KR100715954B1 - 펩티드 리간드에 의하여 부착된 다중 면역원성 성분을보유한 ｈｂｖ 코어 항원 입자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 다중 면역원 특이성을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스("HBV") 코어 항원 입자에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 본 발명은 HBV 코어 항원 단백질에 선택적으로 결합하는 HBV 캡시드-결합 펩티드인 리간드에 의하여 여기에 가교되는 면역원, 에피토프 또는 기타 관련된 구조를 포함하는 HBV 코어 항원 입자에 관한 것이다. 이러한 입자는 HBV 캡시드-결합 펩티드를 포함하는 다양한 범위의 면역원성 에피토프에 대한 전달계로서 사용된다. 상기 HBV 캡시드-결합 펩티드는 HBV 코어 단백질과 HBV 표면 단백질간의 상호작용을 차단함으로써 HBV 바이러스 조립을 동시에 저해하고 방해한다. 다른 면역원 및/또는 캡시드-결합 펩티드 리간드의 복합체는 동일한 HBV 코어 입자에 가교될 수 있다. 상기 생성된 다중성분 또는 다가 HBV 코어 입자는 치료 및 예방 백신 및 조성물뿐만 아니라 이들을 사용한 진단 조성물 및 방법에 사용되는 것이 유리하다.

Description

펩티드 리간드에 의하여 부착된 다중 면역원성 성분을 보유한 ＨＢＶ 코어 항원 입자{HBV CORE ANTIGEN PARTICLES WITH MULTIPLE IMMUNOGENIC COMPONENTS ATTACHED VIA PEPTIDE LIGANDS}
본 발명은 다중 면역원 특이성을 특징으로 하는 B형 간염 바이러스("HBV") 코어 항원 입자에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 본 발명은 HBV 코어 단백질에 선택적으로 결합하는 HBV 캡시드-결합 펩티드인 리간드에 의하여 가교된 면역원, 에피토프, 또는 기타 관련된 구조를 포함하는 HBV 코어 항원 입자에 관한 것이다. 상기 입자는 HBV 캡시드-결합 펩티드를 비롯한 다양한 범위의 면역원 에피토프를 위한 전달 시스템으로 사용될 수 있다. 상기 HBV 캡시드-결합 펩티드는 HBV 코어 단백질과 HBV 표면 단백질간에 상호작용을 차단함으로써 HBV 바이러스 조립을 방해하고 간섭하는데 유리하다. 다른 면역원들의 혼합물, HBV 캡시드-결합 펩티드 리간드들의 혼합물 또는 양자의 혼합물은 동일한 HBV 코어 입자에 가교될 수 있다. 상기의 생성된 다중성분 또는 다가 HBV 코어 입자는 치료 및 예방 백신 및 조성물뿐만 아니라 이들을 이용한 진단 조성물 및 진단 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
임상 면역치료 요법의 최전선은 감염성 병원균 및 기타 건강을 위협하는 작용물질에 대하여 환자를 면역화하는 것을 포함한다. 면역화 제제가 과다함에도 불 구하고, 접종은 기껏해야 부분적으로 면역화시키기 때문에 자주 재면역화를 필요로 한다. 다양한 통상적 단가 또는 다가 백신에서도 이러하다. 상기 백신중에서도, 다양한 면역원에 대하여 면역을 유도할 수 있는 단일 제제 접종물의 수가 제한된다. 또한, 병원균에서 항원의 변화는 통상적 백신의 효능을 제한할 수 있다.
이러한 장애 때문에, 주어진 면역원에 대한 면역계 반응의 향상을 위한 방법론에 대하여 많은 노력을 집중하고 있다. 결국, 연결된 면역원의 면역원성을 향상시기키 위한 노력으로, HBV 코어 항원의 T 세포 의존성 결정기 및 T 세포 독립성 결정기의 작동을 통하여, B형 간염 바이러스("HBV") 코어 입자(뉴클레오캡시드 또는 뉴클레오캡시드 외피로 언급됨)에 면역원을 연결시킴으로써 면역원성 접합체를 제조하였다. 참조, 미국 특허 제4,818,527호 및 R. Ulrich 등, "외인성 에피토프용 담체로서 B형 간염 바이러스의 코어 입자", Adv. Virus. Res., 50, pp. 141-82 (1998). 관심있는 에피토프의 면역원성 향상은 자연 발생적인 바이러스 입자 형성 단백질의 적어도 일부, 예를 들면 HBV 표면 항원 및 1 이상의 관심있는 에피토프 부위를 포함하는 하이브리드 바이러스 입자-형성 단백질에 의하여 연구되었다. 참조, 미국 특허 제 5,965,140호. 이러한 노력에서 증명된 바와 같이, HBV의 단백질은 면역계에 관심있는 면역원을 제시하기 위한 발판으로 사용되었다.
B형 간염 바이러스는 HBV 표면 항원("HBsAg")을 함유하는 막 외피(envelope)에 의하여 둘러싸이고, HBV 코어 단백질("HBcAg"), 바이러스 폴리머라제 및 바이러스 DNA를 포함하는 내부 뉴클레오캡시드로 구성되며, 4개의 광범위하게 중복된 개방 해독 구조를 지니는 소형의 부분적 이본쇄 DNA 게놈을 함유하는 혈액-매개성 바이러스이다. 바이러스 외피는 3개의 다른, 그러나 관련된 긴(L), 중간(M) 및 짧은(S) 표면 항원 단백질을 함유한다. 이들은 공통의 카르복시 말단 부분을 공유하나 다른 아미노 말단을 보유하며, 연속한 개방 해독 구조내의 다른 지점에서 개시 트리플렛을 다양하게 사용함으로써 생성된다.
긴 폴리펩티드(L 폴리펩티드)는 pre-S1, pre-S2 및 S 영역으로 구성된다. 완전한 해독 구조의 생성물로서, 이것의 아미노 말단에서 108 아미노산(또는 199, 바이러스 하위 유형에 따라 달라짐)의 pre-S1 도메인 및 이에 뒤따르는 55 아미노산의 pre-S2 도메인 및 226 아미노산의 짧은 폴리펩티드(S 폴리펩티드) 영역을 포함한다. 중간-길이 폴리펩티드(M 폴리펩티드)는 S 영역이 뒤따르는 아미노 말단에 pre-S2 도메인을 보유하는 반면, 가장 풍부한 형태의 S 폴리펩티드는 S 영역만으로 구성된다. pre-S 영역은 숙주 세포에의 부착 및 바이러스 조립 모두에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. S형은 바이러스에서 HBsAg의 M 및 L 형에 비하여 더 풍부하고, 글리코실화된 형 및 비글리코실화된 형으로 모두 발생한다[V. Bruss 및 D. Garem, "B형 간염 바이러스 조립시 외피 단백질의 역할", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp. 1059-63 (1991); V. Bruss 등, "B형 간염 바이러스 대형 외피 단백질의 경막 위상에서 해독후 변형", EMBO J., 13, pp. 2273-79 (1994); A.R. Neurath 등, "B형 간염 바이러스에서 숙주 세포 수용체 결합 부위의 동정 및 화학적 합성", Cell, 46, pp. 429-36(1986); K. Ueda et al., "B형 간염 바이러스의 3가지 외피 단백질: Dane 입자의 형성에 필요한 대형 S, 중형 S, 및 주요 S 단백질", J.Viol, 65, pp. 3571-29 (1991)]. 외피의 내부 표면과 코어의 외부 표면 사이의 특이적 상호작용은 바이러스의 정확한 조립을 인도하고 생성된 입자를 안정화시키는 것 같다.
HBV 코어 단백질은 대장균(E. coli)에서 효과적으로 발현될 수 있다[M. Pasek 등, "대장균에서 B형 간염 바이러스 유전자 및 이것의 발현", Nature, 282, pp. 575-79(1979)]. 상기 단백질은 180(T=3) 또는 240(T=4) 서브유니트를 함유하는 2가지 크기의 정20면체 쉘(shell)내로 조립된다[R.A. Crowther et al., "전자현미경에 의하여 결정된 간염 B 바이러스 코어 입자의 3차 구조", Cell, 77, pp. 943-50(1994)]. 서브유니트는 이량체로 집합되며, 각 이량체는 쉘의 표면상에 돌출하는 스파이크를 형성한다. 전자 냉현미경 및 이미지 프로세싱을 사용하여, 최근에 T=4 쉘의 맵이 6000개 이상의 개체 입자의 이미지로부터 7.4A 해상도에서 제작되었다[B. Bottecher 등, "전자 냉현미경에 의하여 B형 간염 바이러스의 코어 단백질의 접힘을 측정", Nature, 386, pp. 88-91 (1997)]. 이것은 폴리펩티드 사슬의 접힘이 이전에 해결된 바이러스 캡시드와는 매우 다르고, 대개 α-헬릭스라는 것을 보여주었다. 각 이량체 스파이크는 이량체의 각 단량체로부터의 하나씩으로 된 긴 α-헬릭스 헤어핀 쌍에 의하여 형성되었다[Bottcher 등, (1997); J.F. Conway 등, "냉전자현미경에 의하여 B형 간염 바이러스 캡시드에서 4-헬릭스 다발의 시각화", Nature, 386, pp. 91-94 (1997)]. 접힘위에 아미노산 서열을 포개놓는 번호매김 계획[Bottcher 등, (1997)]은 스파이크의 끝에 아미노산 78-82 주위에 HBV 코어 단백질의 주요 면역우성 영역[J. salfeld 등, "B형 간염 바이러스로부터 코어 항원 및 E 항원에 항원 결정기 및 기능성 도메인", J.Virol, 63, pp. 798-800 (1989); M. Sallberg 등, "B형 간염 코어 항원에 대한 모노클론 항체를 위하여 선형 결합 부위의 특성화", J. Med. Viol. 33, pp. 248-52 (1991)]을 위치시켰다.
