttc agg agg taa aaa gat atc ggg tgt ggg GCG GCC GCT TCT GGT GGT TGC GGT GGT
(goi) A A A S G G C G G61/21 91/31CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAAL T D T L Q A E T D Q V E D E K S A L Q121/41 151/51ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CACT E I A N L L K E K E K L E F I L A A H181/61 HindIIIGGT GGT TGC taa gct t (SEQ ID NO:22)G G C * (SEQ ID NO:23)pAV4
此载体是为在E.coli细胞质生产FOS位于N-末端的融合蛋白而设计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以连接到此载体的NotI/EcoRV(或NotI/HindIII)位点处。一旦蛋白质被合成即通过蛋白质水解去除甲硫氨酸残基(Hirel等,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:8247-8251(1989))。EcoRI 31/11caa ttc agg agg taa aaa acg ATG GCT TGC GGT GGT CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAAE F R R * K T M A C G G L T D T L Q A E61/21 91/31ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAA ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAAT D Q V E D E K S A L Q T E I A N L L K121/41 151/51 NotIGAA AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CAC GGT GGT TGC GGT GGT TCT GCG GCCE K E K L E F I L A A H G G C G G S A A181/61 EcoRV HindIIIGCT ggg tgt ggg gat atc aag ctt (SEQ ID NO:24)A (goi) (SEQ ID NO:25)
载体pAV5和pAV6,是为FOS融合蛋白的真核生产而设计的,包括按不同次序排列的下列遗传元件:(a)一个编码人生长激素的前导肽的区域(MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA)(第26号序列);(b)一个编码两侧具有两个甘氨酸残基和一个丝氨酸残基的FOS二聚化结构域的序列(CGGLTDTLQAETDQVEDEKSALQTEIANLLKEKEKLEFILAAHGGC)(第15号序列);及(c)一个编码一个连接感兴趣蛋白与FOS二聚化结构域的短肽接头(AAASGG(第16号序列)或GGSAAA(第17号序列))的区域。有关的编码区域以大写字母列出。限制性切割位点的排列使得FOS融合基因的构建容易。此盒式组件被克隆到表达载体pMPSVEH的EcoRI/HindIII限制性位点中(Artelt,等,基因(Gene)68:1998))。pAV5
此载体是为FOS位于C-末端的融合蛋白的真核生产而设计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以通过将其连接到此载体的Eco47III/NotI位点而被插入编码hGH信号序列和FOS结构域的序列之间。或者,一个含有其自身信号序列的基因可以通过将其连接到StuI/NotI位点而与FOS编码序列融合。EcoRI StuI 31/11
gaa ttc agg cct ATG GCT ACA GGC TCC CGG ACG TCC CTG CTC CTG GCT TTT GGC CTG CTC
M A T G S R T S L L L A F G L L
61/21 Eco47III NotI
TGC CTG CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGC GCT ggg tgt ggg GCG GCC GCT TCT GGT GGT TGC
C L P W L Q E G S A (goi) A A A S G G C
121/41 151/51
GGT GGT CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACC GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG
G G L T D T L Q A E T D Q V E D E K S A
181/61 211/71
CTG CAA ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAA AAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG
L Q T E I A N L L K E K E K L E F I L A
241/81 HindIII
GCA CAC GGT GGT TGC taa gct t (SEQ ID NO:27)
A H G G C * (SEQ ID NO:28)pAV6
此载体是为FOS位于N-末端的融合蛋白的真核生产而设计的。感兴趣的基因(g.o.i)可以连接到此载体的NotI/StuI(NotI/HindIII)位点。EcoRI 31/11gaa ttc ATG GCT ACA GGC TCC CGG ACG TCC CTG CTC CTG GCT TTT GGC CTG CTC TGC CTG
M A T G S R T S L L L A F G L L C L61/21 Eco47III 91/31CCC TGG CTT CAA GAG GGC AGC GCT TGC GGT GGT CTG ACC GAC ACC CTG CAG GCG GAA ACCF W L Q E G S A C G G L T D T L Q A E T221/41 151/51GAC CAG GTG GAA GAC GAA AAA TCC GCG CTG CAA ACC GAA ATC GCG AAC CTG CTG AAA GAAD Q V E D E K S A L Q T E I A N L L K E181/61 211/71 NotIAAA GAA AAG CTG GAG TTC ATC CTG GCG GCA CAC GGT GGT TGC GGT GGT TCT GCG GCC GCTK E K L E F I L A A H G G C G G S A A A241/81 StuI HindIIIggg tgt ggg agg cct aag ctt (SEQ ID NO:29)(goi) (SEQ ID NO:30)表达载体pAV1-pAV6的构建合成了以下寡聚核苷酸用于表达载体pAV1-pAV6的构建:FOS-FOR1:CCTGGGTGGGGGCGGCCGCTTCTGGTGGTTGCGGTGGTCTGACC(SEQID NO:31);FOS-FOR2:GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATCGGGTGTGGGGCGGCC(SEQ ID NO:32);FOS-FOR3:GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAACGATGGCTTGCGGTGGTCTGACC(SEQ ID NO:33);FOS-FOR4:GCTTGCGGTGGTCTGACC(SEQ ID NO:34);FOS-REV1:CCACCAAGCTTAGCAACCACCGTGTGC(SEQ ID NO:35); FOS-REV2:CCACCAAGCTTGATATCCCCACACCCAGCGGCCGCAGAACCACCGCAACCACCG(SEQID NO:36);FOS-REV3:CCACCAAGCTTAGGCCTCCCACACCCAGCGGC(SEQ ID NO:37);OmpA-FOR1:GGTGGGAATTCAGGAGGTAAAAAACGATG(SEQ ID NO:38);hGH-FOR1:GGTGGGAATTCAGGCCTATGGCTACAGGCTCC(SEQ ID NO:39);和hGH-FOR2:GGTGGGAATTCATGGCTACAGGCTCCC(SEQ ID NO:40)
为了载体pAV2的构建,使用引物对OmpA-FOR1/FOS-REV2从载体pKK223-3的ompA-FOS-hGH融合基因(参见实施例5)扩增了编码OmpA信号序列和FOS结构域的区域。PCR产物用EcoRI/HindIII消化并连接到载体pKK223-3的相同位点上(Pharmacia)。
为了载体pAV1的构建,使用引物对FOS-FOR1/FOS-REV1从载体pKK223-3中的ompA-FOS-hGH融合基因(参见实施例5)扩增了编码FOS的区域。PCR产物用HindIII消化并连接到用StuI/HindIII消化过的载体pAV2。
为了载体pAV3的构建,使用引物对FOS-FOR2/FOS-REV1从载体pAV1扩增了编码FOS结构域的区域。PCR产物用EcoRI/HindIII消化并连接到载体pKK223-3的相同位点上(Pharmacia)。
为了载体pAV4的构建,使用引物对FOS-FOR3/FOS-REV2从载体pKK223-3中的ompA-FOS-hGH融合基因(参见实施例5)扩增了编码FOS结构域的区域。PCR产物用EcoRI/HindIII消化并连接到载体pKK223-3的相同位点上(Pharmacia)。
为了载体pAV5的构建,使用引物对hGH-FOR1/hGHREV1从载体pSINrep5中的hGH-FOS-hGH融合基因(参见实施例7)扩增了编码hGH信号序列的区域。PCR产物用EcoRI/NotI消化并连接到载体pAV1的相同位点上。此后,通过EcoRI/HindIII消化,分离所产生的编码hGH信号序列和FOS结构域的盒式组件,并将其克隆到用相同的酶消化过的载体pMPSVEH上(Artelt等,基因(Gene)68:213-219(1998))。
为了载体pAV6的构建,使用引物对FOS-FOR4/FOSREV3从载体pAV2扩增了编码FOS的区域。PCR产物用HindIII消化,并被克隆到用Eco47III/HindIII切割过的载体pAV5上。此后,使用引物对hGH-FOR2/FOSREV3从所产生的载体上再次扩增编码hGH信号序列和FOS结构域的完整盒式组件,用EcoRI/HindIII消化并将其连接到用相同的酶消化过的载体pMPSVEH上(Artelt等,基因(Gene)68:213-219(1998))。
