KR20160063984A - 아미노기를 포함하는 이온 교환기와 부틸기를 포함하는 소수성기를 가지는 다공성 셀룰로오스 입자 및 그것을 포함하는 크로마토그래피 담체 및 b형 간염 바이러스의 바이러스 유사 입자의 정제 방법 - Google Patents

아미노기를 포함하는 이온 교환기와 부틸기를 포함하는 소수성기를 가지는 다공성 셀룰로오스 입자 및 그것을 포함하는 크로마토그래피 담체 및 b형 간염 바이러스의 바이러스 유사 입자의 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 스케일 업 정제에 유리한 조건 하에서 사용할 수 있고, 또한 분리 특성을 자유롭게 조절할 수 있는 크로마토그래피 담체 및 B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)의 정제 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는, 아미노기를 포함하는 이온 교환기와 부틸기를 포함하는 소수성기를 가지는 다공성 셀룰로오스 입자로서, 다공성 셀룰로오스 입자 중의 질소 원자 함유량이 1 mg/g∼10 mg/g의 범위인 다공성 셀룰로오스 입자를 크로마토그래피 담체로서 사용한다.

Description

아미노기를 포함하는 이온 교환기와 부틸기를 포함하는 소수성기를 가지는 다공성 셀룰로오스 입자 및 그것을 포함하는 크로마토그래피 담체 및 B형 간염 바이러스의 바이러스 유사 입자의 정제 방법{POROUS CELLULOSE PARTICLES HAVING AMINO GROUP-CONTAINING ION-EXCHANGE GROUP AND BUTYL GROUP-CONTAINING HYDROPHOBIC GROUP, AND CHROMATOGRAPHY MEDIA CONTAINING THE SAME, AND METHOD FOR PURIFYING VIRUS-LIKE PARTICLES OF HEPATITIS B VIRUS}
본 발명은, 아미노기를 포함하는 이온 교환기와 부틸기를 포함하는 소수성(疏水性)기를 가지는 다공성 셀룰로오스 입자 및 그것을 포함하는 크로마토그래피 담체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 크로마토그래피 담체를 사용한 B형 간염 바이러스의 바이러스 유사 입자(Virus-Like Particle)의 정제 방법에 관한 것이다.
B형 간염은, B형 간염 바이러스(HBV)에 의해 발생하고, 전세계에 보균자(carrier)가 약 4억명 이상 존재하며, 연간 50만명 이상이 사망하고 있는 것으로 추정되는 중대한 질병이다. 예방에는 HBs 항원을 유효 성분으로 하는 백신이 유효하며, 현재는 제1 세대의 바이러스 그 자체를 사용한 약독화(弱毒化) 백신으로부터, 제2 세대의 감염성이 없는 바이러스 유사 입자(VLP) 백신이 주류가 되고 있다. VLP는, 감염성 및 전파성을 가진 바이러스로부터 유전자나 코어 단백질 등의 세포 유래의 혼입 물질을 제거한 것을 인공적으로 만든 유사 바이러스 입자이며, 현재 국내에서 승인되어 있는 2종의 HBV 백신은, HBV 표면 항원의 Pre-S1 및 Pre-S2를 제외한 S 영역을 유전자 재조합 기술을 사용하여 만든 VLP를 주성분으로 한 것이다. 이 재조합 단백질의 숙주로서는 대장균, 효모 및 동물 세포 등이 있으며, 그 중에서도, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 피히아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세누라 폴리모파(Hansenura polymorpha) 등의 효모를 사용한 제법이 주류를 이루고 있다.
B형 간염 바이러스의 VLP 백신의 제조는, VLP 생산 재조합 미생물을 배양하여 백신을 만드는 상류(上流) 공정과, 배양액을 원심분리 등에 의해 청징화(clarification, 淸澄化)하고, 어피니티크로마토그래피(affinity chromatography), 소수성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피를 사용하여 공잡물 중으로부터 혼입 물질을 제거하고, 정밀·한계 여과막 등을 사용하여 최종 여과하여 백신을 분리 정제하는 하류 공정으로 이루어진다. 특히 크로마토그래피에 의한 정제 공정에서는, 독자적인 분리 특성을 가지는 믹스 모드·크로마토그래피 담체의 사용이 유효한 것으로 알려져 있다.
종래, 크로마토그래피에 의한 분리 정제 공정에 있어서, 아가로스비즈(agarose beads)에 n-부틸아민을 공유 결합시켜 이루어지는 부틸아가로스크로마토그래피 담체를 사용한 어피니티크로마토그래피에 의해 배양액을 분리 정제하는 방법이 알려져 있다(미국 특허 제4707542호 명세서(특허 문헌 1) 및 일본공개특허 제 소62-258398호 공보(특허 문헌 2) 등). 이 방법에서는, 저염화 나트륨 농도로 목적물을 흡착시키고, 계면활성제를 사용하여 용출시키는 스케일 업 정제에 유리한 방법이 채용되고 있다. 그러나, 일반적으로, 부틸아가로스크로마토그래피 담체의 제조에는, 독물인 브롬화 시안이 사용되고 있어, 제법상 바람직하다고는 할 수 없다. 또한, 몇 가지 유도체가 부산물로서 생기므로, 동일 제품을 안정적으로 공급하는 점에서 과제가 있다. 또한, 이 방법에서는, 아가로스비즈에 부틸기와 아미노기가 등량씩 도입되므로, 분리 특성을 자유롭게 조절할 수 없다.
또한, 다른 방법으로서, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 담체를 사용한 어피니티크로마토그래피에 의해 배양액을 분리 정제하는 방법이 알려져 있다(일본공개특허 제 소60-78999호 공보(특허 문헌 3)). 그러나, 이 방법에서는, 고가이며 초기 투자가 필요한 초원심법(超圓心法)을 조합시킬 필요가 있다. 또한, 어피니티크로마토그래피의 전처리(前處理) 단계에서 공업적 생산에 적합하지 않은 유안(硫安) 침전법을 사용하고 있어, 실용화에는 도달하고 있지 않다.
미국 특허 제4707542호 명세서 일본공개특허 제 소62-258398호 공보 일본공개특허 제 소60-78999호 공보
이와 같은 상황에 있어서, 스케일 업 정제에 유리한 조건 하에서 사용할 수 있고, 또한 분리 특성을 자유롭게 조절할 수 있는 크로마토그래피 담체의 제공이 요구되고 있다. 또한, 독물을 사용하지 않고 안정적으로 공급 가능한 크로마토그래피 담체의 제공이 요구되고 있다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결할 수 있도록 예의(銳意) 검토한 결과, 아미노기를 포함하는 이온 교환기와 부틸기를 포함하는 소수성기를 각각 셀룰로오스 입자에 도입함으로써, 소수성기 및 이온 교환기의 양비(量比)를 자유롭게 조절할 수 있고, 용도에 따라 원하는 분리 특성을 가지는 크로마토그래피 담체를 제공할 수 있는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한, 셀룰로오스 입자에 포함되는 수산기의 일부에 부틸기와 글리시딜기를 가지는 화합물을 반응시킴으로써 셀룰로오스 입자에 부틸기를 포함하는 소수성기를 도입할 수 있고, 이어서, 상기 수산기의 다른 일부에 에피할로히드린을 반응시켜 에폭시화한 후, 암모니아수를 가하여 반응시킴으로써 아미노기를 포함하는 이온 교환기를 도입할 수 있는 것을 발견하였다. 이 방법에 의하면, 독물을 사용하지 않고, 다공성 셀룰로오스 입자에 도입되는 소수성기 및 이온 교환기를 각각 독립적으로, 임의의 양으로 도입할 수 있다. 본 발명자들은, 얻어진 본 발명의 크로마토그래피용 담체가, B형 간염 바이러스의 VLP 백신의 정제 등에 유용한 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 이하에 나타낸 다공성 셀룰로오스 입자, 크로마토그래피 담체, B형 간염 바이러스의 바이러스 유사 입자의 정제 방법 등에 관한 것이다.
