KR100949310B1 - 세포 영상 기법을 이용한 ｈｂｖ 캡시드 단백질과 표면단백질 간 상호작용 측정 방법과 이를 이용한 ｈｂｖ 증식억제물질의 검색방법 - Google Patents

세포 영상 기법을 이용한 ｈｂｖ 캡시드 단백질과 표면단백질 간 상호작용 측정 방법과 이를 이용한 ｈｂｖ 증식억제물질의 검색방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HBV(Hepatitis B Virus) 증식에 필요한 캡시드 단백질과 표면 단백질 간 상호작용(결합도)을 세포 영상으로 측정하여 HBV의 증식 억제물질을 검색하는 방법으로, 구체적으로 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위와 세포막 표적화 기능의 PH(Pleckstrin homology) 도메인의 서열을 포함하는 융합단백질, 상기 융합단백질과 상호작용하는 캡시드 단백질과 형광단백질(GFP)을 포함하는 융합단백질 간의 상호작용에 의하여 세포 영상의 변화를 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 HBV 증식에 필요한 단백질 간의 상호작용을 세포 수준에서 검색하는 방법을 이용하여 새로운 HBV의 증식 억제물질을 세포 수준에서 검색하는데 유용하게 이용될 수 있다.
HBV, 세포 영상, 단백질 상호작용, 검색방법, 증식 억제물질

Description

세포 영상 기법을 이용한 ＨＢＶ 캡시드 단백질과 표면 단백질 간 상호작용 측정 방법과 이를 이용한 ＨＢＶ 증식 억제물질의 검색방법{Method for detection of the interaction HBV capsid and surface proteins using cellular imaging, and screening method of inhibitory agent of HBV proliferation using thereof}
본 발명은 HBV(Hepatitis B Virus) 증식에 필요한 캡시드 단백질과 표면 단백질 간 상호작용(결합도)을 세포 영상으로 측정하여 HBV의 증식 억제물질을 검색하는 방법으로, 더욱 상세하게는 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위와 세포막 표적화 기능의 PH(Pleckstrin homology) 도메인의 서열을 포함하는 융합단백질, 상기 융합단백질과 상호작용하는 캡시드 단백질과 형광단백질(GFP)을 포함하는 융합단백질 간의 상호작용에 의하여 세포 영상의 변화를 측정하는 방법에 관한 것이다.
HBV(hepatitis B virus)는 B형 간염을 유발하는 헤파드나비리대(Hepadnaviridae) 계통의 바이러스로서 세계적으로 약 2억 명에 달하는 인구가 HBV 보균자이다. HBV에 대한 백신은 이미 개발되어 널리 보급되고 있으나, 이미 감염된 사람을 치료하기 위한 치료제로는 단지 라미부딘(lamivudine)과 인터페레론(interfereron) 만이 사용되고 있다. 이 중 라미부딘은 HBV의 DNA 중합효소(polymerase)의 활성을 억제하는 특성이 있지만 장기 투여할 시 내성이 있는 바이러스가 발생하고 있어 그 적용이 제한되고 있다. 따라서 더욱 다양한 HBV 치료제의 개발이 요구되고 있다.
지금까지 B형 간염 바이러스의 억제물질로 인터페론, 핵산 유도체 또는 면역 조절물질 등이 개발되어 왔지만 만족할만한 효능을 지닌 것은 거의 없는 실정이기에, B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 물질로서 바이러스가 수용체에 부착하는 것을 저해하거나, 바이러스의 활성 단백질이나 중합효소를 특이적으로 저해하는 물질을 찾는 연구가 이루어지고 있다. 하지만 최근 HBV 단백질들의 다양한 활성을 억제하는 물질의 개발이 시도되고 있다. HBV가 감염된 세포에서 HBV의 조립을 위하여 HBV의 캡시드(capsid) 단백질과 표면 단백질의 상호작용이 필요하다. HBV의 캡시드 단백질은 HBV 핵산과 결합하여 지름 30 ㎚ 크기의 뉴클레오캡시드 입자를 구성한다. HBV의 표면 단백질은 하나의 유전자(S gene)로부터 세 가지 L, M, S 단백질이 생합성 된 후 세포 내 ER 지질 막에서 발현되어 상기 뉴클레오캡시드와 특이적 결합을 하고, 동시에 ER의 지질 막이 HBV 뉴클레오캡시드를 둘러싸면서 완성된 형태의 HBV 입자를 형성하게 된다(Volker B & Don G, PNAS USA 88:1059-1063, 1991). 이러한 과정에서 HBV 뉴클레오캡시드의 표면에 존재하는 캡시드 단백질과 표면 단백질-특히 PreS라 명명된 L 단백질의 N-말단의 아미노산 1-163에 해당하는 부위 간의 선택적인 결합이 HBV 입자의 형성을 유발하게 되며, 이러한 두 단백질 간의 상호작용은 HBV의 증식을 억제하는 물질 개발의 표적(target)으로 고려될 수 있다. 이러한 HBV의 캡시드 단백질과 표면 단백질 간의 상호작용의 검출을 위해 재조합 단백질을 이용한 면역 검출 방법이 개발되었다(Asif-Ullah M et al ., Antiviral Res 70;85-90. 2006). 상기 방법은 대장균에서 발현된 재조합 단백질을 이용하는 특성이 있다.
