JP6409528B2

JP6409528B2 - アミノ基を含むイオン交換基とブチル基を含む疎水性基とを有する多孔性セルロース粒子及びそれを含むクロマトグラフィー担体ならびにｂ型肝炎ウィルスのウィルス様粒子の精製方法

Info

Publication number: JP6409528B2
Application number: JP2014240120A
Authority: JP
Inventors: 祐歌北川; 昭博内田; 靖人梅田
Original assignee: JNC Corp
Current assignee: JNC Corp
Priority date: 2014-11-27
Filing date: 2014-11-27
Publication date: 2018-10-24
Anticipated expiration: 2034-11-27
Also published as: CN105646912A; KR20160063984A; JP2016102145A; CN105646912B

Description

本発明は、アミノ基を含むイオン交換基とブチル基を含む疎水性基とを有する多孔性セルロース粒子及びそれを含むクロマトグラフィー担体に関する。本発明はまた、該クロマトグラフィー担体を用いたＢ型肝炎ウィルスのウィルス様粒子の精製方法に関する。

Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）によって引き起こされ、世界中でキャリアが約４億人以上存在し、年間５０万人以上が死亡していると推定される重大な疾病である。予防にはＨＢｓ抗原を有効成分とするワクチンが有効であり、現在は第一世代のウィルスそのものを用いた弱毒化ワクチンから、第二世代の感染性のないウィルス様粒子（ＶＬＰ）ワクチンが主流となっている。ＶＬＰは、感染性及び伝播性を持ったウィルスから遺伝子やコアタンパク質などの細胞由来の混入物質を除いたものを人工的に作り出した擬似ウィルス粒子であり、現在国内で承認されている２種のＨＢＶワクチンは、ＨＢＶ表面抗原のＰｒｅ−Ｓ１及びＰｒｅ−Ｓ２を除いたＳ領域を遺伝子組換え技術を使って作ったＶＬＰを主成分としたものである。この組換えタンパク質の宿主としては大腸菌、酵母及び動物細胞などがあり、中でも、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなどの酵母を使った製法が主流である。

Ｂ型肝炎ウィルスのＶＬＰワクチンの製造は、ＶＬＰ産生組換え微生物を培養してワクチンを作る上流工程と、培養液を遠心分離などによって清澄化し、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーを用いて共雑物中から混入物質を除去し、精密・限界濾過膜などを用いて最終濾過してワクチンを分離精製する下流工程とからなる。特にクロマトグラフィーによる精製工程では、独自の分離特性を持つミックスモード・クロマトグラフィー担体の使用が有効であることが知られている。

従来、クロマトグラフィーによる分離精製工程において、アガロースビーズにｎ−ブチルアミンを共有結合させてなるブチルアガロースクロマトグラフィー担体を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより培養液を分離精製する方法が知られている（米国特許第４７０７５４２号明細書（特許文献１）及び特開昭６２−２５８３９８号公報（特許文献２）など）。この方法では、低塩化ナトリウム濃度で目的物を吸着させ、界面活性剤を用いて溶出させるといったスケールアップ精製に有利な方法が採用されている。しかし、一般的に、ブチルアガロースクロマトグラフィー担体の製造には、毒物である臭化シアンが使用されており、製法上好ましいとはいえない。また、いくつかの誘導体が副生することから、同一製品を安定供給するという点で課題が残る。また、この方法では、アガロースビーズにブチル基とアミノ基とが等量ずつ導入されるため、分離特性を自由に調節することができない。

また、別の方法として、ハイドロキシアパタイト担体を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより培養液を分離精製する方法が知られている（特開昭６０−７８９９９号公報（特許文献３））。しかし、この方法では、高価で初期投資が必要な超遠心法を組み合わせる必要がある。また、アフィニティクロマトグラフィーの前処理段階で工業生産に適さない硫安沈殿法を用いており、実用化には至っていない。

米国特許第４７０７５４２号明細書特開昭６２−２５８３９８号公報特開昭６０−７８９９９号公報

このような状況において、スケールアップ精製に有利な条件で使用でき、且つ、分離特性を自由に調節することが可能なクロマトグラフィー担体の提供が望まれている。また、毒物を使用せず安定供給が可能なクロマトグラフィー担体の提供が望まれている。