实施例7:
具有人(hGH)信号序列的FOS-hGH的构建
为了FOS-hGH融合蛋白的真核表达,利用Xba I/Bsp120 I消化从pBluescript∷OmpA-FOS-hGH(参见实施例4)分离了OmpA-FOS-hGH融合基因,并将其克隆到用相同的酶消化过的载体pSINrep5(Invitrogen)上。使用重叠的寡聚核苷酸Sig-hGH-FOR(GGGTCTAGAATGGCTACAGGCTCCCGGACGTCCCTGCTCCTGGCTTTTGGCCTGCTCTG)(第41号序列)和Sig-hGH-REV(CGCAGGCCTCGGCACTGCCCTCTTGAAGCCAGGGCAGGCAGAGCAGGCCAAAAGCCAG)(第42号序列),通过PCR合成了hGH信号序列(反应混合物:每种引物各50pmol,dATP、dGTP、dTTP、dCTP各200μM,2.5单位Taq DNA聚合酶(Qiagen),50μl总反应体积,在生产商所提供的的缓冲液中;扩增:92℃30秒、55℃30秒、72℃30秒,30个循环)。PCR产物使用QiaEx II Kit试剂盒进行纯化,用Stu I/Xba I进行消化,并连接到用同样的酶切割过的载体pSINrep∷OmpA-FOS-hGH上。
实施例8:
FOS-hGH的真核表达
通过利用ScaI限制性消化,使无RNase的载体(1.0μg)(pSINrep∷OmpA-FOS-hGH)及1.0μg DHEB(Bredenbeek等,病毒学杂志(J.Virol.)67:6439-6446(1993))线性化。此后,使用SP6体外转录试剂盒(InvitroscriptCAP,InvitroGen,Invitrogen BV,NVLeek,Netherlands)进行体外转录。所产生的5′-加帽的mRNA在还原性琼脂糖凝胶上进行分析。
根据Invitrogen的使用手册(辛德比斯病毒表达系统,Invitrogen BV,Netherlands)将体外转录的mRNA 5μg电穿孔导入BHK21细胞(ATCC:CCL10)中。在37℃温育10小时之后,用不含有FCS的HP-1培养基替换含有FCS的培养基,随后又在37℃温育10小时。收获上清,并利用斑点印迹(dot-Blot)分析了FOS-hGH的生产。
在硝酸纤维素膜上点培养基(2.5μl)并在室温干燥10分钟。用1%牛血清白蛋白(Sigma)的TBS(10×TBS每毫升:87.7g NaCl,66.1g Trizma hydrochloride(Sigma)和9.7g Trizma base(Sigma),pH7.4)溶液在室温封闭此膜1小时,此后在10ml TBS-T(含有0.05%Tween20的TBS)中与2μg兔抗-人hGH抗体温育1小时。用TBS-T洗涤此印迹斑点3次10分钟,并与用TBS-T 1∶5000稀释的偶联了抗-兔IgG的碱性磷酸酶(Jackson Laboratories,Inc.)温育1小时。在用TBS-T洗涤2次10分钟和TBS洗涤2次10分钟之后,如实施例2中所述,利用AP染色使印迹显色。结果表示在图3中。
实施例9:
FOS-PLA(N-和C-末端)的构建
通过编码一种蜂毒磷脂酶A2(PLA)的、催化活性被灭活的突变体的化学基因合成,构建下列基因(Frster等,过敏反应临床免疫学杂志(J.Allergy Clin.Immunol.)95:1229-1235(1995))。 1/1 31/11ATC ATC TAC CCA GGT ACT CTG TGG TGT GGT CAC GGC AAC AAA TCT TCT GGT CCG AAC GAAI I Y P G T L W C G H G N K S S G P N E61/21 91/31CTC GGC CGC TTT AAA CAC ACC GAC GCA TGC TGT CGC ACC CAG GAC ATG TGT CCG GAC GTCL G R F K H T D A C C R T Q D M C P D V121/41 151/51ATG TCT GCT GGT GAA TCT AAA CAC GGG TTA ACT AAC ACC GCT TCT CAC ACG CGT CTC AGCM S A G E S K H G L T N T A S H T R L S181/61 211/71TGC GAC TGC GAC GAC AAA TTC TAC GAC TGC CTT AAG AAC TCC GCC GAT ACC ATC TCT TCTC D C D D K F Y D C L K N S A D T I S S241/81 271/91TAC TTC GTT GGT AAA ATG TAT TTC AAC CTG ATC GAT ACC AAA TGT TAC AAA CTG GAA CACY F V G K M Y F N L I D T K C Y K L E H301/101 331/111CCG GTA ACC GGC TGC GGC GAA CGT ACC GAA GGT CGC TGC CTG CAC TAC ACC GTT GAC AAAP V T G C G E R T E G R C L H Y T V D K361/121 391/131TCT AAA CCG AAA GTT TAC CAG TGG TTC GAC CTG CGC AAA TAC (SEQ ID NO:43)S K P K V Y Q W F D L R K Y (SEQ ID NO:44)
为了PLA与FOS二聚化结构域的N-末端的融合,使用寡聚核苷酸PLA-FOR1(CCATCATCTACCCAGGTAC)(第45号序列)和PLA-REV1(CCCACACCCAGCGGCCGCGTATTTGCGCAGGTCG)(第46号序列)扩增了该区域。这个PCR产物用Not I进行切割,并被连接到先前已经用限制性内切酶Stu I/Not I切割过的载体pAV1上。为了PLA与FOS二聚化结构域的C-末端的融合,使用寡聚核苷酸PLA-FOR2(CGGTGGTTCTGCGGCCGCTATCATCTACCCAGGTAC)(第47号序列)和PLA-REV2(TTAGTATTTGCGCAGGTCG)(第47号序列)扩增了该区域。这个PCR产物用Not I切割并连接到先前已经用限制性内切酶Not I/EcoRV切割过的载体pAV2上。
实施例10:
FOS-卵清蛋白融合基因(N-末端和C-末端)的构建
为了卵清蛋白编码序列的克隆,根据生产商的使用说明,使用QuickPrepTM Micro mRNA Purifieation Kit试剂盒(Pharmacia)用鸡输卵管组织制备mRNA。使用SuperScriptTM One-step RT-PCR Kit试剂盒(Gibco BRL),使用引物Ova-FOR1(CCGGCTCCATCGGTGCAG)(第49号序列)和Ova-REV1(ACCACCAGAAGCGGCCGCAGGGGAAACACATCTGCC)(第50号序列)合成一个编码卵清蛋白的成熟部分的cDNA(对应于该mRNA的68-1222位核苷酸(McReynold等,科学(Nature)273:723-728(1978))。这个PCR产物用Not I消化,并被克隆到用StuI/Not I消化过的载体pAV1上,以表达FOS二聚化结构域在C-末端的融合蛋白。为了FOS二聚化结构域在N-末端的融合蛋白的生产,使用引物Ova-FOR2(CGGTGGTTCTGCGGCCGCTGGCTCCATCGGTGCAG)(第51号序列)和Ova-REV2(TTAAGGGGAAACACATCTGCC)(第52号序列),从已构建的载体(pAV1∷Ova)扩增了卵清蛋白编码区。PCR产物用Not I消化,并被克隆到用Not I/EcoR V消化过的载体pAV2上。所克隆的片段利用DNA序列分析验证。
实施例11:
FOS-PLA和FOS-卵清蛋白融合蛋白的生产和纯化
为了在细胞周质产生FOS融合蛋白,用载体pAV3∷PLA、pAV4∷PLA、pAV3∷Ova或pAV4∷Ova转化了一种合适的E.coli菌株。培养物在37℃,在存在氨苄青霉素的丰富培养基中温育和摇动。在光密度(550nm)为1时,加入1mM IPTG并继续温育5小时。通过离心收获细胞,重新悬浮在一种含有DNase、RNase和溶菌酶的合适的缓冲液(例如,Tris-HCl,pH7.2,150mM NaCl)中,并使细胞通过弗氏压碎器(Fench pressure cell)从而将细胞破碎。离心(Sovall RC-5C,SS34转头,15000rpm,10分钟,4℃)之后,在4℃将沉淀物重新悬浮于25ml包函体洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl,23%蔗糖,0.5%TritonX-100,1mM EDTA,pH8.0)中,并如上所述再次离心。重复进行此过程直到离心以后的上清基本澄明。在室温将包函体溶解于20ml溶解缓冲液(5.5M盐酸胍,25mM Tris-HCl,pH7.5)中,并离心、此后使上清通过无菌滤膜(0.45μm)从而去除不溶物质。蛋白溶液在存在10mM和100mM DTT的条件下在4℃保存至少10小时,对10体积的5.5M盐酸胍,25mM Tris-HCl,10mM EDTA,pH6(溶液)透析3次。在存在redox shuffle(氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽;胱氨酸/半胱氨酸)的条件下,将此溶液对5升2M尿素,4mM EDTA,O.1MNH4Cl,20mM硼酸钠(pH8.3)(溶液)透析2次。然后对重折叠的蛋白进行离子交换层析。将此蛋白贮存于一种合适的缓冲液中,pH大于7并存在2-10mM DTT,从而使位于FOS侧翼的半胱氨酸残基处于还原形式。在此蛋白和甲病毒颗粒偶联之前,将此蛋白溶液通过SephadexG-25凝胶过滤柱,从而除去DTT。
实施例12:
gp140-FOS的构建
使用下列寡核苷酸,通过PCR从含有全长gp160基因的原始质粒pAbT4671(ATCC 40829)扩增了不含有内部蛋白酶切割位点的gp140基因(Swiss-Prot:P03375):HIV-1:5′-ACTAGTCTAGAatgagagtgaaggagaaatatc-3′(SEQ ID NO:53);HIV-end:5′-TAGCATGCTAGCACCGAAtttatctaattccaataattcttg-3′(SEQ ID NO:54);HIV-Cleav:5′-gtagcacccaccaaggcaaagCTGAAAGCTACCCAGCTCGAGAAACTGgca-3′(SEQ ID NO:55);和HIV-Cleav2:5′-caaagctcctattcccactgcCAGTTICTCGAGCTGGGTAGCTTICAG-3′(SEQ IDNO:56).