그러나, 최근의 신약 개발 과정에서 화합물의 생리활성을 측정하는 방법으로서, 정제된 표적 단백질의 활성을 측정하는 방법 이외에 세포를 대상으로 표적 단백질의 활성을 측정하는 방법이 활발하게 모색되고 있다. 세포를 대상으로 화합물의 생리활성을 측정하는 방법은 목적하는 생리활성을 측정하는 동시에 화합물의 세포 투과성과 독성을 동시에 검증할 수 있는 장점이 있어 보다 효과적인 검색방법으로 인식되고 있다.
HBV가 감염된 세포 내에서 HBV의 캡시드 단백질과 HBV 핵산으로 이루어진 뉴클레오캡시드 입자는 세포의 소포체 막에 발현된 HBV의 표면 단백질들과 특이적 결합을 하면서 활성이 있는 완성된 HBV 입자를 형성하게 된다. 이러한 HBV 단백질간의 결합은 HBV의 캡시드 단백질과 표면 단백질의 PreS 부위간의 선택적인 상호작용에 의해 결정된다. 따라서 HBV의 캡시드 단백질과 표면 단백질의 PreS 부위 간의 결합을 세포 수준에서 측정할 수 있다면, 상기 측정 방법을 세포 검색 방법으로 이용하여 이들 단백질 간의 결합을 억제하는 화합물을 효과적으로 검색할 수 있을 것이다. 이러한 활성을 갖는 화합물은 HBV 증식을 억제할 수 있는 기능을 가질 것이며 따라서 HBV에 의해 유발되는 간염 치료제로서 개발될 수 있다.
본 발명은 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위와 세포막 표적화(targeting) 기능의 PH 서열을 포함하는 융합단백질, 상기 단백질과 상호작용하는 캡시드 단백질과 형광단백질(GFP)을 포함하는 융합단백질을 이용하여 이들 단백질들의 상호작용에 의하여 형광신호의 세포 분포가 변화하게 되고 이를 형광 현미경으로 측정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 HBV 증식에 필요한 단백질 간의 상호작용을 세포 수준에서 검색하는 방법으로 새로운 HBV의 증식 억제물질을 세포 수준에서 검색하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이에, 본 발명자들은 HBV의 캡시드 단백질과 표면 단백질의 상호작용을 세포에서 측정할 수 있는 방법을 개발하여 HBV의 캡시드 단백질과 표면 단백질 간의 상호작용을 저해하여 바이러스 증식을 억제할 수 있는 물질을 검색하는데 유용하게 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 효과적으로 HBV의 증식을 억제할 수 있는 물질을 검색하기 위해 세포 수준에서 HBV의 캡시드 단백질과 표면 단백질간의 상호작용을 측정할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HBV(Hepatitis B Virus)의 캡시드 단백질 부위와 표면 단백질의 PreS 부위 간 상호작용(결합도)을 세포 영상으로 측정하여 HBV의 증식을 억제하는 물질을 검색하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 HBV의 캡시드 단백질 부위에 형광 단백질이 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질도입된 동물세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 1 발현벡터 및 상기 융합단백질과 상호작용하는 HBV의 캡시드 단백질 부위에 형광 단백질이 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 2 발현벡터가 함께 형질도입된 동물세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 동물세포를 배양하면서 후보물질을 처리하는 단계;
2) 형광 현미경을 이용하여 단계 1)에서 발현된 형광 단백질의 형광 영상을 촬영하는 단계; 및,
3) 형광 영상이 세포질에 위치하게 하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 HBV의 증식을 억제하는 물질을 검색하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 동물세포를 포함하는 HBV의 증식을 억제하는 물질의 검색키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 HBV(Hepatitis B Virus)의 캡시드 단백질 부위와 표면 단백질의 PreS 부위 간 상호작용(결합도)을 세포 영상으로 측정하여 HBV의 증식을 억제하는 물질을 검색하는 방법을 제공한다.
상기 캡시드 단백질 부위는 캡시드 단백질 전장일 수 있고, 표면 단백질과 상호작용할 수 있는 부위의 단편일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 서열번호 19의 아미노산 서열의 HBV의 캡시드 단백질 중 pro 서열(pro sequence)을 제외한 부위(아미노산 30-214)를 사용하였다. 상기 표면 단백질은 표면 단백질의 PreS 부위의 전장일 수 있고, 캡시드 단백질 부위와 상호작용할 수 있는 PreS 부위의 단편일 수 있으며, HBV의 또 다른 단백질인 코아 단백질과 상호작용하는 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위의 93번 아미노산부터 117번 아미노산이 결여된 부위일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 캡시드 단백질 부위와 상호작용할 수 있는 표면 단백질의 서열번호 20으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 PreS 부위를 사용하였다. 또 다른 실시예에서는 상기 PreS 부위로부터 코아 단백질과 상호작용하는 93번 아미노산부터 117번 아미노산이 결여된 부위를 사용하였다. 상기 캡시드 단백질 부위는 형광 단백질과 연결되어 사용될 수 있고, 상기 표면 단백질의 PreS 부위는 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위와 연결되어 사용될 수 있다(도 1 참조). 상기 형광 단백질과 연결된 캡시드 단백질 부위가 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위와 연결된 표면 단백질의 PreS 부위와 결합함으로써 형광 단백질과 연결된 캡시드 단백질 부위는 세포질에서 세포막으로 이동할 수 있다(도 3 참조). PreS 유래의 펩타이드에 의해 캡시드 단백질 부위와 PreS 부위의 상호작용이 억제되고 캡시드 단백질에 연결된 형광 단백질의 형광 영상이 세포막이 아닌 세포질에 위치하는 것을 확인함으로써(도 5 및 도 6 참조), 본 발명의 형광 단백질과 연결된 캡시드 단백질 부위와 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위와 연결된 표면 단백질의 PreS 부위의 결합이 특이적임을 확인하였다.
