PL222497B1 - Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania, kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowanie wektorowej cząsteczki wirusopodobnej - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania, zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną. Bardziej szczegółowo rozwiązanie dotyczy białkowej wektorowej cząsteczki wirusopodobnej, stanowiącej dodekahedron adenowirusowy (Dd), dostarczającej do tkanek ssaczych substancje terapeutyczne, pochodzące z klasy białek, peptydów, polisacharydów, kwasów nukleinowych, tłuszczów, lipoprotein lub ich pochodnych. Przedmiotowe rozwiązanie umożliwia uzyskanie szczepionek ludzkich lub zwierzęcych, dostarczenie do tkanek ssaczych przeciwciał, substancji antynowotworowych, kwasów nukleinowych, enzymów oraz substancji immunosupresyjnych, a także białek/peptydów i lipidów specyfikujących tropizm tkankowy. W sposobie według wynalazku domeny WW pochodzą z białka grzybów, zwłaszcza białka szczepów drożdżowych.

Description

(21) Num^{er z}gł^oszeni^a: ³⁸⁸⁴⁰³ C12N 7/01 (2006.01)

C12N 15/861 (2006.01) A61K 39/00 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 26.06.2009 ^{A61K 48/00 (200601)}

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, sposób jej wytwarzania, ( ) kompozycja farmaceutyczna oraz zastosowanie wektorowej cząsteczki wirusopodobnej
	(73) Uprawniony z patentu:
	INSTYTUT BIOCHEMII I BIOFIZYKI POLSKIEJ AKADEMII NAUK, Warszawa, PL
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
03.01.2011 BUP 01/11	(72) Twórca(y) wynalazku: JADWIGA CHROBOCZEK, Warszawa, PL EWA SZOŁAJSKA, Warszawa, PL ANTONINA NASKALSKA, Kraków, PL
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.08.2016 WUP 08/16	(74) Pełnomocnik:
	rzecz. pat. Aleksandra Twardowska-Czerwińska

PL 222 497 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest wektorowa cząsteczka wirusopodobna (ang. VLP, virus-like particie), sposób jej wytwarzania, zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca wektorową cząsteczkę wirusopodobną. Bardziej szczegółowo rozwiązanie dotyczy białkowej wektorowej cząsteczki wirusopodobnej, zawierającej dodekahedron adenowirusowy (Dd), dostarczającej do tkanek ssaczych substancje terapeutyczne, pochodzące z klasy białek, polisacharydów, kwasów nukleinowych, tłuszczy, lipoprotein lub ich pochodnych. Przedmiotowe rozwiązanie umożliwia uzyskanie szczepionek ludzkich lub zwierzęcych, dostarczan ie przeciwciał, peptydów antynowotworowych oraz substancji immunosupresyjnych, a także białek/peptydów i lipidów specyfikujących tropizm tkankowy, lub też kwasy nukleinowe. W sposobie według wynalazku, łącznikowe domeny WW pochodzą z białka grzybów, zwłaszcza białka szczepów drożdżowych.

Adenowirus jest bezotoczkowym wirusem ludzkim i zwierzęcym zawierającym jedną cząsteczkę dwuniciowego DNA i 11-14 kodowanych przez wirusa białek. Kapsyd adenowirusa ma budowę ikozahedronu składającego się z 20 ścian zbudowanych z heksonów i 12 wierzchołków zbudowanych z pentonów. Penton, niekonwalencyjny kompleks dwóch białek, składa się z pentamerycznego białka podstawy (ang. penton base protein) i trymerycznego białka włókna (ang. fibre protein), jak przedstawiono poniżej.

Pentony spełniają podwójną rolę przy rozpoczęciu infekcji wirusowej. Infekcja zaczyna się od adsorpcji, podczas której infekujący wirion przyłącza sie przy pomocy C-końcowej domeny globularnej białka włókna do receptora pierwszorzędowego na powierzchni komórek wrażliwych (Philipson i wsp., 1968). Drugim etapem infekcji wirusowej jest penetracja wirusa. W etapie tym bierze udział białko podstawy pentonu, kiedy to penetracja wirusa następuje w wyniku interakcji motywu RGD tego białka z integrynami komórkowymi (Wickham i wsp., 1993). Białko podstawy jest również zaangażowane w uwolnienie wirusa z endosomów. Uważa się, że kwaśne środowisko endosomów powoduje zmianę strukturalną, polegającą na ujawnieniu się domen hydrofobowych białka podstawy i w konsekwencji ich interakcję z membraną endosomalną, na skutek czego dochodzi do jej pęknięcia (Wohlfart, 1988). Specyficzność tkankowa adenowirusów (czyli tropizm) zależy od białka włókna. Tak więc np. adenowirusy z podgrupy C (Ad2, Ad5) zakażają najczęściej układ oddechowy, z podgrupy B (Ad3, Ad7) układ oddechowy i oczy, a z podgrupy F (Ad40, Ad41) - układ trawienny.

Niektóre serotypy adenowirusa wytwarzają w trakcie normalnej infekcji symetryczne dodekahedryczne cząsteczki wirusopodobne, złożone z dwóch białek wirusa odpowiedzialnych za wniknięcie, a mianowicie z białka włókna i białka podstawy pentonu. Poza dawno opublikowanymi obrazami m ikroskopii elektronowej (Valentine i Pereira, 1965), nie wiadomo nic o funkcji, roli lub biogenezie molekularnej tych cząsteczek wirusopodobnych.

W wyniku nadprodukcji tych dwóch białek w systemie bakulowirusa dochodzi spontanicznie do powstania takich samych symetrycznych nanocząsteczek dodekahedrycznych składających się z 12 pentonów. Równolegle można przy pomocy podobnej procedury uzyskać dodekahedr yczne cząsteczki wirusopodobne składające się z 12 kopii samego białka podstawy pentonu. Oba rodzaje dodekahedronów zachowują funkcjonalność swoich części składowych wykazując nadzwyczajną zdolność wnikania do komórek (Fender i wsp., 1997; Fender i wsp., 2003; Vives i wsp., 2004).

PL 222 497 B1

Dodekahedron rozpoznaje dwa rodzaje receptorów. Z jednej strony zachowuje on specyficzność białka podstawy pentonu rozpoznającego integryny av i wykazuje on powinowactwo do tego rodzaju integryn, których poziom jest podwyższony w nowotworzonych naczyniach doprowadzających krew do tkanki nowotworowej. Jednocześnie dodekahedron ma silne powinowactwo do siarczanów heparanowych (Vives i wsp., 2004), które znajdują się na powierzchni wszystkich komórek epitelialnych.

W opisach patentowych FR 2747681 (opubl. 1997-10-24) oraz FR 2741087 (opubl. 1997-05-16) przedstawiono białkowy kompleks, dodekahedron adenowirusowy, składający się z białka podstawy pentonu i opcjonalnie zawierający białko włókna. Białkowy kompleks adenowirusowy (A) zawiera: (a) 12 pentonów (P), z których każdy zawiera co najmniej po jednej podstawie pentonu (Pb - ang. penton base) i jednym białku włókna (F - ang. fiber), przy czym pentony są powiązane poprzez Pbazy, tak że tworzą strukturę dodekahedryczną odporną na proteolizę, o masie cząsteczkowej wynoszącej 4.8-6.6 MD, lub (b) 12 Pb tworzy dodekahedron jak powyżej, jednak masa cząsteczkowa wynosi 3,2 do 4 MD. (A) nie zawiera innych składników adenowirusa, a F i Pb są z tego samego lub różnych serotypów adenowirusów (Ad).

W opisach patentowych US 6083720 (opubl. 2000-07-04), EP0861329 (opubl. 2000-07-04), WO 9718317 (opubl. 2006-02-16) zastrzeżono białkowy kompleks dodekahedronu adenowirusowego, kompozycję zawierającą ten kompleks oraz jej zastosowanie. Natywny lub rekombinowany białkowy kompleks adenowirusowy, który może być stosowany w leczeniu i profilaktyce chorób ludzkich i zwierzęcych. Przedstawiony w rozwiązaniu kompleks zawiera 12 pentonów, przy czym każdy zawiera co najmniej jedno białko włókna i białko podstawy pentonu, bez dodatkowych elementów adenowirusa, przy czym wspomniane białko włókna pochodzi z jednego lub więcej serotypów adenowirusów, a białka podstawy pentonu są połączone między sobą i tworzą oporną na proteolizę stabilną strukturę dodekahedryczną.

W opisie patentowym PL 192016 (zgł. 1999-11-30) opisano kompozycję, sposób wytwarzania sztucznego, uporządkowanego i powtarzalnego układu antygenu, kompozycję szczepionki oraz zastosowanie kompozycji. Wynalazek dostarcza sposób wytwarzania uporządkowanych i powtarzalnych układów antygenów lub determinat antygenowych. Kompozycje są użyteczne w wytwarzaniu szczepionek do zapobiegania chorobom infekcyjnym, leczenia alergii i leczenia raków. Różne rozwiązania wynalazku dostarczają wirus, cząsteczkę wirusopodobną, cząsteczkę kapsydu wirusowego, faga lub ich zrekombinowaną postać, opłaszczone dowolnym pożądanym antygenem w wysoce uporządkowany i powtarzalny sposób w wyniku specyficznych oddziaływań. W jednym szczególnym rozwiązaniu nowa technologia umożliwia wytwarzanie cząsteczek wirusowych opłaszczonych antygenem. Inne szczególne rozwiązania umożliwiają wytwarzanie cząsteczek wirusopodobnych wirusa zapalenia wątroby typu B opłaszczonych antygenem lub cząsteczek wirusopodobnych wirusa odry opłaszczonych antygenem.