[1] 아미노기를 포함하는 이온 교환기와 부틸기를 포함하는 소수성기를 가지는 다공성 셀룰로오스 입자로서, 다공성 셀룰로오스 입자 중의 질소 원자 함유량이 1 mg/g∼10 mg/g의 범위인, 다공성 셀룰로오스 입자.
[2] 다공성 셀룰로오스 입자는, 그 베이스 담체인 셀룰로오스 입자가 가교제에 의해 가교된 가교 셀룰로오스 입자로부터 얻어진 것인, [1]에 기재된 다공성 셀룰로오스 입자.
[3] 가교제가 에피클로로히드린인, [2]에 기재된 다공성 셀룰로오스 입자.
[4] 아미노기를 포함하는 이온 교환기가 3-아미노-2-하이드록시프로필기이며, 부틸기를 포함하는 소수성기가 3-부톡시-2-하이드록시프로필기인, [1]∼[3] 중 어느 한 항에 기재된 다공성 셀룰로오스 입자.
[5] [1]∼[4] 중 어느 한 항에 기재된 다공성 셀룰로오스 입자를 포함하는 크로마토그래피 담체.
[6] B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)를 정제하기 위한 것인, [5]에 기재된 크로마토그래피 담체.
[7] VLP가 HBs 항원의 S 영역인, [6]에 기재된 크로마토그래피 담체.
[8] [6] 또는 [7]에 기재된 크로마토그래피 담체를 사용하여 B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)를 정제하는 방법로서,
(a) B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)를 포함하는 세포 용해물 또는 배양 상청액을 [6] 또는 [7]에 기재된 크로마토그래피 담체와 접촉시켜, 상기 VLP 및 혼입 물질인 단백질 및 핵산을 상기 크로마토그래피 담체에 흡착시키는 공정과,
(b) 혼입 물질인 단백질 및 핵산이 상기 크로마토그래피 담체에 유지되고, VLP가 상기 크로마토그래피 담체를 통과하도록, 상기 크로마토그래피 담체의 소수성 상호 작용을 조절하여, 상기 크로마토그래피 담체로부터 상기 VLP를 용출하는 공정을 포함하는 방법.
[9] VLP가 HBs 항원의 S 영역인, [8]에 기재된 방법.
[10] 공정(b)에 있어서, 상기 크로마토그래피 담체의 소수성 상호 작용이, 이동상으로서 계면활성제 및 유기용매를 사용함으로써 조절되는, [8] 또는 [9]에 기재된 방법.
[11] [8]∼[10] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 조제된 상기 VLP를 포함하는 백신.
본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자는, 아미노기를 포함하는 이온 교환기 및 부틸기를 포함하는 소수성기를 각각 독립적으로 임의의 양으로 도입할 수 있다. 다공성 셀룰로오스 입자 중의 소수성기 및 이온 교환기의 도입량 및 그 양비를 조절함으로써 원하는 분리 특성을 부여할 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자는 독물을 사용하지 않고 제조할 수 있고, 안정적인 공급이 가능하다.
본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자는, 스케일 업 정제에 유리한 조건 하에서 사용할 수 있고, 믹스 모드·크로마토그래피 담체로서 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명의 크로마토그래피 담체는, 특히 B형 간염 바이러스의 VLP의 정제에 유용하다. 본 발명의 크로마토그래피 담체를 사용함으로써, B형 간염 바이러스의 VLP를 단백질 및 핵산 등의 혼입 물질로부터 분리 정제할 수 있다.
도 1은, HBs 항원을 본 발명의 크로마토그래피 담체를 사용하여 정제할 때의 크로마토그램이다.
이하에서, 본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자, 크로마토그래피 담체, B형 간염 바이러스의 바이러스 유사 입자의 정제 방법 등에 대하여 상세하게 설명한다.
<다공성 셀룰로오스 입자>
본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자는, 아미노기를 포함하는 이온 교환기와 부틸기를 포함하는 소수성기를 가지는 다공성 셀룰로오스 입자로서, 다공성 셀룰로오스 입자 중의 질소 원자 함유량이 1 mg/g∼10 mg/g의 범위인 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자는, 상기한 바와 같이 아미노기를 포함하는 이온 교환기와 부틸기를 포함하는 소수성기를 각각 독립적으로 임의의 양으로 도입할 수 있다.
아미노기를 포함하는 이온 교환기로서는, 적어도 아미노기를 포함하고, 셀룰로오스 입자의 수산기에 도입할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 다관능성 화합물을 통하여 셀룰로오스 입자에 아미노기를 부가시킬 수 있는 것 등이 있다. 구체적으로는, 에피클로로히드린으로 활성화한 후, 이어서, 암모니아를 부가시킴으로써 도입되는 3-아미노-2-하이드록시프로필기 등을 예로 들 수 있다. 아미노기를 포함하는 이온 교환기를 가지는 것에 의해, 본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자의 이온 교환 상호 작용을 높일 수 있다.
부틸기를 포함하는 소수성기로서는, 적어도 부틸기를 포함하고, 셀룰로오스 입자의 수산기에 도입할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 분자 내에 반응성 관능기와 부틸기를 가지는 화합물 등이 있다. 구체적으로는, 부틸글리시딜에테르의 글리시딜기를 이용하여 도입되는 3-부톡시-2-하이드록시프로필기 등을 예로 들 수 있다. 부틸기를 포함함으로써, 다공성 셀룰로오스 입자의 소수성 상호 작용을 높일 수 있다.
본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자 중의 질소 원자 함유량은, 1 mg/g∼10 mg/g의 범위인 것이 바람직하고, 2∼5 mg/g의 범위인 것이 보다 바람직하고, 3∼4 mg/g의 범위인 것이 더욱 바람직하다. 질소 원자 함유량이, 전술한 범위 내이면, 목적물을 저염 농도로 흡착시키고, 또한 저염 농도인 상태에서 계면활성제 등을 사용하여 용출할 수 있다. 또한, 본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자를 특히 B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)의 정제에 사용하는 경우에도 적합하다.