본 발명의 검색 방법은 상세하게는 하기와 같은 단계로 이루어진다.
1) HBV의 캡시드 단백질 부위에 형광 단백질이 연결된 융합단백질 및 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질을 동시에 발현할 수 있는 발현벡터를 제조하는 단계;
2) 단계 1)의 발현벡터를 동물세포에 형질도입하는 단계;
3) 단계 2)의 형질도입된 동물세포를 배양하면서 후보물질을 처리하는 단계;
4) 형광 현미경을 이용하여 단계 3)에서 발현된 형광 단백질의 형광 영상을 촬영하는 단계; 및,
5) 형광 영상이 세포질에 위치하게 하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 HBV의 증식을 억제하는 물질을 검색하는 방법을 제공한다.
단계 1)의 형광 단백질은 그린 형광 단백질(GFP), 레드 형광 단백질(RFP), 블루 형광 단백질(BFP), 옐로우 형광 단백질(YFP), 시안 형광 단백질(CFP; cyan fluorescent protein) 및 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP) 등을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 GFP를 사용하였다. 상기 HBV의 캡시드 단백질 부위에 형광 단백질이 연결된 융합단백질은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다(도 2b 참조). 상기 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열은 서열번호 3으로 기재되는 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 한다.
단계 1)의 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위는 PLC-δ(phospholipase C delta)의 PH(Pleckstrin homology) 도메인(Genebank ID: 241276, 아미노산 2-175), EEA1(early endosome antigene1)의 FYVE (No full name) 도메인(Genebank ID: L40157, 아미노산 1352-1410), ING2(Inhibitor of growth2)의 PHD(Prolyl-hydroxylase) 도메인(Genebank ID: NM_001564, 아미노산 212-261), Protein kinase C의 C2(calcium/lipid-binding) 도메인(Genebank ID: NM002737, 아미노산 172-260) 및 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 DBS(Guanine nucleotide exchange factor DBS)의 SEC14(S. cerevisiae phosphatidylinositol transfer protein homology) 도메인(Genenbank ID: AB_116074, 아미노산 90-236) 등을 예시할 수 있으나, 이로 제한되지 않으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 PLC-δ의 PH 도메인을 사용하였다. 상기 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질은 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다(도 2a 참조). 상기 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열은 서열번호 1로 기재되는 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 한다.
또 다른 본 발명의 바람직한 실시예에서는 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위는 상기 PreS 부위의 코아 단백질과 상호작용하는 93번 아미노산부터 117번 아미노산까지를 제거시킨 단백질 부위로 대체되어 사용가능하다. 즉, PreS 부위의 코아 단백질과 상호작용하는 93번 아미노산부터 117번 아미노산까지를 제거시킨 단백질 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질은 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다(도 2c 참조). 상기 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열은 서열번호 5로 기재되는 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 한다.
상기 HBV의 캡시드 단백질 부위에 형광 단백질이 연결된 융합단백질 및 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질을 동시에 발현할 수 있는 발현벡터(pHBsPH-HBcGFP, 도 4b 참조)를 이용한 것보다 HBV의 캡시드 단백질 부위에 형광 단백질이 연결된 융합단백질 및 PreS 부위의 코아 단백질과 상호작용하는 93번 아미노산부터 117번 아미노산 까지를 제거시킨 단백질 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질을 발현할 수 있는 발현벡터(pΔHBsPH-HBcGFP, 도 4c 참조)를 사용한 경우 코아 단백질과 표면 단백질의 상호작용을 배제함으로써 더욱 특이적으로 캡시드 단백질과 표면 단백질의 상호작용을 관찰할 수 있다(도 4 참조).
또한, 본 발명은 HBV의 캡시드 단백질 부위에 형광 단백질이 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다
상기 발현벡터는 뼈대 벡터에 HBV의 캡시드 단백질 부위에 형광 단백질이 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결되어 포함되며, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 뼈대 벡터는 특별히 이제 제한되는 것은 아니나, pBud-CE 4.1, pcDNA3.1, pcDNA4 및 pEF6로 이루어진 군으로부터 선택되는 동물 세포 형질도입에 사용가능한 다양한 벡터를 사용할 수 있고, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pBud-CE 4.1를 이용하였다.
상기 HBV의 캡시드 단백질 부위에 형광 단백질이 연결된 융합단백질은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열은 서열번호 3으로 기재되는 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질은 서열번호 2 또는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열은 서열번호 1로 기재되는 염기서열에 의해 코딩되고(도 2a 참조), 상기 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열은 서열번호 5로 기재되는 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 한다(도 2c 참조).
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질도입된 동물세포를 제공한다.
상기 동물세포는 HEK293T, COS7, HeLa 및 CHO 등을 예시할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 HEK293T 세포를 사용하였다.
또한, 본 발명은 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질(이하, PreS-PH)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 1 발현벡터 및 상기 융합단백질과 상호작용하는 HBV의 캡시드 단백질 부위에 형광 단백질이 연결된 융합단백질(이하, Capsid-GFP)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 2 발현벡터가 함께 형질도입된 동물세포를 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서는 PreS-PH와 Capsid-GFP는 기원이 다른 벡터에 각각 클로닝되어 하나의 동물세포에 공동 형질도입됨으로써 공동 발현될 수 있다.