HBV 바이러스 조립을 방해하는 제제는 HBV의 코어 항원에 결합함으로써 HBV 코어 단백질과 HBV 표면 단백질 간의 상호작용을 차단하는 제제를 포함한다. 일부 이러한 HBV 캡시드-결합 펩티드는 PCT 특허 출원 제 WO98/18818호 및 M.R. Dyson 및 K. Murray의 "복합체 단백질 조립에 관여하는 상호작용의 펩티드 저해제의 선택: B형 간염 바이러스의 코어 및 표면 항원의 결합" 77Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, pp. 2194-98(1995)에 기재된다. 상기 캡시드-결합 펩티드, MHRSLLGRMKGA는 HBV 코어 항원에 가교되었다[B. Bottcher et al., "B형 간염 바이러스 조립을 차단하는 펩티드: 냉현미경, 돌연변이유발법 및 형질감염에 의한 분석", EMBO J., 17, PP. 6839-45 (1998)]
다음의 개시로부터 명백한 바와 같이, HBV 캡시드-결합 펩티드는 단일 또는 다중 면역원에 대한 면역 반응의 향상을 유도하는 능력을 특징으로 하는 HBV 코어 항원 입자를 제작하기 위한 리간드로서 유용하게 사용될 수 있다.
발명의 개시
본 발명은 1 이상의 면역원 성분에 대한 면역원성의 향상을 유도하는 HBV 코어 항원 입자를 제공함으로써 상술된 문제를 해결한다. 상기 다중성분 또는 다가 HBV 코어 항원 입자는, 코딩 서열의 유전자 조작을 통하여 또는 폴리펩티드 합성에 의하여 HBV 코어 항원 폴리펩티드내로 삽입되거나 부착되는 면역원 도메인 또는 에피토프 뿐만 아니라 HBV 코어 항원 입자에 선택적으로 결합하는 펩티드인 리간드를 통하여 상기에 가교된 면역원, 에피토프 또는 기타 관련된 구조를 포함한다. 상기 입자는 HBV 캡시드-결합 펩티드를 비롯하여 다양한 범위의 면역원 에피토프를 위한 전달 시스템으로 사용된다. 상기 HBV 캡시드-결합 펩티드 자체는 HBV 코어 단백질과 HBV 표면 단백질 간의 상호작용을 차단함으로써 HBV 바이러스 조립을 방해하거나 간섭할 수 있다. 생성된 다중성분 또는 다가 HBV 코어 입자는 치료 및 예방 백신 및 조성물뿐만 아니라 이들을 사용한 진단 조성물 및 진단 방법에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 다양한 면역원의 혼합물, HBV 캡시드-결합 펩티드 리간드의 혼합물 또는 양자의 혼합물이 동일한 HBV 코어 입자에 유용하게 가교되도록 한다. 결과적으로 T 세포의 효과적인 자극체이고 면역학적으로 다가인 단일 입자가 생성된다. 따라서, 단일 항원-제시 세포가 다른 특이성의 다중 B 세포 클론의 증식을 자극할 수 있다.
본원에 제시된 발명을 충분히 이해시키기 위하여, 다음과 같이 상세한 설명을 기재한다.
본 발명의 한 구체예에 따라, 1 이상 형태의 면역원 및 1 이상 형태의 HBV 캡시드-결합 펩티드 리간드의 혼합물이 동일한 HBV 코어 입자에 가교될 수 있다. 대안적으로, 다수의 동일한 면역원이 1 형태의 HBV 캡시드-결합 펩티드에 연결될 수 있고, HBV 코어 입자 상의 다양한 위치에 가교될 수 있다. 본 발명에 따른 다중성분 또는 다가 HBV 코어 항원 입자는 모든 성분 면역원에 대한 항체를 유도하는데 특히 유용하다.
HBV 코어 항원 입자에 면역원을 연결하는데 HBV 캡시드-결합 펩티드를 이용함으로써 변성, 구조 파괴 또는 기타 불안정한 영향에 의하여 면역원의 면역원성 또는 안정성을 파괴하지 않으면서 면역원 제시를 향상시킬 수 있다. 예를 들면, HBV 캡시드-결합 펩티드 링커는 성분 면역원이 서로 간섭하여 기능적 물질의 손실을 일으킬 수 있는 위험을 감소시킨다. 결과적으로, HBV 코어 항원 입자는 이것의 성분 면역원에 대한 면역 반응의 향상을 유도한다. 따라서, 단일 제제로서 투여되는 각 면역원으로 필요한 것 보다 더 적은 수의 접종 및/또는 더 소량의 접종물을 가지고 원하는 치료 또는 예방효과를 얻을 수 있다.
또한 HBV 캡시드-결합 펩티드를 통한 HBV 코어 항원 입자에 면역원의 연결은 크기, 구조 및 성질이 다양한 면역원의 제시를 가능하게 한다. 결과적으로, 본 발명은 주어진 개체에서 넓은 범위의 면역성 또는 치료를 유도하는데 유용한 면역원의 조합을 하나의 백신 또는 조성물에 포함시킬 수 있도록 한다.
면역원
HBV 캡시드-결합 펩티드에 연결되어 HBV 코어 항원 입자내로 삽입될 수 있는 면역원은 1 이상의 면역학적, 면역원성 또는 항원성 에피토프를 함유하는 임의의 분자를 포함한다. 이러한 에피토프는 자연에서 선형, 구조적, 단일 또는 혼합일 수 있다.
더욱 자세하게는, 면역원은 면역 반응을 유도할 수 있는 임의의 제제로부터 선택될 수 있다. 상기 제제는 항원, 항원 결정기, 단백질, 당단백질, 항체, 항체 단편, 펩티드, 항원 또는 항원 결정기를 의태하는 펩티드 미모토프(mimotope), 폴리펩티드, 글리코펩티드, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 면역원은 알러지원, 독소 또는 내독소일 수 있다.
상기 제제는 또한 바이러스, 기생충, 박테리아, 진균, 파지, 원생동물 및 식물과 같은 다양한 병원성 제제로부터 유래되거나 또는 이것을 표적화하는 제제를 포함한다. 상기 바이러스는 인간 면역결핍 유형 1 및 유형 2 바이러스 및 T 세포-백혈병 바이러스를 비롯한 레트로바이러스; 단순 포진 유형 1 및 유형 2 바이러스, 수두-대상포진, 사이토메갈로바이러스 및 엡스테인-바르 바이러스와 같은 헤르페스바이러스; 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 인플루엔자 C 바이러스와 같은 오르토믹소바이러스; 호흡기 합포체 바이러스, 홍역 유사 바이러스, 볼거리 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스와 같은 파라믹소바이러스; B형 간염 바이러스와 같은 헤파드나바이러스; C형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 황열 바이러스, 뎅그열 바이러스 및 진드기-매개성 뇌염 바이러스와 같은 플라비바이러스; 엔테로바이러스, 라이노바이러스, 족구(足口) 질환 바이러스 및 회백수염 바이러스와 같은 피코르나바이러스; 풍진 바이러스와 같은 토가바이러스; 광견병 바이러스와 같은 랍도바이러스; 아데노바이러스, 에볼라바이러스; 바큘로바이러스; 한타바이러스; 파필로마바이러스와 같은 파포바바이러스; 파르보바이러스; DNA 바이러스; RNA 바이러스; 온코바이스 같은 RNA 종양 바이러스 및 백시니아 바이러스와 같은 폭스바이러스를 포함한다. 또한, 면역원은 바실러스, 엔테로박테리아, 클로스트리듐, 리스테리아, 마이코박테리아, 슈도모나스, 스타필로콕쿠스, 유박테리아, 마이코플라스마, 클라미디아, 스피로케테스, 네이세리아 또는 살모넬라로부터 유래되거나 또는 이것에 표적화되는 것일 수 있다. 면역원은 또한 인간 면역결핍성 바이러스의 다음 에피토프로부터 선택될 수 있다: GELDRWEKI(gag); ELDKWAS(gp40); IGPGRAFYTTKN(V3 loop); ELDKWA(gp41) 및 DRFYKTLRA(gp41).
HBV 캡시드-결합 펩티드에 연결될 수 있고, 따라서 HBV 코어 항원 입자내로 삽입될 수 있는 당단백질은 예를 들면, 항체, 동물 세포 또는 바이러스의 표면 성분에서 유래한 또는 유사한 글리코펩티드 또는 수막염을 야기하는 것과 같은 박테리아, 또는 이것의 분절과 같은 단편을 포함한다.
당업자라면 이해할 수 있는 바대로, 면역원의 크기는 그것의 기능기가 HBV 캡시드-결합 펩티드 링커를 저해할 수 있기에 충분한 정도로 커서는 안된다.
HBV 코어 항원 단백질
입자 성질에 기인하여, HBV 코어 항원 단백질은 유사하거나 비유사한 형태의 다중 면역원을 면역계에 제시하기 위한 유용한 발판을 만들었다. 본 발명에 따르면, HBV 코어 입자에 원하는 면역원을 부착시키는 리간드로서 HBV 캡시드-결합 펩티드를 사용하여 상기의 이점을 더욱 향상시킨다. 상기 입자는 90 또는 120 리간드-결합 부위-HBV 코어 항원 이량체로 각각 구성된 캡시드 스파이크를 함유한다(도 1 참조). 따라서, 다중 면역원은 리간드로서 HBV 캡시드-결합 펩티드에 의한 HBV 코어 항원 입자에 물리적으로 연결될 수 있다. 생성된 입자는 이것의 성분 면역원 모두에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있다.
HBV 코어 항원 입자는 적절한 미생물계, 동물계 또는 식물계에서 HBV 코어 항원 폴리펩티드에 대한 재조합 코딩 서열의 발현시에 형성될 수 있다. 참조, 예를 들면 Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). 발현되는 폴리펩티드는 전장 HBV 코어 항원 서열, 또는 발현계의 세포에서 입자 형태로 조립되는 능력을 보유한 돌연변이, 유도체, 절단물 또는 이들의 일부를 포함할 수도 있다. 상기 HBV 코어 항원 입자를 제조하는 재조합 방법은 당업계에 공지되었다. 참조, 예, 미국 특허 4,710,463.
대안적으로, HBV 코어 항원 폴리펩티드를 제조하는데 화학적 합성 방법이 사용될 수 있다. HBV 코어 항원 폴리펩티드의 아미노산 서열에 기초하여, 고형상 합성을 사용하여 화학적 합성을 수행할 수 있다[R.B. Merrifield, Fed. Proced, 21, p.412 (1964); R.B. Merrifield, Biochemistry, 3, pp. 1385-90, (1964) and D.R. Milich 등, J.Immunol., 139, pp. 1223-31 (1987)].
당업자는 돌연변이체 또는 변이체 HBV 코어 항원 서열이 결합 또는 리간드 펩티드와의 반응에 영향을 미치기 때문에, 본 발명은 HBV 코어 항원 서브유니트 또는 상응하는 결합 또는 리간드 펩티드에서 코딩 서열의 조작 또는 기타 방법에 의하여 도입되는 자연 변이체 또는 돌연변이체에 동등하게 적용된다는 것을 이해할 것이다.