본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자 중의 부틸기의 함유량은 특별히 한정되지 않지만, 다공성 셀룰로오스 입자 중의 부틸기의 함유량이, 셀룰로오스 입자에 포함되는 수산기의 일부가 부틸기를 포함하는 소수성기로 치환된 후에, 또한 아미노기를 포함하는 이온 교환기로 치환되기 전의 다공성 셀룰로오스 입자를 컬럼에 충전하고, 상기 컬럼을 2 mol/L의 황산 암모늄을 포함하는 0.2 mol/L의 인산 완충액(pH 7.0)으로 평형화하고, 상기 완충액에 용해시킨 리소자임을 흡착시키고, 황산 암모늄을 포함한 0.2 mol/L의 인산 완충액(pH 7.0)에 의해 용출한 경우에, 황산 암모늄 농도가 1.2 mol/L 이상, 2.0 mol/L 미만의 범위에서 리소자임이 용출하는 양인 것이 바람직하다. 다공성 셀룰로오스 입자 중의 부틸기의 함유량은, 목적물의 흡착량 및 용출성에 관계하므로, 상기 황산 암모늄 농도의 범위에서 리소자임이 용출하는 양으로 조정되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자 중의 부틸기의 함유량은, 실시예 1에 기재한 방법으로 평가했을 때, 표준 단백질인 리소자임의 용출 피크가 12∼20 분의 범위에서 출현하도록 조정되는 것이 바람직하고, 12.5∼15.0 분의 범위에서 출현하도록 조정되는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자의 베이스 담체로서 사용되는 셀룰로오스 입자로서는, 크로마토그래피 담체로서 통상 사용되는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 그 중에서도, 가교제에 의해 가교된 가교 셀룰로오스 입자인 것이 바람직하다. 원료가 되는 셀룰로오스는, 결정 셀룰로오스라도 되고 비결정 셀룰로오스라도 되지만, 강도가 높은 것을 고려하면 결정 셀룰로오스가 바람직하다.
셀룰로오스 입자는, 예를 들면, 결정 셀룰로오스 분말을 재생함으로써 얻을 수 있다. 구체적으로는 결정 셀룰로오스 분말을 직접 로단 칼슘 용액에 용해시키고, 상기 용액을 오르토-디클로로벤젠 등의 고비등점 용매에 분산시킴으로써, 물/기름(W/O) 타입의 수성 액적을 만들고, 여기에 메탄올 등의 알코올을 가함으로써, 결정 셀룰로오스 분말로부터 다공질 셀룰로오스 입자를 재생할 수 있다. 일본특허공고 소63-62252호 공보에 나타낸 바와 같이, 이 방법에 의해 얻어지는 셀룰로오스 입자는 매우 다공질이며 경도가 높고, 진구(眞球) 모양의 형상을 나타내므로 크로마토그래피용 충전제로의 이용에 적합하다.
셀룰로오스 입자의 가교 방법은 특별히 한정되지 않지만, 본 발명에 사용하는 가교 셀룰로오스 입자로서는 에폭시드기를 적어도 1개 포함하는 다가 가교제를 사용하여 가교된 것이 바람직하고, 그 중에서도 에피클로로히드린을 사용하여 가교된 것이 바람직하다. 셀룰로오스 입자의 가교 방법으로서는, 셀룰로오스 입자의 현탁액에, 소정량의 무기염의 존재 하, 소정의 몰비로 가교제와 알칼리를 소정 시간 이상 연속적으로 적하 또는 분할 첨가하여 가교하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 미가교의 셀룰로오스 입자의 현탁액에, 셀룰로오스 모노머의 몰수의 6∼20 배량의 염산염, 황산염, 인산염 및 붕산염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 무기염의 존재 하, 셀룰로오스 모노머의 몰수의 4∼12 배량의 가교제와, 가교제의 몰수의 0.1∼1.5 배량의 알칼리를 3시간 이상 연속적으로 적하 또는 분할 적하하는 것이 바람직하다. 이 방법에 의하여, 기계적 강도가 높고, 내유속성(耐流速性)이 우수한 가교 셀룰로오스 입자를 얻을 수 있다. 보다 구체적으로는, 일본공개특허 제2009-242770호 공보에 개시되어 있는 방법을 참조할 수 있다. 이 방법으로 얻어진 가교 셀룰로오스 입자는, 기계적 강도가 높고, 고유속에서의 사용이 가능하므로, 생산성이 높은 크로마토그래피 담체를 제공할 수 있다.
셀룰로오스 입자의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 기계적 강도가 높고, 겔 침강성이 우수하고, 균일한 충전 바닥을 제작할 수 있으므로, 구형(球形)인 것이 바람직하다. 이 경우에, 셀룰로오스 입자의 진구도는 0.8∼1.0인 것이 바람직하다. 여기서 「진구도」는, 셀룰로오스 입자의 단경(短徑)/장경(長徑)을 의미한다.
구형 셀룰로오스 입자는, 예를 들면, 결정 셀룰로오스 또는 결정 영역과 비결정 영역으로 이루어지는 셀룰로오스를 용해하고 재생함으로써 용이하게 얻을 수 있다. 구형 셀룰로오스의 제조 방법으로서는, 예를 들면, 일본특허공고 소55-39565호 공보, 일본특허공고 소55-40618호 공보 등에 기재된 아세트산 에스테르를 경유하는 방법, 일본특허공고 소63-62252호 공보 등에 기재된 티오시안산 칼슘염을 사용한 용액으로부터 조립(造粒)하는 방법, 일본공개특허 제 소59-38203호 공보 등에 기재된 파라포름알데히드·디메틸술폭시드 용액으로부터 제조하는 방법, 또한, 일본 특허 제3663666호 공보에 기재된 셀룰로오스를 염화 리튬 함유의 아미드에 용해시킨 셀룰로오스 용액으로부터 성형하는 방법 등이 있다.
구형 가교 셀룰로오스 입자는, 전술한 방법 등을 사용하여 구형 셀룰로오스 입자를 가교함으로써 얻을 수 있다.
본 발명에서 사용하는 다공성 셀룰로오스 입자 및 그 베이스 담체인 셀룰로오스 입자의 입자 직경은 30∼200 ㎛의 범위가 바람직하고, 50∼150 ㎛의 범위가 더욱 바람직하다. 또한, 평균 입자 직경은, 30∼200 ㎛의 범위가 바람직하고, 40∼150 ㎛가 보다 바람직하고, 50∼100 ㎛의 범위가 더욱 바람직하다.
본 명세서에 있어서, 다공성 셀룰로오스 입자 및 그 베이스 담체인 셀룰로오스 입자의 입자 직경은, 광학 현미경으로 촬영한 화상의 입자 직경을, 노기스 등을 사용하여 계측하여, 촬영 배율로부터 원래의 입자 직경을 구하고, 광학 현미경 사진으로부터 구한 각각의 입자 직경의 값으로부터, 하기의 식에 의해 평균 입자 직경을 산출할 수 있다.
체적 평균 입자 직경(Mv) = Σ(nd4)/Σ(nd3)
[식 중, d는 광학 현미경 사진으로부터 구한 각각의 입자 직경의 값을 나타내고, n은, 측정한 입자의 개수를 나타낸다.]