本発明者等は、上記課題を解決するべく鋭意検討した結果、アミノ基を含むイオン交換基とブチル基を含む疎水性基とをそれぞれセルロース粒子に導入することで、疎水性基及びイオン交換基の量比を自由に調節することができ、用途に応じて所望の分離特性を有するクロマトグラフィー担体を提供することができることを見出した。本発明者等はさらに、セルロース粒子に含まれる水酸基の一部にブチル基とグリシジル基とを有する化合物を反応させることでセルロース粒子にブチル基を含む疎水性基を導入することができ、次いで、該水酸基の他の一部にエピハロヒドリンを反応させてエポキシ化した後、アンモニア水を加えて反応させることでアミノ基を含むイオン交換基を導入することができることを見出した。この方法によれば、毒物を使用せずに、多孔性セルロース粒子に導入される疎水性基及びイオン交換基をそれぞれ独立に、任意の量、導入することができる。本発明者等は、得られた本発明のクロマトグラフィー用担体が、Ｂ型肝炎ウィルスのＶＬＰワクチンの精製等に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下に示した多孔性セルロース粒子、クロマトグラフィー担体、Ｂ型肝炎ウィルスのウィルス様粒子の精製方法等に関するものである。
［１］アミノ基を含むイオン交換基とブチル基を含む疎水性基とを有する多孔性セルロース粒子であって、多孔性セルロース粒子中の窒素原子含有量が１ｍｇ／ｇ〜１０ｍｇ／ｇの範囲である、多孔性セルロース粒子。
［２］多孔性セルロース粒子が、そのベース担体であるセルロース粒子が架橋剤により架橋された架橋セルロース粒子から得られたものである、［１］に記載の多孔性セルロース粒子。
［３］架橋剤がエピクロロヒドリンである、［２］に記載の多孔性セルロース粒子。
［４］アミノ基を含むイオン交換基が３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル基であり、ブチル基を含む疎水性基が３−ブトキシ−２−ヒドロキシプロピル基である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の多孔性セルロース粒子。
［５］［１］〜［４］のいずれか一項に記載の多孔性セルロース粒子を含むクロマトグラフィー担体。
［６］Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を精製するためのものである、［５］に記載のクロマトグラフィー担体。
［７］ＶＬＰがＨＢｓ抗原のＳ領域である、［６］に記載のクロマトグラフィー担体。
［８］［６］又は［７］に記載のクロマトグラフィー担体を用いてＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を精製する方法であって、
（ａ）Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を含む細胞溶解物又は培養上清を［６］又は［７］に記載のクロマトグラフィー担体と接触させ、前記ＶＬＰならびに混入物質であるタンパク質及び核酸を前記クロマトグラフィー担体に吸着させる工程と、
（ｂ）混入物質であるタンパク質及び核酸が前記クロマトグラフィー担体に保持され、ＶＬＰが前記クロマトグラフィー担体を通過するように、前記クロマトグラフィー担体の疎水性相互作用を調節して、前記クロマトグラフィー担体から前記ＶＬＰを溶出させる工程と、を含む方法。
［９］ＶＬＰがＨＢｓ抗原のＳ領域である、［８］に記載の方法。
［１０］工程（ｂ）において、前記クロマトグラフィー担体の疎水性相互作用が、移動相として界面活性剤及び有機溶媒を用いることにより調節される、［８］又は［９］に記載の方法。
［１１］［８］〜［１０］のいずれか一項に記載の方法によって調製された前記ＶＬＰを含むワクチン。

本発明の多孔性セルロース粒子は、アミノ基を含むイオン交換基及びブチル基を含む疎水性基をそれぞれ独立に任意の量で導入することができる。多孔性セルロース粒子中の疎水性基及びイオン交換基の導入量及びその量比を調節することにより所望の分離特性を付与することができる。本発明の好ましい態様によれば、本発明の多孔性セルロース粒子は毒物を使用せずに製造することができ、安定供給が可能である。
本発明の多孔性セルロース粒子は、スケールアップ精製に有利な条件で使用することができ、ミックスモード・クロマトグラフィー担体として好適に用いることができる。本発明のクロマトグラフィー担体は、特にＢ型肝炎ウィルスのＶＬＰの精製に有用である。本発明のクロマトグラフィー担体を用いることにより、Ｂ型肝炎ウィルスのＶＬＰをタンパク質及び核酸などの混入物質から分離精製することができる。

図１は、ＨＢｓ抗原を本発明のクロマトグラフィー担体を用いて精製した時のクロマトグラムである。

以下、本発明の多孔性セルロース粒子、クロマトグラフィー担体、Ｂ型肝炎ウィルスのウィルス様粒子の精製方法等について詳しく説明する。

＜多孔性セルロース粒子＞
本発明の多孔性セルロース粒子は、アミノ基を含むイオン交換基とブチル基を含む疎水性基とを有する多孔性セルロース粒子であって、多孔性セルロース粒子中の窒素原子含有量が１ｍｇ／ｇ〜１０ｍｇ／ｇの範囲であることを特徴としている。本発明の多孔性セルロース粒子は、上記のようにアミノ基を含むイオン交換基とブチル基を含む疎水性基とをそれぞれ独立に任意の量で導入することができる。
アミノ基を含むイオン交換基としては、少なくともアミノ基を含み、セルロース粒子の水酸基に導入できるものであれば特に制限されない。例えば、多官能性化合物を介してセルロース粒子にアミノ基を付加させることができるものなどが挙げられる。具体的には、エピクロロヒドリンで活性化した後、続いてアンモニアを付加させることで導入される３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル基などが挙げられる。アミノ基を含むイオン交換基を有することにより、本発明の多孔性セルロース粒子のイオン交換相互作用を高めることができる。
ブチル基を含む疎水性基としては、少なくともブチル基を含み、セルロース粒子の水酸基に導入できるものであれば特に制限されない。例えば、分子内に反応性官能基とブチル基を持つ化合物などが挙げられる。具体的には、ブチルグリシジルエーテルのグリシジル基を利用して導入される３−ブトキシ−２−ヒドロキシプロピル基などが挙げられる。ブチル基を含むことにより、多孔性セルロース粒子の疎水性相互作用を高めることができる。

本発明の多孔性セルロース粒子中の窒素原子含有量は、１ｍｇ／ｇ〜１０ｍｇ／ｇの範囲であることが好ましく、より好ましくは２〜５ｍｇ／ｇ、更に好ましくは３〜４ｍｇ／ｇの範囲である。窒素原子含有量が、上記の範囲であると、目的物を低塩濃度で吸着させ、且つ、低塩濃度のまま界面活性剤などを使って溶出させることができる。また、本発明の多孔性セルロース粒子を特にＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）の精製に用いる場合にも適している。

本発明の多孔性セルロース粒子中のブチル基含有量は特に制限されないが、多孔性セルロース粒子中のブチル基含有量が、セルロース粒子に含まれる水酸基の一部がブチル基を含む疎水性基で置換された後であって、且つ、アミノ基を含むイオン交換基で置換される前の多孔性セルロース粒子をカラムに充填し、該カラムを２ｍｏｌ／Ｌの硫酸アンモニウムを含んだ０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化し、該緩衝液に溶解させたリゾチームを吸着させて、硫酸アンモニウムを含んだ０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にて溶出させた場合に、硫酸アンモニウム濃度１．２ｍｏｌ／Ｌ以上、２．０ｍｏｌ／Ｌ未満の範囲でリゾチームが溶出する量であることが好ましい。多孔性セルロース粒子中のブチル基含有量は、目的物の吸着量及び溶出性に関係するため、上記硫酸アンモニウム濃度の範囲でリゾチームが溶出する量に調整されることが好ましい。
また、本発明の多孔性セルロース粒子中のブチル基含有量は、実施例１に記載した方法で評価した時に、標準タンパク質であるリゾチームの溶出ピークが１２〜２０分の範囲に出現するように調整されることが好ましく、より好ましくは１２．５〜１５．０分の範囲に出現するように調整される。