W zgłoszeniu patentowym P-366990, (opubl. 2002-05-29) opisano nową kompozycję szczepionkową. Opisane rozwiązanie dotyczy preparatu inaktywowanego wirusa grypy, zawierającego antygen hemaglutyniny stabilizowany bez użycia tiomersalu lub przy niskim poziomie tiomersalu. Preparat wirusa grypy może zawierać substancję pomocniczą modyfikującą micele, np. α-tokoferol lub jego pochodną, w ilości wystarczającej do stabilizacji hemaglutyniny.

W zgłoszeniu patentowym WO 0166700 (opubl. 2001-09-13) opisano podskórny sposób immunizacji przeznaczony dla dużych antygenów cząsteczkowych. Wynalazek opisuje nieinwazyjne, ekonomiczne i łatwe sposoby indukowania odpowiedzi immunologicznej względem antygenów cząsteczkowych.

W opisach patentowych EP 1862550 (opubl. 2007-12-05) oraz US 2005186621 (opubl. 200508-25) opisano tworzenie cząsteczek wirusopodobnych typu dzikiego oraz chimerycznych cząsteczek wirusopodobnych grypy. Opisano cząsteczki wirusopodobne grypy zawierające białka strukturalne hemaglutyninę (HA), neuraminidazę (NA), białka macierzy M1 i M2. VLPs mogą być również utworzone wyłącznie z białka M1, bądź z M1 w połączeniu z HA, NA i M2.

W zgłoszeniu patentowym WO 2007085969 (opubl. 2007-08-02) opisano szczepionki przeciw grypie zawierające hemaglutyninę (HA) oraz białka macierzy (M1, M2). Wynalazek dostarcza kompozycję immunogenną antygrypową zawierającą HA oraz M1 i M2, pochodzącą z wirusów hodowanych w hodowli komórkowej, a nie w jajach. Białka macierzy mogą stanowić fragment białka macierzy wir usa grypy, a mianowicie fragment białka macierzy M1 o masie cząsteczkowej poniżej 20 kDa. Kompozycja może stanowić podjednostkę szczepionki zawierającą oczyszczone glikoproteiny powierzchniowe wirusa.

PL 222 497 B1

Zgłoszenie patentowe WO 2007066334 (opubl. 2007-06-14) odnosi się do szczepionek przeciw grypie dla ludzi i do zastosowania w weterynarii, a zwłaszcza do szczepionki działającej długoterminowo i dającej ochronę krzyżową, zawierającej co najmniej dwa epitopy wirusa grypy, które są wyrażane w postaci chimerycznego polipeptydu, w którym co najmniej jeden epitop stanowi epitop peptydowy białka macierzy wirusa grypy A (M1 lub M2), a drugi epitop stanowi epitop peptydowy hemaglutyniny.

W opisie patentowym CA 2615372 (opubl. 2009-01-13) opisano cząsteczki wirusopodobne (VLPs) grypy zawierające hemaglutyninę (HA) oraz sposób syntezy tych cząsteczek w roślinie, bądź we fragmencie rośliny. Sposób obejmuje nadprodukcję białka HA grypy w roślinie oraz jego oczyszczanie. Rozwiązanie dotyczy także VLP zawierających białko HA grypy oraz lipidów roślinnych, a także kwasów nukleinowych kodujących HA grypy i wektory. VLP według wynalazku mogą być zastosowane w wytwarzaniu szczepionek, bądź też do poprawienia szczepionek już istniejących.

W zgłoszeniu patentowym WO 2009012489 (opubl. 2009-01-22) przedstawiono chimeryczne VLPs ptasiej grypy. Wynalazek dostarcza metody mającej na celu zwiększenie wydajności wytwarzania cząsteczek wirusopodobnych zawierających białko macierzy ptasiej grypy. Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania i zastosowania takich VLPs.

Pomimo opisanych powyżej badań istnieje ciągła potrzeba stworzenia wydajnej wektorowej cząsteczki wirusopodobnej. Twórcy przedmiotowego rozwiązania opracowali w tym celu wektor białkowy składający się z dodekahedronu adenowirusowego (Dd), dostarczającego do tkanek ssaczych substancje terapeutyczne. Zrekombinowana cząsteczka dodekahedronowa, rDd otrzymywana jest w komórkach owadzich w systemie bakulowirusa z wysoką wydajnością, która wynosi 10 mg rDd ze 100 ml hodowli komórkowej. Wydajność produkcji jest porównywalna z tą, którą otrzymuje się w najwydajniejszych układach bakteryjnych. Dotychczas rDd oczyszczano jedynie przez ultrawirowanie w gradiencie sacharozy. Etap ten umożliwia wyeliminowanie białek komórkowych, ale nie kwasów nukleinowych, najprawdopodobniej przyłączonych do powierzchni Dd.

Celem wynalazku było opracowanie warunków pozwalających na użycie dodekahedrycznej wektorowej cząsteczki wirusopodobnej dla przeniesienia do komórek ssaczych, w tym ludzkich, czynników terapeutycznych takich jak białka, polisacharydy, kwasy nukleinowe, tłuszcze, lipoproteiny lub pochodne tych substancji, takie jak szczepionki ludzkie lub zwierzęce, przeciwciała, peptydy antynowotworowe, lecz również substancje immunosupresyjne lub białka/peptydy i lipidy specyfikujące tropizm tkankowy, dla użycia w terapii zwierzęcej i ludzkiej. W swoich pracach Zgłaszający stwierdzili, że dodekahedron wnika do komórek wydajniej niż adenowirus serotypu 3 (Ad3), z którego pochodzi. Wektor ten transdukuje 100% komórek w hodowli komórkowej, przy czym jest w stanie transdukować również komórki niepermisywne dla Ad3. Wynika to z tego, że Dd posiada nową funkcję, a mianowicie możliwość rozpoznawania siarczanów heparanowych. Siarczany heparanowe (HS) oddziałują z pozytywnie naładowanymi fragmentami białkowymi i wydaje się, że zbliżone w Dd białka podstawy pentonu tworzy miejsca oddziaływania z HS. W przypadku kapsydu wirusa podstawy pentonu są bardziej oddalone, ze względu na obecność innego białka wirusowego, heksonu, pomiędzy sąsiednimi białkami podstawy pentonu. Tak więc penetracja dodekahedronu następuje nie tylko za pośrednictwem receptorów wirusa, ale również przy pomocy bardzo rozpowszechnionych siarczanów heparanowych, które znajdują się na powierzchni wszystkich komórek epitelialnych.

Dodekahedron jest również potencjalnym wektorem, który może służyć jako platforma dla dostarczenia antygenów. Użycie dodekahedronu jako platformy, ze względu na poliwalencyjność otrzymanej szczepionki pozwoli na wywołanie znaczącej odpowiedzi zwierzęcego/ludzkiego systemu immunologicznego, co może pozwolić na zapobieżenie epidemii choroby zakaźnej, takiej jak grypa.

Dodekahedron jest potencjalnie także wektorem specyficznym dla komórek nowotworowych. Wektor ten posiada aktywność endosomolityczną adenowirusów dzięki czemu przenika łatwo do cytosolu komórkowego. Dodatkowo wektor ten ma wysokie powinowactwo do integryn av. Integryny te rozpoznają motyw RGD (arginina - glicyna - kwas asparaginowy). Dodekahedron adenowirusowy posiadający 60 motywów RGD jest zapewne najbardziej specyficznym ligandem integryn av. Ponieważ wiadomo, że poziom integryn av jest podwyższony w endotelium guzów złośliwych, Zgłaszający ocenił, że Dd mógłby wybiórczo dostarczać czynniki terapeutyczne do wnętrza komórek endotelialnych, z których są zbudowane nowopowstające naczynia krwionośne guzów. Dlatego też, twórcy wynalazku postanowili wykorzystać te cząsteczki wirusopodobne do przenoszenia czynników terapeutycznych takich jak antyrakowe białka lub peptydy.

Realizacja tak określonego celu i rozwiązanie opisanych w stanie techniki problemów związanych z opracowaniem i dostarczeniem wynalazku umożliwiającego wydajne wprowadzenie czynnika

PL 222 497 B1 terapeutycznego do komórki oraz osiągnięcie jego podwyższonej biodostępności i funkcjonalności przy jednoczesnym obniżeniu niepożądanych efektów ubocznych, zostały osiągnięte w niniejszym wynalazku.

Globularne domeny WW są to najmniejsze dotychczas poznane domeny białkowe (długość 23-30 aminokwasów), których nazwa pochodzi od dwóch zakonserwowanych reszt tryptofanu, niezbędnych dla właściwego zwijania domeny i wiązania ligandu (Koepf i wsp., 1999). Domeny WW mają zdolność do wiązania się z bogatymi w proliny sekwencjami peptydowymi o specyficznych sekwencjach konsensusowych (Pawson i Scott, 1977). Białko podstawy adenowirusa zawiera w N-końcowej części dwa zakonserwowane motywy PPxY (prolina - prolina - dowolny aminokwas - tyrozyna). Zgłaszający wykazali, że jeden z tych motywów jest odpowiedzialny za oddziaływanie z domenami WW (Galinier i wsp., 2002).

Zgodnie z wynalazkiem, substancje terapeutyczne w postaci fuzji genetycznej z domenami WW są przyłączone niekowalencyjnie do wektora poprzez interakcje z motywami PPxY lub poprzez interakcje z miejscem przyłączenia partnera Dd, białka włókna adenowirusa, lub też przez interakcje z motywem RGD (arginina - glicyna - kwas asparaginowy) lub fragmentami zasadowymi lub hydrofobowymi wektora, lub też poprzez wklonowanie do zewnętrznych pętli wektora, lub na jego końcu N- lub końcu C-.