상기 HBV의 캡시드 단백질 부위에 형광 단백질이 연결된 융합단백질은 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열은 서열번호 3으로 기재되는 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 HBV의 표면 단백질의 PreS 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질은 서열번호 2 또는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열은 서열번호 1로 기재되는 염기서열에 의해 코딩되고(도 2a 참조), 상기 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열은 서열번호 5로 기재되는 염기서열에 의해 코딩되는 것을 특징으로 한다(도 2c 참조).
또한, 본 발명은 1) 상기 동물세포를 배양하면서 후보물질을 처리하는 단계;
2) 형광 현미경을 이용하여 단계 1)에서 발현된 형광 단백질의 형광 영상을 촬영하는 단계; 및,
3) 형광 영상이 세포질에 위치하게 하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 HBV의 증식을 억제하는 물질을 검색하는 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 동물세포를 포함하는 HBV의 증식을 억제하는 물질의 검색키트를 제공한다.
상기 동물세포는 PreS-PH와 Capsid-GFP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 하나의 벡터에 존재하는 벡터로 형질도입된 동물세포 또는 PreS-PH와 Capsid-GFP를 코 딩하는 폴리뉴클레오티드가 기원이 다른 두 개의 벡터에 존재하는 벡터로 형질도입된 동물세포일 수 있다.
본 발명의 HBV 증식에 필요한 단백질 간의 상호작용을 세포 수준에서 검색하는 방법을 이용하여 새로운 HBV의 증식 억제물질을 세포 수준에서 검색하는데 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 발현벡터 제조
<1-1> pCapsid - GFP 유전자의 제조
HBV 캡시드 단백질 중 pro 서열(pro sequence)을 제외한 부위(아미노산 30-214)(서열번호 19)를 포함하는 pHBcAg(Choi KJ et al ., Biochem Biophys Res Commun 319:959-66, 2004)를 주형으로 하고, 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머 쌍을 이용하여 DNA 중합 연쇄 반응법(PCR)으로 95℃, 1분; 55℃, 30초; 72℃, 1분 의 조건으로 25회 반복하여 합성한 후 SalI와 KpnI의 DNA 제한효소로 절단한 후 같은 제한 효소로 절단된 pEGFP-N1(Clontech)벡터에 T4 DNA 리가아제를 이용하여 삽입하여 capsid-GFP가 포함된 플라스미드인 pCapsid-GFP를 제조하였다. 이 DNA를 주형으로 서열번호 9와 서열번호 10의 프라이머 쌍을 이용하여 DNA 중합 연쇄 반응법으로 NotI과 XhoI의 DNA 제한 효소를 포함한 capsid-GFP DNA 단편을 만들었다. 합성된 capsid-GFP와 pBud-CE 4.1(Stratagene, USA)을 NotI과 XhoI의 DNA 제한 효소로 절단한 후 T4 DNA 리가아제를 이용하여 연결하여 pHBc-GFP(도 2b)를 제조하였고 DNA 염기서열을 분석하여 서열번호 4로 기재되는 아미노산을 암호화하는 서열번호 3의 capsid-GFP DNA가 적절히 삽입되었음을 확인하였다.
<1-2> PreS - PH 유전자의 제조
생쥐 cDNA를 주형으로 서열번호 11과 서열번호 12의 프라이머 쌍을 이용하여 PLC-δ(phospholipase C delta)의 PH 도메인(Genebank ID: 241276, 아미노산 2-175)을 DNA 중합 연쇄 반응법(PCR)으로 95℃, 1분; 55℃, 30초; 72℃, 1분의 조건으로 25회 반복하여 합성하였다. pTrx-PreS(Choi KJ et al ., Biochem Biophys Res Commun 319:959-66, 2004)를 주형으로 서열번호 13과 서열번호 14의 프라이머 쌍을 이용하여 HBV 표면 단백질 중 PreS 부위(아미노산 1-163)(서열번호 20)를 갖는 DNA를 DNA 중합 연쇄 반응법(PCR)으로 95℃, 1분; 55℃, 30초; 72℃, 1분의 조건으로 25회 반복하여 합성하였다. 상기 방법으로 수득한 PreS를 코딩하는 DNA와 PH를 코딩하는 DNA를 주형으로 서열번호 15와 서열번호 16의 프라이머 쌍을 이용하여 DNA 중합 연쇄 반응법(PCR)으로 95℃, 1분; 55℃, 30초; 72℃, 1분의 조건으로 25회 반 복하여 PreS-PH DNA를 합성하였다. 이때, 상기 두 개의 주형 DNA들이 오버랩(overlap)되어 PCR이 수행되었다. 증폭된 DNA를 HindIII와 XbaI의 DNA 제한 효소로 절단한 후 같은 제한효소로 절단된 pHBc-GFP에 T4 DNA 리가아제를 이용하여 연결하여 서열번호 2로 기재되는 아미노산을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 DNA를 포함하는 pHBsPH-HBcGFP(도 2b)를 제조하였고 DNA 염기서열을 분석하여 증폭된 DNA가 적절히 삽입되었음을 확인하였다.
PreS 부위 중 코아 단백질과 상호 작용하는 93번 아미노산부터 117번 아미노산이 결여된 부위는 pHBsPH-HBcGFP를 주형으로, DNA 중합 연쇄 반응법(PCR)으로 95℃, 30초; 55℃, 1분; 68℃, 7분의 조건으로 18회 반복하여 서열번호 17과 서열번호 18의 프라이머를 이용하여 서열번호 6으로 기재되는 아미노산을 암호화하는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 DNA를 합성하였다. 메틸화된 아데닌을 인식하여 절단하는 DpnI 제한효소를 처리하여 PCR 방법으로 합성되어 메틸화되지 않은 DNA를 제외한 부분을 제거하였고, 염기서열 분석을 통해 pΔHBsPH-HBcGFP(도 2c)를 확인하였다.