다공성 셀룰로오스 입자 및 그 베이스 담체인 셀룰로오스 입자의 입자 직경은 세공 사이즈의 특성을 가지고 특징지을 수 있다. 세공 사이즈의 특성을 나타내는 지표의 하나로서, 겔 분배 계수 Kav가 있다. 세공 사이즈는 입자의 물리적 강도나 정제 대상이 되는 목적 물질의 입자 내의 확산성과 관련이 있으므로, 담체의 유속 특성이나 동적 흡착 용량에 영향을 미친다. 이에 따라, 목적에 따라 최적 설계가 필요로 한다. 동적 흡착 용량의 관점에서, 특히, 본 발명에 사용하는 다공성 셀룰로오스 입자 및 그 베이스 담체인 셀룰로오스 입자의 세공 사이즈는, 중량 평균 분자량 1.5×105 Da의 표준 폴리에틸렌 옥시드에 있어서 순수를 이동상으로서 사용했을 때의 겔 분배 계수 Kav가, 0.15∼0.6의 범위인 것이 바람직하고, 0.2∼0.55의 범위인 것이 보다 바람직하고, 0.3∼0.5의 범위인 것이 더욱 바람직하다.
겔 분배 계수 Kav는, 특정한 분자량을 가지는 표준 물질(예를 들면, 폴리에틸렌옥시드)의 용출 체적 및 컬럼 체적의 관계에 의해 하기 식에 의해 구할 수 있다.
Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0)
[식 중, Ve는 샘플의 유지 용량(mL), Vt는 공 컬럼 체적(mL), V0는 블루 덱스트란 유지 용량(mL)을 나타낸다.]
겔 분배 계수 Kav의 측정 방법은, 예를 들면, L. Fischer저 생물화학 실험법 2 「겔 크로마토그래피」 제1판(도쿄 화학 동인) 등에 기재되어 있다. 본 발명에 사용하는 셀룰로오스 입자의 겔 분배 계수 Kav는, 예를 들면, 입자 형성시의 셀룰로오스의 용해 농도를 제어함으로써 조정할 수 있다.
본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자는, 공지의 반응을 조합함으로써 제조할 수 있다. 예를 들면, 셀룰로오스 입자에 포함되는 수산기의 일부에, 부틸기를 포함하는 소수성기를 도입하고, 이어서, 상기 수산기의 다른 일부에 아미노기를 포함하는 이온 교환기를 도입함으로써 본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자를 얻을 수 있다. 또는, 아미노기를 포함하는 이온 교환기를 먼저 도입할 수도 있다.
셀룰로오스 입자에 포함되는 수산기의 일부에 부틸기를 포함하는 소수성기를 도입하는 방법으로서는, 예를 들면, 부틸기와 반응성 관능기를 포함하는 화합물을 사용하는 방법 등이 있다. 그 중에서도, 부틸기와 글리시딜기를 포함하는 화합물을 셀룰로오스 입자와 반응시키는 방법이 바람직하다. 이 방법에 의하면, 독물을 사용하지 않고, 간편한 방법으로, 셀룰로오스 입자에 아미노기를 포함하는 이온 교환기를 도입할 수 있다.
셀룰로오스 입자에 포함되는 수산기의 다른 일부에 아미노기를 포함하는 이온 교환기를 도입하는 방법으로서는, 예를 들면, 다관능성 시약을 사용하여 아미노기를 도입하는 방법 등이 있다. 그 중에서도, 셀룰로오스 입자에 에피클로로히드린을 반응시키고, 다른 수산기의 일부를 에폭시화하고, 그 후, 암모니아와 반응시키는 방법이 바람직하다. 이 방법에 의하면, 독물을 사용하지 않고, 간편한 방법으로, 셀룰로오스 입자에 부틸기를 포함하는 소수성기를 도입할 수 있다.
본 발명의 바람직한 태양에 있어서, 본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자는, 가교 셀룰로오스 입자에 포함되는 수산기의 일부가 3-아미노-2-하이드록시프로필기(-CH2CH2(OH)CH2NH2)로 치환되고, 또한, 상기 수산기의 다른 일부가 3-부톡시-2-하이드록시프로필기(-CH2CH2(OH)CH2OC4H9)로 치환되어 이루어진다. 상기 다공성 셀룰로오스 입자는, 기계적 강도가 높고, 분리 특성이 우수하며, 크로마토그래피 담체로서 특히 적합하다. 또한, 독물을 사용하지 않고, 반응 상 유도체가 부산물로서 생성되는 것을 억제하면서 간편한 방법으로 제조할 수 있으므로, 안정적 공급의 면에서도 우수하다.
상기한 다공성 셀룰로오스 입자는, 예를 들면, 이하의 방법에 의해 제조할 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00001
<공정 a>
먼저, 가교 셀룰로오스 입자에 부틸글리시딜에테르를 반응시켜 부틸기를 도입한다.
반응 용기에 물 및 황산 나트륨, 또한 가교 셀룰로오스 입자를 가하여 균일한 슬러리가 되도록 교반한다. 여기에 수산화 나트륨 수용액을 가하고, 0.5∼2.0 시간 교반한다.도
이어서, 부틸글리시딜에테르를 가하고, 반응액을 45∼55 ℃까지 승온(昇溫)하고, 액체의 온도가 일정 온도에 도달한 후, 6∼48 시간 교반하면서 반응시킨다.
반응 종료 후, 반응액을 흡인 여과하고, 얻어진 습윤 겔(wet gel)을 물로 중성이 될 때까지 세정하고, 가교 셀룰로오스 입자에 부틸기가 도입된 화합물을 습윤 겔로서 얻을 수 있다.
황산 나트륨의 사용량은, 반응액 중의 수분에 대하여, 통상, 5∼50 질량%의 범위이며, 바람직하게는 20∼30 질량%의 범위이다.
수산화 나트륨 수용액의 농도 및 사용량은, 반응액 중의 농도가 1∼10 질량%로 되도록 가하는 것이 바람직하다.
부틸글리시딜에테르의 사용량은, 가교 셀룰로오스 입자에 도입하고자 하는 부틸기의 양에 따라, 적절하게 조정할 수 있다. 예를 들면, 셀룰로오스 모노머의 몰수의 0.05∼2.0 배량이 바람직하고, 0.1∼0.6 배량이 보다 바람직하고, 0.2∼0.4 배량이 더욱 바람직하다. 여기서, 「셀룰로오스 모노머」란, 셀룰로오스의 구성 단위인 글루코오스 유닛을 의미하고, 셀룰로오스 모노머의 몰수(즉, 중합도)는, 글루코오스 1유닛으로부터 수분을 뺀 양, 즉 분자량 162를 1 몰로 하여, 셀룰로오스의 건조 중량으로부터 계산한다.
<공정 b>
다음으로, 공정 a에서 얻어진 부틸기를 도입한 가교 셀룰로오스의 다른 수산기의 일부를 에폭시화한다.
반응 용기에 물 및 공정 a에서 얻어진 습윤 겔을 가하고, 0.5∼2.0 시간 교반한다. 이어서, 반응액을 25∼35 ℃까지 승온하고, 액체의 온도가 일정 온도에 도달한 후, 수산화 나트륨 수용액, 에피클로로히드린의 순으로 가하고, 1.0∼5.0 시간 교반한다.