本発明の多孔性セルロース粒子のベース担体として用いられるセルロース粒子としては、クロマトグラフィー担体として通常使用されるものであれば特に制限されない。中でも、架橋剤により架橋された架橋セルロース粒子であることが好ましい。原料となるセルロースは、結晶セルロースであっても非結晶セルロースであってもよいが、強度が高いことから結晶セルロースが好ましい。

セルロース粒子は、例えば結晶セルロース粉末を再生することで得ることができる。具体的には結晶セルロース粉末を直接ロダンカルシウム溶液に溶解させ、該溶液をオルト−ジクロロベンゼン等の高沸点溶媒に分散させることで、水／油（Ｗ／Ｏ）タイプの水性液滴をつくり、これにメタノール等のアルコールを加えることで、結晶セルロース粉末から多孔質セルロース粒子を再生することができる。特公昭６３−６２２５２号公報に示されるように、この方法で得られるセルロース粒子は非常に多孔質で硬度が高く、真球様の形状を示すのでクロマトグラフィー用充填剤への利用に適している。

セルロース粒子の架橋方法は特に制限されないが、本発明に用いる架橋セルロース粒子としてはエポキシド基を少なくとも一つ含む多価架橋剤を用いて架橋されたものが好ましく、中でもエピクロロヒドリンを用いて架橋されたものが好ましい。セルロース粒子の架橋方法としては、セルロース粒子の懸濁液に、所定量の無機塩の存在下、所定のモル比で架橋剤とアルカリとを所定時間以上かけて連続滴下又は分割添加して架橋することが好ましい。例えば、未架橋のセルロース粒子の懸濁液に、セルロースモノマーのモル数の６〜２０倍量の塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩及びホウ酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１種の無機塩の存在下、セルロースモノマーのモル数の４〜１２倍量の架橋剤と、架橋剤のモル数の０．１〜１．５倍量のアルカリとを３時間以上かけて連続滴下又は分割滴下することが好ましい。この方法により、機械的強度が高く、耐流速性に優れた架橋セルロース粒子を得ることができる。より具体的には、特開２００９−２４２７７０号公報に開示されている方法を参照することができる。この方法で得られた架橋セルロース粒子は、機械的強度が高く、高流速での使用が可能であるので、生産性の高いクロマトグラフィー担体を提供することができる。

セルロース粒子の形状は特に制限されないが、機械的強度が高く、ゲル沈降性に優れ、均一な充填床を作製できることから、球状であることが好ましい。この場合、セルロース粒子の真球度は０．８〜１．０であることが好ましい。ここで「真球度」は、セルロース粒子の短径／長径を意味する。

球状セルロース粒子は、例えば、結晶セルロースまたは結晶領域と非結晶領域とからなるセルロースを溶解し再生することで容易に得ることができる。球状セルロースの製造方法としては、例えば、特公昭５５−３９５６５号公報、特公昭５５−４０６１８号公報などに記載される酢酸エステルを経由する方法、特公昭６３−６２２５２号公報などに記載されるチオシアン酸カルシウム塩を用いた溶液から造粒する方法、特開昭５９−３８２０３号公報などに記載されるパラホルムアルデヒド・ジメチルスルホキシド溶液から製造する方法、また、特許第３６６３６６６号公報に記載されるセルロースを塩化リチウム含有のアミドに溶解させたセルロース溶液から成形する方法などが挙げられる。
球状の架橋セルロース粒子は、前述した方法などを用いて球状セルロース粒子を架橋することで得ることができる。

本発明に用いる多孔性セルロース粒子及びそのベース担体であるセルロース粒子の粒子径は３０〜２００μｍの範囲が好ましく、より好ましくは５０〜１５０μｍの範囲である。また、平均粒子径は、３０〜２００μｍの範囲が好ましく、より好ましくは４０〜１５０μｍ、更に好ましくは５０〜１００μｍの範囲である。

本明細書において、多孔性セルロース粒子及びそのベース担体であるセルロース粒子の粒子径は、光学顕微鏡で撮影した画像の粒子径を、ノギスなどを用いて計測して、撮影倍率から元の粒子径を求め、光学顕微鏡写真から求めたそれぞれの粒子径の値から、下記の式によって平均粒子径を算出することができる。
体積平均粒子径（Ｍ_ｖ）＝ Σ（ｎｄ⁴）／Σ（ｎｄ³）
［式中、ｄは光学顕微鏡写真から求めたそれぞれの粒子径の値を表し、ｎは、測定した粒子の個数を表す。］

多孔性セルロース粒子及びそのベース担体であるセルロース粒子の粒子径は細孔サイズの特性をもって特徴づけることができる。細孔サイズ特性を示す指標の一つとして、ゲル分配係数Ｋａｖがある。細孔サイズは粒子の物理的強度や精製対象となる目的物質の粒子内の拡散性との関連から、担体の流速特性や動的吸着容量に影響を与える。そのため、目的に応じた最適な設計が必要となる。動的吸着容量の観点から、特に、本発明に用いる多孔性セルロース粒子及びそのベース担体であるセルロース粒子の細孔サイズは、重量平均分子量１．５×１０^５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドにおいて純水を移動相として使用したときのゲル分配係数Ｋａｖが、０．１５〜０．６の範囲であるものが好ましく、より好ましくは０．２〜０．５５、更に好ましくは０．３〜０．５の範囲である。
ゲル分配係数Ｋａｖは、特定の分子量を有する標準物質（例えば、ポリエチレンオキシド）の溶出体積およびカラム体積の関係から次式により求めることができる。
Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖ_０）／（Ｖｔ−Ｖ_０）
［式中、Ｖｅはサンプルの保持容量（ｍＬ）、Ｖｔは空カラム体積（ｍＬ）、Ｖ_０はブルーデキストラン保持容量（ｍＬ）を表す。］