为了PCR I,使用寡聚核苷酸HIV-I和HIV-Cleav2各100pmol和5ng模板DNA在75μl反应混合液(4单位Taq或Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4)中进行反应。PCR循环以如下方式进行:30个循环,退火温度是60℃,延伸时间72℃2分钟。
为了PCRII,使用寡聚核苷酸HIV-end和HIV-Cleav各100pmol和5ng模板DNA在75μl反应混合液(4单位Taq或Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4)中进行反应。PCR循环以如下方式进行:30个循环,退火温度是60℃,延伸时间72℃50秒。
两个PCR产物都进行纯化、分离,并用于装配PCR反应。为了这个装配PCR反应,使用寡聚核苷酸HIV-I和HIV-end各100pmol和每一个PCR片段各2ng在75μl反应混合液(4单位Taq或Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4)中进行反应。PCR循环以如下方式进行:30个循环,退火温度是60℃,延伸时间72℃2.5分钟。装配PCR产物用Xba I和Nhe I消化。此FOS两亲性螺旋符合阅读框地融合到gp-140的C-末端。
使用下列寡聚核苷酸,从载体pJuFo(Crameri & Suter基因(Gene)137:69(1993))PCR-扩增了编码FOS两亲性螺旋结构域的DNA序列:FOS-HIV:5′-ttcggtgctagcggtggcTGCGGTGGTCTGACCGAC-3′(SEQID NO:57);和FOS-Apa:5′-gatgctgggcccttaaccGCAACCACCGTGTGCCGCC-3′(SEQID NO:58).
为了这个PCR反应,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol与5ng模板DNA在75μl反应混合物(4单位Taq或Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和1.5mM MgSO4)中进行反应。温度循环以如下方式完成:95℃2分钟;随后是5个95℃(45秒)、60℃(30秒)、72℃(25秒)的循环;随后又是25个95℃(45秒)、68℃(30秒)、72℃(20秒)循环。所获得的PCR片段用NheI和Bsp120L消化。
GP140-FOS的最终表达载体在将2个PCR片段连接到pSinRep5的3片段连接反应中获得。所产生的载体pSinRep5-GP140-FOS通过限制性分析和DNA测序进行评价。
GP140-FOS还经过XbaI和Bsp120L而被克隆到pCYTts中,从而获得一个稳定的可以诱导的GP140-FOS表达细胞系。
实施例13:
使用pSinRep5-GP140FOS表达GP140FOS
通过限制性内切酶消化,使无RNA酶(RNase-free)的载体(1.0μg)(pSinRep5-GP140-FOS)和1.0μg DHEB(Bredenbreek等,病毒学杂志(J.Virol.)67:6439-6446(1993))线性化。此后,使用一种SP6体外转录试剂盒(InvitroscriptCAP,InvitroGen,Invitrogen BV,NV Leek,Netherlands)进行体外转录。所产生的5′-加帽的mRNA在还原性琼脂糖凝胶上分析。
根据Invitrogen的使用手册(辛德比斯病毒表达系统,Invitrogen BV,Netherlands),将所转录的mRNA(5μg)电穿孔导入BHK21细胞系(ATCC:CCL10)。37℃温育10小时之后,用不含有FCS的HP-1培养基交换含有FCS的培养基,此后又在37℃温育10小时。收获上清,并完全按照实施例2中所述,利用Western印迹分析可溶性GP140-FOS的生产。
实施例14:
使用pCYTts-GP140FOS表达GP140FOS
利用限制性内切酶消化使pCYT-GP140-FOS线性化。利用酚/氯仿抽提终止此反应,此后用异丙醇沉淀线性DNA。利用琼脂糖凝胶电泳评价限制性内切酶消化。为了转染,将5.4μg的线性pCYTtsGP140-FOS与0.6μg线性pSV2Neo混合于30μlH2O中,并加入30μlCaCl2溶液。在加入60μ1磷酸缓冲液(50mM HEPES,280mM NaCl,1.5mMNa2HPO4,pH7.05)之后,振摇此溶液30秒,然后在室温温育25秒。立即将此溶液加入2ml含有2%FCS(2%FCS)的HP-1培养基中。然后用含有DNA的培养基替换80%铺满的BHK21细胞培养(6-孔板)的培养基。在CO2培养箱中在37℃温育5小时后,去除含有DNA的培养基,并用2ml内含15%甘油的2%FCS培养基替换。在30秒的温育期4之后,去除含有甘油的培养基,通过用5ml含有10%FCS的HP-1培养基漂洗而洗涤细胞。最后,加入2ml含有10%FCS的新鲜HP-1培养基。
选择稳定转染的细胞,并在CO2培养箱中,在选择培养基(补充G418的HP-1培养基)中在37℃培养。当混合的细胞群培养到铺满时,将细胞分到两个平皿中,然后在37℃培养12小时。将一平皿细胞转移到30℃,从而诱导可溶性GP140-FOS的表达。另一平皿细胞在37℃保存。
利用Western印迹测定了可溶性GP140-FOS的表达。培养基(0.5ml)用甲醇/氯仿沉淀,并将此沉淀物重新悬浮于SDS-PAGE上样缓冲液中。将样品95℃加热5分钟,然后上样到15%丙烯酰胺凝胶上。SDS-PAGE之后,如Bass和Yang在Creighton,T.E.,eds.蛋白质功能:一种实用方法(Protein Function:A Practical Approch,2nd edn.,),IRLPress,Oxford(1997),29-55页所述,将蛋白转移到Protan硝酸纤维膜(Schleicher & Schuell,Germany)上。用含有1%牛血清白蛋白(Sigma)的TBS溶液(10×TBS/升:87.7g NaCl,66.1g Trizmahydrochloride(Sigma)和9.7g Trizma base(Sigma),pH7.4)室温封闭1小时,随后与抗-GP140或GP160抗体温育1小时。印迹斑点用TBS-T(含有0.05%Tween20的TBS)洗涤3次10分钟,并与碱性磷酸酶抗-小鼠/兔/猴/人IgG偶联物温育1小时。用TBS-T洗涤2次10分钟和TBS洗涤2次10分钟之后,使用碱性磷酸酶检测试剂和50μlNBT(内含7.7%氮蓝四唑(Sigma)的70%二甲基甲酰胺)及37μlX-Phosphate溶液(内含5%5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸的二甲基甲酰胺)进行显色反应。
实施例15:
GPl40FOS的生产及纯化
将一种抗-gp120抗体共价偶联到一种用NHS/EDC活化的右旋糖苷上,并装到层析柱中。将含有GP140FOS的上清装载到层析柱上,充分洗涤之后,用0.1M HCl洗脱GP140FOS。在收集期间,使用1M TrispH7.2直接在收集试管中中和洗脱物。
纯化期间可能存在二硫键形成,因此所收集的样品用内含10mMDTT的10mM Tris pH7.5在25℃处理2小时。
随后对10mM Mes;80mM NaCl pH6.0透析从而去除DTT。最后,如实施例16中所述,将GP140-FOS与在E2中含有JUN亮氨酸拉链的甲病毒颗粒混合。
实施例16:
甲疫苗(AlphaVaccine)颗粒的制备
根据生产商所提供的操作程序,使用分子量截留值为100kD的Millipore Ultra Centrifugal Filter Devices浓缩病毒颗粒(参见实施例2和3)。或者,病毒颗粒可如辛德比斯病毒表达系统(Invitrogen,Sam Diego,California)的使用手册所述,利用蔗糖梯度离心来浓缩。将病毒悬浮液的pH调整到pH7.5,在存在2-10mM DTT的条件下将病毒颗粒温育数小时。用一种合适的缓冲液在SephacrylS-300柱(Pharmacia)(病毒颗粒用空体积洗脱)上从污染蛋白纯化出病毒颗粒。
在存在一种redox shuffle(氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽;胱氨酸/半胱氨酸)的条件下,在一种适当的缓冲液(pH7.5-8.5)中将所纯化的病毒颗粒与至少240倍摩尔过量的FOS-抗原融合蛋白在4℃温育至少10小时。在使用分子量截留值为100kD的Millipore UltraCentrifugal Filter Devices浓缩此颗粒之后,将此混合物通过Sephacryl S-300过滤柱(Pharmacia)。病毒颗粒用空水体积(voidvolume)洗脱。
实施例17:
JUN两亲性螺旋与HBcAg(1-144)的氨基端的融合
JUN螺旋被融合到HBcAg第1到144位氨基酸序列的氨基末端(JUN-HBcAg构建体)。为了JUN-HBcAg DNA序列的构建,通过PCR扩增了编码JUN螺旋和HBcAg(1-144)的序列。使用引物EcoR I-JUN(s)和JUN-SacII(as)从pJuFo质粒扩增了JUN序列。EcoR I-JUN(s)引物引进了一个EcoR I位点和此后一个启始ATG密码子。JUN-SacII(as)引物引进了一个编码氨基酸序列GAAGS的接头。使用引物JUN-HBcAg(s和HBcAg(1-144)Hind(as),从pEco63质粒(从ATCC No.31518获得)扩增了HBcAg(1-144)序列。JUN-HBcAg(s)含有一个对应于编码JUN螺旋和此后一个编码GAAGS接头的序列和HBcAg序列5′末端的序列的3′末端。HBcAg(1-144)Hind(as)在HBcAg基因的114位密码子之后引进一个终止密码子和一个HindIII位点。为了这个PCR反应,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2个单位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合液中进行反应。对于这两个反应,温度循环都以如下方式进行:94℃2分钟;及30个94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、72℃(2分钟)。引物序列:EcoRI-JUN(s):(5′-CCGGAATTCATGTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3′)(SEQ IDNO:61);JUN-SacII(as):(5′-GTCGCTACCCGCGGCTCCGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′)(SEQID NO:62);JUN-HBcAg(s): (5′-GTTGGTTGCGGAGCCGCGGGTAGCGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGG-3′)(SEQ ID NO:63);HBcAg(1-144)Hind(as):(5′-CGCGTCCCAAGCTTCTACGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3′)(SEQID NO:64).