Wynalazek dotyczy nowej szczepionki przeciw grypie, skonstruowanej z dodekahedronu adenowirusa (Dd), stanowiącego platformę dla dostarczenia wewnętrznego białka grypy zwanego białkiem macierzy M1. Dla przyłączenia antygenu do wektora zastosowano domeny WW współdziałające z Dd. Przy zastosowaniu technik biochemii oraz biologii komórkowej zaobserwowano internalizację kompleksu Dd-M1WW. W następnym etapie wykazano, że kompleks Dd z antygenem jest silnym aktywatorem ludzkich mieloidalnych komórek dendrytycznych (MDC), oraz że jest wydajnie prezentowany przez komórki dendrytyczne CD8+T limfocytom pamiętającym epitop białka M1. Wyniki te wskazują, że zaproponowany model szczepionki jest w pełni wykonany, a także iż dodekahedron adenowirusa stanowi wydajną platformę dla przenoszenia obcych antygenów do komórek ludzkich.

Przedmiotem wynalazku jest wektorowa cząsteczka wirusopodobna, charakteryzująca się tym, że stanowi cząsteczkę dodekahedronu adenowirusowego składającego się z pentonów lub białek podstawy pentonu, z przyłączoną domeną WW z białka grzybów, w fuzji genetycznej z białkową lub peptydową substancją terapeutyczną stanowiącą antygeny wirusa grypy, przy czym cząsteczka dodekahedronu adenowirusowego pochodzi z wirusa ssaka. Korzystnie, gdy zawiera substancje terapeutyczne, w postaci fuzji genetycznej z domenami WW, przyłączone niekowalencyjnie do wektora poprzez: interakcje z motywami PPxY lub interakcje z miejscem przyłączenia partnera Dd, białka włókna adenowirusa lub interakcje z motywem RGD lub fragmentami zasadowymi lub hydrofobowymi wektora lub wklonowanie do zewnętrznych pętli wektora, lub na jego końcu N- lub końcu C-. Korzystnie, gdy substancja terapeutyczna pochodzi z klasy białek, peptydów, polisacharydów, kwasów nukleinowych tłuszczy, lipoprotein lub ich pochodnych lub jest peptydem lub białkiem lub lipidem antynowotworowym lub immunosupresyjnym i/lub peptydem lub białkiem lub lipidem specyfikującym tropizm tkankowy. Korzystnie, gdy białko grzybów stanowi białko szczepów drożdżowych, korzystnie z drożdży

S. cerevisiae, korzystnie z białka Rsp5. Korzystnie, gdy pochodzące z drożdżowego białka Rsp5 trzy domeny WW w tandemie stanowią uniwersalny adaptator umożliwiający przyłączenie białka lub peptydu do dodekahedronów. Korzystnie, gdy białko antygenowe zawiera białko macierzy wirusa grypy, M1, w fuzji genetycznej z białkiem łącznikowym WW.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania wektorowej cząsteczki wirusopodobnej, charakteryzuje się tym, że stosuje się cząsteczkę dodekahedronu adenowirusa składającą się z pontonów lub białek podstawy pentonu z wirusa ssaczego, produkowanego w komórkach owadzich w systemie bakulowirusa, po czym oczyszcza z zastosowaniem kolumny jonowymiennej, eliminuje nisko- i średniocząsteczkowe białka oraz kwasy nukleinowe i otrzymuje się frakcję rDd o czystości powyżej 90%, a następnie do wytworzonej cząsteczki zrekombinowanego dodekahedronu adenowirusowego przyłącza się przez inkubację lub przez jednoczesną ekspresję w układzie bakulowirusa białko fuzyjne zaopatrzone w domenę WW pochodzącą z białka grzybów, przedłużone przez białkową lub peptydową substancję terapeutyczną. Korzystnie, gdy przyłączony łącznik w postaci domen WW pochodzi z białka szczepów drożdżowych, korzystnie z drożdży S. cerevisiae, korzystnie z białka Rsp5, w fuzji genetycznej z białkową lub peptydową substancją terapeutyczną stanowiącą antygen M1 wirusa grypy. Korzystnie, gdy podwójne fuzyjne białko antygenowe zawiera białko M1 w fuzji genetycznej z białkiem łącznikowym WW. Korzystnie, gdy cząsteczkę dodekahedronową, rDd, otrzymuje się

PL 222 497 B1 w komórkach owadzich w systemie bakulowirusa, przy czym wydajność wynosi co najmniej 8 mg rDd ze 100 ml hodowli komórkowej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera wektorową cząsteczkę wirusopodobną, którą stanowi cząsteczka dodekahedronu adenowirusowego składająca się z pentonów lub białek podstawy pentonu, z przyłączoną domeną WW przedłużoną o białkową lub peptydową substancją terapeutyczną określoną powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wektorowej cząsteczki wirusopodobnej, stanowiącej cząsteczkę dodekahedronu adenowirusowego którą stanowi cząsteczka dodekahedronu adenowirusowego składająca się z pentonów lub białek podstawy pentonu, z przyłączoną domeną WW przedłużoną o białkową lub peptydową substancją terapeutyczną określoną powyżej do otrzymywania kompozycji farmaceutycznej określonej powyżej do wprowadzania substancji terapeutycznych do tkanek ludzkich lub zwierzęcych. Korzystnie, gdy pochodzące z białka drożdży Rsp5 trzy domeny WW w tandemie pełnią rolę uniwersalnego adaptatora (łącznika) umożliwiającego przyłączenie dowolnego białka do dodekahedronów. Korzystnie, gdy kompozycja jest w formie szczepionki. Korzystnie, gdy wydajność systemu wynosi co najmniej 100 tys. cząsteczek białka wprowadzanych do wnętrza jednej komórki w fuzji z domeną.

Załączone figury pozwalają na lepsze wyjaśnienie istoty wynalazku, gdzie:

Figura 1 przedstawia wnikanie dodekahedronu do ludzkich komórek HeLa w hodowli in vitro. Komórki traktowane Dd analizowane w mikroskopie konfokalnym z użyciem przeciwciała anty-Dd zielony sygnał w cytoplazmie (na czarno-białych zdjęciach biały/szary). Jądra komórkowe wybarwiono DAPI na niebiesko (na czarno-białych fotografiach widoczne na szaro).

Figura 2 przedstawia stabilność termiczną Dd w zależności od pH i siły jonowej. Dd w 150 mM NaCl badano metodą dynamicznego rozproszenia światła (DLS) w różnych pH, przy temperaturze wzrastającej o 2°C co 2 min w zakresie od 12 do 65°C. (B) Analiza Dd i pentametrycznych baz (Pb) w buforze CAPS pH 9 i w buforze węglanowym pH 10. Niektóre próby zostały poddane zmianom temperatury imitującym warunki DLS. (C) Analiza DLS przeprowadzona na Dd w PBS, w warunkach różnej siły jonowej. Podano wartości średnie dla 3 odczytów aparatu.

Figura 3 przedstawia stabilność Dd podczas liofilizacji, w komórkach HeLa oraz w surowicy ludzkiej. (A) Oczyszczone rDd były dializowane przez noc w temperaturze 4°C do wody lub 150 mM siarczanu amonu w wodzie. Do prób oznaczonych „krioprotektant +” dodawano mannitol (0,4%) i sacharozę (0,4%). Próbki Dd zamrażano w -80°C, lub suszono w speed-vacu, lub liofilizowano. Odwodnione próby zawieszano w wyjściowej objętości wody. Próby wirowano przez 30 min przy 13000 rpm, a stan białek w supernatancie analizowano za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym. (B) Stabilność Dd w hodowli komórek HeLa. Na 2x10⁴ komórek nałożono oczyszczone rDd (2 pg/100 pl). Po określonych czasach penetracji lizaty komórkowe rozdzielano w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących (lewy panel) albo w żelu agarozowym w warunkach niedenaturujących (dwa prawe panele). W obu przypadkach prowadzono analizę metodą Western blot, stosując przeciwciała anty-Dd. Kontrolne próby Dd zawierały 30 ng białka, a próba pentametrycznych baz (Pb) 10 ng białka. (C) Stabilność Dd w surowicy ludzkiej. Próbki Dd zatężone przez ultrafiltrację w Microcon (Millipore) (porcje 5 pg), zostały poddaje inkubacji w surowicy ludzkiej (SL) przy temperaturze 4°C przez 2 godz. (ścieżka 4) i przy 37°C przez 15 min albo 2 godz. (odpowiednio ścieżki 5 i 6). Próby rozdzielano w żelu agarozowym w warunkach niedenaturujących, a następnie analizowano metodą Western blot z użyciem przeciwciała rozpoznającego Dd. Górna część przedstawia żel wybarwiony CBB z białkami pozostałymi po transferze, a dolna wywołany Western blot. Ścieżki 1 i 7 odpowiadają próbkom Dd bez surowicy, odpowiednio - nie traktowanym i inkubowanym przez 2 godz. przy 37°C. Ścieżki 2 i 3 odpowiadają surowicy ludzkiej inkubowanej przez 2 godz., odpowiednio przy 4 i 37°C.

Figura 4 przedstawia zmodyfikowany test ELISA wykazujący interakcję Dd z fuzyjnym białkiem GST-M1 WW, wykonany tak jak opisano w przykładzie III.

Figura 5 przedstawia internalizację kompleksu Dd z GST-M1WW. Kompleksy Dd z GSTM1WW, otrzymane w wyniku połączenia składników w różnych proporcjach, wprowadzano do komórek HeLa. Wydajność internalizacji analizowano stosując przeciwciała anty-Dd i antyGST: (A) metodą Western blot; (B) w mikroskopie konfokalnym. Widoczny jest zielony sygnał pochodzący od Dd (na czarno-białych zdjęciach - biały/szary) i czerwony - od GST-M1WW (na czarno-białych zdjęciach biały/szary).

