JP3842729B2 - 低分子量ｇｔｐ結合タンパク質の活性モニタータンパク質 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む発現ベクター、該発現ベクターを保持する形質転換された細胞およびトランスジェニック動物、前記タンパク質を用いる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法、ならびに低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
細胞内情報伝達分子には非常に多くの種類が知られており、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（以下、ＧＴＰ結合タンパク質という場合がある）はその中でも種類が多いこと、重要な分子スイッチとして働いていることから非常に詳しく解析されてきている。低分子量ＧＴＰ結合タンパク質群はＲａｓファミリー、Ｒｈｏファミリー、Ｒａｂファミリー、Ｒａｎファミリーなどからなる（文献１）。これらの低分子量ＧＴＰ結合タンパク質は、細胞増殖、細胞骨格、細胞内輸送、核輸送など細胞内での多様な情報伝達を制御する重要な分子スイッチである。低分子量ＧＴＰ結合タンパク質は、ＧＤＰに結合している不活性化型とＧＴＰに結合している活性化型との間をサイクルしている（第１図）。ＧＴＰ結合型はそれぞれのＧＴＰ結合タンパク質に特異的な標的タンパク質に結合し、該標的タンパク質を活性化する。ＧＤＰ結合型をＧＴＰ結合型にする反応を触媒するタンパク質はグアニンヌクレオチド交換因子であり、ＧＴＰ結合型をＧＤＰ結合型に戻す反応を触媒するタンパク質はＧＴＰ水解促進酵素（ＧＴＰアーゼ活性化因子）である。該ＧＴＰ水解促進酵素は、結合したＧＴＰの加水分解を促進し、無機リン酸を遊離させてＧＤＰを生じさせるように働く。
最近、多くの低分子量ＧＴＰ結合タンパク質およびその活性化因子と不活性化因子が単離されるにおよび、これら低分子量ＧＴＰ結合タンパク質が細胞内および個体内でどのような機能的差異があるのかに注目が集まっている。その機能的差異を明らかにするためには、細胞内および個体内での低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化状態をモニターする必要がある。
細胞内での低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の程度を調べるには、細胞内での低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のＧＴＰ結合型とＧＤＰ結合型の量比を知る必要がある。現在、細胞内での低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のＧＴＰ結合型とＧＤＰ結合型の量比を調べる方法としては次の二つがよく用いられている。
（１） ラジオアイソトープ３２Ｐｉによる標識を利用する方法：細胞を３２Ｐｉで標識したのち低分子量ＧＴＰ結合タンパク質を精製し、結合しているＧＴＰおよびＧＤＰを薄層クロマトグラフィーにて分離し定量する（文献２）。
（２） プルダウン法：低分子量ＧＴＰ結合タンパク質に結合する標的タンパク質を固層に結合させておき、可溶化した細胞抽出液と混合する。ＧＴＰ結合型のものは標的タンパク質に高いアフィニティーで結合するので、ＧＴＰ結合型のみを選択的に回収することができる。これを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて分離した後に、イムノブロッティングにて定量する（文献３）。しかしながら、いずれの方法も細胞を一旦可溶化する必要があり、生細胞で直接、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を調べる方法はこれまでなかった。
細胞内には、細胞膜、細胞質以外にも多くの細胞内小器官が存在するだけでなく、細胞質の中でも異なる場所では異なる生化学的現象が起きていることが近年明らかにされている。また、個体レベルでも低分子量ＧＴＰ結合タンパク質が高次神経機能や器官形成に非常に重要であるということがわかっている。したがって、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化状態を細胞内あるいは個体内で非侵襲的に知ることは、生命現象の理解のみならず、薬剤開発などにおいても必須である。しかし、これまでの生化学的方法では細胞を可溶化してしまうため、細胞内のどの場所で低分子量ＧＴＰ結合タンパク質が活性化されているのか、また、どの細胞で低分子量ＧＴＰ結合タンパク質が活性化されているのかを知ることはできなかった。
一方、生細胞においてタンパク質を可視化する技術としてはＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いる方法が知られている（文献４）。ＧＦＰは発光クラゲなどより単離されるタンパク質群で、主に緑色の蛍光を発するタンパク質である。現在、細胞内でのタンパク質の局在を調べるのに広く用いられている。ＧＦＰとしてはＣＦＰ（ｃｙａｎ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＧＦＰ）、ＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＧＦＰ）などがあり、また、それらを改良したタンパク質としてＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＣＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ＣＦＰ）、ＥＹＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ＹＦＰ）、ＥＢＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｌｕｅ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＧＦＰ）など（本明細書において、これらをまとめてＧＦＰ関連タンパク質という）がある。これらは、それぞれ異なる波長の光で励起され、異なる波長の蛍光を放出する。
さらにＧＦＰを応用した技術としてＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を用いるものがある（文献５）。ＦＲＥＴとは以下の現象を指す。蛍光物質ＡおよびＢという物質がそれぞれλａｅｘおよびλｂｅｘで励起され、λａｅｍおよびλｂｅｍの光をそれぞれ発光するとする。この時、ＡおよびＢがごく近傍に存在し、λａｅｍがλｂｅｘに充分に近い時、ＡおよびＢの混合物にλａｅｘの光を照射すると、物質ＡのエネルギーがＢに吸収されλｂｅｍの発光が観察される。これをＦＲＥＴという。この方法を利用して、２分子間の距離を推定することもできる。この時、蛍光物質Ａをドナー、蛍光物質Ｂをアクセプターという。
さらにこの技術の応用として、二つの蛍光物質を一つのタンパク質内に標識することにより、タンパク質の構造変化を検出することが可能である。ＥＢＦＰおよびＥＧＦＰ、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの２セットのＧＦＰ関連タンパク質は、至適なＦＲＥＴのためのドナーとアクセプターの組み合わせを作ることが知られている。たとえば、ＥＢＦＰとＥＧＦＰとの二つのタンパク質とカルシウム結合タンパク質カルモジュリンとの融合タンパク質で、このＦＲＥＴ技術を応用してカルシウムの濃度を測りうることが知られている（文献６）。しかしながら、ＧＦＰタンパク質とＦＲＥＴ技術とを応用した１分子モニターによる測定法は、前記カルシウム測定ならびにサイクリックＡＭＰ依存性リン酸化酵素の活性測定以外には、現時点では成功していない。
発明の開示