使用引物EcoR I-JUN(s)和HbcAg(1-144)Hind(as)通过PCR进行这两个PCR片段的融合。使用每一种寡聚核苷酸各100pmol与100ng纯化的PCR片段在50μl含有2个单位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合物中进行反应。PCR循环条件是:94℃2分钟;及35个94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、72℃(2分钟)循环。最终的PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳进行分析,纯化,并在一种合适的缓冲液中用EcoR I和HindIII限制性内切酶消化16小时。将已消化的DNA片段连接到用EcoR I/HindIII-消化过的pKK载体上,从而产生pKK-JUN-HBcAg表达载体。利用EeoR I/HindIII限制性分析及利用插入物的DNA序列测定,分析了这个PCR产物的插入。
实施例18:
JUN两亲性螺旋与HBcAg(1-144)的羧基末端的融合
JUN螺旋被融合到HBcAg氨基酸序列第1到144位的羧基末端(HBcAg-JUN构建体)。为了HBcAg-JUN DNA序列的构建,通过PCR分别扩增了编码JUN螺旋和HBcAg(1-144)的序列。使用引物SacII-JUN(s)和JUN-HindIII(as)从pJuFo质粒扩增了JUN序列。SacII-JUN(s)引物引进了一个编码氨基酸LAAG的接头。此序列还含有一个SacII位点。JUN-HindIII(as)引进了一个终止密码子(TAA)及随后一个HindIII位点。使用引物EcoR I-HBcAg(s)和HBcAg(1-144)-JUN(as),从pEco63质粒扩增了HBcAg(1-144)DNA序列。EcoR I-HBcAg(s)在HBcAg编码序列的启始ATG之前引进一EcoR I位点。HBcAg(1-144)-JUN(as)引进一个编码肽接头(LAAG)的序列,这个序列还含有一个SacII位点。为了这个PCR反应,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2个单位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合液中进行反应。温度循环都以如下方式进行:94℃2分钟;及30个94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、72℃(2分钟)。引物序列:SacII-JUN(s):(5′-CTAGCCGCGGGTTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3′)(SEQ IDNO:65);JUN-HindIII(as):(5′-CGCGTCCCAAGCTTTTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′)(SEQID NO:66);EcoRI-HBcAg(s):(5′-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3′)(SEQ ID NO:67);和HBcAg-JUN(as):(5′-CCGACCACCGCAACCCGCGGCTAGCGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3′)(SEQ ID NO:68).
使用引物EcoR I-HBcAg(s)和JUN-HindIII(as)通过PCR进行这两个PCR片段的融合。使用每一种寡聚核苷酸各100pmol与100ng纯化的PCR片段在50μl含有2个单位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合物中进行。PCR循环条件是:94℃1分钟;及35个94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、72℃(2分钟)循环。最终的PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳进行分析,并在一种合适的缓冲液中用EcoRI和HindIII限制性内切酶消化16小时。凝胶纯化此DNA,并连接到经EcoR I/HindIII-消化过的pKK载体上,从而产生pKK-HBcAg-JUN表达载体。利用EcoR I/HindIII限制性分析及利用插入物的DNA测序分析这个PCR产物的插入。
实施例19:
JUN两亲性螺旋插入HBcAg(1-144)的c/el表位
已知HBcAg的c/el表位(第72-78位残基)是定位于乙型肝炎病毒衣壳表面的尖端区域。此蛋白这一区域的一部分(第76-82残基)在遗传上被JUN螺旋替换,从而提供一个抗原结合位点(HBcAg-JUNIns构建体)。HBcAg-JUNIns DNA序列通过PCR产生:通过PCR分别扩增JUN螺旋和两个编码HBcAg片段(第1到75位氨基酸残基和第83到144位氨基酸残基)的序列。使用引物BamH I-JUN(s)和JUN-SacII(as)从pJuFo质粒扩增了JUN序列。BamH I-JUN(s)引进一个编码又含有一个BamH I位点的肽序列的接头序列。JUN-SacII(as)引进一个编码肽接头GAAGS及其后一个与JUN编码序列的3′末端互补的序列。使用引物EcoR I HBcAg(s)和HBcAg75-JVN(as),从pEco63质粒扩增了HBcAg(1-75)DNA序列。EcoR I HBcAg(s)引进了一个EcoR I位点,和此后一个对应于HBcAg序列的5′末端的序列。HBcAg75-JUN(as)引进了一个编码HBcAg第75位氨基酸之后的肽GSGGG的接头,及此后一个与JUN螺旋编码序列的5′末端互补的序列。使用引物JUN-HBcAg83(s)和引物HBcAg(1-144)Hind(as)扩增了HBcAg(83-144)片段。JUN-HBcAg83(s)含有一个对应于JUN-编码序列的3′末端和此后一个编码多肽GAAGS的接头的序列和一个对应于HBcAg(83-144)编码序列的5′端的序列。HBcAg(1-144)Hind(as)引进了一个终止密码子和一个位于HBcAg基因的第144位密码子之后的HindIII位点。为了这个PCR反应,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl反应混合液(2单位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4)中进行反应。温度循环都以如下方式进行:94℃2分钟;及35个94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、72℃(2分钟)。引物序列:BamHI-JUN(s):(5′-CTAATGGATCCGGTGGGGGCTGCGGTGGTCGGATCGCCCGGCTCGAG-3′)(SEQ ID NO:69);JUN-SacII(as):(5′-GTCGCTACCCGCGGCTCCGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3)(SEQID NO:70);EcoRIHBcAg(s):(5′-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3′)(SEQ ID NO:71);HBcAg75-JUN(as):(5′-CCGACCACCGCAGCCCCCACCGGATCCATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3′)(SEQ ID NO:72);JUN-HBcAg83(s):(5′-GTTGGTTGCGGAGCCGCGGGTAGCGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3′)(SEQ ID NO:73);和HBcAg(1-144)Hind(as):(5′-CGCGTCCCAAGCTTCTACGGAAGCGTTGATAGGATAGG-3′)(SEQID NO:74).