펩티드 결합에 중요한 코어 단백질 잔기의 돌연변이
코어 단백질의 접힘를 측정하는데 사용되는 방법은 냉현미경에 의하여 L-HBsAg에의 결합을 저해하는 HBV 캡시드-결합 펩티드, SLLGRMKGA의 코어 단백질 상에서 결합 부위를 위치시키는데 이용되었다. 본 방법은 현재 T=3 및 T=4 쉘 모두에서 스파이크의 끝에 결합된 펩티드를 보여주었다[B. Bottcher 등, "B형 간염 바이 러스 조립을 차단하는 펩티드: 냉현미경법, 돌연변이유발법 및 형질감염에 의한 분석", EMBO J., 17, pp. 6839-45 (1998)]. 이미지 분석은 펩티드 결합 부위가 폴리펩티드 접힘을 위한 제안된 번호매김 계획[Bottcher 등 (1997)]에서 아미노산 78-82의 영역내 잔기에 상응하는 스파이크의 끝에 위치함을 보여준다. 코어 단백질의 끝에 가까운 2개의 산성 잔기(glu77 및 asp78)가 존재하고 선택된 결합 펩티드는 2개의 보존된 염기성 잔기를 함유한다. 단백질내 이들 산성 잔기 중 하나를 알라닌으로 돌연변이시킬 경우 변형된 코어 쉘에 대한 펩티드의 친화성을 크게 감소시킴을 발견함으로써, 결합 반응에서 이러한 상반되게 하전된 잔기의 중요성을 확인했다. 아스파르트산 78을 알라닌으로 바꾸면 친화성이 160배 감소되고, 글루탐산 77을 알라닌으로 바꾸면 친화성이 1000배 감소된다. 이것은 HBV 코어 항원 단백질 상에 한쪽 또는 양쪽 산성 잔기가 HBV 캡시드-결합 펩티드를 위한 결합 부위의 적어도 일부를 제공할 것임을 시사한다.
또한 이러한 결과는 리간드 결합에 있어서 스파이크의 끝 영역에서 HBV 코어 항원의 아미노산 서열의 중요성을 보여준다. 당업자는 일부 HBV 균주에서 유래된 HBV 코어 항원이 특정 리간드-면역원 펩티드의 효과적 결합을 위한 돌연변이, 또는 특이적 HBV 코어 항원 변이체에의 효과적 결합을 위한 리간드 변이체의 선택 및 적응을 요구할 수도 있음을 이해할 것이다.
HBV 코어 항원 융합 단백질
본 발명의 한 구체예에 따르면, 면역원이 HBV 캡시드-결합 펩티드를 통하여 연결될 수 있는 HBV 코어 항원 입자는 유전자 융합 기술의 결과로서 1 이상의 면역 원을 이미 제시하고 있는 것일 수 있다. 이러한 기술로, 적절한 코딩 서열은 HBV 코어 항원 폴리펩티드를 위한 서열을 보유하는 기타 벡터 또는 플라스미드내 적절한 위치에 삽입된다.
HBV 코어 항원 폴리펩티드의 발현 수준을 향상시키기 위하여 사용된 E.coli의 β-갈락토시다제 유전자에의 융합에 의하여 11개 아미노산의 서열(유전자 융합에서 도입된 링커 서열의 해독으로부터 생성된 3개의 추가 잔기 및 β-갈락토시다제의 아미노 말단에서 8개)로 항원의 첫번째 2개 아미노산을 대체하면 생성물의 복구의 용이성, 항원성 또는 형태에 악영향을 주지 않는다는 것을 보여주었다[S. Stahl 등, "B형 간염 바이러스 코어 항원, 에슈리키아 콜리에서의 합성 및 진단 용도", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, pp. 1606-10(1982); B.J. Cohen 및 J.E. Richmond, "E.Coli에서 합성된 B형 간염 코어 항원의 전자현미경 검사", Nature, 296, pp.677-78 (1982)].
본 발명에 유용한 HBV 코어 항원 융합 단백질은 문헌[S. J. Stahl 및 K. Murray, "B형 간염 바이러스 코어 항원에 펩티드 융합의 면역원성", Proc. Natl. Acadl Sci. USA, 86, pp. 6283-87 (1989)]에 예시된 바와 같이 제조될 수 있다. 대안적으로, 고도의 면역원성 입자를 부여하기 위한, HBV 코어 항원의 주요 단편에 폴리펩티드 서열의 융합은 도 2에 열거된 바와 같이 다수의 바이러스 코딩 서열로 예시화된다. 이것은 HBV 코어 항원 폴리펩티드의 아미노 말단에 바로 선행하는 예비 코어 서열의 6개 아미노산에 헵타펩티드 링커 서열을 통하여 융합된 VP1 펩티드(잔기 142-160)를 백시니아(vaccinia) 바이러스 벡터를 통하여 발현시킴으로써 제조되는 고도의 면역원성을 가진 입자 생성물을 포함한다[B. E. Clarke 등, "간염 B 코어 단백질에 융합 후 펩티드 에피토프의 면역원성 개선", Nature, 330, pp. 381-84 (1987)]. HBV 코어 항원 융합 단백질에 유용한 다른 것들을 위해서는 Ulrich 등(1998)을 참조할 수 있다.
일련의 다른 융합 단백질은 HBV 코어 항원 폴리펩티드의 카르복시 말단에 아르기닌이 풍부한 영역이 기타 다른 코딩 서열에 의해 대체됨을 특징으로 한다. HBV 표면 항원의 면역우성 a 영역, pre-S1 및 pre-S2 에피토프 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)의 외피 단백질의 다양한 단편을 포함하는 펩티드를 HBV 코어 항원 폴리펩티드의 잔기 144에 부착시켰다. 모두 E.Coli에서 효과적으로 발현되어 HBV 코어 항원 자체와 실질적으로 동일한 형태를 나타내는 입자 생성물을 생산한다[Stahl 및 Murray, 1989]. 생성물은 HBV 코어 항원의 항원 반응성을 나타내고, 잔기 144에서 절단된 HBV 코어 항원 폴리펩티드의 제조처럼, 시험된 것들은 HBV 항원 반응성을 나타낸 반면, 전장 HBV 코어 항원은 이러한 활성을 거의 나타내지 않는다. HBV 표면 항원으로부터의 잔기 111-156 또는 111-165를 보유한 융합 단백질은, 입자내에 매립된 서열의 가능성 또는 상기 주요 에피토프의 구조적 의존성과 일치하는 결과로서, 상당한 HBV 표면 항원 반응성을 나타내지 않는다. 그러나, 융합 단백질에 대한 면역원적 반응은 이들의 다양한 성분 에피토프를 반영하였다.
L-HBsAg 및 주요 면역우성 a 영역의 pre-S1 및 pre-S2 영역에 위치하는 에피토프뿐 아니라 많은 다양한 하위유형 결정기가 HBV 표면 항원의 짧은, 즉 S 폴리펩티드의 기타 영역에 부여되어 있기 때문에, HBV 표면 항원에 대한 면역 반응이 복 잡하다[G. L. Le Bouvier, "B형 간염 항원의 추가적 항원 결정기의 검출", "오스트렐리아 항원의 이종성", J. Infect. Dis., 123, pp. 671-75 (1971); W. H. Bancroft등, J. Immunol., 109, pp. 842-48 (1972); A.-M. Courouce-Pauty P.V. 및 Holland, "워크숍 A2의 요약: HBsAg 및 그것의 하위유형", Viral Hepatitis, G.N. Vyas, S.N. Cohen 및 R. Schmid, eds.(Philadelphia, USA: Franklin Institute Press), pp. 649-54(1978)]. 다른 하위유형 혈청으로부터 클론된 HBV DNA 상에서 결정된 HBV 표면 항원 코딩 서열은 상응하는 단백질 서열에서 차이점을 나타낸다. 그러나, 명백하게 중요한 잔기의 특정 단일 돌연변이는 하나의 혈청학적 하위유형(y)에서 또 다른 하위유형(d)으로의 전환을 일으키지 않는다. 그러나, 추가적 단일 돌연변이는 y와 d 반응성 및 동일한 분자에서 나타날 수 있는 면역원성 모두에 점진적 변화를 유도한다[P. G. Ashton-Rickardt 및 K. Murray, "B형 간염 바이러스 표면 항원의 면역학적 하위유형을 변화시키고 항원 결정과 면역원 결정 간을 구별시키는 돌연변이", J. Med. Virol., 29, pp. 204-14(1989)]. 관련된 돌연변이는 구조-민감성 면역우성 a 영역내 또는 가까이에서 제조되고, 상술된 HBV 코어 항원에 융합시 사용되는 HBV 코어 항원의 단편내에 모두 존재한다.
유도된 항체의 하위유형 특이성에 대한 돌연변이의 영향은 곧 융합 단백질이 특히 구조에 의존한다면 융합 단백질은 관심있는 에피토프에 대한 반응의 특이성을 변화시키기 위한 방법을 제공할 수도 있음을 제안한 것이다. 천연 탈출(escape) 돌연변이를 의태하는 아르기닌으로, 또한 기타 양성 또는 음성으로 하전된 잔기(라이신 및 글루탐산)으로 글리신145의 돌연변이는 체액성 및 세포성 면역 반응의 비교 연구를 위하여 HBcS111-156의 이 잔기에서 제조되었다[A. L. Shiau 및 K. Murray, "바이러스의 코어 항원에 융합된 B형 간염 표면 항원의 돌연변이된 에피토프가 천연 표면 항원과 반응하는 항체를 유도", J. Med. Virol., 51, pp. 159-66 (1997)]. 모두 대장균에서 효과적으로 발현되어, 강한 HBV 코어 항원성을 나타내는, 예상되는 입자 생성물을 생성하고, 모두 토끼에서 HBV 코어 항원에 대한 높은 역가의 항체를 유도한다.