本発明は、非侵襲的な低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定を可能にする低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質；該タンパク質をコードする遺伝子；該遺伝子を含む発現ベクター；前記タンパク質を発現し、非侵襲的な低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定に有用な前記発現ベクターを保持する形質転換された細胞およびトランスジェニック動物；前記タンパク質を用いる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法、より詳しくは生細胞においても使用可能な、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のＧＴＰ結合型とＧＤＰ結合型の量比を測定する方法；ならびに低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の全部または一部、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質の全部または一部、ＧＦＰアクセプタータンパク質の全部または一部、及びＧＦＰドナータンパク質の全部または一部が、各タンパク質の機能を発揮し得る状態で直接または間接的に連結されてなる融合タンパク質からなる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質、
〔２〕 前記〔１〕記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質をコードする遺伝子、
〔３〕 前記〔２〕記載の遺伝子を含む発現ベクター、
〔４〕 前記〔３〕記載の発現ベクターを保持してなる形質転換された細胞、
〔５〕 前記〔３〕記載の発現ベクターを保持してなるトランスジェニック動物、
〔６〕 前記〔１〕記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質におけるＦＲＥＴを検出する工程を含む低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法、
〔７〕 前記〔４〕記載の細胞または前記〔５〕記載のトランスジェニック動物におけるＦＲＥＴを検出する工程を含む低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法、ならびに
〔８〕 （ａ）前記〔４〕記載の細胞と被検物質とを接触させる工程、および
（ｂ）低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性の変化を検出する工程、
を含む、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質（以下、モニタータンパク質という）は、ＧＴＰ結合型の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質が特異的にその標的タンパク質のみに結合するという性質を利用したものであり、非侵襲的な低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定に非常に有用なタンパク質である。本発明のモニタータンパク質は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質、ＧＦＰアクセプタータンパク質、およびＧＦＰドナータンパク質からなる融合タンパク質であり、各タンパク質が適切に、すなわち個々に本来のコンフォメーションを形成して各タンパク質が有する機能を完全な程度に発揮し得るような状態で、前記各タンパク質が直接または間接的に連結されてなる。従って、かかる融合タンパク質のアミノ酸配列は、前記各タンパク質のアミノ酸配列部分が直接または間接的に連結されてなる構造を有する。なお、本発明のモニタータンパク質を構成する各タンパク質は、当該タンパク質が有する機能を完全な程度に発揮し得るようであれば当該タンパク質の一部であってもよい。
本明細書においては、モニタータンパク質内に含まれる各タンパク質をいう場合、例えば、標的タンパク質を例にあげると、標的タンパク質そのものと区別し、標的タンパク質部分というべきところ、かかる区別なく、簡易に標的タンパク質と表現する。
本発明のモニタータンパク質では、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のＧＴＰとの結合による活性化（ＧＤＰ結合型の、グアニンヌクレオチド交換因子によるＧＴＰ結合型への変換による低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を含む）に伴いモニタータンパク質内で低分子量ＧＴＰ結合タンパク質とその標的タンパク質とが結合し、その結果、ＧＦＰドナータンパク質からＧＦＰアクセプタータンパク質へのＦＲＥＴ効率に変化が生ずることになる。第２図に、本発明のモニタータンパク質の一例を模式的に示し、該モニタータンパク質を用いる、ＦＲＥＴを利用した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法の原理を示す。なお、本明細書においてＦＲＥＴ効率とは、ＧＦＰドナータンパク質に対する励起光を本発明のモニタータンパク質に照射した場合の、ＧＦＰドナータンパク質の蛍光波長における蛍光強度とＧＦＰアクセプタータンパク質の蛍光波長における蛍光強度との比（蛍光強度比）をいう。詳しくは後述する。
ＦＲＥＴを実現するためには、ｉ）ＧＦＰドナーの発光スペクトラムとＧＦＰアクセプターの吸光スペクトラムとの重なり、ｉｉ）ドナーとアクセプター間の距離、ｉｉｉ）ドナーの発光モーメントとアクセプターの吸光モーメントの配向の３因子を考慮しなければならない。また、ＧＦＰを他のタンパク質と融合する場合、他のタンパク質と融合することがストレスとなってＧＦＰのミスフォールディングが生じ、その結果、発色団形成の効率が低下し、無蛍光のＧＦＰとなる可能性をも考慮しなければならない。このように、ＧＦＰドナーとＧＦＰアクセプターを利用して両者間にＦＲＥＴの良好な発現を生じさせるには厳格な条件が存在し、未だ両者間の配置等に一定の規則も見出されておらず、ＦＲＥＴの実現は一般に困難である。すなわち、ＦＲＥＴの実現は公知の技術常識に基づき容易になし得るものではなく、期待し得る程度を超える試行錯誤や複雑高度の実験等を要するものである。本発明のモニタータンパク質は、前記タンパク質を、本発明の所望の効果が得られ得るように適切に組み合わせたものであり、ＧＴＰ結合型の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質が特異的にその標的タンパク質のみに結合するという性質を利用し、ＧＴＰの低分子量ＧＴＰ結合タンパク質への結合に応じて変化し得るＧＦＰドナータンパク質とＧＦＰアクセプタータンパク質との間で生ずるＦＲＥＴを実現させたもので、その技術的価値は非常に大きい。
本発明のモニタータンパク質における各構成タンパク質の結合の順序は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化前後におけるＦＲＥＴ効率の差（以下、単にＦＲＥＴ効率の差という）の増大を考慮して適宜選択され得る。低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化前後におけるＦＲＥＴ効率の差が大きい程、当該タンパク質の活性化状態をより的確に捉えることができ、従って、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定精度を向上させることができるので好ましい。該モニタータンパク質における低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質との結合の好ましい態様としては、アミノ末端側に存在する低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質結合部位のカルボキシル末端が、カルボキシル末端側に存在する標的タンパク質のアミノ末端に直接または間接的に結合される態様（１）、アミノ末端側に存在する標的タンパク質のカルボキシル末端が、カルボキシル末端側に存在する低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質結合部位のアミノ末端に直接または間接的に結合される態様（２）が挙げられる。