Figura 6 przedstawia aktywację mieloidalnych komórek dendrycznych (ang. myeloid dendritic cells, MDC) przez dodekahedron. MDC traktowane Dd analizowano: (A) w mikroskopie konfokalnym

PL 222 497 B1 stosując przeciwciało anty-Dd - zielony sygnał w cytoplazmie (na czarno-białych zdjęciach biały/szary); (B) w cytometrze przepływowym badając indukcję markerów powierzchniowych: CD40, CD80, CD83 i CD86; (C) w mikroskopie optycznym obserwując zmiany morfologiczne. Komórki kontrolne traktowano buforem lub lipopolisacharydem (LPS).

Figura 7 przedstawia prezentację krzyżową peptydu M1 względem specyficznych limfocytów T. Komórki dendrytyczne naładowane Dd lub samym antygenem M1WW, lub też kompleksem Dd-M1WW, były inkubowane z limfocytami T specyficznymi dla immunodominującego epitopu białka M1. Po 24 godzinach ko-kultury, supernatanty były zbierane a ich zawartość interferonu gamma (IFNy) była mierzona przy zastosowaniu cytometrii przepływowej. Otrzymane wyniki wskazują, że kompleks Dd-M1WW został skutecznie pobrany i przetworzony przez DC, prowadząc do zaprezentowania peptydów utworzonych z białka M1 T limfocytom uczulonym na białko M1.

Poniżej zaprezentowano przykładowe realizacje zdefiniowanego powyżej wynalazku.

Przykłady

Z białka adenowirusa odpowiedzialnego za endocytozę twórcy skonstruowali cząsteczki wirusopodobne określane tu jako Dd i zastosowali Dd jako platformę do przenoszenia antygenów grupy. Wektor ten wykazuje wiele ciekawych właściwości. Dd w sposób bardzo skuteczny penetruje komórki, jest stabilny do temp. 50°C, można go także przechowywać w stanie zamrożonym i/lub liofilizować (Zochowska i wsp., 2009). Jego rozmiary wynoszą w przybliżeniu 40 nm, co sugeruje, że w przeciwieństwie do większych VLP (500 do 2000 nm) Dd będzie zdolny do dotarcia nie tylko do komórek dendrytycznych znajdujących się w obszarze iniekcji, ale także do komórek dendrytycznych rezydujących w oddalonych węzłach chłonnych. Ponadto, przyłączenie antygenu uzyskiwane jest poprzez łącznik białkowy otrzymany z białka drożdży, co powinno wyeliminować niebezpieczeństwo ewentualnej reakcji autoimmunologicznej. Poza tym, wydajność produkcji rekombinowanego Dd w systemie bakulowirusa jest porównywalna z najbardziej wydajnymi systemami bakteryjnymi (ok. 10 mg Dd ze 100 ml) hodowanych komórek owadzich (Zochowska i wsp., 2009; Song i wsp., 2008).

Dd z przyłączonym peptydem antygenicznym penetruje do wnętrza komórek dendrytycznych i wywołuje ich dojrzewanie co prowadzi do skutecznej prezentacji peptydu limfocytom T CD8+. Wyzwalana przez ten kompleks reakcja limfocytów T powinna zapewnić wystarczającą ochronę przed zachorowaniem na grypę. Ponadto, ze względu na to, że antygeny rozpoznawane przez komórki T są otrzymywane z wewnętrznych białek wirusowych, które są konserwowane bardziej niż białka zewnętrzne, rozwiązanie to dostarcza szczepionkę, którą charakteryzuje szerokie spektrum działania skierowane przeciwko różnym szczepom wirusa grypy. Biotechnologiczne rozwiązania stosowane w niniejszym wynalazku pozwolą na dodanie wielorakich epitopów w celu uniknięcia ucieczki immunologicznej wirusa, oraz na uzupełnienie szczepionki o dodatkowe antygeny rozpoznawane przez limfocyty T CD4+. Co niebagatelne, zastosowanie symetrycznego poliwalentnego wektora jako składnika szczepionki wzmacnia prezentację antygenów.

Reasumując, Zgłaszający wykazali, że przyłączenie antygenu grypy do dodekahedronu adenowirusa nie hamuje znakomitej wydajności penetracji Dd, co można zaobserwować dzięki wysokiemu transferowi antygenu do komórek dendrytycznych. Ponadto, szczepionka w formie niekowalencyjnego kompleksu wektora z antygenem powoduje aktywację komórek dendrytycznych. W efekcie, nowa szczepionka zapewnia skuteczne pobranie, przetworzenie oraz prezentację antygenu poprzez DC.

Zgłaszający w swoich pracach stwierdzili, że dodekahedrony wnikają do komórek wydajniej niż adenowirus serotypu 3 (Ad3), z którego pochodzą, transdukując 100% komórek w hodowli komórkowej, przy czym są w stanie transdukować również komórki niepermisywne dla Ad3.

Dodekahedron, z którym pracują Zgłaszający, pochodzi z serotypu 3, należącego do podgrupy B o tropizmie skierowanym na układ oddechowy i wzrokowy. Dzięki temu, że sekwencje aminokwasowe bazy podstawy pentonu i białka włókna niezbędne do utworzenia pentonu, a więc i dodekahedronu zaopatrzonego w białko włókna, są silnie zakonserwowane, można, poprzez manipulacje genetyczne, utworzyć Dd chimeryczny, o zmienionym tropizmie tkankowym. Przykładem może być Dd pochodzący z Ad3, który dzięki zaopatrzeniu w krótkie białko włókna Ad41 będzie miał powinowactwo do ludzkiego układu trawiennego.

Podjęto prace własne dotyczące dodekahedronu adenowirusa. Prace te dotyczyły nadprodukcji, oczyszczania i charakterystyki dodekahedronów, jak również ich zastosowania dla wewnątrzkomórkowego dostarczenia czynników terapeutycznych, opierając się na przykładzie dostarczenia białka terapeutycznego, poprzez użycie specyficznego łącznika. Prace te obejmowały:

PL 222 497 B1

- Otrzymanie wysokiej jakości preparatów oczyszczonych do homogenności kodekahedronów. Preparaty te są pozbawione białek, kwasów nukleinowych, oraz proteaz pochodzących z komórek, w których odbywa się nadprodukcja Dd.

- Zbadanie warunków stabilności wektora. Wykazano, że takie czynniki jak pH, siła jonowa i temperatura wpływają na integralność Dd. Opracowano warunki pozwalające na przechowywanie, przesyłanie oraz użycie preparatów Dd w różnych warunkach klim atycznych, również tropikalnych.

- Skonstruowanie specyficznego dla Dd łącznika pochodzącego z białka nie ssaczego, pozwalającego na niekowalencyjne przyłączenie każdego białka lub peptydu do Dd i uniesienie tego białka/peptydu do komórki docelowej, zwłaszcza do wprowadzania czynników terapeutycznych do tkanek, zwłaszcza szczepionek do tkanek zwierząt, zwłaszcza ssaków.

W sposobie według wynalazku Zgłaszający wykazali, że pochodzące z białka drożdży Rsp5 trzy domeny WW w tandemie pełnią rolę uniwersalnego adaptatora umożliwiającego przyłączenie dowolnego białka do dodekahedronów i przeniesienie do komórek docelowych. Wydajność tego systemu jest zaskakująco wysoka - około 10-20 milionów cząsteczek białka w fuzji z domeną WW może być wprowadzonych do wnętrza jednej komórki.

Okazało się, że opracowana według wynalazku wektorowa cząsteczka wirusopodobna umożliwia uzyskanie przenikania czynników terapeutycznych, takich jak białka czy peptydy, przez błony komórkowe (Garcel i wsp., 2006). Wiadomo, że motyw RGD oddziałuje z integrynami av, których poziom jest podwyższony w komórkach endotelialnych wyłącznie w nowopowstających naczyniach doprowadzających krew do tkanki nowotworowej (Chen, 2006). Motyw ten znajduje się w białku podstawy pe ntonu, z którego jest zbudowany Dd, tak więc Dd zawierający 60 motywów RGD, jest bardzo specyfic znym ligandem dla av integryn, a jednocześnie posiada wysoką zdolność penetracji komórek dzięki swojej aktywności endosomolitycznej oraz powinowactwu do siarczanów heparanowych. Wskazuje to, że użycie Dd do dostarczania czynników terapeutycznych oznacza jednocześnie specyficzne ukierunkowanie tych czynników do nowopowstających naczyń krwionośnych odżywiających guzy nowotworowe. Wykorzystanie Dd jako wektora dla przeniesienia białkowych/peptydowych czynników terapeutycznych

Dostarczanie białek z użyciem Dd jest bardzo wydajnym procesem, w trakcie którego 100% komórek jest transdukowanych (fig. 1). Wykazano również, że duże multimeryczne białka, takie jak przeciwciała monoklonalne rozpoznające dodekahedron, mogą być wydajnie wprowadzane do cytoplazmy na powierzchni dodekahedronów (Fender i wsp., 2003), co wskazuje na ogromną wydajność transdukcji z użyciem Dd.