이들의 모(Parent) 단백질 HBcS111-156처럼, 3개의 잔기 145 돌연변이체는 고체 상 방사능-면역 분석(AUSRIA; Abbott Laboratories) 또는 용액내 항체 침전 분석에서 HBV 표면 항원에 대한 항체와 최소의 상호작용를 보여주었다. 그러나, 이들은 모두 변성 조건하에서 아크릴아미드 겔에서 전기영동 후 면역블롯팅 실험에서 토끼 항-HBV 표면 혈청과 강한 반응을 나타냈다[A.L. Shiau, "B형 간염 바이러스 코어 항원 및 이것의 유도체에 대한 면역학적 양태", PhD Thesis, University of Edinburgh, UK (1993)]. 또한 고농도에서 모 단백질 및 돌연변이 단백질은 HBV 코어 항원에 대한 항체로 코우팅된 고체 상 위에서 포착된 경우 HBV 표면 항원에 대한 항체와 약하게 양성 반응을 보이며, 이는 항-HBsAg 분자에 대한 접근이 가능한 입자의 일부 파괴의 결과일 수 있다[Shiau 및 Murtay, 1997].
면역화된 토끼를 사용하여 융합 단백질에 대한 T-세포 반응 및 항체 생성을 실험하였다. 면역화시킨 후 다양한 시간에서 채취된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 사용하여, 면역화에 사용된 HBV 코어 항원 또는 융합 단백질의 노출에 대한 반응으로 혼입되는 [3H]-티미딘에 기초하여 증식 분석을 수행하였다. 모든 경우에, 강한 반응을 발견하였고, 융합 단백질은 HBV 코어 항원보다 더 강한 자극 지수를 나타냈고, HBV 표면 항원은 예상대로 낮은 자극원이었다. [125I]-HBV 표면 항원으로 수행한 이중 항체 방사능-면역침전 분석[C.J. Burrell 등, "이중 항체 방사능면역분석에 의한 간염 B 표면 항원의 신속한 검출", J. Med. Virol., 3, pp. 1926 (1978)]은 혈청 샘플에서 항-HBs를 측정하기 위하여 사용되었으며, 이는 HBcS111-156에 대한 예상된 양성 반응을 보여주었다. 또한 아르기닌 돌연변이체는 상기 분석에서 그것의 모 분자보다 다소 약하지만 양성 반응을 나타냈고, 글루탐산 돌연변이체로부터 약한 응답을 얻었으나, 라이신 돌연변이에서는 얻지 못했다. 따라서, 결과는 아르기닌 145 돌연변이체를 보유한 융합 단백질(HBcS145R로 지정됨)이 강한 T-세포 자극원이며 더 넓은 반응 특이성을 갖는 항체를 유도함을 보여주었다.
HBV 코어 항원 폴리펩티드에 잔기 145 돌연변이체를 비롯한 다양한 부분의 HBV 표면 항원 폴리펩티드가 융합된 추가 그룹을 제조하여 생성물의 면역원성에 대하여 미치는 다양한 추가적 성분의 전체 크기, 수 및 위치의 영향을 탐구하였다[Shiau (1993)]. 이러한 작제물은 도 2에 포함되고, 다른 융합체처럼 모두 HBV 코어 항원의 형태를 나타내는 입자 생성물을 생성하고, HBV 코어 항원의 아미노 말단에서 HBs111-156 단편과의 융합체는 불용성 집합체를 형성하는 생성물을 제조하여 덜 만족스러웠다.
상기 그룹의 생성물은 HBcS111-156 단편을 가진 초기 생성물처럼 고체 상 위에 또는 용액내에서 HBV 표면 항원에 대한 항체와의 반응을 거의 또는 전혀 보여주지 않았으나, 고체상 위에서 HBV 코어 항원에 대한 항체에 의하여 포집되었을 때, 이들은 HBV 표면 항원에 대한 항체와의 유사한 반응성을 나타내고, HBcS111-155 뿐만 아니라 pre-S1 및 pre-S2 단편을 보유하는 융합체에서 다소 더 높은 반응성(약 2배)을 나타냈다. 림프구 증식 저해를 위한 자극 지수는 모든 융합 단백질에 대하여 역시 강하고, 천연 또는 돌연변이체 HBcS111-156 서열뿐만 아니라 pre-S 단편을 포함하는 것은 강한 반응을 야기한다. HBc144과 HBcS111-156 서열(야생형 또는 돌연변이체) 간에 pre-S1 및 pre-S2 서열의 포함은 이중 항체 방사성-면역침전 분석에서 pre-S 단편이 부족한 융합체에 비하여 높은 항체 수준을 나타내었으나, HBc144 와 pre-S 서열간에 제2 HBcS111-156 서열의 도입은 임의의 반응에서 추가적 향상을 야기하지 않았다. 프롤린144에서 HBV 코어 항원 폴리펩티드에 부착된 최장의 상기 서열은--165 아미노산-- 융합 단백질의 물리적 성질 또는 수율에 악영향을 미치지 않는 것이 명백하다.
또한 C형 간염 바이러스(HCV)의 코어 단백질(HCc)은 발린 149에서 절단된 HBV 코어 항원 폴리펩티드에 부분적 및 다중 전장 복사체(copy)로 융합되었다[A. Yoshikawa 등, "B형 간염 바이러스 코어 단백질의 복사체 일부와의 키메라 B형 간 염 바이러스 코어 입자", J. Virol., 67, pp. 6064-70 (1993)]. HCc 잔기 39-75를 보유하는 융합체는 거의 무시할만한 HCc 항원성을 나타내지만, 잔기 1-91 또는 180 아미노산의 전장 서열이 양성반응을 나타내었고, 항원성은 짧은 링커를 통하여 1-180 서열의 추가적 복사체(최대 4개까지)의 첨가로 거의 지수적으로 증가하였다. 전자현미경은 HCc 잔기 1-91의 단일 복사체를 보유하는 융합체가 HBV 코어 항원 폴리펩티드와 형태적으로 등가인 입자를 형성함을 보여주었으나, 3개의 전장 HCc 복사체는 상기 구조를 매우 변형시켜서 생성물은 단백질분해에 매우 민감하지만, HBV 코어 항원성을 보유하는 물질을 생산한다. 가장 큰 융합 단백질은 720 이상의 추가 아미노산을 보유하지만, HBV 코어 항원 유형의 입자에 대한 제한은 상당히 덜한 것 같다.
PreS 서열은 HBcAg에서의 융합의 위치가 면역원성에 대하여 미치는 영향에 대한 기타 연구에 사용되었다. Borisova 등(1989)은 프롤린 144에서 절단된 HBV 코어 항원에 연결되거나 전장 HBV 코어 항원내에서 이 위치에서 삽입된 pre-S2 전체 또는 pre-S1의 단편(잔기 20-68, 20-69, 또는 69-106)과의 융합체를 제조하였다. HIV 경막 단백질(gp41)의 잔기 78-129 또는 소 백혈병 바이러스(BLV)의 외피 단백질의 잔기 56-103을 가진 이러한 유사 작제물에서, HBV 코어 항원에 융합된 서열은 입자 표면 상에 발현될 수 있을 것으로 생각되었다. 왜냐하면, 모두 항원성이고 면역원성인 것으로 보고되었고, C-말단 아르기닌이 풍부한 도메인은 거의 역효과가 없는 것이 명백하기 때문이었다.
문헌[F. Schodel 등, "B형 간염 바이러스 코어 입자에 삽입된 이종 에피토프 의 위치는 이것의 면역원성을 결정", J. Virol., 6, pp. 106-14 (1992)]은 pre-S1 또는 pre-S2 단편이 전장 HBV 코어 항원의 아미노 말단(pre-코어 서열의 일부에 의하여 또는 직접) 또는 절단된 HBV 코어 항원의 카르복시 말단에 부착되는 경우, 근교배 마우스에서 면역 반응 및 항원성에 미치는 융합의 위치의 효과를 탐구하였다: 추가 작제물은 절단된 카르복시 말단(프롤린 156)에서 pre-S2 단편 및 HBV 코어 항원 잔기 75와 83 사이의 pre-S1 단편을 보유하였다.
포괄적 분석은 짧은 예비-코어 서열을 통한 HBV 코어 항원의 아미노 말단에 융합된 pre-S1 서열이 항원성이지만, 아미노산에 직접 융합된 것은 그렇지 않으며, 양자가 모두 동일한 HBV 코어 항원 면역원성을 갖는 반면, 예비-코어 서열을 통한 융합은 매우 높은 항-pre-S1 반응을 자극함을 보여주었다. 절단된 HBV 코어 항원 말단에서 pre-S2 서열은 양쪽에서 유사한 정도로 항원성 및 면역원성이었으나, 잔기 76-82를 대체하도록 내부적으로 융합된 pre-S1 서열(주요 HBV 코어 항원 에피토프를 포함)은 N-말단 융합에서보다 실질적으로 더 항원성이고 상당히 더 면역원적이었다. 예상한 바와 같이, HBV 코어 항원성 및 면역원성은 내부 융합 단백질에서 상당히 감소되었다. 면역우성 a 에피토프를 함유하는 HBV 표면 항원의 단편으로 HBV 코어 항원의 내부 서열(잔기 78-82)을 대체하여 양성 HBV 코어 항원성 및 면역원성을 나타내는 생성물을 생산하였다[G. Borisova 등, "B형 간염 표면 항원에서 유래한 면역우성 영역을 보유하는 하이브리드 B형 간염 바이러스 뉴클레오캡시드", J. Virol., 67, pp. 3696-3701 (1993)].
추가적 대안으로 또는 상술된 융합 단백질에 더하여, 면역원성 성분이 화학 적 가교 방법에 의하여 HBV 코어 항원에 부착될 수 있다.
Bottcher 등(1997)의 방법에 의하여 제안되는 물리적 구조 상에 HBV 코어 항원의 아미노산 서열의 포개놓음(superimposition)은 HBV 코어 항원의 카르복시 말단에 또는 가까이에 융합된 서열의 낮은 항원성을 설명하는데 용이하다. 이것은 N-말단 융합체는 스파이크의 바닥에서 상대적으로 국한된 공간으로부터 면역원을 더 가져오기 위하여 가요성 링커 서열로부터 이익을 볼 수 있는 반면, HBV 코어 항원의 카르복시 말단에 융합된 서열은 HBV 코어 항원 입자내에 매몰되기 쉽기 때문이다. 스파이크의 끝에서 면역우성 HBV 코어 항원 에피토프의 위치[잔기 78-82; Salfeld 등, (1989)]는 HBV 캡시드-결합 펩티드-면역원의 삽입 또는 부착을 위한 상기 위치의 장점을 보여준다. 기본적으로, 모든 상기 위치는 동시에 사용되어 주어진 HBV 코어 항원 입자에 의하여 제시되는 에피토프의 수 및/또는 다양성을 증가시킬 수 있다.