ゲル分配係数Ｋａｖの測定方法は、例えば、Ｌ．Ｆｉｓｃｈｅｒ著生物化学実験法２「ゲルクロマトグラフィー」第１版（東京化学同人）等に記載されている。本発明に用いるセルロース粒子のゲル分配係数Ｋａｖは、例えば、粒子形成時のセルロースの溶解濃度を制御することにより調整することができる。

本発明の多孔性セルロース粒子は、公知の反応を組み合わせることにより製造することができる。例えば、セルロース粒子に含まれる水酸基の一部に、ブチル基を含む疎水性基を導入し、次いで、該水酸基の他の一部にアミノ基を含むイオン交換基を導入することで本発明の多孔性セルロース粒子を得ることができる。あるいは、アミノ基を含むイオン交換基を先に導入してもよい。
セルロース粒子に含まれる水酸基の一部にブチル基を含む疎水性基を導入する方法としては、例えば、ブチル基と反応性官能基を含む化合物を用いる方法などが挙げられる。中でも、ブチル基とグリシジル基とを含む化合物をセルロース粒子と反応させる方法が好ましい。この方法によれば、毒物を使用することなく、簡便な方法で、セルロース粒子にアミノ基を含むイオン交換基を導入することができる。
セルロース粒子に含まれる水酸基の他の一部にアミノ基を含むイオン交換基を導入する方法としては、例えば、多官能性の試薬を用いてアミノ基を導入する方法などが挙げられる。中でも、セルロース粒子にエピクロロヒドリンを反応させて、他の水酸基の一部をエポキシ化し、その後、アンモニアと反応させる方法が好ましい。この方法によれば、毒物を使用することなく、簡便な方法で、セルロース粒子にブチル基を含む疎水性基を導入することができる。

本発明の好ましい態様において、本発明の多孔性セルロース粒子は、架橋セルロース粒子に含まれる水酸基の一部が３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル基（−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＯＨ）ＣＨ_２ＮＨ_２）で置換され、且つ、該水酸基の他の一部が３−ブトキシ−２−ヒドロキシプロピル基（−ＣＨ_２ＣＨ_２（ＯＨ）ＣＨ_２ＯＣ_４Ｈ_９）で置換されてなる。上記多孔性セルロース粒子は、機械的強度が高く、分離特性に優れており、クロマトグラフィー担体として特に適している。また、毒物を使用することがなく、反応上誘導体の副生を抑制しながら簡便な方法で製造することができるため、安定供給の点でも優れている。

上記の多孔性セルロース粒子は、例えば、以下の方法により製造することができる。

＜工程ａ＞
まず、架橋セルロース粒子にブチルグリシジルエーテルを反応させてブチル基を導入する。
反応容器に水及び硫酸ナトリウム、更に架橋セルロース粒子を加えて均一なスラリーとなるように攪拌する。これに水酸化ナトリウム水溶液を加え、０．５〜２．０時間攪拌する。
次いで、ブチルグリシジルエーテルを加え、反応液を４５〜５５℃まで昇温し、液温が一定温度に達した後、６〜４８時間攪拌しながら反応させる。
反応終了後、反応液を吸引濾過し、得られた湿ゲルを水で中性になるまで洗浄して、架橋セルロース粒子にブチル基が導入された化合物を湿ゲルとして得ることができる。
硫酸ナトリウムの使用量は、反応液中の水分に対して、通常、５〜５０質量％の範囲であり、好ましくは２０〜３０質量％の範囲である。
水酸化ナトリウム水溶液の濃度及び使用量は、反応液中の濃度が１〜１０質量％になるように加えることが好ましい。
ブチルグリシジルエーテルの使用量は、架橋セルロース粒子に導入したいブチル基の量に応じて適宜調整することができる。例えば、セルロースモノマーのモル数の０．０５〜２．０倍量が好ましく、より好ましくは０．１〜０．６倍量、更に好ましくは０．２〜０．４倍量である。ここで、「セルロースモノマー」とは、セルロースの構成単位であるグルコースユニットを意味し、セルロースモノマーのモル数（すなわち、重合度）は、グルコース１ユニットから水分を引いた量、すなわち分子量１６２を１モルとして、セルロースの乾燥重量から計算する。

＜工程ｂ＞
次に、工程ａで得られたブチル基を導入した架橋セルロースの他の水酸基の一部をエポキシ化する。
反応容器に水及び工程ａで得られた湿ゲルを加え、０．５〜２．０時間攪拌する。次いで、反応液を２５〜３５℃まで昇温し、液温が一定温度に達した後、水酸化ナトリウム水溶液、エピクロロヒドリンの順に加え、１．０〜５．０時間攪拌する。
反応終了後、酢酸などの弱酸を反応液が中性になるまで加え、水で洗浄した後、反応液を吸引濾過してエポキシ化した湿ゲルを得る。
水酸化ナトリウム水溶液の濃度及び使用量は、反応液中の水分に対し、１〜２０質量％であり、エピクロロヒドリンに対し、１〜１０倍量であることが好ましい。
エピクロロヒドリンの使用量は、次の工程で架橋セルロース粒子に導入したいアミノ基の量に応じて適宜調整することができる。例えば、工程ａで得られた湿ゲルのセルロースモノマーのモル数の０．１〜５０倍量が好ましく、より好ましくは１．０〜２０倍量、更に好ましくは５．０〜１０倍量である。