P r z y k ł a d: Dostarczenie antygenu wirusa grypy, białka M1

W celu skonstruowania nowej szczepionki grypy wybrano jedno z bardziej stabilnych genetycznie białek grypy, białko macierzy 1 (M1), w celu dostarczenia go na platformie utworzonej przez cząsteczki dodekahedronu adenowirusa, zbudowanego z białka podstawy pentonu adenowirusa. Zgłaszający zaproponował użycie domen WW dla przyłączenia antygenu grypy do Dd. Fuzyjne białko antygenowe, według wynalazku, zawiera białko M1 w fuzji genetycznej z łącznikowym białkiem WW, pochodzącym z drożdżowego białka Rsp5.

Białko antygenowe otrzymano przez namnożenie w E. coli. Oddziaływanie wektora Dd z antygenem zostało potwierdzone za pomocą zmodyfikowanego testu ELISA. Pomyślna internalizacja utworzonego kompleksu w komórkach HeLa była obserwowana przy użyciu metod biochemicznych i techniki mikroskopii konfokalnej. Ponadto, internalizacja dodekahedronu wywołała aktywację ludzkich komórek dendrytycznych. Zaproponowaliśmy zastosowanie dodekahedronu niosącego białko wirusa grypy jako szczepionki przeciwgrypowej. Udowodniliśmy, że taki model szczepionki jest wykonalny i że Dd może być platformą dostawy obcych antygenów do ludzkich komórek.

W sposobie według wynalazku, żeby przyłączyć białko M1 do wektora Dd, wykorzystano białko łącznikowe WW, oddziaływujące z dodekahedronem przez jego motywy PPxY. Otrzymanie fuzji genetycznej antygenu grupowego z domeną WW pozwala na przyłączenie antygenu do wektora. Ten wynalazek opisuje syntezę, izolowanie i konstrukcję nowej szczepionki grypy jak również funkcjonalne analizy tej szczepionki.

PL 222 497 B1

Aktywacja mieloidalnych komórek dendrycznych (ang. myeloid dendritic cells, MDC) przez dodekahedron

Komórki dendryczne (DC) są znane jako najbardziej wszechstronne komórki prezentujące antygen. Główne funkcje komórek dendrytycznych to pochwycenie, przeniesienie do węzłów chłonnych prezentacja antygenu limfocytom T, co prowadzi do zapoczątkowania odpowiedzi immunologicznej na dany antygen. Zgłaszający wykazał, że sam wektor dodekahedryczny może aktywować ludzkie komórki dendrytyczne co powinno pozwolić na wzmocnienie odpowiedzi komórek T (przykład V). Internalizacja szczepionki (kompleksu Dd z anty genem GST-M1WW)

Kompleks Dd z GST-M1WW, sposobem według wynalazku, otrzymano przez zmieszanie oczyszczonego wektora z antygenem, w różnych proporcjach. Kompleks ten wprowadzono do komórek HeLa. Wydajność internalizacji była oceniana przy pomocy immunochemicznej metody Western blot. Najlepsza internalizacja zachodziła przy aplikacji 30 pg kompleksu zawierającego 5 pg Dd oraz 25 pg antygenu. Równolegle, internalizacja szczepionki była obserwowana przy pomocy mikroskopii konfokalnej. Komórki HeLa zostały poddane inkubacji z kompleksem składającym się z Dd wraz z GST-M1WW w stosunku wagowym 1:10, jak również z samym Dd. Lokalizacja szczepionki została zbadana po 1 godz. internalizacji. Kompleks skutecznie internalizował się do komórek HeLa, gdzie był równomiernie rozprowadzony w cytoplazmie.

W sposobie według wynalazku użyto białkową domenę WW, która, jak wykazano, posiada szczególne powinowactwo do wektora dodekahedrycznego. W niniejszym patencie wykorzystano domenę WW pochodzącą z białka drożdżowego. W sposobie według wynalazku Dd jako białko rekombinowane (rDd) jest uzyskiwany z nadzwyczaj dużą wydajnością w komórkach owadzich w systemie bakulowirusa. Produkcja wynosi 10 mg rDd ze 100 ml zawiesiny komórek. Jest to wydajność nadprodukcji porównywalna z tą, którą otrzymuje się w najbardziej wydajnych układach bakteryjnych. Dotychczas rDd oczyszczano jedynie przez ultrawirowanie w gradiencie sacharozy. Etap ten umożliwia wyeliminowanie nisko- i średniocząsteczkowych białek komórkowych, ale nie kwasów nukleinowych, najprawdopodobniej przyłączonych do powierzchni rDd. Planowane terapeutyczne zastosowanie rDd wymagało przygotowania lepiej oczyszczonego i bardziej homogennego preparatu, co osiągnięto stosując 2-etapowy proces oczyszczania białka. Po wstępnym oczyszczeniu rDd w gradiencie sacharozy zastosowano chromatografię jonowymienną. Otrzymano frakcję czystych rDd (powyżej 95% czystości), co stwierdzono analizując preparaty metodami elektroforezy na żelach poliakrylamidowych oraz przy pomocy mikroskopii elektronowej.

Przeprowadzone badania biochemiczne oraz biofizyczne (mikroskopia elektronowa, elektroforeza na żelu agarozowym w warunkach niedenaturujących oraz na żelach poliakrylamidowych w warunkach denaturujących, jak również pomiary z zastosowaniem metody dynamicznego rozpraszania światła (DLS)) wykazały, że rDd jest trwały do 40°C w szerokim zakresie pH, a do około 50°C w pH 7-8, przy fizjologicznym stężeniu NaCl (150 mM). Odkryto, że warunki podwyższonej siły jonowej znacząco stabilizują jego strukturę, gdyż wtedy rDd nie ulega denaturacji aż do 60°C. Cząsteczka wektora zachowuje integralność podczas dializy, po zamrożeniu, suszeniu w speed-vacu oraz liofilizacji w obecności krioprotektanta. Wysoka stabilność wektora ułatwia zarówno pracę z rDd, jak i jego przechowywanie (przykład II).

Ponadto stwierdzono, że rDd utrzymuje integralność w warunkach imitujących jego zastosowanie in vivo, a mianowicie jest stabilny w surowicy ludzkiej w temperaturze 37°C przez co najmniej godziny. Oczyszczone zgodnie z opracowaną przez Zgłaszających procedurą rekombinowane dodekahedrony wydajnie wnikają do ludzkich komórek nowotworowych hodowanych in vitro. Wyniki te pozwalają na zastosowanie rDd jako wektora przy różnorodnych aplikacjach i przy różnorodnych warunkach klimatycznych.

Opisane powyżej właściwości Dd, implikują możliwość wykorzystania tego wektora dla dostarczenia czynników terapeutycznych do tkanek ludzkich. Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.

P r z y k ł a d I

Sposób wytwarzania dodekahedronu adenowirusowego

Planowane przez nas zastosowanie terapeutyczne rDd wymagało przygotowania homogennego preparatu, co osiągnięto stosując 2-etapowy proces oczyszczania białka. Po wstępnym oczyszczeniu rDd w gradiencie sacharozy zastosowano niskociśnieniową chromatografię jonowymienną. Otrzymano frakcję czystych rDd, drugą frakcję zawierającą wolne pentametryczne bazy (składnik bu10

PL 222 497 B1 dulcowy Dd), oraz trzecią frakcję zawierającą kwasy nukleinowe, co wskazuje jak mało homogenny jest preparat Dd uzyskiwany przy jednostopniowym oczyszczaniu.

Na wstępie otrzymano zrekombinowany bakulowirus zawierający gen dla całkowitego białka podstawy pentonu ludzkiego Ad3 (Fender i wsp., 1997), Amplifikacja zrekombinowanego bakulowirusa niosącego gen białka podstawy została wykonana w jednowarstwowej hodowli komórek Spodoptera frugiperda (Sf21). Komórki utrzymywano w medium TC100, zawierającym 5% płodową surowicę cielęcą (Invitrogen). Dd nadprodukowano w komórkach Trichoplusia ni (T. ni, in. HF) hodowanych w zawiesinie w medium Express Five SFM (Invitrogen) z gentamycyną (50 mg/l) i amfoteryną B (0.25 mg/l). Komórki HF infekowano zrekombinowanym bakulowirusem przy MOI (ang. multiplicity of infection) równym 4 jednostkom tworzącym łysinkę/komórkę. Po 48 godz. od momentu infekcji komórki zostały zebrane i lizowane przez trzykrotne zamrażanie i rozmrażanie. Supernatant otrzymany po odwirowaniu lizatu nanoszono na 15-40% gradient sacharozy (Fender, 1997). Uzyskany po ultrawirowaniu preparat VLPs odzyskiwanych w 30-40% sacharozie, był zanieczyszczony innymi białkami i kwasami nukleinowymi. Końcowe oczyszczenie Dd zostało osiągnięte przez chromatografię na kolumnie jonowymiennej, prowadzącą do otrzymania dodekahedronów jako homogennej frakcji. Stan oligomeryczny cząsteczek analizowano w natywnych żelach agarozowych oraz przy zastosowaniu mikroskopii elektronowej, a stopień czystości otrzymanego preparatu oceniano w żelach poliakrylamidowych.

P r z y k ł a d II

Badania trwałości i stabilności dodekahedronu adenowirusowego

Przetestowano stabilność i rozpuszczalność oczyszczonych cząsteczek Dd. W tym celu oczyszczone rDd były dializowane do różnych buforów (z 3 zmianami każdego) i następnie inkubowane w 30 albo 37°C. Po inkubacji, próby wirowano, a stan białek w supernatancie analizowano za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym.

Cząsteczki Dd były rozpuszczalne w 4°C przy pH od 4 do 10,9, w obecności 150 mM NaCl. W nieobecności NaCl Dd nie utrzymuje się w roztworze, znikając z supernatantu podczas wirowania, co pozwala stwierdzić, że NaCl w stężeniu fizjologicznym chroni Dd przed denaturacją.