HBV 코어 항원 입자에 면역원을 연결하는데 사용되는 HBV 캡시드-결합 펩티드
상술한 바와 같이, 관심있는 면역원은 HBV 캡시드-결합 펩티드인 리간드를 사용하여 HBV 코어 입자에 연결될 수 있다. 상기 HBV 캡시드-결합 펩티드는 분리, 정제된 펩티드이다. 이러한 HBV 캡시드-결합 펩티드는 HBV 코어 단백질과 HBV 표면 단백질간의 상호작용을 차단함으로써 HBV 바이러스 조립을 방해 및 저해하는데 유리하다.
바람직하게는, HBV 캡시드-결합 펩티드는 펩티드, 단편, 이들의 유사체 및 상동체를 포함하고, 이들은 길이가 약 2 내지 약 20 아미노산이다. 더욱 바람직하게는, 펩티드는 길이가 약 3 내지 약 15 아미노산이다. 이러한 펩티드는 하기 표에 열거된 것 및 이것의 단편 및 유사체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단편"은 그것이 유래된 펩티드보다 짧으나 본래 펩티드의 것과 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 이러한 단편은 길이가 적어도 2개 아미노산이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유사체"는 펩티드의 아미노산 서열에서 변이를 의미하며, 약 4개 중 하나의 아미노산 변화에 의하여만 달라지는 유사체를 통상 포함할 것이다. 유사체의 기타예는 본원에서 예시된 펩티드로부터 소수의 아미노산 변이를 갖는 펩티드를 포함한다. 특히, 보존적 아미노산 대체, 즉 이들의 측쇄에서 관련된 아미노산의 일족(family) 내에서 일어나는 대체를 포함하는 펩티드는 유사체를 구성한다.
유전자적으로 암호화되는 아미노산은 4개 족으로 통상 구분된다: (1) 산성: 아스파르테이트, 글루타메이트; (2) 염기성: 라이신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비극성: 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비전하 극성: 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 종종 방향족 아미노산으로서 함께 분류된다. HBV 캡시드-결합 펩티드에 있어서, 1 이상의 아미노산을 변화시키는 것이 유리할 수도 있다. 당업자는 이러한 변화의 영향을 용이하게 평가할 것이다.
용어 "상동체"는 아미노산 수준에서 60% 이상의 동일성, 바람직하게는 75% 의 동일성 및 기준 펩티드에 실질적으로 유사한 생물학적 활성을 공유하는 펩티드 단편을 포함한다. 이러한 바람직한 백분율은 펩티드의 작은 크기를 반영한다.
유용한 HBV 캡시드-결합 펩티드는 문헌[Dyson 및 Murray (1995)]에 개시된 펩티드에 기초한 것을 포함한다. 이러한 펩티드를 합성하여, 융합 파지 B1에서 펩티드 LLGRMK에 인접한 잔기를 무작위 돌연변이발생시키고 향상된 친화성을 갖는 항원과 결합하는 유도체를 획득하기 위하여 생-팬닝(bio-panning) 반응으로 HBV 코어 항원에 대해 재-선택한다. 고 해상도 전자 냉현미경은 이러한 HBV 캡시드-결합 펩티드가 HBV 코어 단백질 쉘의 스파이크의 끝에 결합하는 것을 보여주었다. 감염된 세포에서 HBV 코어 항원과 HBV 표면 항원 단백질간의 상호작용에 미치는 펩티드의 저해 효과를, 펩티드의 존재 또는 부재시 HBV 게놈의 머리-꼬리(head-to-tail) 이량체를 보유하는 복제-가능 플라스미드로 투과가능한 간암 Hep G2 세포의 형질감염을 통하여 실험하였다. 참조 Bottcher 등 (1998).
LLGRMK 서열을 보유하는 HBV 캡시드-결합 펩티드는 용액내에서 L-HBV 표면 항원과 HBV 코어 항원 사이의 반응 저해시 펩티드에 대한 IC50 값을 반영하는 상대적 효율로, 용량 의존적인 방식으로 형질감염된 간암 세포 배양액에서 HBV의 수율을 감소시켰다.
HBV 캡시드-결합 펩티드는 약 10 uM 이하, 바람직하게는 5 이하, 더욱 바람직하게는 약 2이하, 가장 바람직하게는 약 0.5이하의 ½최대(half-maximal) 농도(IC50)를 갖는다. 바람직한 펩티드는 SLLGRMKG(β-A)C, RSLLGRMKGA, HRSLLGRMKGA, 및 RSLLGRMKGA(β-A)C 또는 이것에서 유래한 펩티드를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 대안적으로, 이러한 펩티드는 펩티드 ALLGRMKG이고, 이것은 긴 B형 간염 바이러스 표면 항원(L HBsAg)와 HBcAg간의 상호작용을 저해하며, ½최대 농도(IC50)가 10.0 uM이다.
HBV 캡시드-결합 펩티드는 다음에 의하여 예시화되고, 여기서 Kp Rel(nM)이 gpIII 단백질의 아미노 말단 영역에서 펩티드 서열을 보유하는 fd 융합 파지와 HBV 코어 항원간의 반응에 대한 상대적 분해 상수를 나타낸다[참조 Dyson 및 Murray (1995)]:
서열 K p Rel (nM)
ADGALLGRMKGA 152 ±5
ADGALLGRMKPA 767 ±8
ADGSLLGRMKPA 322 ±50
ADGALLGRMKRA 181 ±12
ADGTLLGRMKLA 20 ±2
ADGSLLGRMKGA 1.7 ±0.3
ADRSLLGRMKGA 1.09 ±0.02
ADGSRSSLLGRMKGA 1.96 ±0.32
ADGAHSSLLGRMKGA 1.72 ±0.17
ADGHRSLLGRMKGA 1.40 ±0.13
ADGPRSLLGRMKGA 0.84 ±0.07
ADGAHSLLGRMKGA 0.94 ±0.12
ADGYQRSLLGRMKGA 0.88 ±0.08
ADGTQRSLLGRMKGA 0.84 ±0.06
ADGMHRSLLGRMKGA 0.55 ±0.03
L HBsAg의 세포질 영역을 의태하는 이러한 펩티드는 파지 결합된 형태로 측정된 용액내 HBV 코어 항원에 대한 이들의 친화성 및 섬유상 파지에 나타나는 임의의 헥사펩티드 라이브러리로부터 선택됨으로써 동정되었다. 다음의 관련된 펩티드(하기 열거됨)는 또한 HBV 캡시드-결합 펩티드의 예이고, IC50 uM 값은 ½최대 수준에서 HBV 코어 항원에 대한 L HBsAg의 결합을 저해하는 데 필요한 펩티드의 농도를 나타내고, N/D는 관찰가능한 저해가 없음을 나타내고, β-A는 베타 알라닌을 나타낸다[Dyson 및 Murry (1995)]:
서열 IC 50A uM
ALLGRMKG 11.0 ±0.8
삭제
LLGRMKG 46.2 ±7.4
LGRMKG 980 ±157
GRMKG N/D
LLGRM N/D
CLLGRMKC 652 ±74
ALLPRMKG N/D
SLLGRMKG 6.4 ±0.7
SLLGRMK 40.7 ±4.8
SLLGRMKGA 2.4 ±0.2
GSLLCRMKGA 0.79 ±0.23
DGSLLGRMKGAA 3.0 ±0.4
ADGSLLGRMKGAAG 4.5 ±0.8
ACSLLGRMKG 26.2 ±5.0
SLLGRMKG(β-A)C 1.8 ±0.4
RSLLGRMKGA 0.29 ±0.02
HRSLLGRMKGA 0.50 ±0.04
MHRSLLGRMKGA 0.80 ±0.10
RSLLGRMKGA(β-A)C 0.29 ±0.03
MHRSLLGRMKGAG(β-A)C 3.80 ±0.69
HBV 코어 항원 입자에 면역원을 결합시키기 위하여 리간드로 작용할 수 있는 HBV 캡시드-결합 펩티드, 단편, 이것의 유사체 및 상동체는 통상적 합성 기술, 예를 들면, 화학적 합성 기법을 사용하여 합성되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 당업자는 예를 들면, t-BOC 화학 물질과 같은 표준 화학 물질을 이용하여 자동화된 펩티드 합성기를 사용함으로써 임의의 펩티드를 합성할 것이다. 예, 참조 L. A. Carpino, J. Am. Chem. Soc., 79, pp. 4427 (1957). 그리고 펩티드는 단백질의 화학적 절단 또는 기타 방법에 의하여 제조될 수 있다. 펩티드는 분리되어 이들이 단백질의 화학적 절단에 의하여 얻어지든지 또는 화학적으로 합성되는 경우에 화학 전구체 또는 기타 화학물질이 실질적으로 없다.
대안적으로, HBV 캡시드-결합 펩티드는 통상의 유전 공학 기술, 예컨대 선택된 펩티드에 대한 코딩 서열을 보유하는 DNA 단편을 숙주 미생물 또는 세포내에 클로닝 및 발현시킴으로써 펩티드를 코딩하는 핵산 서열로 형질전환된 숙주 세포 내에서 재조합 DNA 기법에 의하여 제조될 수 있다. 적절하게 형질전환된 세포에서 재조합 기법에 의하여 제조된 경우, 펩티드는 통상의 방법을 사용하여 세포 배양액 배지, 숙주 세포 또는 양쪽 모두로부터 정제될 수 있다. 재조합 펩티드는 분리되고, 펩티드가 재조합 DNA 기법에 의하여 생성된 경우 세포 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없다. 펩티드에 대한 코딩 서열은 이용가능한 cDNA를 함유한 플라스미드로부터 또는 공지된 기법에 의하여 바이러스 RNA로부터 합성되어 제조되거나 또는 유래될 수 있다.
상기 발명의 방법을 사용하기 위하여 상술된 펩티드를 통상의 공지된 또는 대안적 작제물내로 설계하여 펩티드의 제조 또는 HBV 코어 항원에 대한 이것의 결합을 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 펩티드는 단백질 또는 펩티드 융합 짝에 선택적으로 융합될 수 있다. 따라서, 당업자는 선택된 융합 짝과 결합하는 펩티드, 예를 들면 또다른 펩티드 또는 이것에 바람직한 특성을 부여하는 기타 펩티드 또는 단백질을 설계할 수 있다.