这三个PCR片段的融合如下进行。首先,使用引物EcoR I HBcAg(s)和JUN-SacII(as)通过PCR将编码HBcAg1-75的片段与编码JUN的序列融合。第二,使用引物EcoR I HBcAg(s)和HBcAgHindIII(as)通过PCR将所获得的产物与HBcAg(83-144)片段融合。为了PCR融合,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和100ng纯化的PCR片段在50μl含有2个单位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合物中进行反应。同样的PCR条件被用于产生个别片段。最终的PCR产物在一种适合的缓冲液中用EcoR I/HindIII限制性内切酶消化16小时。将此DNA片段连接到已用EcoR I/HindIII消化的pKK载体上,产生pKK-HBcAg-JUNIns载体。利用EcoR I/HindIII限制性分析以及利用插入物的DNA序列测定,分析了这个PCR产物的插入。
实施例20:
JUN两亲性螺旋与麻疹病毒核衣壳(N)蛋白的羧基端的融合
JUN螺旋被融合到截短的、包括第1到473位氨基酸残基的麻疹病毒N蛋白片段的羧基端(N473-JUN构建体)。为了编码N473-JUN的DNA序列的构建,通过PCR分别扩增了编码JUN螺旋的序列和编码N473-JUN的序列。使用引物SacII-JUN(s)和JUN-HindIII(as)从pJuFo质粒扩增了JUN序列。SacII-JUN(s)引物引进了一个编码肽接头LAAG的序列。此序列还含有一个SacII位点。JUN-HindIII(as)反义引物引进了一个终止密码子(TAA)及此后一个HindIII位点。使用引物EcoR I-Nmea(s)和Nmea-JUN(as),从含有完整的麻疹病毒N蛋白编码序列(从M.Billeter,Zurich处获取)的pSC-N质粒扩增了N(1-473)序列。EcoR I-N(mea)(s)在N编码序列的启始ATG之前引进一个EcoR I位点。N(mea)-JUN(as)与N(1-473)编码序列的3′末端互补,此后是一个与肽接头(LAAG)的编码序列互补的序列。为了这个PCR反应,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2个单位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合液中进行反应。温度循环以如下方式进行:94℃2分钟;及35个94℃(1分钟)、55℃(1分钟)、72℃(2分钟)循环。引物序列:SacII-JUN(s):(5′-CTAGCCGCGGGTTGCGGTGGTCGGATCGCCCGG-3′)(SEQ IDNO:75); JUN-HindIII(as):(5′-CGCGTCCCAAGCTTTTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′)(SEQID NO:76);EcoRI-Nmea(s):(5′-CCGGAATTCATGGCCACACTTTTAAGGAGC-3′)(SEQ ID NO:77);和Nmea-JUN(as):(5′-CGCGTCCCAAGCTTTTAGCAACCAACGTGGTTCATGAC-3′)(SEQ IDNO:78)
使用引物EcoR I-Nmea(s)和Nmea-JUN(as)通过进一步PCR使这两个PCR片段的融合。为了这个PCR融合,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol与100ng所纯化的PCR片段在50μl含有2个单位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合物中进行。进行如下的温度循环:95℃2分钟;及35个94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、72℃(2分钟)的循环。PCR产物在一种合适的缓冲液中用EcoR I和HindIII限制性内切酶消化16小时。凝胶纯化此DNA片段,并连接到用EcoRI/HindIII-消化过的pKK载体上,产生pKK-N473-JUN质粒。利用EcoRI/HindIII限制性分析及利用插入物的DNA序列测定,分析了PCR产物的插入。
实施例21:
HBcAg-JUN的表达及部分纯化
用pKK-HBcAg-JUN转化了E.coli菌株XL-1 blue。用1ml细菌过夜培养物接种100ml含有100μg/ml培养基氨苄青霉素的LB培养基。此培养物在37℃培养4小时,直至600nm光密度达到约0.8。通过加入最终浓度1mM的IPTG,诱导HBcAg-JUN的合成。诱导之后,细菌进一步在37℃摇16小时。通过5000xg离心10分钟,收获细菌。将沉淀物在-20℃冰冻。解冻此沉淀物,并用补充了200μg/ml溶菌酶和10μl Benzonase(Merck)的细菌裂解缓冲液(10mM Na2PO4,pH 7.0,30mM NaCl,0.25% Tween-20,10mM EDTA,10mM DTT)重新悬浮。细胞在室温温育30分钟,并用弗氏压碎器(Fench pressurecell)破碎细胞。向裂解物中加入最终浓度为0.2%的Triton X-100,并将裂解物在冰上温育30分钟,偶尔摇动。图4表示一旦用IPTG诱导时,HBcAg-JUN蛋白在E.coli中的表达。带有pKK-HBcAg-JUN表达质粒或一种对照质粒的E.coli,被用于HBcAg-JUN表达的IPTG诱导。在加入IPTG之前,从携带pKK-HBcAg-JUN质粒(第3栏)的细菌培养物及从携带对照质粒(第1栏)的细菌培养物中取出一份样品。加入IPTG后16小时,从携带pKK-HBcAg-JUN质粒(第4栏)的培养物及对照培养物(第2栏)取样。利用SDS-PAGE及随后的考马斯亮蓝染色(Coomassie staining)来监测蛋白的表达。
然后,为了除去不溶性的细胞碎片,将裂解物在12,000xg离心30分钟。使用一种抗HBcAg单克隆抗体(YVS1841,购买自AccurateChemical and Scientific Corp,Westbury,NY,USA)进行Wesatern印迹来分析上清和沉淀物,表明显著量的HBcAg-JUN是可溶性的(图5)。简单地说,表达HBcAg-JUN的E.coli细胞及对照细胞的裂解物在14,000xg离心30分钟。上清(=可溶性部分)和沉淀物(不溶性部分)被分离,并用SDS上样缓冲液稀释到相同体积。利用SDS-PAGE,随后使用抗-HBcAg单克隆抗体YVS1841进行Western印迹来分析这些样品。第1栏:可溶性部分;第1和2栏:不溶性部分,对照细胞;第3栏:可溶性部分,表达HBcAg-JUN的细胞;第4栏:不溶性部分,表达HBcAg-JUN的细胞。
使用包括用3ml 15%蔗糖溶液、随后又用4ml细菌裂解物覆盖的4ml 65%蔗糖溶液的蔗糖分级梯度对澄明的细菌裂解物进行分级梯度离心。样品在4℃用100,000xg离心3小时。离心之后,从顶部收集了1ml的部分,并用SDS-PAGE及其后的考马斯亮蓝染色分析(图6)。第1栏:离心前的总细菌裂解物;第1和2栏:梯度顶部的第1部分和第2部分;第4到7栏:第5到8部分(15%蔗糖)。HBcAg-JUN蛋白利用考马斯亮蓝染色检测。
HBcAg-JUN蛋白在15%和65%蔗糖之间的界面处富集,说明已经形成了衣壳颗粒。大多数的细菌蛋白保留在梯度的无蔗糖的上层中,因此HBcAg-JUN蛋白的分级梯度离心导致这些颗粒的富集和部分纯化。
实施例22:
hGH对HBcAg-JUN的共价偶联
为了证明蛋白对HBcAg-JUN颗粒的结合,我们选择在其羧基端融合剂FOS螺旋的人生长激素(hGH-FOS)作为模型蛋白(hGH-FOS)将HBcAg-JUN颗粒与部分纯化的hGH-FOS混合并在4℃下温育4小时让蛋白结合。然后,该混合物对300倍体积的透析缓冲液(150mMNaCl,10mMTris-HCl溶液,pH8.0)透析过夜以除去在HBcAg-JUN溶液和hGH-FOS溶液中存在的DTT并从而让蛋白通过二硫键的建立而共价偶联。作为对照,HBcAg-JUN和hGH-FOS溶液也对透析缓冲液透析。通过还原条件下的SDS-PAGE分析来自所有三个透析的蛋白溶液的样品。在抗-hGH免疫印迹(图))中检测hGH-FOS对HBcAg-JUN的偶联。结合到HBcAg-JUN的hGH-FOS应该迁移的表观分子量约53KDa,而未结合的hGH-FOS迁移的表观分子量为31KDa。在无(栏3)和有还原剂(栏2)的存在下通过SDS-PAGE分析透析液并通过考马斯染色检测。作为对照,也将未与衣壳颗粒混合的hGH-FOS负载到存在还原剂的凝胶(栏1)上。
在存在HBcAg-JUN衣壳蛋白下观察到hGH-FOS迁移到约53KDa的分子量,提示发生了hGH-FOS与HBcAg-JUN的有效结合。
实施例23
将一个含有一个赖氨酸残基的肽插入HBcAg(1-149)的c/el表位
HBcAg的c/el表位(第72到88位残基)位于乙型肝炎病毒衣壳(HBcAg)表面的尖端区域。这个区域的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)在遗传上被肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly(HBcAg-Lys构建体)替换。所引进的赖氨酸残基在其侧链中含有一个可用于HBcAg颗粒与任何含有自由半胱氨酸基团之间化学交联的反应性氨基。
HBcAg-Lys DNA序列通过PCR产生:通过PCR分别扩增编码HBcAg片段的两个片段(第1到78位和第81到149位氨基酸残基)。这些PCR所使用的引物也引进了一个编码Gly-Gly-Lys-Gly-Gly肽的DNA序列。使用引物EcoR I HBcAg(s)和Lys-HBcAg(as)从pEco63质粒中扩增了HBcAg(1到78)片段。使用引物Lys-HBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)从pEco63扩增了HBcAg(81到149)片段。引物Lys-HBcAg(as)和Lys-HBcAg(s)在这两个PCR产物的末端引进了互补的DNA序列,(这就)允许这两个PCR产物在随后的一个装配PCR中的融合。使用引物EcoR I HBcAg(s)和HBCAg(1-149)Hind(as)扩增这些已装配的片段。
为了这些PCR反应,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2单位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合液中进行反应。对于这两个反应,温度循环以如下方式进行:94℃2分钟;及30个94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、72℃(2分钟)的循环。引物序列:EcoRIHBcAg(s):(5’-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3)(SEQ ID NO:79);Lys-HBcAg(as):(5’-CCTAGAGCCACCTITGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3’)(SEQ ID NO:80);Lys-HBcAg(s):(5’-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTAT GTC-3’)(SEQ ID NO:81);HBcAg(1-149)Hind(as):(5’-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3’)(SEQID NO:82).