Żeby zbadać odporność Dd na denaturację cieplną, użyto techniki dynamicznego rozproszenia światła (DLS), która pozwala na monitorowanie denaturacji lub rozpadu białka. Próbki białka (0,2 mg/ml) były dializowane i przefiltrowane (przez filtry o porach 0,45 pm) do odpowiednich buforów. Próbki umieszczano w kuwecie (45 pl, Greiner, Frickenhausen, Niemcy) i przy pomocy aparatu ZS Nano Zetasizer (Malvern, Worcestershire, GB) prowadzono zautomatyzowane pomiary wielkości cząsteczek. Temperatura zmieniała się o 2°C co 2 min w zakresie od 12 do 65°C. Dane zostały ocenione z zastosowaniem metody kumulacyjnej (fig. 2A).

W zakresie pH 4-9 wielkość cząsteczki była stabilna do 40°C. Powyżej tej temperatury wielkość cząsteczki zwiększała się wykładniczo wraz ze wzrostem temperatury, co wskazuje na zajście denaturacji. Denaturacja/agregacja Dd rozpoczyna się w pH 4-5 w temperaturze niższej o około 10°C niż w pH 7-8. W pH 9 (bufor CAPS) i 10 (bufor węglanowy) następują niewielkie zmiany wielkości cząstek. Analiza białek w natywnych żelach agarozowych wykazała, że przy pH 10 Dd dysocjuje do wolnych zasad, a w pH 9 (bufor CAPS) białko znika, najprawdopodobniej w wyniku agregacji. Należy zauważyć, że CAPS jest organicznym buforem, który może mieć skłonność do oddziaływania z fragmentami hydrofobowymi na powierzchni białka, co może prowadzić do agregacji (fig. 2B)).

Dodanie 750 mM NaCl do PBS spowodowało podwyższenie temperatury topnienia (Tm) Dd, co wskazuje na stabilizację struktury (fig. 2C). Ale najbardziej znaczący wzrost wartości Tm został spowodowany przez dodatek siarczanu amonu (pozytywne przesunięcie o około 12°C (fig. 2C)).

Przeprowadzone badania wykazały, że cząsteczka wektora/Dd zachowuje integralność podczas dializy, zamrażania i rozmrażania oraz suszenia w speed-vacu w obecności 150 mM siarczanu amonu. Dla zachowania struktury Dd podczas liofilizacji niezbędna jest obecność krioprotektanta (fig. 3A). Trwałość wektora w kulturze komórkowej została przetestowana w komórkach HeLa, w różnych okresach po podaniu Dd, w następujący sposób. Komórki HeLa (2x10⁴ komórek) zostały umieszczone na płytkach. Medium zostało usunięte, i nałożono oczyszczony Dd (4 pg/100 pl, 10,8 nM) w medium EMEM bez FCS, następnie komórki umieszczono w inkubatorze. Trzy godziny po podaniu Dd, do medium dodano FCS do 10% końcowego stężenia. Komórki zbierano we wskazanych okresach (fig. 3B), lizowano w roztworze Laemmli lub w buforze hypotonicznym. Próbki zawierające połowę ekstraktu komórkowego rozdzielano w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących

PL 222 497 B1 (SDS-PAGE), a drugą połowę - w żelu agarozowym w warunkach niedenaturujących, po czym w obu przypadkach prowadzono analizę metodą Western blot, stosując przeciwciała anty-Dd.

Ilość wewnątrzkomórkowego Dd wzrastała do 32 godz. po transdukcji, z widoczną proteolizą, w wyniku czego po 4 dniach w komórkach pozostała tylko część białka bazy (fig. 3B, lewy panel). Analiza w natywnym żelu agarozowym wykazała, że 96 godz. po penetracji, większość wewnątrzk omórkowego materiału migrowała pomiędzy Dd i Pb, co sugeruje usunięcie zewnętrznych pętli Dd, przy zachowaniu integralności cząstki.

Stabilność Dd podczas inkubacji w ludzkiej surowicy

Próbki Dd (porcje 5 pg) zatężone przez ultrafiltrację w Microcon (Millipore), zostały poddane inkubacji w ludzkiej surowicy (SL) w temperaturze 4°C przez 2 godz., oraz w temp. 37°C przez 15 min albo 2 godz. Dd zachowuje integralność w warunkach imitujących jego zastosowanie in vivo, a mianowicie w świeżo przygotowanej surowicy ludzkiej w 37°C jest stabilny przez co najmniej dwie godziny (fig. 3C).

Przedstawione wyniki wskazują na to, że Dd może być dogodnie magazynowany i transportowany oraz potencjalnie może zostać użyty do terapeutycznych celów w różnych warunkach klimatycznych.

P r z y k ł a d III

Sposób wytwarzania wektorowej cząsteczki dodekahedronu adenowirusowego z białkiem WW oraz antygenem wirusa grypy

Domeny WW: klonowanie, ekspresja i oczyszczanie

WW1,2,3 pochodzące z drożdżowego białka Rsp5 pierwotnie zostały umieszczone w plazmidzie pY11. Fragment DNA zawierający gen WW1,2,3 (Rsp5) został zsyntetyzowany przez PCR przy wykorzystaniu starterów 5'-TTA TTC GAA CCG CCC TGG GOT CCT GA-3' i 5'-ATG ATG GCG CTA GGT GTT CGA GCT TAC GTA G-3' (miejsca rozpoznawane przez enzymy EcoRI i XhoI są zaznaczone pogrubionym drukiem) i wklonowany do plazmidu pGEX-4T-1 w celu otrzymania fuzji z białkiem z GST. Prawidłowość klonowania została potwierdzona przez sekwencjonowanie DNA.

Białko fuzyjne GST-WW było nadprodukowane w szczepie E. coli Rosetta 2 (DE3) (Novagen). Bakterie hodowano w 37°C i przy gęstości optycznej OD_600nm około 0,6 indukowano produkcję białka w obecności 0,4 mM (końcowa koncentracja) IPTG przez 4 godziny. Białko zostało oczyszczone na złożu Glutathion-Sepharose 4B i przeanalizowane przy pomocy SDS-PAGE i Western Blot. Klonowanie, nadprodukcja i oczyszczanie białka GST-M1WW

Gen kodujący białko macierzy 1 (M1) wirusa grypy (szczep Puerto Rico/8/34 35 H1N1), pierwotnie dostarczony w pET15b został zsyntetyzowany przez PCR, z zastosowaniem 3'-końcowego startera GGA C GGT CGA AAC TCT TCT GAG TAT CCA ATT' i 5'-końcowego startera GGA C GGT CGA AAC TCT TCT GAG TAT CCA ATT' (miejsce rozpoznania przez enzym restrykcyjny EcoRI jest zaznaczone pogrubionym drukiem) i wklonowany do plazmidu pBlucScript. Następnie, uzyskany gen białka M1 ligowano w miejsce EcoRI plazmidu pGEX-4T-1 posiadającego gen fuzyjny GST-WW, umieszczając gen M1 między GST i domeną WW. Prawidłowość sekwencji klonowanego białka GSTM1WW została potwierdzona za pomocą sekwencjonowania DNA.

Szczep E. coli Rosetta 2 (DE3) (Novagen) transformowano plazmidem niosącym gen GSTM1WW, komórki hodowano w 37°C i przy gęstości optycznej OD600nm około 0,6 indukowano produkcję białka za pomocą 0,4 mM (końcowa koncentracja) IPTG przez 4 godziny. Rekombinowane białko fuzyjne było nierozpuszczalne podczas nadprodukcji w E. coli. Ekstrahowano je w obecności 5 mM TCEP [Tris (2-karboxyetylo-fosfiny] i 4,5% N-laurylosiarczanu w 50 mM buforze Tris, pH 8, zawierającym 50 mM NaCl, 0,5 mM EDTA i 5% glicerol, stosując kit iFold (Merck). By usunąć N-laurylosiarczan, supernatanty uzyskane z lizatów komórkowych przez wirowanie (14000 obrotów przez 30 min w 4°C) dializowano do 50 mM buforu Tris, pH 7.5, zawierającego 100 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10% glicerol i 12,5 mM cyklodekstrynę. Białko fuzyjne GST-M1WW zostało oczyszczone na kolumnie GlutathionSepharose-4B (Amersham), przy pomocy 20 mM zredukowanego glutationu w 50 mM buforze Tris, pH 8,5, zawierającym 100 mM NaCl. Etykietka (tag) GST została odtrawiona za pomocą hydrolizy trombiną (Amersham), przez 8 godzin w temperaturze pokojowej, z 10U enzymu dla 100 pg białka. Etykietka GST została całkowicie usunięta przez elektroforezę na żelu poliakrylamidowym, a białko fuzyjne M1WW wyeluowane elektroforetycznie do worka dializującego (Novagen) zostało wytrącone przy pomocy 4 M (NH4)2SO4 (końcowe stężenie). Otrzymany osad białka został zawieszony w 50 mM buforze Tris, pH 7,5, zawierającym 100 mM NaCl, 0.5 mM TCEP, 5% glicerol i 0,05% N-laurylosiarczanu. Z 500 ml kultury bakteryjnej uzyskano w przybliżeniu 1 mg oczyszczonego białka.