대장균, 바실러스, 스트렙토마이세스, 사카로마이세스, 포유동물, 효모, 곤충 세포 및 식물 세포를 비롯한 다양한 미생물 및 세포, 및 이를 위한 적절한 벡터에서 HBV 캡시드-결합 펩티드를 클로닝하고 발현하기 위한 시스템은 공지되었고 개인 및 공공의 실험실 및 기탁기관에서 입수가능하고 상업적으로 시판된다.
재조합적으로 제조되든지 또는 합성되든지, HBV 캡시드-결합 펩티드는 통상적 정제 수단을 사용하여 정제될 수 있다. 당업자는 펩티드가 사용될 수 있는 바람직한 용도를 위하여 요구되는 적절한 정제 수준을 용이하게 결정할 수 있다.
HBV 캡시드-결합 펩티드 링커의 선택이 HBV 코어 항원 입자를 형성하는 특정 HBV 코어 항원 폴리펩티드의 성질에 따라 어느 정도 좌우될 것이다. 예를 들면, 다른 최초 바이러스 균주의 HBV 코어 항원 입자는 주어진 HBV 코어 항원 폴리펩티드의 리간드 결합 부위에 또는 가까이에서의 다른 아미노산 서열 때문에 다른 HBV 캡시드-결합 펩티드 리간드를 요구할 수 있다.
면역원에 HBV 캡시드-결합 펩티드의 연결
HBV 캡시드-결합 펩티드는 관심있는 면역원에 연결하여 펩티드 결합을 통해 캡시드-결합 면역원을 형성할 수 있다. 면역원이 그 자체가 펩티드인 경우, 이것은 더 긴 펩티드의 2 성분간에 어느 정도의 유연성을 부여하기 위하여, 통상적으로 바람직하게는 2 내지 5(및 종종 3)개의 글리신 잔기를 통하여, 면역원 서열에 연결된 HBV 캡시드-결합 서열을 포함하는 펩티드의 상응하는 코딩 서열의 형질전환된 세포에서의 발현에 의하여 또는 단일 합성에 의하여 용이하게 완성될 수 있다. 대안적으로, 펩티드는 면역원에 가교될 수 있다.
펩티드 및 면역원의 결합 성분간에 연결 방향은 HBV 코어 항원 입자에 캡시드-결합 면역원을 가교하기 위한 궁극적 방법의 효율에 영향을 미칠 것이다. 대안적으로, HBV 코어 항원 입자에 가교될 수 있는 다수의 캡시드-결합 면역원 중에, 하나의 면역원은 가교된 펩티드의 아미노 말단에 위치하는 반면, 또다른 면역원은 연결된 펩티드의 카르복시 말단에 위치할 수 있다. 일부 경우에, HBV-캡시드 결합 펩티드의 각 끝에 동일한 면역원 또는 상이한 면역원을 위치시키는 것이 유리할 것이다. 주어진 HBV 코어 항원 입자에 가교될 수 있는 HBV 캡시드-결합 펩티드-면역원 복합체의 조직화에서 이러한 변형은 고도의 다중성분 또는 다가 HBV 코어 항원 입자를 유리하게 제공한다. 참조 도 1.
따라서, HBV 코어 항원 입자에 가교될 수 있는 캡시드-결합 면역원의 방향은 생성된 입자의 궁극적 면역원성 또는 다원자가(multivalency)에 있어서 중요하다. 고도의 면역원성 또는 다원자가는 면역원이 HBV 캡시드-결합 펩티드의 아미노 말단으로 배향되는 경우에 예상된다. 가요성을 증가시킬 수 있는 상기 배향은 또한 대형 면역원에 대하여 바람직하다.
HBV 코어 항원 입자에 캡시드-결합 면역원의 연결
캡시드-결합 면역원은 임의의 통상적 가교제를 사용하여 HBV 코어 항원 입자에 가교될 수 있다. 이러한 가교제는 예를 들면 다기능성 가교제, 예컨대 글루타르알데히드, 숙신알데히드, 옥탄디알데히드 및 글리옥솔을 포함한다. 추가적 가교제는 피어스 카타로그 및 핸드북[Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1997)]에 열거되어 있다. 기타 가교제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보 디이미드 히드로클로라이드(EDC) 및 N-히드록시설포숙신이미드(설포-NHS)와 같은 것을 포함하고, 이것은 인접한 1차 아미노기 및 카르복시기를 연결하여 아미드 결합을 형성한다. 상기 제제를 캡시드-결합 면역원/HBV 코어 항원 입자 혼합물에 첨가하는 경우 HBV 코어 항원으로부터 인접하는 아스파르테이트 또는 글루타메이트에 펩티드의 이용가능한 라이신 성분을 공유적으로 가교시킨다.
또한 주어진 HBV 코어 항원 입자에 부착된 다른 면역원의 비율이 HBV 코어 항원 입자에 캡시드-결합 면역원을 연결시키는데 사용되는 혼합물에서 각 면역원의 상대적 비율에 의하여 다양화될 수 있다.
본 발명에 따른 치료적 조성물
본 발명은 또한 본원에서 개시된 다중성분 또는 다가 HBV 코어 항원 입자로 개체의 치료적 또는 예방적 처리하는데 유용한 조성물을 제공한다. 임의의 동물 뿐만 아니라 인간 및 기타 포유동물을 포함하는 임의의 개체는 본원에서 개시된 HBV 코어 항원 입자로 처리될 수 있다. 치료적 조성물은 HBV 코어 항원 입자의 약학적 유효량을 포함한다. 즉, 상기 유효량이란 일정 기간에 걸쳐 투여되는 개체에서 1 이상의 질병을 치료하는데 또는 1 이상의 감염성 제제에 대하여 면역화시키는데 효과적인 양이다. 예방적 조성물은 HBV 코어 항원 입자의 예방학적 유효량을 포함한다. 즉, 상기 유효량은 일정 기간에 걸쳐 투여되는 개체에서 1 이상의 질병을 예방하는데 효과적인 양이다.
HBV 코어 항원 입자가 다양한 형태의 다중 면역원을 포함하는 경우에, 이들을 포함하는 조성물 및 백신은 각 성분 면역원에 대하여 개체에서 면역 반응의 향 상을 유도하는데 사용될 수 있다. HBV 코어 항원 입자가 공통 유형의 다중 면역원을 포함하는 경우에, 이들을 포함하는 조성물 및 백신이 공통 면역원에 대하여 개체에서 면역 반응의 향상을 유도하는데 사용될 수 있다. 공통 유형의 다중 면역원을 함유하는 조성물 및 백신은 통상적 단일치료법에 비하여, 단일가 및 성능의 향상을 특징으로 한다.
본 발명의 다중성분 또는 다가 HBV 코어 항원 입자를 포함하는 조성물은 보강제와 함께 또는 보강제 없이, 조절되는 방출 제형을 포함하여 약학적 또는 예방적 제제의 일부로서 또는 단독으로 투여될 수 있다. 이들은 상기 감염의 치료를 위한 투여에 적합한 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 추가로 함유할 수도 있다. 적절한 약학적 허용 담체는 생리적으로 불활성이고 및/또는 비독성이다. 다수의 담체가 당업계에 공지되었고, 원하는 용도에 기초하여 선택될 수 있다. 예시적 담체는 살균 염수, 락토스, 수크로스, 칼슘 포스페이트, 겔라틴, 덱스트린, 아가, 알룸, 알루미나, 알루미늄 히드록시드, 펩틴, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가적으로, 담체 또는 희석제는 시간 지연 물질, 예를 들면 글리세롤 모노스테레이트 또는 글리세롤 디스테레이트를 왁스와 배합하여 또는 단독으로 포함할 수 있다. 게다가, 가용성 유리와 같은 통상적인 서방성(slow release) 중합체 제형이 사용될 수 있다.
잠재적으로, 다중성분 또는 다가 HBV 코어 항원 입자를 포함하는 조성물은 기타 치료적 또는 예방적 제제를 함유할 수도 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 감염의 치료 또는 예방에 유용한 다중 시약의 "칵테일"을 포함할 것이다. 이러한 임 의의 칵테일은 인터페론, 뉴클레오티드 유사체 및/또는 N-아세틸-시스테인과 같은 기타 시약을 포함할 것이다.
선택적으로, 면역원성 HBV 코어 항원 입자를 함유하는 조성물은 환자에서 항체 및 T 세포 반응을 추가로 유도하는데 유용한 보강제 또는 시토킨과 같은 면역계 개질제를 추가로 함유할 것이다. 상기 개질제는 통상적 알룸 기초한 보강제 또는 무라밀 디펩티드, 보존제, 화학적 안정화제 또는 기타 항원성 단백질을 포함한다. 통상, 안정화제, 보강제 및 보존제 등은 원하는 용도에서 효능을 위한 최상의 제형을 결정하기 위하여 최적화된다. 적절한 보존제는 클로릴부틴올, 포타슘 소르베이트, 소르브산, 설퍼 디옥시드, 프로필 갈레이드, 파라빈스, 글리세린 및 페놀을 포함할 수 있다.
상기 조성물의 적절한 양은 원하는 반응의 수준에 기초하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 면역원 HBV 코어 항원 입자를 포함하는 조성물은 입자 약 5ug 내지 약 200 ug을 포함할 것이다. 상기 조성물은 한번 또는 일련의 접종, 예를 들면 2 내지 6개월의 간격으로 3회 접종으로서 투여될 수 있다. 또한 적절한 용량은 단일치료로 투여시 성분 면역원의 통상적 용량 및 환자의 건강 상태, 몸무게 또는 연령과 같은 인자를 고려하여 주치의의 판단에 의하여 결정될 수 있다. 필요하다면 주어진 병원균에 노출 증가 가능성 또는 환자의 상태 개선시, 면역원성 HBV 코어 항원 입자를 포함하는 조성물의 유지 용량이 투여될 수 있다. 이어서, 투여의 용량 또는 회수, 또는 양쪽 모두가 원하는 효과를 유지하는 수준으로 감소될 수 있다. 그 지점에서 치료를 정지해야 한다. 그러나, 개체는 주어진 원치않는 질병의 재발시 장기적으로 간헐적 치료를 요구할 수 있다.