特に、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲａｓファミリーに属するものである場合は態様（１）が、Ｒｈｏファミリーに属するものである場合は態様（２）が好ましい。ＧＦＰアクセプタータンパク質およびＧＦＰドナータンパク質は各々、それらのアミノ末端またはカルボキシル末端が低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と標的タンパク質とが連結されたもの（連結物）のアミノ末端またはカルボキシル末端に直接または間接的に連結されて連結される。中でも、前記連結物のアミノ末端にＧＦＰアクセプタータンパク質のカルボキシル末端が、カルボキシル末端にＧＦＰドナータンパク質のアミノ末端が直接または間接的に連結されてなるモニタータンパク質が好ましい。従って、本発明のモニタータンパク質としては、該モニタータンパク質において、アミノ末端側より、ＧＦＰアクセプタータンパク質、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質、ＧＦＰドナータンパク質となるように、あるいはアミノ末端側より、ＧＦＰアクセプタータンパク質、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、ＧＦＰドナータンパク質となるように、それぞれ直接または間接的に連結されてなるものが特に好ましい。なお、「間接的に連結」とは、各タンパク質間の連結を、たとえば、後述するスペーサーとしてのペプチド等を介して行う態様をいう。
本発明のモニタータンパク質の構成要素である低分子量ＧＴＰ結合タンパク質としては、当該タンパク質として知られるものであれば特に限定されるものではないが、有用性の観点からＲａｓスーパーファミリーに属するものが好ましく、中でもＲａｓファミリーまたはＲｈｏファミリーに属するものがより好ましい。より詳しくは、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｒ−Ｒａｓ、Ｒａｐ１Ａ、Ｒａｐ１Ｂ、Ｒａｐ２Ａ、およびＲａｐ２Ｂからなる群、またはＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、ＲｈｏＣ、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、およびＣｄｃ４２からなる群より選ばれる１種が好ましい。
一方、前記低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質は、前記例示するような各低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＧＴＰ結合型となった際に特異的に結合するものであれば特に限定されるものではない。有用性の観点から、好ましくはＲａｆまたはＲａｌＧＤＳ、あるいはＰａｋまたはｍＤｉａである。
さらに、前記低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と前記標的タンパク質の組み合わせとしては、有用性ならびに特異性の観点から、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＨ−Ｒａｓであり、標的タンパク質がＲａｆである組み合わせ、または低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲａｐ１Ａであり、標的タンパク質がＲａｌＧＤＳである組み合わせ、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲａｃ１であり、標的タンパク質がＰａｋである組み合わせ、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＣｄｃ４２であり、標的タンパク質がＰａｋである組み合わせ、あるいは低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲｈｏＡであり、標的タンパク質がｍＤｉａである組み合わせが特に好ましい。
また、ＧＦＰアクセプタータンパク質としては前記例示したＧＦＰ関連タンパク質のいずれを使用することもできるが、機能的観点から、好ましくはＥＧＦＰまたはＥＹＦＰである。一方のＧＦＰドナータンパク質も同様に前記例示したＧＦＰ関連タンパク質のいずれを使用することもできるが、機能的観点から、好ましくはＥＣＦＰまたはＥＢＦＰである。
前記した本発明のモニタータンパク質の構成要素それぞれの特に好ましい組み合わせとしては、有効性、特異性および感度の観点から、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＨ−Ｒａｓであり、標的タンパク質がＲａｆであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰであるか、または、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲａｐ１Ａであり、標的タンパク質がＲａｌＧＤＳであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰであるか、または低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲａｃ１であり、標的タンパク質がＰａｋであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰであるか、または低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＣｄｃ４２であり、標的タンパク質がＰａｋであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰであるか、または低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲｈｏＡであり、標的タンパク質がｍＤｉａであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰである。
また、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、標的タンパク質、ＧＦＰドナータンパク質、およびＧＦＰアクセプタータンパク質の結合の順序は、ＦＲＥＴ効率の差の増大の観点から、本発明のモニタータンパク質において、好ましくはアミノ末端側よりＥＹＦＰ−Ｈ−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＥＣＦＰまたはＥＹＦＰ−Ｒａｐ１Ａ−ＲａｌＧＤＳ−ＥＣＦＰ、あるいはＥＹＦＰ−Ｐａｋ−Ｒａｃ１−ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ−Ｐａｋ−Ｃｄｃ４２−ＥＣＦＰまたはＥＹＦＰ−ｍＤｉａ−ＲｈｏＡ−ＥＣＦＰが挙げられる。また、これらにおいてＥＹＦＰとＥＣＦＰとが互いに交換されてなるものも好適に使用できる。
低分子量ＧＴＰ結合タンパク質は、その標的タンパク質に結合することができれば該タンパク質の一部でもよく、必ずしも、その全部（全長）である必要はない。ここで、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の一部とは、たとえば、公知の方法に従って当該タンパク質分子を大腸菌で生産し、試験管内でＧＴＰと結合せしめるという方法により、標的タンパク質との結合が検出され得るタンパク質部分をいう。なお、検出は、たとえば、標的タンパク質に対する抗体で免疫沈澱させ、ＧＴＰ結合タンパク質の一部が共沈するかをイムノブロッティングで調べる方法により行うことができる。たとえば、Ｈ−ＲａｓおよびＲａｐ１Ａであれば、好ましくは１〜１８０位、より好ましくは１〜１７２位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を、Ｒ−Ｒａｓであれば、好ましくは１〜２０４位、より好ましくは２８〜２０４位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分、Ｒａｃ１であれば、好ましくは１〜１７７位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を、Ｃｄｃ４２であれば、好ましくは１〜１７６位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を、ＲｈｏＡであれば好ましくは１〜１７６位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を挙げることができる。