PL 222 497 B1

Oddziaływanie Dd z białkami fuzyjnymi zawierającymi domeny WW

Do analizy oddziaływania Dd z białkami fuzyjnymi użyto zmodyfikowany test ELISA. Płytka 96-dołkowa została pokryta preparatem Dd (100 pg/ml w PBS) i pozostawiona na noc w temp. 4°C. Następnego dnia niezaabsorbowana część wektora została usunięta, a jego ilość została zmierzona przy użyciu aparatu Nanodrop, co pozwoliło na obliczenie ilości związanego Dd. Płytki przemyto PBS. Następnie dodano wzrastające stężenia oczyszczonych białek GST-WW do części dołków, a do innych dołków - GST-M1WW. Całość pozostawiono na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Roztwór z niezwiązanymi białkami usunięto i po zablokowaniu przez 1 godzinę w temp. 37°C przy użyciu 5% albuminy wołowej (BSA) w PBS dodano przeciwciało anty-GST-HRP i inkubowano przez 1 godzinę w temp. 37°C. Płytki zostały przemyte 3 razy 5-procentowym roztworem BSA w PBS, po czym reakcja barwna została uzyskana przy pomocy odczynnika TMB (Sigma) i zablokowana 1N HCl. Absorpcja światła była mierzona przy długości fali 480 nm, przy użyciu fluorymetru BIO-TEK Synergy HT (fig. 4).

Ten eksperyment potwierdził oddziaływanie GST-M1 WW z Dd i pozwolił oszacować ilość GSTM1WW jaką można przyłączyć do Dd. Stwierdzono, że około 2,5 pg Dd pokryło każdą studzienkę. Taka ilość Dd może przyłączyć około GST-M1WW, co odpowiada około 10-krotnemu wagowemu nadmiarowi.

Internalizacja GST-M1WW w kompleksie z Dd

Trzy różne kompleksy Dd-GST-M1 WW zostały przygotowane przez inkubację przez 1 godzinę w temp. pokojowej preparatów Dd i GST-M1WW w stosunkach wagowych 1:5; 1:10 i 1:15. Komórki HeLa umieszczono w 24-dołkowej płytce (1x10 komórek na dołek) i po 16 godz. hodowli traktowano je 15 pg i 30 pg porcjami kompleksu, w dwóch powtórzeniach. W sposób analogiczny dodano sam wektor oraz samo białko fuzyjne GST-M1WW do komórek kontrolnych, w ilościach odpowiadających tym użytym do utworzenia kompleksu.

Po dwu i pół godzinnej inkubacji w temp 37°C komórki przemyto PBS, oddzielono je od płytek przy użyciu wersenu i zebrano przez wirowanie przy 500 x g przez 5 min. Następnie komórki lizowano za pomocą 50 pl buforu Reporter Lysis Buffer (Promega) i analizowano metodą Western blot, z przeciwciałami anty-GST-HRP (1:50000, Amersham) albo anty-Dd (1:40000). Membrany zawierające białko były wywołane przy pomocy systemu ECL (Amersham Biosciences, Piscataway NJ, USA) z użyciem Hyperfilmu ECL. Membrany zostały przeskanowane i zanalizowane przy użyciu skanera BioRad i oprogramowania Qantity One 4.6. Najlepszy wynik internalizacji osiągnięto przy użyciu 30 pg kompleksu zawierającego 25 pg antygenu i 5 pg Dd (fig. 5A).

P r z y k ł a d IV

Internalizacja szczepionki in vitro

Zbadano wewnątrzkomórkowe dostarczanie antygenu przy pomocy dodekahedronu metodą mikroskopii konfokalnej. Komórki HeLa, przygotowane jak powyżej na szkiełkach typu koverslip umieszczonych w dołkach 24-dołkowej płytki, inkubowano z utworzonym wcześniej kompleksem Dd i GST-M1WW w stosunku wagowym 1 do 10, jak również z samym Dd lub z samym białkiem fuzyjnym GST-M1WW. Po jednej godzinie inkubacji w temp. 37°C koverslipy z komórkami przemyto sterylnym PBS, pozostawiono w zimnym metanolu na 5 min, a następnie blokowano 5% BSA w PBS przez 30 min w 37°C. KoversIipy przepłukano w PBS i inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami. Królicze przeciwciała poliklonalne anty-Dd użyto w rozcieńczeniu 1:1000, mysie przeciwciała monoklonalne anty-GST (Sigma) użyto w rozcieńczeniu 1:250 do wykrycia antygenu GST-M1WW, każde przez godzinę w temp 37°C. Jako przeciwciała drugorzędowe użyto przeciwciało anty-królicze znakowane Texas Red i anty-mysie znakowane FITC, w rozcieńczeniach 1:250. Jądra barwiono przy pomocy odczynnika DAPI (1 pg/ml). Przed obserwacją preparaty przemyto ponownie PBS, a następnie zamontowano koverslipy na podstawowych szkiełkach mikroskopowych. Preparaty obserwowano przy pomocy skanującego laserowego mikroskopu konfokalnego a zdjęcia wykonano używając programu EZ-C1 Free Viewer (Nikon). Kompleks skutecznie internalizował się do komórek HeLa i był równomiernie rozmieszczony w cytoplazmie (fig. 5B).

P r z y k ł a d V

Aktywacja mieloidalnych komórek dendrycznych (ang. myeloid dendritic cells, MDC) przez dodekahedron

Internalizacja Dd do MDC została potwierdzona przy pomocy mikroskopii konfokalnej (fig. 6A). Równolegle monitorowano wywołaną przez kontakt z Dd indukcję markerów aktywacji: CD40, CD80, CD83 i CD86, na powierzchni MDC. Aplikacja Dd wywołała po 24 godzinach indukcję trzech z czterech markerów (fig. 6B). Równoległa obserwacja przy pomocy mikroskopu optycznego wykazała

PL 222 497 B1 zmiany morfologiczne charakterystyczne dla dojrzałych MDC (fig. 6C). Te wyniki potwierdzają, że sam dodekahedron wywołuje dojrzewanie komórek dendrytycznych.

P r z y k ł a d VI

Analiza kinetyki internalizacji kompleksu antygenu Dd przez mieloidalne komórki dendrytyczne

Kompleks Dd-WW 1,2,3 (RSP5) został uformowany w temperaturze pokojowej poprzez 1-godzinną inkubację 20 pg Dd z 60 pg WW1.2,3 Rsp5 (w połączeniu z GST). Porcje roztworu kompleksu (100 pl) były dodawane do czterech porcji komórek, zawierających 3.8 x 10⁵ MDC w 1 ml PBS każda. Równolegle MDC inkubowano z samym Dd w ilości 20 pg. Komórki były zbierane po upływie 30 min, 60 min, 90 min i 120 min inkubacji, przemyte sterylnym PBS i utrwalane zimnym metanolem (-20°C, przez 30 min). Dla detekcji kompleksu zastosowano króliczą poliklonalną surowicę rozpoznającą Dd w rozcieńczeniu 1:500 i mysie monoklonalne anty-GST (Sigma Aldrich, St. Louis, US) w stosunku 1:250, każde przez 1 godz. w 37°C. Drugorzędowe przeciwciała anty-królicze-PE i anty-mysieFlTC (oba z Jackson ImmunoResearch, Baltimore Pike, US) były używane w stosunku 1:250, przez 30 min, w lodzie. Porcja komórek bez dodatku białek była inkubowana z przeciwciałami, w celu określenia sygnału tła. Analiza kinetyczna internalizacji kompleksu przez komórki dendrytyczne została dokonana przy zastosowaniu analizy cytometrii przepływowej przy użyciu aparatu FACScan (Becton Dickinson), a wyniki zostały poddane analizie z zastosowaniem programu Cellquestpro.

P r z y k ł a d VII

Otrzymanie skierowanych przeciw grypie limfocytów T i krzyżowa prezentacja białka M1 przez mieloidalne komórki dendrytyczne

Limfocyty T otrzymane po pobraniu od zdrowych dawców HLA-A*0201 (którzy udzielili świadomej zgody) zostały specyficznie uczulone na immunodominujący peptyd 58-66 białka M1 (Manches i wsp., 2008). Peryferyjne komórki mononuklearne krwi zostały oczyszczone przez wirowanie w gradiencie gęstości i zamrożone. Komórki dendrytyczne mieloidalne (MDC) były uzyskiwane z oczyszczonych monocytów i dojrzewały przez dwa dni w obecności CD40L (Alexis Biochemicals, Lausanne, Switzerland). Dojrzałe MDC były inkubowane przez 3 godziny z peptydem M1 58-66 (GlLGGFVFTTL, 1 pM, Neosystem, Strasbourg, France) w obecności 32-mikroglobuliny. Limfocyty T CD8+ zostały oczyszczone z rozmrożonych mononuklearnych komórek krwi (Peripheral Blood Mononuclear Cell, PBMC) (StemSep human CD8+ T cell enrichment kit, StemCell Technologies. Grenoble, France), i hodowane (1 x 10⁶ komórek T /ml) waz z MDC uprzednio inkubowanymi z peptydem 58-66 białka M1 (T:MDC = 10:1), w pożywce RPMl uzupełnionej 10% surowicą cielęcą (FCS). Komórki były rozcieńczane 6-go i 10-go dnia pożywką zawierającą IL2 (20 U/ml stężenie końcowe) i IL15 (25 pg/ml stężenie końcowe). Dwunastego dnia limfocyty T skierowane przeciw peptydowi 58-66 białka M1 były liczone poprzez znakowanie tetrameryczne (Beckman Coulter Inc, Fullerton, USA) i zamrożone. Preparaty zawierały powyżej 50% M1 -specyficznych limfocytów T CD8+.

Miarą prezentacji antygenu przez komórki dendrytyczne limfocytom T jest wydzielanie interferonu gamma (IFNy) przez limfocyty. W teście prezentacji, rozmrożone MDC były inkubowane przez 3 godziny z antygenem M1WW (1 pg/ml), lub z Dd (0,5 pg/ml), lub z kompleksem Dd-M1WW. Hodowle na płytkach 96-studzienkowych były inkubowane w pożywce RPMI zawierającej 10% FCS. W trzech identycznych studzienkach zmieszano MDC (10 000 komórek na studzienkę) z M1 -specyficznymi limfocytami T CD8+ (25 000 komórek na studzienkę) i hodowano przez 24 godziny. Następnie zbierano supernatanty z hodowli i ich zawartość IFNy była mierzona przy pomocy cytometrii przepływowej (Becton Dickinson).