< 실시예 2> 동물세포에서의 형질전환
<2-1> 동물세포의 배양
HEK293T 세포는 5% CO2와 37℃ 조건하에서 10% FBS(fetal bovine serum)가 공급된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; Gibco, USA)에서 배양하였다. 세포는 90%의 밀도에서 계대 배양하여 25% 밀도를 유지하면서 형질전환을 위해 준 비하였다.
<2-2> 동물세포의 형질 전환
실시예 2-1의 방법으로 배양된 HEK293T 세포를 계대 배양하여 커버 글라스가 들어있는 6 웰 플레이트에서 배양하였다. 밀도조건이 40~60%가 되도록 키운 뒤, Lipofectamine(Invitrogen, USA)과 PLUS reagent(Invitrogen, USA)를 이용하여 pHBc-GFP, pHBsPH-HBcGFP 또는 pΔHBsPH-HBcGFP를 상기 동물세포에 감염시켰다. 상기 형질 도입된 세포를 48시간 동안 배양하여 단백질을 생성할 수 있도록 하였다.
< 실시예 3> PreS 유래의 펩타이드에 의한 캡시드 단백질과 PreS 단백질의 상호작용의 억제
PreS 유래의 펩타이드(ΔL4b 펩타이드; 서열번호 21: RQPTPISPPLRDSHPQAMQWNS; 펩트론, 한국)가 PreS 단백질과 캡시드 단백질의 상호작용을 억제할 수 있음을 확인하였다.
pTrx-PreS(Choi KJ et al ., Biochem Biophys Res Commun 319:959-66, 2004)가 형질도입된 대장균으로부터 정제된 티오레독신이 융합된 PreS 단백질을 완충용액-A(50 mM sodium phosphate, 0.15M NaCl, pH 8.0)에 10 g/㎖의 농도로 녹인 후, 상기 혼합 용액 100 ㎕를 96 웰 플레이트(CoStar, USA)에 넣고, 한 시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 고정화시켰다. 5%(w/v)의 스킴 밀크를 포함하는 완충용액-A로 상기 플레이트를 블로킹 한 후, 여러 농도로 시리얼 희석된 ΔL4b 펩타이드와 pHBcAg(Choi KJ et al ., Biochem Biophys Res Commun 319:959-66, 2004)가 형질도입된 대장균으로부터 정제된 캡시드 단백질(최종농도 0.4 mM)을 첨가하였다. 추가로 60분 동안 실온에서 인큐베이션 하고 PBS-T 완충용액(50 mM sodium phosphate, 0.15M NaCl, pH 7.4 및 0.1 % Tween-20)으로 6회 세척한 후(300 ㎕/웰), 항-HBcAg 항체(1:2000, Cat. No. K0112162, KOMA biotechnology, 한국) 100 ㎕로 한 시간 동안 배양하고 HRP가 표지된 항-래빗 2차 항체(1:2000, Sigma, USA)로 추가로 한 시간 동안 배양하였다. 상기 플레이트를 PBS-T 완충용액으로 6회 세척한 후, OPD 용액(퍼옥시드 기질 완충용액에 1 ㎎/㎖의 농도로 녹임; Pierce, USA) 100 ㎕를 첨가하여 발색반응을 수행하였다. 2.5 M 황산 100 ㎕를 첨가하여 반응을 종료시키고, 멀리플레이트 리더기 Spectra Max340 스펙트로미터(Molecular Devices Corp., USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, PreS 유래의 펩타이드가 농도에 따라 캡시드 단백질과 PreS 단백질의 상호작용을 억제하는 것을 확인하였다(도 5).
< 실시예 4> 형광현미경을 이용한 세포 영상 측정
<4-1> 상호결합의 측정
pHBc-GFP, pHBsPH-HBcGFP 또는 pΔHBsPH-HBcGFP로 형질 도입된 HEK293T 세포가 자라는 플레이트로부터 커버 글라스를 회수하여 ice-colded PBS로 세척한 후 현미경 관찰을 위한 슬라이드 글라스에 붙였다. 형광현미경을 이용하여 GFP를 관찰할 수 있는 490±20/528±38 ㎚(여기/방사)파장의 필터를 통해 세포를 관찰하였다.
그 결과, pHBc-GFP로 형질 도입된 세포에서는 GFP의 형광 영상이 세포질에 위치하고, pHBsPH-HBcGFP 또는 pΔHBsPH-HBcGFP로 형질 도입된 세포에서 GFP의 형광영상이 세포막에 위치하는 것을 확인하였다(도 4). 또한 pΔHBsPH-HBcGFP로 형질 도입된 세포에서의 형광 영상의 면적이 pHBsPH-HBcGFP로 형질 도입된 세포보다 좁은 것을 확인하였다.
<4-2> 상호결합 억제의 측정
pHBc-GFP, pHBsPH-HBcGFP 또는 pΔHBsPH-HBcGFP로 형질 도입된 HEK293T 세포의 배양기간 동안 PreS와 캡시드 사이의 상호 작용을 억제하는 PreS 유래의 펩타이드(ΔL4b 펩타이드; 서열번호 21)를 50μM의 농도로 하루 동안 60% 유착(confluence) 세포에 처리하였다. 형질 도입된 HEK293T 세포가 자라는 플레이트로부터 커버 글라스를 회수하여 ice-colded PBS로 세척한 후 현미경 관찰을 위한 슬라이드 글라스에 붙였다. 형광현미경을 이용하여 GFP를 관찰할 수 있는 490±20/528±38 ㎚(여기/방사)파장의 필터를 통해 세포를 관찰하였다.