다중성분 또는 다가 HBV 코어 항원 입자를 포함하는 조성물은 임의의 적절한 경로, 예를 들면 비경구 투여, 특히 근육내 또는 피하내 및 경구 투여에 의하여 투여될 수 있다. 기타 경로로 기관지, 비강, 귀, 항문, 피부, 눈, 정맥내, 동맥내, 복강내, 점막, 혀아래, 피하 및 두개내가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 면역원 HBV 코어 항원 입자는 HBV 감염된 개체의 활성 치료에서 체내 바이러스의 증식을 저해, 감소 또는 지연시키는데 사용될 수 있다. 치료적 조성물은 바이러스의 조립 기작을 무력화, 저해 또는 예방할 수 있는 면역원 HBV 코어 항원 입자를 포함한다. 상기 치료적 조성물은 1 이상의 본 발명의 면역원 HBV 코어 항원 입자 및 담체 또는 희석제를 함유하도록 제형화될 수 있다. 상기 담체 및 희석제는 특정의 다른 조성물과의 배합에 대하여 상술되었고 당업자에 의하여 동정될 수 있다.
유효 성분으로서 면역원 HBV 코어 항원 입자를 함유하는 조성물 제제 또는 백신 제제를 이용하여 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사가능한 조성물 또는 백신을 제형화시킬 수 있다. 또한 주사전 용액 또는 액체중 현탁액에 적절한 고체 형태가 제조될 수 있다. 또한 제제는 특정 구체예로 단계적 방출 및/또는 지연된 전달을 위하여 리포좀 또는 가용성 유리에 에멀션화되거나 캡슐화될 수 있다. 대안적으로, 제형은 에어로졸 또는 분무형일 수 있다. 또한, 이들은 피부투과 패치로 포함될 수 있다. 유효 성분은 임의의 부형체와 혼합될 수 있고 상기 부형제는 유효 성분 또는 기타 성분과 혼화가능하고 약학적으로 허용가능하다. 상기 부형제는 예를 들면 프로인트 불완전, 박테리아 리포폴리사카라이드, 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 뮤라밀 디펩티드, 레시틴, 완충액 물질, 셀룰로스-기초한 물질 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
본 발명에 따른 HBV 코어 항원 입자를 포함하는 백신은 다수의 다른 면역원을 포함하는 배합물 백신이 유리할 것이다. 상기 백신은 디프테리아, 파상풍, 무세포성 백일해, 헤모필루스 인플루엔자, 폴리오, 홍역, 볼거리, 풍진, 수두, B형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스 또는 폐렴구균 폐렴으로 구성된 군에서 2 이상에 대한 면역원을 포함하는 배합물 백신을 포함한다. 기타 백신은 국제 여행전에 개체에 접종을 위한 것을 포함한다. 상기 백신은 예를 들면 황열, B형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, 장티푸스, 수막염구균성 뇌염 또는 콜레라로 구성된 군에서 2 이상에 대한 면역원을 함유하는 백신을 포함한다.
본 발명에 따른 HBV 코어 항원 입자를 포함하는 조성물은 동물 알러지원, 곤충 알러지원, 식물 알러지원, 공기 알러지원 및 흡입 알러지원과 같이 1 이상의 알러지원으로 개체를 탈감작시키기 위한 면역치료 요법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예에 따르면, HBV 코어 항원 입자는 면역요법 또는 진단에 사용하기 위하여 관심있는 면역원에 대한 항체를 유도하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, HBV 코어 항원 입자로 접종된 개체에서 생성된 항체는 분리되어 정제된 형태로 사용될 수 있다. 대안적으로, 개체에서 유래한 상기 항체 또는 B 세포를 이용하여 통상적 기법에 의하여 모노클론 항체를 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 검출 방법
본 발명의 HBV 코어 항원 입자는 또한 다수의 통상적 분석 형태, 특히 감염성 제제의 노출 또는 감염의 진단을 위한 면역분석 형태에 사용될 수 있다. 상기 용도는 본 발명의 작제물의 HBV 캡시드-결합 펩티드 성분이 진단 표지, 화학 마커, 독소 또는 기타 단백질 또는 펩티드와 결합되는 경우 실현된다. 예를 들면, HBV 캡시드-결합 펩티드는, 주어진 HBV 코어 항원-결합 펩티드에 부착된 면역원에 노출되는 경우, 다른 조성물 또는 화합물과 배합하여 또는 단독으로 샘풀에서 표적 분석물의 존재를 나타내는 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 통상의 표지와 결합할 수 있다. 이러한 검출가능한 표지는 진단 분석계 당업자가 용이하게 이용가능하고 공지된 다수의 조성물 중에서 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명은 특정 분석 형태의 선택에 의하여 제한되지 않고, 당업자에게 공지된 분석 형태를 포함하는 것으로 생각된다. 용이하게는, 분석용 시약은 키트 형태로 제공될 수 있다. 상기 키트는 본 발명의 HBV 코어 항원 입자가 예비흡착되는 미세역가플레이트, 다양한 희석제 및 완충액, 특이적 결합된 캡시드 결합 펩티드 면역원의 검출을 위한 표지된 접합체 및, 효소 기질, 공인자 및 크로마겐과 같은 기타 신호 발생 시약을 포함할 수 있다. 기타 성분은 당업자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.
대안적으로, 본 발명에 따른 HBV 코어 항원 입자는 방사능면역분석 또는 ELISA(효소 연결된 면역흡착제 분석)인, 병원균 검출에 현재 이용가능한 면역학적 진단에서 사용될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 다양한 면역원에 대한 항체의 존재에 대하여 시험되 는 샘플은 상기 샘플내 임의의 항체가 1 이상의 HBV 캡시드 결합 면역원과 복합체를 형성할 수 있는 충분한 시간동안 다른 면역원 성분을 보유한 검출가능하게 표지된 HBV 캡시드 결합 면역원을 포함하는 HBV 코어 항원 입자와 접촉될 수 있다. 검출 방법은 상기 샘플에서 상기 항체와 캡시드 결합 면역원 사이에 형성된 복합체에 사용될 수 있다. 제2 검색은 이어서 각 성분 면역원에 기초한 샘플 상에서 수행하여 샘플에서 항체의 특이성을 동정할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 특이적 면역원에 대한 항체의 존재를 시험하기 위한 샘플이 상기 샘플내 임의의 항체가 1 이상의 HBV 캡시드 결합 면역원과 복합체를 형성할 수 있는 충분한 시간동안 이들의 면역원 성분으로서 특이적 면역원을 함유하는 검출가능하게 표지된 HBV 캡시드 결합 면역원을 포함하는 HBV 코어 항원 입자와 접촉될 수 있다. HBV 코어 항원 입자에 의하여 나타나는 특이적 면역원의 높은 가수(valency)에 기인하여, 이러한 진단 분석은 통상적 분석보다 높은 감도(sensitivity)을 특징으로 한다.
도 1은 다양한 캡시드 결합 면역원을 포함하는 HBV 코어 항원 입자의 구조를 도시한다. "캡시드 결합 면역원"은 1 이상의 HBV 캡시드-결합 펩티드 성분 및 1 이상의 면역원 성분을 포함한다. 각 캡시드 결합 면역원은 HBV 캡시드-결합 펩티드를 통하여 HBV 코어 항원 입자에 연결된다.
도 2는 다양한 면역원이 HBV 캡시드-결합 펩티드를 통하여 연결될 수 있는 HBV 코어 항원 입자로서 작용할 수 있는 다양한 HBV 코어 항원 융합 단백질을 요약한 표이다.
본원에서 설명된 발명을 충분하게 이해시키기 위하여, 다음의 실시예가 제시된다. 이 실시예는 단지 예시적 목적이며 그 어떤 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되서는 안된다.
실시예 1
HBV 코어 항원 제조
대장균에서 HBV 코어 항원(aa3-183) 또는 C-말단 절단된 HBV 코어 항원(aa3-148)의 발현 및 정제를 Dvson 및 Murray (1995)에서 설명된 바와 같이 수행하였다. 단백질 제제를 TBS, 수크로스(20%) 및 NaN3 (0.02%)을 함유하는 완충액에서 수크로스 구배 분획물로서 4℃에서 저장하였다. 제제는 6개월 이상 동안 이러한 형태로 안정하였다.
HBV 코어 항원에 HBV 캡시드-결합 펩티드의 화학적 가교 연결
HBV 캡시드-결합 펩티드 MHRSLLGRMKGA(알바켐, 에딘버그 유니버시티)를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC) 및 N-히드록시설포숙신이미드(설포-NHS)(Pierce Europe B.V.에서 모두 입수)를 사용하여 HBV 코어 항원 입자에 가교시켰다. 상기 시약은 인접한 1차 아미노기 및 카르복시기를 연결하여 아미드 결합을 형성한다[Staros 등, "수용성 카르본드이미드-매개된 커플링 결합의 N-히드록시설포숙신이미드에 의한 개량", Analytical Biochem., 156, pp. 220-22 (1986)]. HBV 캡시드-결합 펩티드/HBV 코어 항원 복합물에 첨가하는 경우, 이것은 펩티드의 라이신을 HBV 코어 항원으로부터의 인접한 아스파르테이트 또는 글루타메이트에 공유적으로 가교시켜 이것의 분자량을 증가시킨다.
더욱 자세하게는, 절단된 HBV 코어 항원(15ug)을 펩티드 MHRSLLGRMKGA(1 mM)의 존재 또는 부재하에 포타슘 포스페이트(25 mM, pH7), NaCl(15CmM), (EDC 1.8mM) 및 설포-NHS(1.8 mM)를 함유하는 완충액(30 ul)중에 실온에서 항온처리하였다. 18 시간 후에, 설명된 바와 같이 SDS/PAGE(15% w/v)에 의하여 반응을 분석하였다[Sambrook 등, (1989)]. 펩티드-HBV 코어 항원 입자 복합체에 EDC 및 설포-NHS를 첨가한 결과, HBV 코어 항원의 분획을 위한 SDS-PAGE 상에서 약 1kd에 대응하는 밴드 시프트가 발생하였다. 다양한 조건하에서 반응의 주행에도 불구하고, 이동된 단백질 밴드의 50 % 이상의 수율이 관찰되지 않았다. 이것은 하나의 펩티드가 국소적인 2배 축(2-fold axis)에 가까운 HBV 코어 항원의 이량체에 결합하여, 상기 2배(2-fold) 관련된 부위에 다른 펩티드의 결합을 구조적으로 차단하는 것과 일치한다.