반응 종료 후, 아세트산 등의 약산을 반응액이 중성이 될 때까지 가하고, 물로 세정한 후, 반응액을 흡인 여과하여 에폭시화한 습윤 겔을 얻는다.
수산화 나트륨 수용액의 농도 및 사용량은, 반응액 중의 수분에 대하여, 1∼20 질량%이며, 에피클로로히드린에 대하여, 1∼10 배량인 것이 바람직하다.
에피클로로히드린의 사용량은, 다음 공정에서 가교 셀룰로오스 입자에 도입하고자하는 아미노기의 양에 따라, 적절하게 조정할 수 있다. 예를 들면, 공정 a에서 얻어진 습윤 겔의 셀룰로오스 모노머의 몰수의 0.1∼50 배량이 바람직하고, 1.0∼20 배량이 보다 바람직하고, 5.0∼10 배량이 더욱 바람직하다.
<공정 c>
다음으로, 공정 b에서 얻어진 에폭시화한 가교 셀룰로오스의 에폭시기를 통하여 아미노기를 도입한다.
반응 용기에 공정 b에서 얻어진 습윤 겔과 암모니아수를 가하고, 균일한 슬러리가 되도록 교반한다. 이 반응액을 30∼40 ℃까지 승온하고, 액체의 온도가 일정 온도에 도달한 후, 액체의 온도를 유지한 상태에서 1.0∼5.0 시간 교반하면서 반응시킨다.
반응 종료 후, 반응액을 흡인 여과하고, 얻어진 습윤 겔을 중성이 될 때까지 세정하고, 가교 셀룰로오스 입자에 부틸기 및 아미노기가 도입된 화합물을 습윤 겔로서 얻을 수 있다.
암모니아수의 사용량은, 셀룰로오스 모노머의 몰수의 10 배량 이상인 것이 바람직하다.
이 방법에 의하면, 독물을 사용하지 않고, 간편한 방법으로 다공성 셀룰로오스 입자를 제조할 수 있다. 또한, 반응 상 유도체가 부산물로서 생성되기 어렵기 때문에, 동일 제품을 안정적으로 공급할 수 있다.
<크로마토그래피 담체>
본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자는, 아미노기 및 부틸기가 도입되어 있는 것에 의해 이온 교환 상호 작용 및 소수성 상호 작용을 가진다. 이 성질을 이용하여, 본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자를, 예를 들면, 크로마토그래피 담체로서 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자는, 아미노기 및 부틸기의 도입량 및 그 양비를 조절할 수 있으므로, 이온 교환 상호 작용 및 소수성 상호 작용의 밸런스를 제어하여, 목적에 따라 원하는 분리 특성을 부여할 수 있다. 또한, 이온 교환 상호 작용 및 소수성 상호 작용의 밸런스를 변화시킴으로써 목적물질의 흡착 및 용출을 제어할 수 있다.
또한, 본 발명의 크로마토그래피 담체는, 베이스 겔로서 셀룰로오스 입자를 사용하고 있으므로, 넓은 pH 영역에서 사용하는 것이 가능하며, 저염화 나트륨 농도로 목적물을 흡착시키고, 계면활성제로 용출시키는 스케일 업 정제에 유리한 조건 하에서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 크로마토그래피 담체는, 독물을 사용하지 않고, 안정적으로 공급이 가능한 장점도 가지고 있다.
본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자의 용도로서 구체적으로는, B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)를 정제하기 위한 믹스 모드·크로마토그래피 담체를 바람직한 예로 들 수 있다. VLP는, HBs 항원의 S 영역을 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조된 것이 바람직하다. 본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자를 사용함으로써, B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)로부터 세포 유래의 혼입 물질을 제거할 수 있다.
<B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)의 정제>
전술한 바와 같이, 본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자는, B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)를 정제하기 위한 믹스 모드·크로마토그래피 담체로서 바람직하게 사용할 수 있다. 본 발명의 B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)의 정제 방법에 의하면, 본 발명의 크로마토그래피 담체를 사용함으로써, B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)를 공업적으로 정제할 수 있다.
본 발명의 크로마토그래피 담체는, 산성역에서 사용할 수 있으므로, 예를 들면, 미국 특허 제4707542호 명세서에 기재된 종래법에서 사용되는 믹스 모드·크로마토그래피인 부틸 아가로스의 대체품으로서 사용할 수도 있다. 부틸 아가로스 크로마토그래피 담체 대신 본 발명의 크로마토그래피 담체를 사용함으로써, 스케일 업 정제가 가능하고, 또한 독물을 사용하지 않고 안정적으로 B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)를 공업적으로 정제할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)의 정제 방법은,
(a) B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)를 포함하는 세포 용해물 또는 배양 상청액을 본 발명의 크로마토그래피 담체와 접촉시켜, 상기 VLP 및 혼입 물질인 단백질 및 핵산을 상기 크로마토그래피 담체에 흡착시키는 공정과,
(b) 혼입 물질인 단백질 및 핵산이 상기 크로마토그래피 담체에 유지되고, VLP가 상기 크로마토그래피 담체를 통과하도록, 상기 크로마토그래피 담체의 소수성 상호 작용을 조절하여, 상기 크로마토그래피 담체로부터 상기 VLP를 용출하는 공정을 포함할 수 있다.
먼저, B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)를 포함하는 세포 용해물 또는 배양 상청액을 조제한다.
B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)를 포함하는 세포 용해물은, 재조합 DNA 기술을 이용하여 VLP를 생산하도록 형질 전환된 VLP 생산 재조합 미생물, 예를 들면, 대장균, 효모 및 동물 세포 등을, 적절한 배지 및 배양 조건 하에서 배양하여, VLP를 생산하고 축적시킨 후, 얻어진 배양액을 완충액 중에서 파쇄 처리함으로써 얻어진다.
VLP 생산 재조합 미생물로서는, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 피히아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세누라 폴리모파(Hansenura polymorpha) 등의 효모를 사용하는 것이 바람직하다.
파쇄 처리는, 예를 들면, 초음파 파쇄, 글래스 비즈 파쇄, 만톤·골린(Manton-Gaulin) 파쇄, 또는 세포의 세포벽을 효소적으로 용해시켜 스패로플라스트(sphaeroplas)화한 후, 여기에 계면활성제를 작용시켜 파쇄하는 등의 방법에 의해 실시할 수 있다.
얻어진 세포 용해물은, 원심분리에 의해 세포벽 파편 등의 파쇄물을 분리하고, 필요에 따라 멤브레인 필터를 사용하여 여과 처리하여 큰 입자물을 제거하여 배양 상청액으로 만들어도 된다.
얻어진 세포 용해물 또는 배양 상청액은, 본 발명의 크로마토그래피 담체에 제공하기 전에, 필요에 따라 PEG에 의한 침전, CaCl2에 의한 침전, 초원심, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니티크로마토그래피, 겔 여과, 실리카겔에 의한 흡착, 한외(限外) 여과, 투석 등의 방법이나 또는 이들의 조합을 사용하여 청량화 처리될 수도 있다.