为了通过PCR融合这两个PCR片段,使用引物EcoR I HBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)和100ng两个纯化的PCR片段在50μl含有2个单位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合物中进行反应。PCR循环的条件是:94℃2分钟;及30个94℃(1分钟)、50℃(1分钟)、72℃(2分钟)的循环。装配PCR产物,利用琼脂糖凝胶电泳分析,并纯化,在一种合适的缓冲液中用EcoR I和HindIII限制性内切酶消化19小时。将已消化的DNA片段连接到已用EcoR I/HindIII消化过的pKK载体上,从而产生pKK-HBcAg-Lys表达载体。利用EcoR I/HindIII限制性分析及插入物的DNA序列测定分析这个PCR产物在此载体中的插入。
实施例24:
HBcAg-Lys的表达及部分纯化
用pKK-HBcAg-Lys转化了E.coli菌株XL-1 blue。用1ml细菌过夜培养物接种100ml含有100μg/ml培养基氨苄青霉素的LB培养基。此培养物在37℃培养4小时,直至600nm的光密度达到约0.8。通过加入最终浓度1mM的IPTG,诱导HBcAG-JUN的合成。诱导之后,细菌进一步在37℃摇16小时。5000xg离心15分钟,收获细菌。将沉淀物在-20℃冰冻。解冻此沉淀物,并用补充了200μg/ml溶菌酶和10μl Benzonase(Merck)的细菌裂解缓冲液(10mM Na2PO4,pH7.0,30mM NaCl,0.25%Tween-20,10mM EDTA,10mM DTT)重新悬浮。细胞在室温下温育30分钟,并用弗氏压碎器(Fench pressurecell)破碎细胞。向裂解物中加入最终浓度为0.2%的Triton X-100,并将裂解物在冰上温育30分钟,偶尔摇动。带有pKK-HBcAg-Lys表达质粒或一种对照质粒的E.coli,被用于HBcAg-Lys表达的IPTG诱导。在加入IPTG之前,从携带pKK-HBcAg-Lys质粒的细菌培养物及从携带对照质粒的细菌培养物中取出一份样品。加入IPTG后16小时,再次从携带pKK-HBcAg-Lys质粒的培养物及携带对照质粒的培养物取样。利用SDS-PAGE及其后的考马斯亮蓝染色来监测蛋白的表达。
然后,为了除去不溶性的细胞碎片,将裂解物在12,000xg离心30分钟。使用一种抗HBcAg单克隆抗体(YVS1841,购买自AccurateChemical and Scientific Corp.,Westbury,NY,USA)进行Wesatern印迹,来分析上清和沉淀物,表明有显著量的HBcAg-Lys是可溶性的。简单地说,表达HBcAg-Lys的E.coli细胞及对照细胞的裂解物在14,000xg离心30分钟。上清(=可溶性部分)和沉淀物(不溶性部分)被分离,并用SDS上样缓冲液稀释到相等体积。利用SDS-PAGE,随后使用抗-HBcAg单克隆抗体YVS1841进行Western印迹来分析这些样品。
使用一种由4ml 65%蔗糖溶液,覆盖有3ml 15%蔗糖溶液、随后又覆盖有4ml细菌裂解物组成的蔗糖分级梯度,对澄明的细菌裂解物进行分级梯度离心。样品在4℃100,000xg离心3小时。离心之后,从顶部收集了各1ml的部分,并用SDS-PAGE及其后的考马斯亮蓝染色分析。HBcAg-Lys蛋白利用考马斯亮蓝染色检测。
HBcAg-Lys蛋白在15%和65%蔗糖之间的界面处富集,说明已经形成了衣壳颗粒。大多数的细菌蛋白保留在梯度无蔗糖的上层中,因此,HBcAg-Lys蛋白分级梯度离心导致这些颗粒的富集和部分纯化。
实施例25:
使用异双功能交联剂SPDP将FLAG肽化学偶联到
HBcAg-Lys上
为了引起一个抗FLAG肽的免疫应答,将合成的、在其氨基端具有一个半胱氨酸残基的FLAG肽(氨基酸序列为CGGDYKDDDDK)化学偶联到已纯化的HBcAg-Lys颗粒上。在室温下将600μl HBcAg-Lys颗粒的95%纯溶液与异双功能交联剂N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) propionate)(SPDP)(0.5mM)温育30分钟。反应完成之后,将此混合物对1升50mM磷酸缓冲液(pH7.2)和150mM NaCl(溶液)透析过夜,从而去除游离的SPDP。在存在10mM EDTA的条件下,将500μl已经衍生化的HBcAg-Lys衣壳颗粒(2mg/ml)与0.1mM FLAG肽(含有一个氨基端半胱氨酸)混合,从而避免金属催化巯基的氧化。通过由于一旦与此肽的自由半胱氨酸反应,吡啶-2-硫酮从SPDP释放所引起的溶液的光密度在343nm处的增加来监测此反应。衍生化的赖氨酸残基与此肽的反应在约30分钟后完成。
将FLAG修饰的颗粒注射给小鼠。
实施例26
pMPSV-gp140cys的构建
使用引物寡聚核苷酸gp140CysEcoR I和SalIgp140通过PCR,从pCytTSgp140FOS扩增gp140基因。为了这些PCR反应,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2单位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合液中进行反应。对于这两个反应,温度循环以如下方式进行:94℃2分钟;及30个94℃(0.5分钟)、55℃(1分钟)、72℃(2分钟)的循环。
使用QiaExII试剂盒纯化PCR产物,用Sal I和EcoR I消化,并将其连接到已用同样的酶消化过的载体pMPSVHE上。寡聚核苷酸序列:Gp140CysEcoRI:5’-GCCGAATTCCTAGCAGCTAGCACCGAATTTATCTAA-3’(SEQ IDNO:83);SalIgp1405’-GGTTAAGTCGACATGAGAGTGAAGGAGAAATAT-3’(SEQ ID NO:84).