실시예 2
HBV 코어 항원 제조
실시예1에서 제조된 2개의 HBV 코어 항원 샘플뿐만 아니라, 짧은 링커 펩티드 서열을 통하여 절단된 HBV 코어 항원 폴리펩티드(잔기 114에서 절단)에 부착된 HBV pre-S1 서열 1-36 또는 HBV 표면 항원 서열 111-156 또는 111-165를 갖는 HBV 코어 항원 샘플을 Stahl 및 Murray(1989)에 의하여 설명된 바와 같이 제조하였다.
HBV 코어 항원에 HBV 캡시드-결합 펩티드의 화학적 가교 연결
고체상 합성에 의하여 제조된 다음의 캡시드-결합 면역원은 알바켐, 에딘버그 유니버시티에서 입수하였다:
AS-151: GSLLGRMKGA GGG LDPAFRG
AS-152: GSLLGRMKGA GGG EQKLISEEDL
AS-163: LDPAFR GG GSLLGRMKGA
AS-164: EQKLISEEDL GG GSLLGRMKGA
여기서 서열 GSLLGRMKGA은 HBV 캡시드-결합 펩티드이고, 서열 LDPAFR는 HBV pre-S1 에피토프 또는 면역원이고, 서열 EQKLISEEDL은 myc 온코진 에피토프 또는 면역원이다. 실시예 1에 설명된 바와 같이, 이 펩티드 및 염기성 HBV 캡시드-결합 펩티드 GSLLGRMKGA는 별도로 또는 배합하여 다른 농도에서 HBV 코어 항원 입자와 결합하고, EDC 또는 설포-NHS와 가교되었다.
생성된 HBV 코어 항원 입자의 성질
생성물은 아크릴아미드 겔내 SDS의 존재하에서(SDS-PAGE) 전기영동 시킨 후, 쿠마시 블루에 의해 염색하고, HBV 코어 항원 입자 또는 변성된 HBV 표면 항원 입자에 대하여 생성된 모노클론 항체 및 폴리클론 래빗 혈청으로 웨스턴 블롯 분석함으로써 분석되었다. HBV pre-S1 에피토프 및 myc 온코진 에피토프 각각에 대한 모노클론 항체가 이용가능하다. 이들은 각각 모노클론 항체 18/7[K.H. Heermann 등, J.Virol., 52, pp. 396-402 (1984)] 및 모노클론 항체 9E10[Invitrogen, Cataolg # R950-25]이다.
상기 실험은 모든 가교성 반응에서의 생성물이 연결반응 성분의 구성 에피토프 각각에 대한 항체와 양성 반응을 나타내는 것을 보여주었다. 양성 반응은 리간드 펩티드의 카르복시 말단 또는 아미노 말단을 통하여 연결된 면역원에서 획득되었다.
하기에 기재된 바와 같이, 공통된 HBV 캡시드-결합 펩티드 리간드를 사용하여 2 이상의 다른 면역원과의 가교 결합에 관련되는 반응에서 정제된 HBV 코어 항원 입자의 제제는 모든 성분 면역원에 대한 항체와 반응한다. 또한, 하나의 면역원에 특이적인 항체와 침전되는 HBV 코어 항원 입자는 리간드 가교결합 방법에 포함되는 기타 펩티드에 대한 항체와 교차-반응성을 나타낸다.
연결반응의 생성물은 수크로스 구배를 통한 초원심분리법을 수행하였다. 이들은 항체중의 하나, 항-myc 항체와 침전되어 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅에 의하여 분석되었다.
항-myc 항체와 같은 항체 중의 하나와 침전된 물질은 웨스턴 블롯에서 항-myc 및 항-pre-S1 항체와 강한 교차-반응성을 나타내었다. 다른 항체, 예를 들면 항-pre-S1 항체와 침전된 생성물은 동일한 반응을 보여주었다.
다른 면역원을 보유하는 2개의 HBV 캡시드-결합 펩티드가 코어 입자에 결합 및 가교를 위하여 다른 비율로 혼합되는 반응에서, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의한 분석은 2개의 모노클론 항체에 의한 염색의 상대적 강도가 가교에 사용되는 혼합물에서 2 면역원의 비율을 반영함을 보여주었다.
이러한 실험은 반응에서 생성된 HBV 코어 입자의 적어도 일부가 이들에 공유 적으로 부착된 면역원 양쪽 모두를 갖는 것을 보여주었다. 리간드 펩티드가 HBV 코어 항원 입자(뉴클레오캡시드)의 끝에 결합하기 때문에, 상기 제제는 양 성분에 대하여 높은 면역원적 성능을 나타낼 것이고 이들을 투여받은 개체에서 고도의 항원 역가를 유도할 것으로 예상될 것이다.
본 발명자는 상기에서 본 발명의 다수의 구체예를 제시하였지만, 기초 제작물을 변형하여 본 발명의 방법을 사용하는 기타 구체예를 제공할 수 있음이 명백하다. 따라서, 본 발명의 범위는 실시예에 의하여 상기에서 제시된 특정 구체예가 아니라 본원에 첨부된 청구항에 의하여 한정될 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (60)

  1. 입자가 하나 이상의 캡시드 결합 면역원을 포함하고 상기 캡시드 결합 면역원이 하나 이상의 면역원성 성분 및 하나 이상의 HBV(B형 간염 바이러스) 캡시드-결합 펩티드 성분을 포함하는, 다중 면역원 특이성을 보유하는 HBV 코어 항원 입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 캡시드 결합 면역원은 상기 HBV 캡시드-결합 펩티드 성분의 아미노 말단 또는 카르복시 말단을 통하여 상기 입자에 연결되거나, 또는 가교 링커(crosslinker)에 의하여 상기 입자에 가교결합되는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 성분은 링커 서열을 통하여 또는 직접 상기 HBV 캡시드-결합 펩티드 성분에 연결되는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 성분은 면역학적 에피토프 및 항원성 에피토프로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 에피토프를 포함하는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 성분은 항원, 알러지원, 항원 결정기, 단백질, 당단백질, 항체, 항체 단편, 펩티드, 항원 또는 항원 결정기를 의태하는 펩티드 미모토프(mimotope), 폴리펩티드, 글리코펩티드, 탄수화물, 올리고사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 성분은 바이러스, 기생충, 마이코박테리아, 박테리아, 바실러스, 진균, 원생동물, 식물, 파지, 동물 세포 및 식물 세포로 구성된 군에서 선택된 제제로부터 유래되거나 또는 이에 표적화되는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 헤르페스바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 헤파드나바이러스, 플라비바이러스, 피코르나바이러스, 파포바이러스, 아데노바이러스, 바큘로바이러스, 한타바이러스, 파르보바이러스, 엔테로바이러스, 리노바이러스, 종양 바이러스, DNA 바이러스, RNA 바이러스, 토가바이러스, 랍도바이러스 및 폭스바이러스로 구성된 군에서 선택되는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 바이러스는 인간 면역결핍성 유형 1 바이러스, 인간 면역결핍성 유형 2 바이러스, T 세포-백혈병 바이러스, 단순 포진 유형 1 바이러스, 단순 포진 유형 2 바이러스, 수두-단순포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 엡스테인-바르 바이러스, 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 홍역 유사 바이러스, 볼거리 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 황열 바이러스, 뎅그열 바이러스, 진드기-매개성 뇌염 바이러스, 온코바이러스, 회백수염 바이러스, 파필로마 바이러스, 풍진 바이러스, 광견병 바이러스 및 백시니아 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  9. 제6항에 있어서, 상기 면역원성 성분은 바실러스, 엔테로박테리아, 클로스트리듐, 리스테리아, 마이코박테리아, 슈도모나스, 스타필로콕쿠스, 유박테리아, 마이코플라스마, 클라미디아, 스피로케테스, 네이세리아 또는 살모넬라에서 유래되거나 또는 이에 표적화되는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  10. 제6항에 있어서, 상기 면역원성 성분은 디프테리아, 파상풍, 무세포성 백일해, 헤모필루스 인플루엔자, 폴리오, 홍역, 볼거리, 풍진, 수두, B형 간염 바이러스, A형 간염 바이러스, 폐렴구균 폐렴, 황열, 말라리아, 장티푸스, 수막염구균성 뇌염 또는 콜레라에 표적화되는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  11. 제5항에 있어서, 상기 면역원성 성분은 동물 알러지원, 곤충 알러지원, 식물 알러지원, 공기 알러지원 및 흡입 알러지원으로 구성된 군에서 선택되는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  12. 제1항에 있어서, 상기 HBV 코어 항원은 입자 형태로 조립되는 HBV 코어 항원 융합 단백질인 것인 HBV 코어 항원 입자.
  13. 제12항에 있어서, 상기 HBV 코어 항원 융합 단백질은 면역학적 에피토프 또는 항원성 에피토프를 포함하는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  14. 제12항에 있어서, 상기 HBV 코어 항원 융합 단백질은 절단된 HBV 코어 항원을 포함하는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  15. 제12항에 있어서, 상기 HBV 코어 항원 입자는 HBV 표면 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  16. 제15항에 있어서, 상기 HBV 코어 항원 융합 단백질은 HBV 표면 항원의 pre-S1 영역, HBV 표면 항원의 pre-S2 영역 및 HBV 표면 항원의 면역우성 a 영역으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  17. 제1항에 있어서, 상기 HBV 코어 항원 입자는 전장 HBV 코어 항원 폴리펩티드를 포함하는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  18. 제1항에 있어서, 상기 HBV 캡시드-결합 펩티드 성분은 SLLGRMKGA, GSLLGRMKGA, DGSLLGRMKGAA, ADGSLLGRMKGAAG, SLLGRMKG(β-A)C, RSLLGRMKGA, HRSLLGRMKGA, ALLGRMKG, MHRSLLGRMKGA, RSLLGRMKGA(β-A)C 및 MHRSLLGRMKGAG(β-A)GC, 및 1개 내지 약 4개의 보존적 아미노산 대체를 함유하는 이들의 유사체로 구성된 군에서 선택되는 것인 HBV 코어 항원 입자.
  19. 제1항에 따른 HBV 코어 항원 입자의 예방학적 유효량 및 약학적 허용 담체를 포함하는 백신.
  20. 제1항에 따른 HBV 코어 항원 입자의 치료학적 유효량 및 약학적 허용 담체를 포함하는 약학 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 상기 캡시드 결합 면역원은 진단성 표지 또는 화학 마커를 포함하는 것인 HBV 코어 항원 입자.
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