얻어진 세포 용해물 또는 배양 상청액은, 본 발명의 크로마토그래피 담체와 접촉시킴으로써, VLP 및 혼입 물질인 단백질 및 핵산을 상기 크로마토그래피 담체에 흡착시키고, 비흡착물인 그 외의 불순물을 분리 용출시킨다. 이 때, 세포 용해물 또는 배양 상청액의 pH는, 완충액으로 조절할 수 있다. 예를 들면, pH를 7 미만 또는 7 이상으로 조절한다. 이에 따라, 제거되지 않았던 불순물이 제거될 가능성이 있다.
완충액으로서는, 인산염, 카르본산염, 황산염, 아세트산염, 시트르산염, 트리스, 비스트리스, 또는 굿 버퍼 등을 사용할 수 있다. 완충액의 농도는 1∼1000 mM의 범위인 것이 바람직하고, 5∼200 mM의 범위인 것이 보다 바람직하고, 10∼50 mM의 범위인 것이 더욱 바람직하다.
이어서, 혼입 물질인 단백질 및 핵산이 상기 크로마토그래피 담체에 유지되고, VLP가 상기 크로마토그래피 담체를 통과하도록, 상기 크로마토그래피 담체의 소수성 상호 작용을 조절하여, 상기 크로마토그래피 담체로부터 상기 VLP를 용출시킨다. 여기서, VLP는, HBs 항원의 S 영역을 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조된 것이 바람직하다.
이동상으로서 사용하는 완충액에 계면활성제를 배합함으로써 크로마토그래피 담체의 소수성 상호 작용을 약하게 조절할 수 있다. 계면활성제로서는, 크로마토그래피 담체의 소수성 상호 작용을 약하게 하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르, 아실소르비탄, 스테로이드계 계면활성제, 알킬글루코시드, 알킬알코올의 황산 에스테르염, 알킬알코올의 술폰산 에스테르염, 리조레시틴, 알킬 β아미노산 등을 사용할 수 있다.
용출액은, 필요에 따라, 정밀·한외 여과막 등을 사용하여 최종 여과하여 VLP를 혼입 물질로부터 분리 정제할 수 있다.
이상과 같이 하여, B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)를 포함하는 세포 용해물 또는 배양 상청액으로부터 VLP를 분리 정제할 수 있다. 얻어진 VLP는, B형 간염용 백신으로서 이용할 수 있다.
필요에 따라, 본 발명의 크로마토그래피 담체의 이온 강도를 조절함으로써, 크로마토그래피 담체 중에 유지되고 있는 혼입 물질인 단백질 및 핵산을 용출시킬 수도 있다. 크로마토그래피 담체 중에 유지되고 있는 혼입 물질을 용출시킴으로써, 본 발명의 크로마토그래피 담체를 재생하여 반복적으로 사용하는 것이 가능하게 된다.
크로마토그래피 담체의 이온 강도는, 예를 들면, 염화 나트륨을 첨가함으로써 조절할 수 있다. 염화 나트륨의 농도는, 0.5 M 이상이 바람직하고, 2.0 M 이상이 더욱 바람직하다.
[실시예]
이하에서 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<참고예 1>
[6% 구형 셀룰로오스 입자(함수(包水))의 제조]
(1) 100 g의 티오시안산 칼슘 60 중량% 수용액에 6.4 g의 결정성 셀룰로오스(아사히화성 케미컬즈 주식회사 제조, 상품명: 세올러스 PH101)를 가하고, 110∼120 ℃로 가열하여 용해하였다.
(2) 이 용액에 계면활성제로서 소르비탄모노올레이트 6 g을 첨가하고, 130∼140 ℃로 미리 가열한 o-디클로로벤젠 480 ml 중에 적하하고, 200∼300 rpm으로 교반 분산하였다.
(3) 이어서, 상기 분산액을 40℃ 이하까지 냉각시키고, 메탄올 190 ml 중에 주입하여, 입자의 현탁액을 얻었다.
(4) 이 현탁액을 여과에 의해 분별하고, 입자를 메탄올 190 ml에 의해 세정하고, 여과 분별했다. 이 세정 조작을 수회 행하였다.
(5) 또한 대량의 물로 세정한 후, 구형 셀룰로오스 입자를 얻었다.
(6) 이어서, 이 구형 셀룰로오스 입자를 JIS 표준 체(sieve) 규격 53㎛∼125㎛의 체로 체질하여, 원하는 입자 직경(실제 입자 사이즈 간격 50∼150 ㎛, 평균 입자 직경 약 100㎛)으로 만들어, 목적으로 하는 6% 구형 셀룰로오스 입자(함수: 셀룰로오스 용해 농도 6%)를 얻었다. 그리고, 여기서 평균 입자 직경은, 광학 현미경으로 촬영한 화상의 입자 직경을, 노기스 등을 사용하여 계측하여 촬영 배율로부터 원래의 입자 직경을 구하고, 각각의 입자 직경의 값으로부터, 하기의 식에 의해 산출하여 구하였다.
체적 평균 입자 직경(MV)=Σ(nd4)/Σ(nd3)
[식 중, d는 광학 현미경 사진으로부터 구한 각각의 입자 직경의 값을 나타내고, n은 측정한 입자의 개수를 나타낸다.]
[가교 6% 셀룰로오스 입자의 조제]
(1) 상기에서 얻어진 6% 구형 셀룰로오스 입자(함수) 100 g에 121 g의 순수를 가하고, 교반하면서 가온했다. 30℃에 도달했을 때 45 중량%의 NaOH 수용액 3.3 g과 NaBH 40.5 g을 가하고, 교반하였다. 초기 알칼리 농도는 0.69%(w/w)였다.
(2) 30분 후, 60 g의 Na2SO4를 반응액에 가하고, 용해시켰다. 혼합물의 온도가 50℃에 도달한 시점에서, 2시간 동안 교반을 계속하였다.
(3) 50℃에서 혼합물의 교반을 계속하면서, 45 중량%의 NaOH 수용액 48 g과, 에피클로로히드린 50 g을 각각 25 등분한 양을, 15분마다 대략 6시간에 걸쳐서 첨가하였다.
(4) 첨가 종료 후, 이 혼합물을 온도 50℃에서 16시간 반응시켰다.
(5)이 혼합물을 온도 40℃ 이하로 냉각한 후, 아세트산 2.6 g을 가하여, 중화했다.
(6) 반응 혼합물을 여과하여 겔을 회수하고, 순수로 여과 세정하여, 목적으로 하는 가교 6% 셀룰로오스 입자를 얻었다. 이 때, 주식회사 호리바 제작소의 레이저 회절/산란식의 입자 직경 분포 측정 장치 LA-950을 사용하여 분석한 평균 입자 직경은 85㎛였다. 또한, 중량 평균 분자량 1.5×105 Da의 표준 폴리에틸렌옥시드에 있어서 순수를 이동상으로서 사용했을 때의 겔 분배 계수 Kav는 0.38이었다.