＜工程ｃ＞
次に、工程ｂで得られたエポキシ化した架橋セルロースのエポキシ基を介してアミノ基を導入する。
反応容器に工程ｂで得られた湿ゲルとアンモニア水を加え、均一なスラリーとなるよう攪拌する。この反応液を３０〜４０℃まで昇温し、液温が一定温度に達した後、液温を維持した状態で１．０〜５．０時間攪拌しながら反応させる。
反応終了後、反応液を吸引濾過し、得られた湿ゲルを中性になるまで洗浄して、架橋セルロース粒子にブチル基及びアミノ基が導入された化合物を湿ゲルとして得ることができる。
アンモニア水の使用量は、セルロースモノマーのモル数の１０倍量以上であることが好ましい。

この方法によれば、毒物を使用せずに、簡便な方法で多孔性セルロース粒子を製造することができる。また、反応上誘導体が副生し難いため、同一製品を安定供給することができる。

＜クロマトグラフィー担体＞
本発明の多孔性セルロース粒子は、アミノ基及びブチル基が導入されていることによりイオン交換相互作用及び疎水性相互作用を有する。この性質を利用して、本発明の多孔性セルロース粒子を、例えば、クロマトグラフィー担体として好適に使用することができる。本発明の多孔性セルロース粒子は、アミノ基及びブチル基の導入量及びその量比を調節することができるので、イオン交換相互作用及び疎水性相互作用のバランスを制御して、目的に応じた所望の分離特性を付与することができる。また、イオン交換相互作用及び疎水性相互作用のバランスを変化させることによって目的物質の吸着及び溶出を制御することができる。
また、本発明のクロマトグラフィー担体は、ベースゲルとしてセルロース粒子を使用しているため広いｐＨ領域で使用することが可能であり、低塩化ナトリウム濃度で目的物を吸着させ、界面活性剤で溶出させるといったスケールアップ精製に有利な条件で使用することができる。また、本発明のクロマトグラフィー担体は、毒物を使用せず、安定供給が可能であるといった利点も有している。

本発明の多孔性セルロース粒子の用途として具体的には、例えば、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を精製するためのミックスモード・クロマトグラフィー担体が好ましく挙げられる。ＶＬＰは、ＨＢｓ抗原のＳ領域を遺伝子組換え技術を使って製造されたものであることが好ましい。本発明の多孔性セルロース粒子を用いることにより、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）から細胞由来の混入物質を除去することができる。

＜Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）の精製＞
上述したとおり、本発明の多孔性セルロース粒子は、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を精製するためのミックスモード・クロマトグラフィー担体として好適に用いることができる。本発明のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）の精製方法によれば、本発明のクロマトグラフィー担体を用いることにより、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を工業的に精製することが可能である。
本発明のクロマトグラフィー担体は、酸性域で使用できることから、例えば、米国特許第４７０７５４２号明細書に記載される従来法で用いられるミックスモード・クロマトグラフィーであるブチルアガロースの代替品として使用することもできる。ブチルアガロースクロマトグラフィー担体に替えて本発明のクロマトグラフィー担体を用いることにより、スケールアップ精製が可能であり、且つ、毒物を使用せずに安定してＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を工業的に精製することができる。

例えば、本発明のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）の精製方法は、
（ａ）Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を含む細胞溶解物又は培養上清を本発明のクロマトグラフィー担体と接触させ、前記ＶＬＰならびに混入物質であるタンパク質及び核酸を前記クロマトグラフィー担体に吸着させる工程と、
（ｂ）混入物質であるタンパク質及び核酸が前記クロマトグラフィー担体に保持され、ＶＬＰが前記クロマトグラフィー担体を通過するように、前記クロマトグラフィー担体の疎水性相互作用を調節して、前記クロマトグラフィー担体から前記ＶＬＰを溶出させる工程とを含むことができる。

まず、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を含む細胞溶解物又は培養上清を調製する。
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を含む細胞溶解物は、組換えＤＮＡ技術を利用してＶＬＰを産生するように形質転換されたＶＬＰ産生組換え微生物、例えば、大腸菌、酵母及び動物細胞等を、適当な培地及び培養条件で培養して、ＶＬＰを産生し蓄積させた後、得られた培養液を緩衝液中で破砕処理することにより得られる。
ＶＬＰ産生組換え微生物としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｒａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａなどの酵母を用いることが好ましい。
破砕処理は、例えば、超音波破砕、グラスビーズ破砕、マントン・ゴーリン破砕、あるいは、細胞の細胞壁を酵素的に溶解せしめてスフエロプラスト化した後、これに界面活性剤を作用させて破砕するなどの方法により実施することができる。
得られた細胞溶解物は、遠心分離にかけ、細胞壁破片等の破砕物を分離し、必要に応じてメンブランフィルターを用いて濾過処理して大きな粒子物を取り除いて培養上清としてもよい。

得られた細胞溶解物又は培養上清は、本発明のクロマトグラフィー担体にかけられる前に、必要に応じてＰＥＧによる沈殿、ＣａＣｌ_２による沈殿、超遠心、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過、シリカゲルによる吸着、限外ろ過、透析などの方法やあるいはそれらの組合せを用いて清涼化処理されてもよい。

得られた細胞溶解物又は培養上清は、本発明のクロマトグラフィー担体と接触させることにより、ＶＬＰならびに混入物質であるタンパク質及び核酸を該クロマトグラフィー担体に吸着させ、非吸着物であるその他の不純物を分離溶出させる。この際、細胞溶解物又は培養上清のｐＨは、緩衝液で調節することができる。例えばｐＨを７未満または７以上に調節する。それによって、除けなかった不純物が除ける可能性がある。
緩衝液としては、リン酸塩、カルボン酸塩、硫酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、トリス、ビストリス、またはグッドバッファーなどを用いることができる。緩衝液の濃度は１〜１０００ｍＭの範囲であることが好ましく、より好ましくは５〜２００ｍＭ、更に好ましくは１０〜５０ｍＭの範囲である。