Wyniki

Pobranie szczepionki Dd-M1WW przez mieloidalne komórki dendrytyczne i prezentacja antygenu M1 specyficznym limfocytom T

Po internalizacji kompleksu szczepionkowego Dd-M1WW przez MDC, M1-specyficzne limfocyty T zostały użyte dla dokonania oceny wydajności prezentacji antygenu. M1 -specyficzne limfocyty T. tzn. te, które pozostawały w kontakcie z komórkami dendrytycznymi pre-inkubowanymi z kompleksem DdM1WW, wydzielały IFNy, co wskazuje na wydajne pobranie, procesowanie i prezentację antygenu przez komórki dendrytyczne (fig. 6). MDC inkubowane z samym białkiem M1WW także indukowały wydzielanie IFNy przez limfocyty T, jednakże sekrecja ta była w przybliżeniu trzykrotnie niższa niż gdy białko M1 WW było w kompleksie z Dd, co wskazuje na wzmagający efekt wynikający z użycia Dd jako wektora dla dostarczenia antygenów do komórek dendrytycznych.

PL 222 497 B1

Literatura

Chen X. Mullimodality imaging of tumor integrin alphavbeta3 expression. Mini Rev Med Chem. 2006 Feb; 6(2): 227-34.

Fender P., Ruigrok R.W., Gout E.. Buffet S., Chroboczek J. (1997) Adenovirus dodecahedron, a new vector for human gene transfer. Nat. 15(1), 52-56.

Fender P., Schoehn G., Foucaud-Gamen J., Gout E., Garcel A., Drouet E., Chroboczek J. (2003) Adenovirus dodecahedron allows large multimeric protein transduction in human cells. J. Virol. 77(8); 4960-4964.

Galinier R., Gout E., Lortat-Jacob H., Wood J., Chroboczek J. (2002) Adenovirus protein invoIved in virus internalization recruits ubiquitin-protein ligases. Biochemistry 41(48): 14299-305.

Garcel A., Gout E., Timmins J., Chroboczek J., Fender P. Protein transduction into human cells by adenovirus dodecahedron using WW domains as universal adaptors. J Gene Med. 2006 Apr; 8(4): 524-31.

Koepf E.K., Petrassi H.M., Ratnaswamy G., Huff M.E., Sudol M., Kelly J.W. (1999). Characterization of the structure and function of WW domain variants: identification of a natively unfolded protein that folds upon ligand binding. Biochemistry 38(43): 14338-51.

Manches O., Lui G., Molens JP., Sotto JJ., Chaperot L., Plumas J. Whole lymphoma B cells allow efficient cross-presentation of antigens by dendritic cells. Cytotherapy 2008; 10(6); 642-9.

Manolova V., Flace A., Bauer M., Schwarz K., Saudan P., Bachmann MF. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. Eur J Immunol 2008; 38(5): 1404-13.

Pawson T. and Scott J.D. (1997) Signaling through scaffold, anchoring, and adaptor proteins. Science 278(5346): 2075-80.

Philipson L., Lonberg-Holm K., and Pettersson U. (1968) Virus-receptor interaction in an adenovirus system. J Virol. 2: 1064-75.

Song L., Nakaar V., Kavita U., Price A., Huleatt J., Tang J et al. Efficacious recombinant influenza vaccines produced by high yield bacterial expression: PLoS ONE. 2008; 3(5): e2257.

Vives R.R., Lortat-Jacob H., Chroboczek J., Fender P. (2004) Heparan sulfate proteoglycan mediates the selective attachment and internalization of serotype 3 human adenovirus dodecahedron. Virology 321: 332-40.

Valentine, R. C. & Pereira, H. G. (1965). Antigens and structure of the adenovirus. J. molec. Biol. 13, 13

Wickham T.J., Mathias P., Chcresh D.A., Nemerow G.R. (1993) Integrins alpha v beta 3 and alpha v beta 5 promote adenovirus internalization but not virus attachment. Cell 73(2); 309-319.

Wohlfart C. (1988) J. Virol. 62, 2321-232.

Zochowska M., Paca A., Schoehn G., Andrieu JP., Chroboczek J., Dublet B., Szolajska E. Adenovirus dodecahedron, as a drug delivety vector. PLoS ONE. 2009; 4(5): e5569.

Claims (15)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wektorowa cząsteczka wirusopodobna, znamienna tym, że stanowi cząsteczkę dodekahedronu adenowirusowego składającego się z pentonów lub białek podstawy pentonu, z przyłączoną domeną WW z białka grzybów, w fuzji genetycznej z białkową lub peptydową substancją terapeutyczną stanowiącą antygeny wirusa grypy, przy czym cząsteczka dodekahedronu adenowirusowego pochodzi z wirusa ssaka.
2. 2. Cząsteczka, według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera substancje terapeutyczne, w postaci fuzji genetycznej z domenami WW, przyłączone niekowalencyjnie do wektora poprzez: interakcje z motywami PPxY lub interakcje z miejscem przyłączenia partnera Dd, białka włókna adenowirusa lub interakcje z motywem RGD lub fragmentami zasadowymi lub hydrofobowymi wektora lub wklonowanie do zewnętrznych pętli wektora, lub na jego końcu N- lub końcu C-.
3. 3. Cząsteczka według zastrz. 1, znamienna tym, że substancja terapeutyczna pochodzi z klasy białek, peptydów, polisacharydów, kwasów nukleinowych tłuszczy, lipoprotein lub ich pochodnych lub jest peptydem lub białkiem lub lipidem antynowotworowym lub immunosupresyjnym i/lub peptydem lub białkiem lub lipidem specyfikującym tropizm tkankowy.
4. 4. Cząsteczka, według zastrz. 1, znamienna tym, że białko grzybów stanowi białko szczepów drożdżowych, korzystnie z drożdży S. cerevisiae, korzystnie z białka Rsp5.

   PL 222 497 B1
5. 5. Cząsteczka, według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że pochodzące z drożdżowego białka Rsp5 trzy domeny WW w tandemie stanowią uniwersalny adaptator umożliwiający przyłączenie białka lub peptydu do dodekahedronów.
6. 6. Cząsteczka, według zastrz. 2, znamienna tym, że białko antygenowe zawiera białko macierzy wirusa grypy, M1, w fuzji genetycznej z białkiem łącznikowym WW.
7. 7. Sposób wytwarzania wektorowej cząsteczki wirusopodobnej, znamienny tym, że stosuje się cząsteczkę dodekahedronu adenowirusa składającą się z pentonów lub białek podstawy pentonu z wirusa ssaczego, produkowanego w komórkach owadzich w systemie bakulowirusa, po czym oczyszcza z zastosowaniem kolumny jonowymiennej, eliminuje nisko- i średniocząsteczkowe białka oraz kwasy nukleinowe i otrzymuje się frakcję rDd o czystości powyżej 90%, a następnie do wytw orzonej cząsteczki zrekombinowanego dodekahedronu adenowirusowego przyłącza się przez inkubację lub przez jednoczesną ekspresję w układzie bakulowirusa białko fuzyjne zaopatrzone w domenę WW pochodzącą z białka grzybów, przedłużone przez białkową lub peptydową substancję terapeutyczną.
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że przyłączony łącznik w postaci domen WW pochodzi z białka szczepów drożdżowych, korzystnie z drożdży S. cerevisiae, korzystnie z białka Rsp5, w fuzji genetycznej z białkową lub peptydową substancją terapeutyczną stanowiącą antygen M1 wirusa grypy.
9. 9. Sposób według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że podwójne fuzyjne białko antygenowe zawiera białko M1 w fuzji genetycznej z białkiem łącznikowym WW.
10. 10. Sposób według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że cząsteczkę dodekahedronową, rDd, otrzymuje się w komórkach owadzich w systemie bakulowirusa, przy czym wydajność wynosi co najmniej 8 mg rDd ze 100 ml hodowli komórkowej.
11. 11. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera wektorową cząsteczkę wirusopodobną, którą stanowi cząsteczka dodekahedronu adenowirusowego składająca się z pentonów lub białek podstawy pentonu, z przyłączoną domeną WW przedłużoną o białkową lub peptydową substancją terapeutyczną określoną zastrzeżeniami 1 do 6.
12. 12. Zastosowanie wektorowej cząsteczki wirusopodobnej, stanowiącej cząsteczkę dodekahedronu adenowirusowego którą stanowi cząsteczka dodekahedronu adenowirusowego składająca się z pentonów lub białek podstawy pentonu, z przyłączoną domeną WW przedłużoną o białkową lub peptydową substancją terapeutyczną określoną zastrzeżeniami 1 do 6 do otrzymywania kompozycji farmaceutycznej określonej zastrzeżeniami 11 do wprowadzania substancji terapeutycznych do tkanek ludzkich lub zwierzęcych.
13. 13. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym pochodzące z białka drożdży Rsp5 trzy domeny WW w tandemie pełnią rolę uniwersalnego adaptatora (łącznika) umożliwiającego przyłączenie dowolnego białka do dodekahedronów.
14. 14. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym kompozycja jest w formie szczepionki.
15. 15. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym wydajność systemu wynosi co najmniej 100 tys. cząsteczek białka wprowadzanych do wnętrza jednej komórki w fuzji z domeną WW.

    Rysunki