一方、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の全部よりはむしろ、そのアミノ酸配列のアミノ末端あるいはカルボキシル末端を一部削ることでしばしばＦＲＥＴ効率の差の増大が生ずる。それゆえ、当該タンパク質の一部としては、そのアミノ酸配列のアミノ末端領域および／またはカルボキシル末端領域に、好ましくは少なくとも１個、より好ましくは１〜２８個、さらに好ましくは１７〜２８個のアミノ酸の欠損を有してなるものも含まれる。なお、かかる領域におけるアミノ酸の欠損部位には特に限定はない。たとえば、Ｈ−Ｒａｓの場合、Ｃ末端を１７２位まで削ったものが１８０位まで削ったものよりＦＲＥＴ効率の差を増大させた。すなわち、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域において好ましくは少なくとも１個、より好ましくは９〜２０個、さらに好ましくは１７個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。また、Ｒ−Ｒａｓの場合、アミノ末端から２８個のアミノ酸を削ったものが削らないものよりもＦＲＥＴ効率の差を増大させた。すなわち、そのアミノ酸配列のアミノ末端領域において好ましくは少なくとも１個、より好ましくは１〜２８個、さらに好ましくは２８個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。
なお、前記アミノ末端領域またはカルボキシル末端領域とは、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のアミノ酸配列において、そのアミノ末端またはカルボキシル末端から、アミノ酸の個数で好ましくは３０個までの領域をいう。
また、標的タンパク質も、対応する低分子量ＧＴＰ結合タンパク質に結合することができれば該タンパク質の一部でもよく、必ずしも、その全部（全長）である必要はない。ここで、標的タンパク質の一部とは、前記低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と同様の方法において、その対応する低分子量ＧＴＰ結合タンパク質との結合が検出され得るタンパク質部分をいう。たとえば、Ｒａｆ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｘ０３４８４）であれば、好ましくはＲａｓ結合領域（ＲＢＤ）、詳しくは、好ましくは５１〜２０４位、より好ましくは５１〜１３１位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を、ＲａｌＧＤＳ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｕ１４４１７）であれば、好ましくは２０２〜３０９位、より好ましくは２１１〜２９７位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を、Ｐａｋ１（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：ＮＭ００２５７６）であれば、好ましくはＲａｃ１結合領域、詳しくは６８〜１５０位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を、ｍＤｉａｌ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｅ１７３６１）であれば、好ましくはＲｈｏ結合領域、詳しくは６８〜２４０位、さらに好ましくは、６８〜１８０位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を挙げることができる。
一方、ＧＦＰドナータンパク質および／またはＧＦＰアクセプタータンパク質も、ＦＲＥＴのペアーとなる機能が保たれていればそれらタンパク質の一部でもよく、必ずしも全部（全長）である必要はない。しばしば、それらのアミノ酸配列のカルボキシル末端を短くすることにより、ＦＲＥＴ効率の差の増大が生ずる。たとえば、ＧＦＰアクセプタータンパク質および／またはＧＦＰドナータンパク質の一部としては、それらのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域に好ましくは少なくとも１個、より好ましくは１〜１１個の欠損を有してなるものを挙げることができる。なお、かかる領域におけるアミノ酸の欠損部位には特に限定はない。たとえば、ＥＹＦＰの場合、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域において好ましくは少なくとも１個、より好ましくは１〜１１個、さらに好ましくは１１個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。また、ＥＣＦＰの場合、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域において好ましくは少なくとも１個、より好ましくは１〜１１個、さらに好ましくは１１個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。ここで、カルボキシル末端領域とは、本発明に使用するＧＦＰ関連タンパク質のアミノ酸配列において、そのカルボキシル末端から、アミノ酸の個数で好ましくは１〜２０個までの、より好ましくは１１個までの領域をいう。なお、ＦＲＥＴのペアーとなる機能が保たれているか否かは、たとえば、公知の方法に従いＦＲＥＴのペアを形成すると想定される１対のタンパク質分子を共に大腸菌で生産し、当該１対のタンパク質を含む細胞抽出液において、当該タンパク質それぞれの想定される励起波長での蛍光強度を観察するという方法により評価することができる。
さらに、ＧＦＰアクセプタータンパク質および／またはＧＦＰドナータンパク質は変異を有していてもかまわない。かかる変異の導入は、ＦＲＥＴのペアーとなる機能が保たれている限り、ＧＦＰアクセプタータンパク質および／またはＧＦＰドナータンパク質のアミノ酸配列における任意の部位に対し行うことができる。たとえば、変異の態様としては複数のアミノ酸の置換が挙げられ、かかるアミノ酸置換の具体的態様としては、たとえば、Ｐｈｅ６４Ｌｅｕ、Ｖａｌ６８Ｌｅｕ、Ｓｅｒ７２Ａｌａ、Ｉｌｅ１６７Ｔｈｒなどが挙げられる。このような変異を導入することで発色団形成効率の上昇や、ＦＲＥＴ効率の上昇などの効果が得られるので好ましい。変異の導入は、公知の制限酵素を用いる方法や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いる方法により行うことができる。
また、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質および／またはその標的タンパク質に変異を導入したものも本発明において好適に使用することができる。例えば点突然変異を導入することにより、グアニンヌクレオチド交換因子やＧＴＰアーゼ活性化因子に対する感受性を向上させたものを得ることができる。かかる変異の導入は、互いに結合する機能が保たれている限り、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質および／またはその標的タンパク質のアミノ酸配列における任意の部位に対し行うことができる。たとえば、変異の態様としてはアミノ酸の置換、挿入、欠失などが挙げられ、具体的には、たとえば、Ｈ−Ｒａｓのアミノ酸配列においてＩｌｅ３６をＬｅｕに変化させる態様（Ｉｌｅ３６Ｌｅｕ）が挙げられる。かかるＨ−Ｒａｓにおける変異により、当該Ｈ−Ｒａｓは、多数の変異の中でもＧＴＰアーゼ活性化因子に対し最も高い感受性を示すようになる。その結果、モニタータンパク質のダイナミックレンジを変化させることができる。かかる変異を有するＨ−Ｒａｓは、本発明のモニタータンパク質において好適に使用することができる。なお、変異の導入は、公知の制限酵素を用いる方法や、ＰＣＲを用いる方法により行うことができる。