实施例27
pMPSVgpl40Cys的表达
利用限制性消化使pMPSVgp140Cys(20μg)线性化。反应用酚/氯仿抽提终止,随后用异丙醇沉淀已线性化的DNA。利用琼脂糖凝胶电泳评价了限制性内切酶消化。为了转染,将5.4μg的线性化pMPSVgp140-Cys与0.6μg线性pSV2Neo在30μl H2O中混合,并加入30μlCaCl2溶液。在加入60μl磷酸缓冲液(50mM HEPES,280mMNaCl,1.5mM Na2HPO4,pH7.05)之后,振动此溶液5秒,然后在室温温育25秒。立即将此溶液加入2ml含有2%FCS(2%FCS)的HP-1培养基中。然后用含有DNA的培养基替换一种80%铺满的BHK21细胞培养(6-孔板)的培养基。在CO2培养箱中37℃温育5小时后,去除含有DNA的培养基,并用2ml内含15%甘油的2%FCS培养基替换。在30秒温育期之后,去除含有甘油的培养基,用5ml含有10%FCS的HP-1培养基漂洗来洗涤细胞。最后,加入2ml含有10%FCS的新鲜HP-1培养基。
选择稳定转染的细胞,并在CO2培养箱中、在选择性培养基(补充G418的HP-1培养基)上37℃培养。当混合的细胞群培养到铺满时,将细胞分到两个平皿中,然后在37℃培养12小时。将一个细胞平皿转移到30℃,诱导可溶性GP140-FOS的表达。另一个细胞平皿在37℃保存。
利用Western印迹分析测定了可溶性GP140-Cys的表达。培养基(0.5ml)用甲醇/氯仿沉淀,并将此沉淀物重新悬浮于SDS-PAGE样品缓冲液中。样品在95℃加热5分钟,然后上样到15%丙烯酰胺凝胶上。SDS-PAGE之后,如Bass和Yang在Creighton,T.E.,编著的蛋白质功能:一种实用方法,第2版(Protein Function:A Practical Approch,2nd edn.,),IRL Press,Oxford(1997),29-55页所述,将蛋白转移到Protan硝酸纤维膜(Schleicher & Schuell,Germany)上。用含有1%牛血清白蛋白(Sigma)的TBS溶液(10×TBS/升:87.7g NaCl,66.1gTrizma hydrochloride(Sigma)和9.7g Trizma base(Sigma),pH7.4)室温封闭1小时,随后与抗-GP140或GP160抗体温育1小时。印迹斑点用TBS-T(含有0.05%Tween20的TBS)洗涤3次10分钟,并与碱性磷酸酶-抗小鼠/兔/猴/人IgG偶联物温育1小时。用TBS-T洗涤2次10分钟和TBS洗涤2次10分钟之后,使用碱性磷酸酶检测试剂和50μl NBT(内含7.7%氮蓝四唑(Sigma)的70%二甲基甲酰胺)及37μlX-Phosphate溶液(内含5%5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸的二甲基甲酰胺)进行显色反应。
实施例28:
gp140Cys的纯化
将一种抗-gp120抗体共价偶联到一种NHS/EDC活化的右旋糖苷上,并装到层析柱中。含有GP140Cys的上清被加载到层析柱上,在充分洗涤之后,用0.1M HCl洗脱GP140Cys。在收集期间,用在收集管中的1MTris pH7.2直接中和该洗脱液。
在纯化期间可能形成二硫键,因此,在25℃用内含10mM DTT的10mM Tris pH7.5(溶液)处理所收集的样品2小时。
随后对10mM Mes;80mM NaCl pH6.0透析,从而除去DTT。最后如实施例16所述,将GP140Cys和在E2中含有JUN残基的甲病毒颗粒混合。
实施例29
PLA2-Cys的构建
使用寡聚核苷酸EcoR I PLA和PLA-Cys-hind通过PCR,从pAV3PLAfOS扩增PLA2基因。为了这些PCR反应,使用每一种寡聚核苷酸各100pmol和50ng模板DNA在50μl含有2单位Pwo聚合酶,0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的反应混合液中进行反应。对于这两个反应,温度循环以如下方式进行:94℃2分钟;及30个94℃(0.5分钟)、55℃(0.5分钟)、72℃(2分钟)的循环。
使用QiaExII试剂盒纯化PCR产物,用EcoRI/HindIII消化,并将其连接到已用同样的酶消化过的载体pAV3上。寡聚核苷酸序列OligosEcoRIPLA:5’-TAACCGAATTCAGGAGGTAAAAAGATATGG-3’(SEQ ID NO:85)PLACys-hind:5’-GAAGTAAAGCTTTTAACCACCGCAACCACCAGAAG-3’(SEQ IDNO:86).
实施例30
PLA-cys的表达及纯化
为了在细胞周质生产Cys标记的蛋白,用载体pAY3∷PLA和pPLA-Cys转化E.coli XL-1 Blue菌株。培养物在37℃,在存在氨苄青霉素的丰富培养基中摇动温育。在光密度(550nm),加入1mMIPTG,再温育5小时。通过离心收获细胞,重新悬浮在一种含有DNase、RNase和溶菌酶的合适的缓冲液(例如,Tris-HCl,pH7.2,150mM NaCl)中,并使细胞通过弗氏压碎器(Fench pressure cell)从而将细胞破碎。离心(Sovall RC-5C,SS34转头,15000rpm,10分钟,4℃)之后,在4℃将沉淀物重新悬浮于25ml包函体洗涤缓冲液(20mM Tris-HCl,23%蔗糖,0.5%Triton X-100,1mM EDTA,pH8.0)中,并如上所述再次离心。重复进行此过程直到离心后的上清基本澄明。在室温下将包函体溶解于20ml溶解缓冲液(5.5M盐酸胍,25mM Tris-HCl,pH7.5)中,并离心,随后使上清通过无菌滤膜(0.45μm)从而去除不溶物质。蛋白溶液在存在10mMEDTA和100mM DTT的条件下4℃保持至少10小时,对10倍体积5.5M盐酸胍,25mM Tris-HCl,10mM EDTA,pH6(溶液)透析3次。在存在redox shuffle(氧化型谷胱甘肽/还原型谷胱甘肽;胱氨酸/半胱氨酸)的条件下,将此溶液对5升2M尿素,4mMEDTA,0.1M NH4Cl,20mM硼酸钠(pH8.3)(溶液)透析2次。然后对重折叠的蛋白进行离子交换层析。将此蛋白贮存于一种适当的、pH大于7、并存在2-10mM DTT的缓冲液中,从而使半胱氨酸残基处于还原型。在将此蛋白与甲病毒颗粒偶联之前,将此蛋白溶液通过Sephadex G-25凝胶过滤柱,从而除去DTT。
Claims (49)
1.一种组合物,包括:
a)一种非天然存在的分子支架,包括:
(i)一种核心颗粒,选自:
(1)一种非天然起源的核心颗粒;及
(2)一种天然起源的核心颗粒;及
(ii)一种组织者,包括至少一个第一结合位点,
其中所说的组织者通过至少一个共价键连接到所说的核心颗粒上;及
b)一种具有至少一个第二结合位点的抗原或抗原决定簇,所说的第二结合位点选自:
(i)一种非天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起存在的结合位点;及
(ii)一种天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起存在的结合位点,
其中,所说的第二结合位点能够通过至少一个非-肽键结合到所说的第一结合位点;而且,其中所说的抗原或抗原决定簇与所说的支架通过所说的结合相互作用,从而形成一种有序的和重复的抗原排列。
2.权利要求1的组合物,其中:
a)所说的核心颗粒,选自:
(i)一种病毒
(ii)一种病毒-样颗粒;
(iii)一种噬菌体;
(iv)一种病毒衣壳颗粒;及
(v)(i),(ii),(iii)或(iv)的一种重组形式;且
b)所说的组织者是多肽或其残基;且
c)所说的第二结合位点是多肽或其残基。
3.权利要求2的组合物,其中所说的第一和/或第二结合位点包括:
a)抗原和其抗体或抗体片段;
b)生物素和亲合素;
c)链亲合素和生物素;
d)一种受体及其配基;
e)一种配基-结合蛋白及其配基;
f)相互作用的亮氨酸拉链多肽;
g)氨基及与其反应的化学基团;
h)羧基及与其反应的化学基团;
i)巯基及与其反应的化学基团;或
j)其组合。
4.权利要求3的组合物,其中所说的第二结合位点非天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起存在。
5.权利要求2的组合物,其中所说的核心颗粒是重组甲病毒。
6.权利要求5的组合物,其中所说的重组甲病毒是辛德比斯病毒而所说的第一结合位点和所说的第二结合位点各包括一种相互作用的亮氨酸拉链多肽。
7.权利要求6的组合物,其中所说的第一结合位点和所说的第二结合位点是JUN和/或FOS亮氨酸拉链多肽。
8.权利要求2的组合物,其中所说的核心颗粒是一种病毒-样颗粒。
9.权利要求8的组合物,其中所说的第一结合位点是氨基而所说的第二结合位点是巯基。
10.权利要求8的组合物,其中所说的病毒-样颗粒是一种乙型肝炎病毒衣壳蛋白。