次いで、混入物質であるタンパク質及び核酸が前記クロマトグラフィー担体に保持され、ＶＬＰが前記クロマトグラフィー担体を通過するように、前記クロマトグラフィー担体の疎水性相互作用を調節して、前記クロマトグラフィー担体から前記ＶＬＰを溶出させる。ここで、ＶＬＰは、ＨＢｓ抗原のＳ領域を遺伝子組換え技術を使って製造されたものであることが好ましい。
移動相として用いる緩衝液に界面活性剤を配合することによりクロマトグラフィー担体の疎水性相互作用を弱めるように調節することができる。界面活性剤としては、クロマトグラフィー担体の疎水性相互作用を弱めるものであれば特に制限されない。例えば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、アシルソルビタン、ステロイド系界面活性剤、アルキルグリコシド、アルキルアルコールの硫酸エステル塩、アルキルアルコールのスルホン酸エステル塩、リゾレシチン、アルキルβアミノ酸などを用いることができる。

溶出液は、必要に応じて、精密・限外濾過膜などを用いて最終濾過してＶＬＰを混入物質から分離精製することができる。
以上のようにして、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を含む細胞溶解物又は培養上清からＶＬＰを分離精製することができる。得られたＶＬＰは、Ｂ型肝炎用ワクチンとして利用することができる。

必要に応じて、本発明のクロマトグラフィー担体のイオン強度を調節することにより、クロマトグラフィー担体中に保持されていた混入物質であるタンパク質及び核酸を溶出させてもよい。クロマトグラフィー担体中に保持されていた混入物質を溶出させることにより、本発明のクロマトグラフィー担体を再生して繰り返し使用することが可能になる。
クロマトグラフィー担体のイオン強度は、例えば塩化ナトリウムを添加することによって調節することができる。塩化ナトリウムの濃度は、０．５Ｍの以上が好ましく、より好ましくは２．０Ｍ以上である。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

＜参考例１＞
〔６％球状セルロース粒子（含水）の製造〕
（１）１００ｇのチオシアン酸カルシウム６０重量％水溶液に６．４ｇの結晶性セルロース（旭化成ケミカルズ株式会社製、商品名：セオラスＰＨ１０１）を加え、１１０〜１２０℃に加熱して溶解した。
（２）この溶液に界面活性剤としてソルビタンモノオレエート６ｇを添加し、１３０〜１４０℃に予め加熱したｏ−ジクロロベンゼン４８０ｍｌ中に滴下し、２００〜３００ｒｐｍにて攪拌分散した。
（３）次いで、上記分散液を４０℃以下まで冷却し、メタノール１９０ｍｌ中に注ぎ、粒子の懸濁液を得た。
（４）この懸濁液を濾過分別し、粒子をメタノール１９０ｍｌにて洗浄し、濾過分別した。この洗浄操作を数回行った。
（５）さらに大量の水で洗浄した後、球状セルロース粒子を得た。
（６）次いで、この球状セルロース粒子をＪＩＳ標準ふるい規格５３μｍ〜１２５μｍのふるいにかけて、所望の粒子径（実粒子サイズ間隔５０〜１５０μｍ、平均粒子径約１００μｍ）にし、目的の６％球状セルロース粒子（含水：セルロース溶解濃度６％）を得た。なお、ここでの平均粒子径は、光学顕微鏡で撮影した画像の粒子径を、ノギスなどを用いて計測して撮影倍率から元の粒子径を求め、それぞれの粒子径の値から、下記の式によって算出して求めた。
体積平均粒子径（Ｍ_Ｖ）＝Σ（ｎｄ^４）／Σ（ｎｄ^３）
［式中、ｄは光学顕微鏡写真から求めたそれぞれの粒子径の値を表し、ｎは測定した粒子の個数を表す。］

〔架橋６％セルロース粒子の調製〕
（１）上記で得られた６％球状セルロース粒子（含水）１００ｇに１２１ｇの純水を加え、攪拌しながら加温した。３０℃に到達したところで４５重量％のＮａＯＨ水溶液３．３ｇとＮａＢＨ_４０．５ｇとを加え、撹拌した。初期アルカリ濃度は０．６９％（ｗ／ｗ）であった。
（２）３０分後、６０ｇのＮａ_２ＳＯ_４を反応液に加え、溶解させた。混合物の温度が５０℃に到達した時点で、２時間撹拌を継続した。
（３）５０℃で混合物の撹拌を継続しながら、４５重量％のＮａＯＨ水溶液４８ｇと、エピクロロヒドリン５０ｇとをそれぞれ２５等分した量を、１５分置きにおよそ６時間かけて添加した。
（４）添加終了後、この混合物を温度５０℃で１６時間反応させた。
（５）この混合物を温度４０℃以下に冷却した後、酢酸２．６ｇを加え、中和した。
（６）反応混合物を濾過してゲルを回収し、純水で濾過洗浄し、目的の架橋６％セルロース粒子を得た。この時、株式会社堀場製作所のレーザ回折／散乱式の粒子径分布測定装置ＬＡ−９５０を用いて分析した平均粒子径は８５μｍであった。また、重量平均分子量１．５×１０^５Ｄａの標準ポリエチレンオキシドにおいて純水を移動相として使用したときのゲル分配係数Ｋａｖは０．３８であった。