本発明のモニタータンパク質においては、構成要素である各タンパク質の空間的な配置は、その機能発現に関連する因子である。かかる配置を変化させることによりＦＲＥＴ効率の差を非常に増大させることができる。たとえば、モニタータンパク質における各構成タンパク質間にスペーサーとなるペプチド配列を入れ、ＦＲＥＴ効率の差を調節することができる。かかるスペーサーは、ＦＲＥＴ効率の差を増大させる観点から、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と標的タンパク質との間に挿入することが好ましい。スペーサーとなるペプチド配列としては、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個の連続した任意のアミノ酸からなるペプチドを挙げることができる。かかるペプチドを低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と標的タンパク質との間に挿入した場合、ＦＲＥＴ効率の差が増大すること、ＧＦＰ関連タンパク質自身の折りたたみの効率が上昇することなどが期待できる。また、各構成タンパク質が、本発明のモニタータンパク質内において適切なコンフォメーションをとり得る観点から、好ましくはグリシンを主とする低分子で二次構造を形成しにくいという性質を有するアミノ酸からなるペプチドをスペーサーとして用いることが好ましい。
また、本発明のモニタータンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に他のタンパク質あるいはペプチドを融合することも好ましい態様の１つである。特に、該モニタータンパク質に、細胞内局在シグナル、たとえば、公知の小胞体（ＥＲ）移行シグナル、細胞膜局在シグナルなどを付加することにより、細胞内の局所でのＧＴＰ結合タンパク質の活性化を直接測定することが可能となり好ましい。また、後述するように、細胞内の局所でのＧＴＰ結合タンパク質のＧＴＰ結合型とＧＤＰ結合型の量比（ＧＴＰ／ＧＤＰ比）（モル比）を直接測定することも可能となり好ましい。
本発明のモニタータンパク質では、ＧＴＰが結合し低分子量ＧＴＰ結合タンパク質が活性化された場合、該モニタータンパク質内で低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と標的タンパク質との結合が誘導され全体のコンフォメーションが変化することになり、ＧＦＰアクセプタータンパク質とＧＦＰドナータンパク質との距離と方向とが変化する。次いで、特定の波長の光を照射すると、かかるアクセプタータンパク質とドナータンパク質との間でＦＲＥＴ効率の増加が検出されるようになる（第２図）。このようなＦＲＥＴ効率の変化には、前記モニタータンパク質のコンフォメーション変化後におけるＧＦＰアクセプタータンパク質とＧＦＰドナータンパク質の配置が影響する。たとえば、ＧＦＰドナータンパク質とＧＦＰアクセプタータンパク質との距離が短くなるとＦＲＥＴ効率は増加し、距離が長くなるとＦＲＥＴ効率は減少する。ＦＲＥＴ効率の変化の幅、すなわち、ＦＲＥＴ効率の差の増減は、たとえば、用いる各構成タンパク質の性質により、スペーサーペプチド等の挿入により、所望により適宜調節することができる。
なお、上述する本発明のモニタータンパク質が本発明の所望の効果を発現し得るか否かについての評価は、たとえば、後述の実施例１に記載の方法に準じて評価することができる。
本発明はまた、本発明のモニタータンパク質をコードする遺伝子を提供する。かかる遺伝子は、該タンパク質の前記各構成タンパク質の遺伝子情報をＧｅｎＢａｎｋ等から入手し、公知のＰＣＲを用いた方法により、あるいは制限酵素とリガーゼとを用いた方法により常法に従って作製することができる。
本発明のモニタータンパク質の構成タンパク質として好適に用いられる各タンパク質のＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬにおけるアクセッション番号を以下に示す。なお、アクセッション番号は各タンパク質名の後の括弧内に示す。
（１）低分子量ＧＴＰ結合タンパク質
Ｈ−Ｒａｓ（Ｖ００５７４）、Ｋ−Ｒａｓ（Ｌ０００４５〜Ｌ０００４９）、Ｎ−Ｒａｓ（Ｌ０００４０〜Ｌ０００４３）、Ｒ−Ｒａｓ（Ｍ１４９４８，Ｍ１４９４９）、Ｒａｐ１Ａ（Ｘ１２５３３）、Ｒａｐ１Ｂ（Ｘ０８００４）、Ｒａｐ２Ａ（Ｘ１２５３４）、Ｒａｐ２Ｂ（Ｘ５２９８７）、ＲｈｏＡ（Ｌ２５０８０）、ＲｈｏＢ（Ｘ０６８２０）、ＲｈｏＣ（Ｘ０６８２１）、Ｒａｃ１（Ｍ２９８７０）、Ｒａｃ２（ＮＭ００２８７２）、Ｒａｃ３（ＮＭ００５０５２）、Ｃｄｃ４２（Ｍ５７２９８）
（２）標的タンパク質
Ｒａｆ（Ｘ０３４８４）、ＲａｌＧＤＳ（Ｕ１４４１７）、Ｐａｋ１（ＮＭ００２５７６）、ｍＤｉａ１（Ｅ１７３６１）
（３）ＧＦＰドナータンパク質とＧＦＰアクセプタータンパク質
ＥＧＦＰ（Ｕ７６５６１）、ＥＹＦＰ（ＡＶＵ７３９０１ １）、ＥＣＦＰ（ＡＢ０４１９０４）
なお、ＥＢＦＰ（ＧＦＰに以下の３つの変異を有するものである：Ｐｈｅ６４Ｌｅｕ、Ｔｙｒ６６Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１４５Ｐｈｅ）については文献６に記載されている。
本発明はさらに、前記遺伝子を含む発現ベクターを提供する。かかるベクターは、公知の方法に従い、本発明のモニタータンパク質をコードする遺伝子を公知の原核細胞発現ベクター、例えばｐＧＥＸ−２Ｔ（アマシャム−ファルマシア バイオテック社製）、真核細胞発現ベクター、例えばｐＣＡＧＧＳ（文献７）に、あるいはウイルスベクター、例えばｐＳｈｕｔｔｌｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）に挿入することにより得ることができる。発現ベクターとしては発現プラスミドが好ましい。
本発明はさらに、前記発現ベクターを保持する形質転換された細胞およびトランスジェニック動物を提供する。かかる細胞は、前記発現ベクターを対象とする細胞に導入することにより得られる。細胞への導入法としては公知のトランスフェクション法やウイルス感染法が使用でき特に制限はないが、たとえばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、あるいはエレクトロポレーション法等が使用できる。該細胞としては真核細胞あるいは原核細胞を用いることができ、特に制限はない。たとえば、真核細胞としては、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、サル腎臓由来ＣＯＳ細胞、ヒト臍帯由来ＨＵＶＥＣ細胞、酵母など、原核細胞としては、大腸菌など、培養細胞や、その他、各種細胞を使用できる。一方、前記発現ベクターを公知の方法、たとえば、マウス受精卵の核内にプラスミドＤＮＡをマイクロインジェクションする方法などにより、マウス等の個体に直接導入することでトランスジェニック動物を得ることができる。
本発明においてはさらに、本発明のモニタータンパク質を用いる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法を提供する。かかる方法によれば、本発明のモニタータンパク質におけるＦＲＥＴを検出することで低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定することができる。また、前記する本発明の形質転換された細胞またはトランスジェニック動物においてＦＲＥＴを検出し、当該細胞または動物における低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を直接測定することもできる。かかる場合、別途、ＧＴＰの結合した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質とＧＴＰからの無機リン酸の遊離によって生じるＧＤＰの結合した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質とを測定してＧＴＰ／ＧＤＰ比〔またはＧＴＰ／（ＧＤＰ＋ＧＴＰ）比〕（いずれもモル比）を算出し、さらに対応するＦＲＥＴ効率を測定して予め検量線を作成しておけば、当該細胞または動物におけるＦＲＥＴ効率に基づいて、ＧＴＰ／ＧＤＰ比を算出することができる。