11.权利要求10的组合物,其中所说的第一结合位点和第二结合位点各包括一种相互作用的亮氨酸拉链多肽。
12.权利要求11的组合物,其中所说的第一结合位点是JUN多肽而所说的第二结合位点是FOS多肽。
13.权利要求10的组合物,其中所说的第一结合位点是一个赖氨酸残基而所说的第二结合位点是一个半胱氨酸残基。
14.权利要求8的组合物,其中所说的病毒-样颗粒是一种麻疹病毒衣壳蛋白。
15.权利要求14的组合物,其中所说的第一结合位点和所说的第二结合位点各自包括一种相互作用的亮氨酸拉链多肽。
16.权利要求15的组合物,其中所说的第一结合位点和所说的第二结合位点是JUN和/或FOS亮氨酸拉链多肽。
17.权利要求2的组合物,其中所说的核心颗粒,选自:
a)轮状病毒属的重组蛋白,
b)诺沃克病毒的重组蛋白,
c)甲病毒属的重组蛋白,
d)口蹄疫病毒的重组蛋白,
e)逆转录病毒的重组蛋白,
f)乙型肝炎病毒的重组蛋白,
g)烟草花叶病毒的重组蛋白,
h)Flock House Virus的重组蛋白,和
i)人乳头瘤病毒属的重组病毒。
18.权利要求17的组合物,其中第一结合位点和第二结合位点各包括一种相互作用的亮氨酸拉链多肽。
19.权利要求17的组合物,其中所说的第一结合位点是氨基而所说的第二结合位点是巯基。
20.权利要求1的组合物,其中所说的核心颗粒是非天然起源的。
21.权利要求20的组合物,其中所说的核心颗粒选自:
a)合成聚合物,
b)一种脂微胶粒,及
c)一种金属。
22.权利要求21的组合物,其中所说的第一结合位点和所说的第二结合位点各包括一种相互作用的亮氨酸拉链多肽。
23.权利要求22的组合物,其中所说的第一结合位点和第二结合位点是JN和/或FOS亮氨酸拉链多肽。
24.权利要求1的组合物,其中所说的抗原选自:
a)适合诱导抗癌细胞免疫应答的蛋白,
b)适合诱导抗传染病免疫应答的蛋白,
c)适合诱导抗过敏原免疫应答的蛋白,
d)适合在家畜动物中诱导免疫应答的蛋白。
25.权利要求24的组合物,其中所说的抗原是:
a)HIV的一种重组蛋白,
b)流感病毒的一种重组蛋白,
c)丙型肝炎病毒的一种重组蛋白,
d)弓形虫的一种重组蛋白,
e)恶性状疟原虫的一种重组蛋白,
f)间日疟原虫的一种重组蛋白,
g)卵形疟原虫的一种重组蛋白,
h)三日疟原虫的一种重组蛋白,
i)乳腺癌细胞的一种重组蛋白,
j)肾癌细胞的一种重组蛋白,
k)前列腺癌细胞的一种重组蛋白,
l)皮肤癌细胞的一种重组蛋白,
m)脑癌细胞的一种重组蛋白,
n)白血病细胞的一种重组蛋白,
o)一种重组profiling,
p)蜂螫过敏反应的一种重组蛋白,
q)坚果过敏反应的一种重组蛋白,
r)食物过敏反应的一种重组蛋白,或
s)哮喘的一种重组蛋白,或
t)衣原体的一种重组蛋白。
26.权利要求24的组合物,其中所说的第一结合位点和第二结合位点各包括一种相互作用的亮氨酸拉链多肽。
27.一种生产非天然存在的、有序的和重复的抗原排列的方法,包括:
a)提供一种非天然存在的分子支架,包括:
(i)一种核心颗粒,选自:
(1)一种非天然起源的核心颗粒;及
(2)一种天然起源的核心颗粒;及
(ii)一种组织者,包括至少一个第一结合位点,
其中,所说的组织者通过至少一个共价键连接到所说的核心颗粒上;且
b)提供一种具有至少一个第二结合位点的抗原或抗原决定簇,所说的第二结合位点选自:
(i)一种非天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起存在的结合位点;及
(ii)一种天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起存在的结合位点,
其中所说的第二结合位点能够通过至少一个非-肽键结合到所说的第一结合位点上;及
c)所说的非天然地存在的分子支架与与所说的抗原或抗原决定簇的结合,
其中所说的抗原或抗原决定簇与所说的支架通过所说的结合相互作用,从而形成一种有序的和重复的抗原排列。
28.权利要求27的方法,其中
a)所说的核心颗粒,选自:
(i)一种病毒
(ii)一种病毒-样颗粒;
(iii)一种噬菌体;
(iv)一种病毒衣壳颗粒;及
(v)(i),(ii),(ii)或(iv)的一种重组形式;且
b)所说的组织者是多肽或其残基;且
c)所说的第二结合位点是多肽或其残基。
29.权利要求28的方法,其中所说的第一和/或第二结合位点包括:
a)抗原和其抗体或抗体片段;
b)生物素和亲合素;
c)链亲合素和生物素;
d)一种受体及其配基;
e)一种配基-结合蛋白及其配基;
f)相互作用的亮氨酸拉链多肽;
g)氨基及与其反应的化学基团;
h)羧基及与其反应的化学基团;
i)巯基及与其反应的化学基团;或
j)其组合。
30.权利要求29的方法,其中所说的第二结合位点非天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起存在。
31.一种分离的重组甲病毒,在其基因组内包括:
a)RNA包装信号序列的缺失;及
b)JUN亮氨酸拉链蛋白结构域核酸序列的符合所说的甲病毒E2包膜蛋白核酸序列读框的非天然存在的插入。
32.一种宿主细胞,包括权利要求31的重组甲病毒。
33.一种医学治疗的方法,包括给受试者给药权利要求1的组合物。
34.一种药物组合物,包括:
a)权利要求1的组合物;及
b)一种可以接受的药物载体。
35.一种免疫方法,包括给受试者给药一种组合物,此组合物包括:
a)一种非天然存在的分子支架,包括:
(i)一种核心颗粒,选自:
(1)一种非天然起源的核心颗粒;及
(2)一种天然起源的核心颗粒;及
(ii)一种组织者,包括至少一个第一结合位点,
其中至少一个所说的组织者通过至少一个共价键连接到所说的核心颗粒上;及
b)一种具有至少一个第二结合位点的抗原或抗原决定簇,所说的第二结合位点选自:
(i)一种非天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起存在的结合位点;及
(ii)一种天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起存在的结合位点,
其中,所说的第二结合位点能够通过至少一个非一肽键结合到所说的第一结合位点上;而且,
其中所说的抗原或抗原决定簇与所说的支架通过所说的结合相互作用,从而形成一种有序的和重复的抗原排列。
36.权利要求35的方法,其中所说的免疫产生一种免疫应答。
37.权利要求35的方法,其中所说的免疫产生一种体液免疫应答。
38.权利要求35的方法,其中所说的免疫产生一种细胞免疫应答。
39.权利要求35的方法,其中所说的免疫产生一种体液免疫应答和细胞免疫应答。
40.权利要求35的方法,其中所说的免疫产生一种保护性应答。
41.一种疫苗组合物,包括:
a)一种非天然存在的分子支架,包括:
(i)一种核心颗粒,选自:
(1)一种非天然起源的核心颗粒;及
(2)一种天然起源的核心颗粒;及
(ii)一种组织者,包括至少一个第一结合位点,
其中至少一个所说的组织者通过至少一个共价键连接到所说的核心颗粒上;及
b)一种具有至少一个第二结合位点的抗原或抗原决定簇,所说的第二结合位点选自:
(i)一种非天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起存在的结合位点;及
(ii)一种天然地与所说的抗原或抗原决定簇一起存在的结合位点,
其中所说的第二结合位点能够通过至少一个非-肽键结合到所说的第一结合位点上;而且,
其中所说的抗原或抗原决定簇与所说的支架通过所说的结合相互作用,从而形成一种有序的和重复的抗原排列。
42.权利要求41的疫苗组合物,进一步包括一种佐剂。
43.权利要求41的疫苗组合物,其中,
a)所说的核心颗粒选自:
(i)一种病毒
(ii)一种病毒-样颗粒;
(iii)一种噬菌体;
(iv)一种病毒衣壳颗粒;及
(v)(i),(ii),(iii)或(iv)的一种重组形式;且
b)所说的组织者是多肽或其残基;且
c)所说的第二结合位点是多肽或其残基。
44.权利要求43的疫苗组合物,其中所说的第一结合位点和/或第二结合位点包括:
a)抗原和其抗体或抗体片段;
b)生物素和亲合素;
c)链亲合素和生物素;
d)一种受体及其配基;
e)一种配基-结合蛋白及其配基;
f)相互作用的亮氨酸拉链多肽;
g)氨基及与其反应的化学基团;
h)羧基及与其反应的化学基团;
i)巯基及与其反应的化学基团;
j)其组合。
45.权利要求43的疫苗组合物,其中所说的核心颗粒包括一种病毒-样颗粒。
46.权利要求45的疫苗组合物,其中所说的核心颗粒包括乙型肝炎病毒-样颗粒。
47.权利要求45的疫苗组合物,其中所说的核心颗粒包括一种麻疹病毒-样颗粒。
48.权利要求43的疫苗组合物,其中所说的核心颗粒包括一种病毒。
49.权利要求48的疫苗组合物,其中所说的核心颗粒包括一种辛德比斯病毒。
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