＜参考例２＞
〔陰イオン交換体の製造〕
０．５Ｌ容のガラス容器に参考例１の架橋６％セルロース粒子７０ｇ、純水３５ｍＬを加え攪拌した。反応液の温度を３８℃に上げ、カチオマスター（四日市合成）１２２ｇ、４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム４．１ｇを投入した。反応温度を４０±２℃に維持したまま６時間攪拌した。６時間後、酢酸で反応液を中性にし、減圧ろ過を使って純水でゲルの洗浄を行った。このゲルに０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加え、３０分間攪拌した。その後、再び減圧濾過を使って純水で中性になるまで洗浄した。減圧濾過により余分な水分を取り除き、湿ゲル６１ｇを得た。このゲルのＮ含量は７３００ｐｐｍであった。

＜実施例１＞
〔ミックスモード担体の製造ブチル基を含む疎水性基の導入（工程ａ）〕
２Ｌ容のガラス容器に純水４８０ｍＬ、硫酸ナトリウム１８５ｇを加えた。次に参考例１の架橋６％セルロース粒子を２５０ｇ加え、均一なスラリーとなるよう攪拌した。得られたスラリーに４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液７６．６ｇを加え、１時間攪拌した。１時間後、反応液にブチルグリシジルエーテル（日本油脂株式会社製「エピオール（登録商標）Ｂ」）をそれぞれ４．８ｇ加え、反応液を５０℃まで昇温した。液温が５０℃に達してから、１６時間攪拌しながら反応させた。１６時間後攪拌を止めスラリーを吸引ろ過した。得られた湿ゲルを純水で５回、メタノールで１５回洗浄した。最後に純水で洗浄液が中性になるまで洗浄した。得られた湿ゲルは余分な水分を取り除いた状態で保存した。

得られたゲルへの疎水性基の導入を確認するため、標準タンパク質リゾチーム（生化学工業株式会社）の吸着を以下のように確認した。上記で製造したゲルおよび原料とした架橋６％セルロース粒子をそれぞれ内径６．６ｍｍのガラスカラムに５ｃｍとなるように詰め、各カラムを２ｍｏｌ／Ｌの硫酸アンモニウムを含んだ０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した。次いで、各カラムに平衡化に用いた緩衝液で懸濁した２ｍｇ／ｍＬＬｙｓｏｚｙｍｅ溶液０．５ｍＬを流速０．８６ｍＬ／分で流し、さらにそのまま平衡化に使用した緩衝液を３．４２ｍＬ通液した。そこから同じく各カラムに流速０．８６ｍＬ／分で平衡化に使用した緩衝液を５１．３ｍＬ流す間に、直線的傾斜勾配により硫酸アンモニウムの濃度を２ｍｏｌ／Ｌから０ｍｏｌ／Ｌまで下げた。この時、Ｌｙｓｏｚｙｍｅは架橋６％セルロースゲルを充填したカラムで１１．３分、ブチル基を含む疎水性基を導入したゲルを充填したカラムで１２．５〜１７．５分の位置に溶出ピークが出現した。このことにより、架橋セルロース粒子中へブチル基を含む疎水性基が導入されたことが確認された。

〔ミックスモード担体の製造エポキシ化（工程ｂ）〕
（製造例１ｂ）
１Ｌ容のガラス容器に純水８５ｍＬを入れ、工程ａで製造したブチル基を有したセルロースゲル７０ｇを加え、３０分間攪拌した。反応液の温度を２８〜３５℃の範囲に調整し、４８．７％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液３８ｇ、エピクロロヒドリン４３ｇの順に加え、２時間攪拌した。２時間後、酢酸を反応液が中性になるまで加えた。純水で上澄み液の電気伝導度が１０μＳ／ｃｍ以下になるまで洗浄した後、吸引ろ過した湿ゲル８６ｇを回収した。得られたゲルのエポキシ導入量は乾燥ゲル１ｇあたり４７μｍｏｌであった。
（製造例２ｂ）
純水８５ｍＬに代えて２０９ｍＬを用いたこと以外は、製造例１ｂと同様にして湿ゲル６９ｇを得た。得られたゲルのエポキシ導入量は乾燥ゲル１ｇあたり、１２８μｍｏｌであった。
（製造例３ｂ）
純水８５ｍＬに代えて５１８ｍＬを用いたこと以外は、製造例１ｂと同様にして湿ゲル６９ｇを得た。得られたゲルのエポキシ導入量は乾燥ゲル１ｇあたり、２２９μｍｏｌであった。

〔ミックスモード担体の製造アミノ基の導入（工程ｃ）〕
（製造例１ｃ）
０．３Ｌ容のガラス容器に工程ｂ（製造例１ｂ）で製造した湿ゲル５０ｇと２５％アンモニア水７５ｍＬを加え、均一なスラリーとなるよう攪拌した。反応液の温度を３５〜４０℃まで上げ、維持したまま２時間攪拌した。２時間後、吸引ろ過でろ液を除き、上澄み液が中性になるまで純水で洗浄した。その後、減圧濾過により余分な水分を取り除き、湿ゲル３４ｇを得た。ゲルを乾燥させＣＨＮ（ＣａｒｂｏｎＨｙｄｒｏｇｅｎＮｉｔｒｏｇｅｎ）元素分析により乾燥重量あたりの窒素原子含有量を求めた。得られたゲルの窒素原子含有量は２４００ｐｐｍ（２．４ｍｇ／ｇ）であった。
（製造例２ｃ）
製造例２ｂで製造した湿ゲル５０ｇを用いたこと以外は、製造例１ｃと同様にして湿ゲル３３ｇを得た。得られたゲルの窒素原子含有量は３１００ｐｐｍ（３．１ｍｇ／ｇ）であった。
（製造例３ｃ）
製造例３ｂで製造した湿ゲル５０ｇを用いたこと以外は、製造例１ｃと同様にして湿ゲル３４ｇを得た。得られたゲルの窒素原子含有量は５０００ｐｐｍ（５．０ｍｇ／ｇ）であった。