たとえば、具体的には以下のような方法が例示される。
（１）分光光度計を用いた測定法
モニタータンパク質を発現し得る本発明の形質転換細胞を、当該タンパク質の発現が可能な条件下に培養する。次いで、当該細胞を可溶化する。細胞の可溶化の方法に特に制限はないが、界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む溶液を用いて可溶化する方法が好ましい。可溶化した溶液に、ＧＦＰドナータンパク質に対する励起光（たとえば、波長４３３ｎｍ）を照射し、たとえば、波長４５０ｎｍから５５０ｎｍの範囲で蛍光プロフィールを公知の蛍光分光光度計を用いて測定する。得られた蛍光プロフィールのデータを基に、たとえば、波長４７５ｎｍにおけるＧＦＰドナータンパク質の蛍光強度と波長５３０ｎｍにおけるＧＦＰアクセプタータンパク質の蛍光強度との比〔（波長５３０ｎｍにおける蛍光強度）／（波長４７５ｎｍにおける蛍光強度）〕を算出し、それをＧＦＰドナータンパク質からＧＦＰアクセプタータンパク質へのＦＲＥＴ効率とする。ＧＴＰの低分子量ＧＴＰ結合タンパク質への結合前に比べ、結合後（すなわち、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化後）にＦＲＥＴ効率が上昇するため、それを指標として低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する。なお、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化と不活性化は、たとえば、前者については、グアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｓ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓ；文献９に記載）を本発明のモニタータンパク質を発現し得る細胞にトランスフェクトすることにより、また、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）による当該細胞の刺激により行うことが、後者については、たとえば、ＧＴＰ水解促進酵素Ｇａｐ１ｍ発現ベクター（ｐＥＦ−Ｂｏｓ−Ｇａｐ１ｍ；文献９に記載）を当該細胞にトランスフェクトすることにより行うことができる。一方、ＦＲＥＴ効率はＧＦＰドナータンパク質とＧＦＰアクセプタータンパク質との距離および方向の変化により生ずるため、ＦＲＥＴ効率の変化によりモニタータンパク質の構造変化をも検出することができる。
（２）顕微鏡を用いた測定法
モニタータンパク質を発現した本発明の形質転換細胞またはトランスジェニック動物を蛍光顕微鏡で観察し、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化前後に生ずるＦＲＥＴ効率の変化を直接的に検出する。なお、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化と不活性化は前記（１）分光光度計を用いた測定法の場合と同様にして行うことができる。
用いる蛍光顕微鏡には特に制限はないが、公知のキセノン光源を有する倒立型蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００）に回転式蛍光励起フィルターおよび回転式蛍光発光フィルターを備え、高感度冷却ＣＣＤカメラを備えたものが好ましい。さらにフィルターおよびカメラ画像は、日本ローパー社製Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ画像解析ソフトにて制御ならびに解析できるシステムが望ましい。
前記細胞または動物にＧＦＰドナータンパク質の励起光を照射し、ＧＦＰドナータンパク質の蛍光波長での画像をＣＣＤカメラにより撮影し、その後、ＧＦＰアクセプタータンパク質の蛍光波長での画像を撮影する。両画像の蛍光強度の比を測定することにより各測定点でのＦＲＥＴ効率を算出できる。また、たとえば、グアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｓ発現ベクターをモニタータンパク質を発現し得る細胞または動物に種々の量で導入して低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の種々の活性化状態（すなわち、活性化の程度が異なる状態）を構築する。次いで、各状態における細胞または動物を蛍光顕微鏡で観察し、前記と同様にしてＦＲＥＴ効率を求める。また、各状態における細胞（当該動物から得られた、ＦＲＥＴ効率を求めた部位に由来する細胞を含む）を可溶化し、別途、ＧＴＰの結合した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質とＧＤＰの結合した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質とを測定してＧＴＰ／ＧＤＰ比を算出する。詳しくは、公知の方法（文献２）により低分子量ＧＴＰ結合タンパク質へのＧＴＰ結合量およびＧＤＰ結合量を測定してＧＴＰ／ＧＤＰ比を求める。次いで、得られたＧＴＰ／ＧＤＰ比を、予め求めておいたＦＲＥＴ効率と関連付ける。すなわち、各状態での測定時点におけるＦＲＥＴ効率とＧＴＰ／ＧＤＰ比を測定し、それらを基に検量線を作成する。このようにして別途、検量線を作成しておけば、モニタータンパク質を発現した細胞または動物におけるＦＲＥＴ効率を蛍光顕徹鏡を用いて直接測定するだけで、各測定時点でのＦＲＥＴ効率からＧＴＰ／ＧＤＰ比を求めることが可能となる。従って、非侵襲的に細胞内または個体内における低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化状態を容易に把握することができ、しかも、かかる状態におけるＧＴＰ／ＧＤＰ比を具体的に得ることができる。なお、かかる検量線を用いる方法は、前記（１）の方法においても同様に使用することができる。
本発明によれば、非侵襲的な低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定を可能にする低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質、その遺伝子等が提供される。また、かかるモニタータンパク質を発現し、非侵襲的な低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定に有用な前記発現ベクターを保持する形質転換された細胞およびトランスジェニック動物、ならびに前記タンパク質を用いる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法が提供される。従って、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化状態を細胞内または個体内で非侵襲的に知ることが可能となり、生命現象の理解のみならず、薬剤開発（たとえば、癌、自己免疫疾患、アレルギー性疾患等の治療剤または予防剤）において多大な利益をもたらし得る。
さらに本発明の別の態様として、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。すなわち、
（ａ）低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質を発現する、当該タンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを保持する形質転換された細胞と被検物質とを接触させる工程、ならびに
（ｂ）低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性の変化を検出する工程、