<참고예 2>
[음이온 교환체의 제조]
0.5 L용 유리 용기에 참고예 1의 가교 6% 셀룰로오스 입자 70 g, 순수 35 mL를 가하고 교반했다. 반응액의 온도를 38℃로 높이고, 카치오마스타(욧카이치합성) 122 g, 48.7%(w/w) 수산화 나트륨 4.1 g을 투입하였다. 반응 온도를 40±2 ℃로 유지한 상태에서 6시간 교반했다. 6시간 후, 아세트산으로 반응액을 중성으로 만들고, 감압 여과를 사용하여 순수로 겔의 세정을 행하였다. 이 겔에 0.2mol/L 염산을 가하고, 30분간 교반했다. 그 후, 다시 감압 여과를 사용하여 순수로 중성이 될 때까지 세정하였다. 감압 여과에 의해 여분의 수분을 제거하여, 습윤 겔 61 g을 얻었다. 이 겔의 N 함량은 7300 ppm이었다.
<실시예 1>
[믹스 모드 담체의 제조 부틸기를 포함하는 소수성기의 도입(공정 a)]
2 L용 유리 용기에 순수 480 mL, 황산 나트륨 185 g을 가하였다. 다음으로, 참고예 1의 가교 6% 셀룰로오스 입자를 250 g 가하고, 균일한 슬러리가 되도록 교반했다. 얻어진 슬러리에 48.7%(w/w) 수산화 나트륨 수용액 76.6 g을 가하고, 1시간 교반했다. 1시간 후, 반응액에 부틸글리시딜에테르(일본 유지 주식회사 제조, 「에피올(등록상표) B」)를 각각 4.8 g 가하고, 반응액을 50℃까지 승온하였다. 액체의 온도가 50℃에 도달한 후, 16시간 교반하면서 반응시켰다. 16시간 후 교반을 중지하고 슬러리를 흡인 여과하였다. 얻어진 습윤 겔을 순수로 5회, 메탄올로 15회 세정하였다. 마지막으로 순수로 세정액이 중성이 될 때까지 세정하였다. 얻어진 습윤 겔은 여분의 수분을 제거한 상태로 보존하였다.
얻어진 겔로의 소수성기의 도입을 확인하기 위하여, 표준 단백질 리소자임(생화학공업 주식회사)의 흡착을 하기와 같이 확인하였다. 전술한 바와 같이 제조한 겔 및 원료로 한 가교 6% 셀룰로오스 입자를 각각 내경(內徑) 6.6 ㎜의 유리 컬럼에 5 cm가 되도록 채워넣고, 각 컬럼을 2 mol/L의 황산 암모늄을 포함한 0.2 mol/L의 인산 완충액(pH 7.0)으로 평형화했다. 이어서, 각 컬럼에 평형화에 사용한 완충액으로 현탁한 2 mg/mL 리소자임 용액 0.5 mL를 유속 0.86 mL/분으로 흐르게 하고, 또한 그대로 평형화에 사용한 완충액을 3.42 mL 통액했다. 거기서부터 동일하게 각 컬럼에 유속 0.86 mL/분으로 평형화에 사용한 완충액을 51.3 mL 흐르게 하는 동안, 직선적 경사 구배에 의해 황산 암모늄의 농도를 2 mol/L로부터 0 mol/L까지 저하시켰다. 이 때, 리소자임은 가교 6% 셀룰로오스 겔을 충전한 컬럼으로 11.3분, 부틸기를 포함하는 소수성기를 도입한 겔을 충전한 컬럼으로 12.5∼17.5 분의 위치에 용출 피크가 출현했다. 이에 따라, 가교 셀룰로오스 입자중에 부틸기를 포함하는 소수성기가 도입된 것이 확인되었다.
[믹스 모드 담체의 제조 에폭시화(공정 b)]
(제조예 1b)
1L용 유리 용기에 순수 85 mL를 넣고, 공정 a에서 제조한 부틸기를 가진 셀룰로오스 겔 70 g을 가하고, 30분간 교반했다. 반응액의 온도를 28∼35 ℃의 범위로 조정하고, 48.7%(w/w)의 수산화 나트륨 수용액 38 g, 에피클로로히드린 43 g의 순서로 가하고, 2시간 교반했다. 2시간 후, 아세트산을 반응액이 중성이 될 때까지 가하였다. 순수로 상등액의 전기 전도도가 10μS/cm 이하가 될 때까지 세정한 후, 흡인 여과한 습윤 겔 86 g을 회수하였다. 얻어진 겔의 에폭시 도입량은 건조 겔 1 g당 47㎛ol이었다.
(제조예 2b)
순수 85 mL 대신 209 mL를 사용한 점 이외에는, 제조예 1b와 동일한 방법으로 습윤 겔 69 g을 얻었다. 얻어진 겔의 에폭시 도입량은 건조 겔 1 g당 128㎛ol이었다.
(제조예 3b)
순수 85 mL 대신 518 mL를 사용한 점 이외에는, 제조예 1b와 동일한 방법으로 습윤 겔 69 g을 얻었다. 얻어진 겔의 에폭시 도입량은 건조 겔 1 g당 229㎛ol이었다.
[믹스 모드 담체의 제조 아미노기의 도입(공정 c)]
(제조예 1c)
0.3L용 유리 용기에 공정 b(제조예 1b)에서 제조한 습윤 겔 50 g과 25%의 암모니아수 75 mL를 가하고, 균일한 슬러리가 되도록 교반했다. 반응액의 온도를 35∼40 ℃까지 높여서 유지한 상태에서 2시간 교반했다. 2시간 후, 흡인 여과에 의해 여과액을 제거하고, 상등액이 중성이 될 때까지 순수로 세정하였다. 그 후, 감압 여과에 의해 여분의 수분을 제거하여, 습윤 겔 34 g을 얻었다. 겔을 건조시키고CHN(Carbon Hydrogen Nitrogen) 원소 분석에 의해 건조 중량당 질소 원자 함유량을 구하였다. 얻어진 겔의 질소 원자 함유량은 2400 ppm(2.4 mg/g)이었다.
(제조예 2c)
제조예 2b에서 제조한 습윤 겔 50 g을 사용한 점 이외에는, 제조예 1c와 동일한 방법에 의해 습윤 겔 33 g을 얻었다. 얻어진 겔의 질소 원자 함유량은 3100 ppm(3.1 mg/g)이었다.
(제조예 3c)
제조예 3b에서 제조한 습윤 겔 50 g을 사용한 점 이외에는, 제조예 1c와 동일한 방법에 의해 습윤 겔 34 g을 얻었다. 얻어진 겔의 질소 원자 함유량은 5000 ppm(5.0 mg/g)이었다.