＜実施例２＞
〔ＨＢｓＡｇ粗精製液の調製〕
ＨＢｓＡｇを含んだ酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ菌体はビークル社より購入し、使用するまで−８０ ℃ で保存した。移行の操作は４℃以下を維持するよう努めた。菌体約３０ｇを１００ｍＬの破砕用バッファー（０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム、０．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／ＬＰＭＳＦ、ｐＨ７．２）に懸濁し、ガラスビーズホモジナイザーを用いて破砕処理を行った。この破砕液を１３０００ｇで遠心して菌体破砕物を除去した。上清を回収し、終濃度１０％（ｗ／ｗ）となるようゆっくり攪拌しながら３３％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ６０００をゆっくり加え、２時間攪拌した。攪拌を止め、そのまま一晩放置した後、８０００ｇで３０分間遠心した。得られた沈殿を０．０５ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０でタンパク質濃度が５ｍｇ／ｍＬ程度になるよう適当に懸濁し、孔径０．２μｍのフィルターでろ過した。タンパク質濃度はＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。

次にこのＨＢｓＡｇを含んだ液を参考例２で製造した陰イオン交換体を用いて精製した。陰イオン交換体を純水で適当にスラリー状にし、減圧下で攪拌、脱気した。そのスラリーをφ１６ｍｍのガラスカラムに流し込みゲル高さが５０ｍｍとなるようパッキングした。ゲルを詰めたガラスカラムはＬＣシステムに接続し、０．０２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０で平衡化した。これにＨＢｓＡｇを含んだ液２０ｍＬを流速２．０ｍＬ／分の速度で流し、続いて０．０５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含んだ０．０２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０をカラムの８倍容量流して非吸着物を除いた。さらに０．３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含んだ０．０２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を５ｍＬ／分の速度でカラムの８倍容量流して溶出液を２．５ｍＬずつ回収した。回収した溶出フラクションのうちタンパク質濃度が３００ｍｇ／ｍＬ以上だったものを集め、０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液、ｐＨ７．０で透析したものを次のクロマトグラフィーのサンプルとした。

〔ミックスモード担体でのＨＢｓＡｇ精製〕
実施例１の製造例２ｃで作製したミックスモード担体を純水で適当にスラリー状にし、減圧下で攪拌、脱気した。そのスラリーをφ６．６ｍｍのガラスカラムに流し込みゲル高さが３０ｍｍとなるようパッキングした。ゲルを詰めたガラスカラムはＬＣシステムに接続し、０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液，ｐＨ７．０で平衡化した。これに調製したＨＢｓＡｇサンプル液（ＨＢｓＡｇ粗精製液）２ｍＬを流速０．５ｍＬ／分の速度で流し、続いて０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をカラムの８倍容量流して非吸着物を除いた。そして０．１％（ｗ／ｗ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んだ０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液，ｐＨ７．０をカラムの１０倍容量流して溶出液を回収した。さらに０．１％（ｗ／ｗ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２ｍｏｌ／ＬＮａＣｌを含んだ０．０２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液，ｐＨ７．０をカラムの１０倍容量流して残留物を回収した。各画分のＨＢｓＡｇ濃度はＥＬＩＳＡキット（株式会社ビークル）で、核酸濃度は「ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（LｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で測定した。結果を図１及び表１に示す。

表１に示されるとおり、本発明のクロマトグラフィー担体を用いることにより、溶出画分１にＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を回収することができた。本発明のクロマトグラフィー担体の分離特性を更に調節することにより、更に高純度のＶＬＰを調製することが可能である。

本発明の多孔性セルロース粒子は、イオン交換相互作用及び疎水性相互作用を有しており、これらのバランスを適宜調節することにより独自の分離特性を示すことができることから、バイオ医薬品の精製等に用いられるクロマトグラフィー担体として有用である。特にＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）精製用のクロマトグラフィー担体として好適に用いることができる。

Claims

３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル基と３−ブトキシ−２−ヒドロキシプロピル基とを有する多孔性セルロース粒子であって、多孔性セルロース粒子中の窒素原子含有量が１ｍｇ／ｇ〜１０ｍｇ／ｇの範囲である、多孔性セルロース粒子。
多孔性セルロース粒子が、そのベース担体であるセルロース粒子が架橋剤により架橋された架橋セルロース粒子から得られたものである、請求項１に記載の多孔性セルロース粒子。
架橋剤がエピクロロヒドリンである、請求項２に記載の多孔性セルロース粒子。
請求項１〜３のいずれか一項に記載の多孔性セルロース粒子を含むクロマトグラフィー担体。
Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を精製するためのものである、請求項４に記載のクロマトグラフィー担体。
ＶＬＰがＨＢｓ抗原のＳ領域である、請求項５に記載のクロマトグラフィー担体。
請求項５又は６に記載のクロマトグラフィー担体を用いてＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を精製する方法であって、
（ａ）Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のウィルス様粒子（ＶＬＰ）を含む細胞溶解物又は培養上清を請求項６又は７に記載のクロマトグラフィー担体と接触させ、前記ＶＬＰならびに混入物質であるタンパク質及び核酸を前記クロマトグラフィー担体に吸着させる工程と、
（ｂ）混入物質であるタンパク質及び核酸が前記クロマトグラフィー担体に保持され、ＶＬＰが前記クロマトグラフィー担体を通過するように、前記クロマトグラフィー担体の疎水性相互作用を調節して、前記クロマトグラフィー担体から前記ＶＬＰを溶出させる工程と、を含む方法。
ＶＬＰがＨＢｓ抗原のＳ領域である、請求項７に記載の方法。
工程（ｂ）において、前記クロマトグラフィー担体の疎水性相互作用が、移動相として界面活性剤及び有機溶媒を用いることにより調節される、請求項７又は８に記載の方法。
ウィルス様粒子（ＶＬＰ）を含むワクチンの製造方法であって、前記ＶＬＰを請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法によって調製することを含む、ワクチンの製造方法。