그 결과, 상기 억제에 의해 세포 내에서 발현된 GFP의 형광 영상이 세포막이 아닌 세포질에 위치하는 것을 확인하였다(도 6).
도 1은 HBV(Hepatitis B Virus)의 표면 단백질의 PreS 부위(domain)가 세포막을 표적화하는 PH 도메인의 N-말단에 연결된 융합단백질(PreS-PH)과 캡시드 단백질(HBcAg)이 녹색형광단백질(green fluorescence protein; GFP)의 N-말단에 연결된 융합단백질(Capsid-GFP)의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 2는 PreS-PH, Capsid-GFP, 돌연변이 PreS-PH 단백질의 동시 발현 벡터의 개열지도를 나타낸 모식도이다:
a: pHBsPH-HBcGFP;
b: pHBc-GFP; 및,
c: pΔHBsPH-HBcGFP.
도 3은 Capsid-GFP 단백질이 PreS-PH 단백질과의 상호작용에 의하여 세포질에서 세포막으로 이동하는 원리를 나타낸 모식도이다.
도 4는 세포에서 발현된 Capsid-GFP 단백질의 형광 영상이 세포질에 존재하다가 PreS-PH 단백질과 동시에 발현될 경우 PreS와의 상호작용에 의하여 세포막으로 영상 신호가 변화하는 것을 나타낸 사진이다:
a: pHBc-GFP;
b: pHBsPH-HBcGFP; 및,
c: pΔHBsPH-HBcGFP.
도 5는 PreS 유래의 펩타이드가 캡시드 단백질과 PreS 단백질의 상호작용을 억제하는 것을 나타낸 도표이다.
도 6는 세포에서 발현된 Capsid-GFP의 형광 영상이 PreS 유래의 펩타이드에 의하여 세포질에 위치하는 것을 나타낸 사진이다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Method for detection of the interaction HBV capsid and surface proteins using cellular imaging and screening method of inhibitory agent of HBV proliferation using there of <130> 7P-10-36 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1044 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PreS-PH nucleotide sequence <400> 1 atggggacga atctttctgt tcccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 60 cctgcgttcg gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcac 120 tggccagagg cgaatcaggt aggagcggga gcattcgggc cagggttcac cccaccacac 180 ggcggtcttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat tgacagcagt gccagcagcg 240 cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaagacagc ctactcccat ctctccacct 300 ctaagagaca gtcatcctca ggccatgcag tggaattcca caacattcca ccaagctctg 360 ctagatccca gagtgagggg cctatatttt cctgctggtg gctccagttc cggaacagta 420 aaccctgttc cgactactgc ctctcccata tcgtcaatct tctcgaggac tggggaccct 480 gcaccgaacc gtggacaggg aaacagcgat gcatctgtgg actcgggtag ggacttcctg 540 accctgcacg ggctccagga tgacccggac cttcaggccc ttctgaaggg cagccagctt 600 ctgaaggtga agtccagctc gtggcgtagg gaacgcttct acaagctaca ggaggactgc 660 aagaccatct ggcaggaatc tcgaaaggtc atgaggtccc cggagtcgca gctgttctcc 720 atcgaggaca ttcaggaggt acggatggga caccgcacag aaggcctgga gaagtttgcc 780 cgagacatcc ccgaggatcg atgcttctcc attgtcttca aggaccagcg caacacccta 840 gacctcattg ccccatcacc agctgacgct cagcactggg tgcagggcct gcgcaagatc 900 atccaccact ccggctccat ggaccagcgg cagaagctgc agcactggat tcactcctgc 960 ttgcgaaagg ctgataaaaa caaggcaaac aagatgaact tcaaggagct gaaggacttc 1020 ctgaaggagc tcaacatcca gtaa 1044 <210> 2 <211> 347 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PreS-PH amino acid sequence <400> 2 Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp 1 5 10 15 His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp 20 25 30 Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly 35 40 45 Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu 50 55 60 Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Ala Val Pro Ala Ala 65 70 75 80 Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro 85 90 95 Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn 100 105 110 Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu 115 120 125 Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro 130 135 140 Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro 145 150 155 160 Ala Pro Asn Arg Gly Gln Gly Asn Ser Asp Ala Ser Val Asp Ser Gly 165 170 175 Arg Asp Phe Leu Thr Leu His Gly Leu Gln Asp Asp Pro Asp Leu Gln 180 185 190 Ala Leu Leu Lys Gly Ser Gln Leu Leu Lys Val Lys Ser Ser Ser Trp 195 200 205 Arg Arg Glu Arg Phe Tyr Lys Leu Gln Glu Asp Cys Lys Thr Ile Trp 210 215 220 Gln Glu Ser Arg Lys Val Met Arg Ser Pro Glu Ser Gln Leu Phe Ser 225 230 235 240 Ile Glu Asp Ile Gln Glu Val Arg Met Gly His Arg Thr Glu Gly Leu 245 250 255 Glu Lys Phe Ala Arg Asp Ile Pro Glu Asp Arg Cys Phe Ser Ile Val 260 265 270 Phe Lys Asp Gln 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Pro Glu Thr Thr 165 170 175 Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro 180 185 190 Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln 195 200 205 Ser Arg Glu Ser Gln Cys Thr Val Pro Arg Ala Arg Asp Pro Thr Gly 210 215 220 Arg His His Gly Glu Gln Gly Arg Gly Ala Val His Arg Gly Gly Ala 225 230 235 240 His Pro Gly Arg Ala Gly Arg Arg Arg Lys Arg Pro Gln Val Gln Arg 245 250 255 Val Arg Arg Gly Arg Gly Arg Cys His Leu Arg Gln Ala Asp Pro Glu 260 265 270 Val His Leu His His Arg Gln Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Pro Arg 275 280 285 Asp His Pro Asp Leu Arg Arg Ala Val Leu Gln Pro Leu Pro Arg Pro 290 295 300 His Glu Ala Ala Arg Leu Leu Gln Val Arg His Ala Arg Arg Leu Arg 305 310 315 320 Pro Gly Ala His His Leu Leu Gln Gly Arg Arg Gln Leu Gln Asp Pro 325 330 335 Arg Arg Gly Glu Val Arg Gly Arg His Pro Gly Glu Pro His Arg Ala 340 345 350 Glu Gly His Arg Leu Gln Gly Gly Arg Gln His Pro Gly Ala Gln Ala 355 360 365 Gly Val Gln Leu Gln Gln Pro Gln Arg Leu Tyr His Gly