<실시예 2>
[HBsAg 조정제액의 조제]
HBsAg를 포함한 효모 S.cerevisiae 균체는 비클사로부터 구입하여, 사용할 때까지 -80 ℃에서 보존하였다. 이행 조작은 4℃ 이하를 유지하도록 노력했다. 균체 약 30 g을 100 mL의 파쇄용 버퍼(0.1 mol/L 인산 나트륨, 0.5 mol/L NaCl, 2 ㎜ol/L PMSF, pH 7.2)에 현탁하고, 유리 비즈 호모지나이저를 사용하여 파쇄 처리를 행하였다. 이 파쇄액을 13000 g로 원심분리하여 균체 파쇄물을 제거하였다. 상청액을 회수하고, 최종 농도가 10%(w/w)가 되도록 천천히 교반하면서 33%(w/w)의 PEG6000을 천천히 가하고, 2시간 교반했다. 교반을 중지하고, 그대로 하룻밤 방치한 후, 8000 g로 30분간 원심분리했다. 얻어진 침전을 0.05 mol/L Tris-HCl, pH 8.0으로 단백질 농도가 5 mg/mL 정도가 되도록 적절하게 현탁하고, 공경(孔徑) 0.2㎛의 필터로 여과하였다. 단백질 농도는 BCA 어세이(Thermo Scientific)를 사용하여 측정하였다.
다음으로, 이 HBsAg를 포함한 액을 참고예 2에서 제조한 음이온 교환체를 사용하여 정제하였다. 음이온 교환체를 순수로 적절하게 슬러리상(狀)으로 만들고, 감압 하에서 교반하여, 탈기하였다. 그 슬러리를 φ16 ㎜의 유리 컬럼에 흘려 넣고 겔 높이가 50 ㎜가 되도록 패킹했다. 겔이 채워넣어진 유리 컬럼은 LC 시스템에 접속하고, 0.02 mol/L Tris-HCl, pH 8.0으로 평형화했다. 여기에 HBsAg를 포함한 액 20 mL를 유속 2.0 mL/분의 속도로 흐르게 하고, 이어서, 0.05 mol/L의 NaCl를 포함한 0.02 mol/L Tris-HCl, pH 8.0을 컬럼의 8배 용량 흐르게 하여 비흡착물을 제거했다. 또한 0.3 mol/L의 NaCl를 포함한 0.02 mol/L Tris-HCl, pH 8.0을 5 mL/분의 속도로 컬럼의 8배 용량 흐르게 하여 용출액을 2.5 mL씩 회수하였다. 회수한 용출 프랙션 중 단백질 농도가 300 mg/mL 이상인 것을 모아서, 0.02 mol/L 인산 완충액, pH 7.0으로 투석 한 것을 다음 크로마토그래피의 샘플로 하였다.
[믹스 모드 담체에서의 HBsAg 정제]
실시예 1의 제조예 2c에서 제작한 믹스 모드 담체를 순수로 적절하게 슬러리상으로 만들고, 감압 하에서 교반하여, 탈기하였다. 그 슬러리를 φ6.6 ㎜의 유리 컬럼에 흘려 넣고 겔 높이가 30 ㎜가 되도록 패킹했다. 겔이 채워 넣어진 유리 컬럼은 LC 시스템에 접속하고, 0.02 mol/L 인산 완충액, pH 7.0으로 평형화했다. 여기에 조제한 HBsAg 샘플액(HBsAg 조정제액) 2 mL를 유속 0.5 mL/분의 속도로 흐르게 하고, 이어서, 0.02 mol/L 인산 완충액(pH 7.0)을 컬럼의 8배 용량 흐르게 하여 비흡착물을 제거했다. 그리고, 0.1%(w/w) Triton X-100을 포함한 0.02 mol/L 인산 완충액, pH 7.0을 컬럼의 10배 용량 흐르게 하여 용출액을 회수하였다. 또한 0.1%(w/w) Triton X-100, 2 mol/L NaCl를 포함한 0.02 mol/L 인산 완충액, pH 7.0을 컬럼의 10배 용량 흐르게 하여 잔류물을 회수하였다. 각 획분의 HBsAg 농도는 ELISA 키트(주식회사 비클)에 의해, 핵산 농도는 「PicoGreen(등록상표)(Life Technologies사)에 의해 측정하였다. 결과를 도 1 및 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure pat00002
표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 크로마토그래피 담체를 사용함으로써, 용출 획분 1에 B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)를 회수할 수 있었다. 본 발명의 크로마토그래피 담체의 분리 특성을 더욱 조절함으로써, 더욱 고순도의 VLP를 조제할 수 있다.
본 발명의 다공성 셀룰로오스 입자는, 이온 교환 상호 작용 및 소수성 상호 작용을 가지고 있고, 이들의 밸런스를 적절하게 조절함으로써 독자적인 분리 특성을 나타낼 수 있으므로, 바이오 의약품의 정제 등에 사용되는 크로마토그래피 담체로서 유용하다. 특히 B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP) 정제용 크로마토그래피 담체로서 바람직하게 사용할 수 있다.

Claims (11)

  1. 아미노기를 포함하는 이온 교환기와 부틸기를 포함하는 소수성(疏水性)기를 가지는 다공성 셀룰로오스 입자로서,
    다공성 셀룰로오스 입자 중의 질소 원자 함유량이 1 mg/g∼10 mg/g의 범위인, 다공성 셀룰로오스 입자.
  2. 제1항에 있어서,
    다공성 셀룰로오스 입자는, 그 베이스 담체인 셀룰로오스 입자가 가교제에 의해 가교된 가교 셀룰로오스 입자로부터 얻어진 것인, 다공성 셀룰로오스 입자.
  3. 제2항에 있어서,
    가교제가 에피클로로히드린인, 다공성 셀룰로오스 입자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    아미노기를 포함하는 이온 교환기가 3-아미노-2-하이드록시프로필기이며, 부틸기를 포함하는 소수성기가 3-부톡시-2-하이드록시프로필기인, 다공성 셀룰로오스 입자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 다공성 셀룰로오스 입자를 포함하는 크로마토그래피 담체.
  6. 제5항에 있어서,
    B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP; Virus-Like Particle)를 정제하기 위한 것인, 크로마토그래피 담체.
  7. 제6항에 있어서,
    VLP가 HBs 항원의 S 영역인, 크로마토그래피 담체.
  8. 제6항 또는 제7항에 기재된 크로마토그래피 담체를 사용하여 B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)를 정제하는 방법으로서,
    (a) B형 간염 바이러스(HBV)의 바이러스 유사 입자(VLP)를 포함하는 세포 용해물 또는 배양 상청액을 제6항 또는 제7항에 기재된 크로마토그래피 담체와 접촉시켜, 상기 VLP 및 혼입 물질인 단백질 및 핵산을 상기 크로마토그래피 담체에 흡착시키는 공정; 및
    (b) 혼입 물질인 단백질 및 핵산이 상기 크로마토그래피 담체에 유지되고, VLP가 상기 크로마토그래피 담체를 통과하도록, 상기 크로마토그래피 담체의 소수성 상호 작용을 조절하여, 상기 크로마토그래피 담체로부터 상기 VLP를 용출하는 공정
    을 포함하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    VLP가 HBs 항원의 S 영역인, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    공정(b)에 있어서, 상기 크로마토그래피 담체의 소수성 상호 작용이, 이동상으로서 계면활성제 및 유기용매를 사용함으로써 조절되는, 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 조제된 상기 VLP를 포함하는 백신.
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