を含む、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法によれば、本発明の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質を発現する細胞を構築し、バイオアッセイ系を用いることによって、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を変化させる物質またはその塩（すなわち、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質）を効率よくスクリーニングすることができる。当該方法における被検物質としては特に限定されるものではないが、たとえば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物等を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法は、（ｉ）低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性化物質の存在下、あるいは（ｉｉ）当該活性化物質の非存在下において行うことができる。なお、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性化物質とは、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質を活性化する物質であり、たとえば、上皮細胞増殖因子等の細胞増殖因子、インターロイキン等のサイトカイン類を挙げることができ、またこれらに限定されない。低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質は、（ｉ）の場合、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を増強あるいは減少させる物質として、（ｉｉ）の場合、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を増強させる物質としてスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のスクリーニング方法は、前記活性化物質の存在下または非存在下に、工程（ａ）において、本発明の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質を発現する細胞と被検物質とを接触させる（態様１）。接触させる方法は特に限定されるものではなく、たとえば、被検物質の存在下に当該細胞を培養することにより行うことができる。また、平行して、対照として、同条件下、本発明の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質を発現する細胞と被検物質とを接触させない場合（態様２）を行う。次いで、工程（ｂ）において、それぞれの場合における低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を測定し、態様２と比較した態様１における低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性の変化を検出することにより低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニングを行う。なお、当該活性の測定は、各々の場合におけるＦＲＥＴ効率を測定することにより行なうことができる。
すなわち、前記（ｉ）の場合に、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性をより増強する物質は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を増強し得る活性調節物質であり、逆に当該活性を減少する物質は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を減少し得る活性調節物質である。また、前記（ｉｉ）の場合に、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を増強する物質は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を増強し得る活性調節物質である。
以上の方法により、簡便かつ迅速に低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質を得ることができる
参照文献
以下に、本明細書において記載する参照文献を列挙する。かかる参照文献は参照により、その全教示が本明細書中に取り込まれる。なお、本明細書中では〔文献（数字）〕として参照する各文献の文献番号を示す。
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１０．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｓ．，Ｎ．Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｙ．Ｏｈｂａ，Ｍ．Ｔｏｂｉｕｍｅ，Ｙ．Ｏｋａｄａ，Ｈ．Ｓａｗａ，Ｋ．Ｎａｇａｓｈｉｍａ，ａｎｄ Ｍ．Ｍａｔｓｕｄａ．「ＧａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩＩによるＲａｓ、Ｒ−Ｒａｓ、Ｒａｐ１の活性化（ＧａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩＩ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｓ，Ｒ−Ｒａｓ，ａｎｄ Ｒａｐ１．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２５４８８−２５４９３，２０００．
１１．Ｔ．Ｇｏｔｏｈ，Ｓ．Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｓ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．Ｋｉｔａｙａｍａ，Ｍ．Ｎｏｄａ，Ｙ．Ｔａｋａｉ，Ｋ．Ｋａｉｂｕｃｈｉ，Ｈ．Ｍａｔｓｕｉ，Ｏ．Ｈａｔａｓｅ，Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．Ｋｕｒａｔａ，ａｎｄ Ｍ．Ｍａｔｓｕｄａ．「Ｃｒｋ ＳＨ３ドメインバインディンググアニンヌクレオチドリリーシングファクター、Ｃ３ＧのターゲットとしてのＲａｐ１の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｐ１ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ｃｒｋ ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，Ｃ３Ｇ）」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：６７４６−６７５３，１９９５．
実施例
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲はかかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下においては、ヒトＨ−ＲａｓをＲａｓと、ヒトｃ−Ｒａｆ１をＲａｆと、ヒトＲａｐ１ＡをＲａｐ１Ａと、ヒトＲａｌＧＤＳをＲａｌＧＤＳと、ヒトＲ−ＲａｓをＲ−Ｒａｓという。また、ヒトＲａｃ１をＲａｃ１と、ヒトＣｄｃ４２をＣｄｃ４２と、ヒトＲｈｏＡをＲｈｏＡと、ヒトＰａｋ１をＰａｋ１と、ヒトｍＤｉａｌをｍＤｉａｌという。
実施例１ Ｒａｆｒａｓ１７２２によるＲａｓ活性化の測定
（１）ＲａｓとＲａｆをコードするキメラ遺伝子の作成
（ｉ）Ｒａｓ遺伝子の増幅
ＲａｓのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｖ００５７４）を鋳型として、センスプライマーｈＲａｓＸｈ（５’−ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＧＧＡＡＴＡＴＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧ−３’）（配列番号：１）およびアンチセンスプライマーＲａｓ１７２Ｒａｆ（５’−ＡＧＴＧＴＴＧＣＴＴＧＴＣＴＴＡＧＡＡＧＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＴＧ−３’）（配列番号：２）と、耐熱性ＤＮＡ複製酵素Ｐｆｘ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｕ．Ｓ．Ａ）とを用い、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によりＲａｓの１位から１７２位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分を増幅した。