Arg Gln Ala 370 375 380 Glu Glu Arg His Gln Gly Glu Leu Gln Asp Pro Pro Gln His Arg Gly 385 390 395 400 Arg Gln Arg Ala Ala Arg Arg Pro Leu Pro Ala Glu His Pro His Arg 405 410 415 Arg Arg Pro Arg Ala Ala Ala Arg Gln Pro Leu Pro Glu His Pro Val 420 425 430 Arg Pro Glu Gln Arg Pro Gln Arg Glu Ala Arg Ser His Gly Pro Ala 435 440 445 Gly Val Arg Asp Arg Arg Arg Asp His Ser Arg His Gly Arg Ala Val 450 455 460 Gln Val 465 <210> 5 <211> 969 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> deleted PreS-PH nucleotide sequence <400> 5 atggggacga atctttctgt tcccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac 60 cctgcgttcg gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcac 120 tggccagagg cgaatcaggt aggagcggga gcattcgggc cagggttcac cccaccacac 180 ggcggtcttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat tgacagcagt gccagcagcg 240 cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca ggaagacaag ctctgctaga tcccagagtg 300 aggggcctat attttcctgc tggtggctcc agttccggaa cagtaaaccc tgttccgact 360 actgcctctc ccatatcgtc aatcttctcg aggactgggg accctgcacc gaaccgtgga 420 cagggaaaca gcgatgcatc tgtggactcg ggtagggact tcctgaccct gcacgggctc 480 caggatgacc cggaccttca ggcccttctg aagggcagcc agcttctgaa ggtgaagtcc 540 agctcgtggc gtagggaacg cttctacaag ctacaggagg actgcaagac catctggcag 600 gaatctcgaa aggtcatgag gtccccggag tcgcagctgt tctccatcga ggacattcag 660 gaggtacgga tgggacaccg cacagaaggc ctggagaagt ttgcccgaga catccccgag 720 gatcgatgct tctccattgt cttcaaggac cagcgcaaca ccctagacct cattgcccca 780 tcaccagctg acgctcagca ctgggtgcag ggcctgcgca agatcatcca ccactccggc 840 tccatggacc agcggcagaa gctgcagcac tggattcact cctgcttgcg aaaggctgat 900 aaaaacaagg caaacaagat gaacttcaag gagctgaagg acttcctgaa ggagctcaac 960 atccagtaa 969 <210> 6 <211> 322 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> deleted PreS-PH amino acid sequence <400> 6 Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp 1 5 10 15 His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp 20 25 30 Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly 35 40 45 Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu 50 55 60 Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Ala Val Pro Ala Ala 65 70 75 80 Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Ala Leu Leu 85 90 95 Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser 100 105 110 Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile 115 120 125 Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro Ala Pro Asn Arg Gly Gln Gly Asn Ser 130 135 140 Asp Ala Ser Val Asp Ser Gly Arg Asp Phe Leu Thr Leu His Gly Leu 145 150 155 160 Gln Asp Asp Pro Asp Leu Gln Ala Leu Leu Lys Gly Ser Gln Leu Leu 165 170 175 Lys Val Lys Ser Ser Ser Trp Arg Arg Glu Arg Phe Tyr Lys Leu Gln 180 185 190 Glu Asp Cys Lys Thr Ile Trp Gln Glu Ser Arg Lys Val Met Arg Ser 195 200 205 Pro Glu Ser Gln Leu Phe Ser Ile Glu Asp Ile Gln Glu Val Arg Met 210 215 220 Gly His Arg Thr Glu Gly Leu Glu Lys Phe Ala Arg Asp Ile Pro Glu 225 230 235 240 Asp Arg Cys Phe Ser Ile Val Phe Lys Asp Gln Arg Asn Thr Leu Asp 245 250 255 Leu Ile Ala Pro Ser Pro Ala Asp Ala Gln His Trp Val Gln Gly Leu 260 265 270 Arg Lys Ile Ile His His Ser Gly Ser Met Asp Gln Arg Gln Lys Leu 275 280 285 Gln His Trp Ile His Ser Cys Leu Arg Lys Ala Asp Lys Asn Lys Ala 290 295 300 Asn Lys Met Asn Phe Lys Glu Leu Lys Asp Phe Leu Lys Glu Leu Asn 305 310 315 320 Ile Gln <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV Capsid forward primer <400> 7 gccgagctcg ccaccatgca actttttcac ctc 33 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV Capsid reverse primer <400> 8 ggggtaccgt ataacattga gattcccg 28 <210> 9 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Capsid-GFP forward primer <400> 9 aaggaaaaag cggccgcgcg ctcgccacca tgcaactttt tcacctc 47 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Capsid-GFP reverse primer <400> 10 ccgctcgagt tacttgtaca gctcgtccca tga 33 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse PLC delta forward primer <400> 11 gactcgggta gggacttcct gaccctgc 28 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse PLC delta reverse primer <400> 12 ttactggatg ttgagctcct tcaggaag 28 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV PreS forward primer <400> 13 gccgagctcg ccaccatggg gacgaatctt tctg 34 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV PreS reverse primer <400> 14 aaggaaaaag cggccgctta ctggatgttg agctc 35 <210> 15 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PreS-PH forward primer <400> 15 cccaagcttt gcgctcgcca ccatgcaact ttttcacctc 40 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PreS-PH reverse primer <400> 16 gctctagatt actggatgtt gagctc 26 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> deleted PreS-PH foward primer <400> 17 ggcagtcagg aagacaagct ctgctagatc 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> deleted PreS-PH reverse primer <400> 18 gatctagcag agcttgtctt cctgactgcc 30 <210> 19 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV capsid protein amino acid sequence <400> 19 Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Thr Cys Pro Thr 1 5 10 15 Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile 20 25 30 Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu 35 40 45 Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser 50 55 60 Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His 65 70 75 80 His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr 85 90 95 Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp 100 105 110 Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln 115 120 125 Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val 130 135 140 Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala 145 150 155 160 Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr 165 170 175 Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro 180 185 190 Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln 195 200 205 Ser Arg Glu Ser Gln Cys 210 <210> 20 <211> 163 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV PreS protein amino acid sequence <400> 20 Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp 1 5 10 15 His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp 20 25 30 Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly 35 40 45 Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu 50 55 60 Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Ala Val Pro Ala Ala 65 70 75 80 Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro 85 90 95 Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn 100 105 110 Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu 115 120 125 Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro 130 135 140 Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Thr Gly Asp Pro 145 150 155 160 Ala Pro Asn <210> 21 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> deleted L4b peptide <400> 21 Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln 1 5 10 15 Ala Met Gln Trp Asn Ser 20

Claims (22)

1) 하기 i) 및 ii)의 융합단백질을 동시에 발현할 수 있는 발현벡터를 제조하는 단계:
i) 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, HBV의 캡시드 단백질 부위에 형광 단백질이 연결된 융합단백질; 및,
ii) 서열번호 2 또는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, HBV의 표면 단백질의 PreS 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질;
2) 단계 1)의 발현벡터를 동물세포에 형질도입하는 단계;
3) 단계 2)의 형질도입된 동물세포를 배양하면서 후보물질을 처리하는 단계;
4) 형광 현미경을 이용하여 단계 3)에서 발현된 형광 단백질의 형광 영상을 촬영하는 단계; 및,
5) 형광 영상이 세포질에 위치하게 하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 HBV의 증식을 억제하는 물질을 검색하는 방법.
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제 1항에 있어서, 단계 1)의 형광 단백질은 그린 형광 단백질(GFP), 레드 형광 단백질(RFP), 블루 형광 단백질(BFP), 옐로우 형광 단백질(YFP), 시안 형광 단백질(CFP; cyan fluorescent protein) 및 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 단계 1)의 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위는 PLC-δ(phospholipase C delta)의 PH(Pleckstrin homology) 도메인(Genebank ID: 241276, 아미노산 2-175), EEA1(early endosome antigene1)의 FYVE(No full name) 도메인(Genebank ID: L40157, 아미노산 1352-1410), ING2(Inhibitor of growth2)의 PHD(Prolyl-hydroxylase) 도메인(Genebank ID: NM_001564, 아미노산 212-261), Protein kinase C의 C2(calcium/lipid-binding) 도메인(Genebank ID: NM002737, 아미노산 172-260) 및 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 DBS(Guanine nucleotide exchange factor DBS)의 SEC14(S. cerevisiae phosphatidylinositol transfer protein homology) 도메인(Genenbank ID: AB_116074, 아미노산 90-236)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
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하기 i)의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 하기 ii)의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터:
i) 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, HBV의 캡시드 단백질 부위에 형광 단백질이 연결된 융합단백질; 및,
ii) 서열번호 2 또는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, HBV의 표면 단백질의 PreS 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질.
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제 11항의 발현벡터로 형질도입된 동물세포.
제 15항에 있어서, 동물세포는 HHEK293T, COS7, HeLa 및 CHO 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 동물세포.
하기 i)의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 1 발현벡터 및 하기 ii)의 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 2 발현벡터가 함께 형질도입된 동물세포:
i) 서열번호 2 또는 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, HBV의 표면 단백질의 PreS 부위에 세포막 표적화 기능을 수행할 수 있는 단백질 부위가 연결된 융합단백질; 및,
ii) 상기 i)의 융합단백질과 상호작용하는 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는, HBV의 캡시드 단백질 부위에 형광 단백질이 연결된 융합단백질.
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1) 제 15항 또는 제 17항의 동물세포를 배양하면서 후보물질을 처리하는 단계;
2) 형광 현미경을 이용하여 단계 1)에서 발현된 형광 단백질의 형광 영상을 촬영하는 단계; 및,
3) 형광 영상이 세포질에 위치하게 하는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 HBV의 증식을 억제하는 물질을 검색하는 방법.
제 15항 또는 제 17항의 동물세포를 포함하는 HBV의 증식을 억제하는 물질의 검색키트.
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