センスプライマーｈＲａｓＸｈは、５’末端の下線で示した制限酵素ＸｈｏＩの切断部位の塩基配列とＲａｓの１位から８位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマーＲａｓ１７２Ｒａｆは、５’末端より、ＲａｆのＲａｓ結合領域のアミノ酸配列のアミノ末端領域（６１位から６７位まで）に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列、スペーサー配列（下線部）、Ｒａｓの１６６位から１７２位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列とからなる。
（ｉｉ）Ｒａｆ遺伝子の増輻
ＲａｆのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｘ０３４８４）を鋳型として、センスプライマーＲａｆＲＢＤ−Ｆ１（５’−ＧＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＡＡＧＡＣＡＡＧＣＡＡＣＡＣＴ−３’）（配列番号：３）およびアンチセンスプライマーＲａｆＲＢＤｎ２（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＧＧＡＡＡＴＣＴＡＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣ−３’）（配列番号：４）と前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲａｆの５１位から１３１位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分を増幅した。
センスプライマーＲａｆＲＢＤ−Ｆ１は、５’末端の下線で示した制限酵素ＫｐｎＩの切断部位の塩基配列とＲａｆの５１位から５７位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマーＲａｆＲＢＤｎ２は、５’末端の下線で示した制限酵素ＮｏｔＩの切断部位の塩基配列とＲａｆのＲａｓ結合領域のアミノ酸配列のカルボキシル末端領域（１２５位から１３１位まで）に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列とからなる。
（ｉｉｉ）ＲａｓとＲａｆをコードするキメラ遺伝子の増幅
前記（ｉ）および（ｉｉ）で増幅された遺伝子を混合したものを鋳型として、センスプライマーｈＲａｓＸｈおよびアンチセンスプライマーＲａｆＲＢＤｎ２と前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲａｓとＲａｆをコードするキメラ遺伝子からなるｃＤＮＡを増幅した。次いで、得られたＤＮＡ断片をｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にライゲーションし、得られたプラスミド構築物で大腸菌を形質転換した。かかる大腸菌を培養後、公知のアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを精製した。
（２）ＥＹＦＰおよびＥＣＦＰを発現するベクターｐＦｒｅｔ２の構築
（ｉ）ｐＣＡＧＧＳ−Ｐ７の構築
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫＩＩ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のマルティプルクローニングサイトをプライマーＰ７（５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）（配列番号：５）とプライマーＰ８（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣ−３’）（配列番号：６）とを用い、前記と同様にしてＰＣＲ法により増幅し、ＤＮＡ断片を得た。
一方、哺乳類細胞発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（文献７）をＥｃｏＲＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端化処理した。次いで、前記ＤＮＡ断片と前記処理後のｐＣＡＧＧＳとをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。得られたベクターをｐＣＡＧＧＳ−Ｐ７と呼ぶ。
（ｉｉ）ＥＹＦＰ遺伝子の増幅
本実施例においては、公知のＥＧＦＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｕ７６５６１）に対し、ＰＣＲ法を用いる公知の方法により６つのアミノ酸置換（Ｌｅｕ６５Ｐｈｅ；Ｔｈｒ６６Ｇｌｙ；Ｖａｌ６９Ｌｅｕ；Ｇｌｎ７０Ｌｙｓ；Ｓｅｒ７３Ａｌａ；Ｔｈｒ２０４Ｔｙｒ）を導入したものをＥＹＦＰとして用いた。このＥＹＦＰのｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーＧＦＰ−Ｎ２（５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ−３’）（配列番号：７）およびアンチセンスプライマーＧＦＰ−Ｎ３（５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧ−３’）（配列番号：８）と前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＥＹＦＰの全長アミノ酸配列に対応するｃＤＮＡを増幅した。
センスプライマーＧＦＰ−Ｎ２は、５’末端の下線で示した制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位の塩基配列と３塩基のスペーサーとＥＹＦＰの１位から７位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマーＧＦＰ−Ｎ３は、５’末端の下線で示した制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩの各々の切断部位の塩基配列と後述のＥＣＦＰのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域（２３３位から２３９位まで）に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列とからなる。
（ｉｉｉ）ＥＣＦＰ遺伝子の増幅
本実施例においては、ＥＧＦＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｕ７６５６１）に対し、ＰＣＲ法を用いる公知の方法により４つのアミノ酸置換（Ｔｙｒ６７Ｔｒｐ；Ａｓｎ１４７Ｉｌｅ；Ｍｅｔ１５４Ｔｈｒ；Ｖａｌ１６４Ａｌａ）を導入したものをＥＣＦＰとして用いた。このＥＣＦＰのｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーＸＦＰＮｏｔ２（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ−３’）（配列番号：９）およびアンチセンスプライマーＸＦＰ−Ｂｇｌ（５’−ＡＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧ−３’）（配列番号：１０）と前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＥＣＦＰの全長アミノ酸配列に対応するｃＤＮＡを増幅した。
センスプライマーＸＦＰＮｏｔ２は、５’末端の下線で示した制限酵素ＮｏｔＩの切断部位の塩基配列とＥＣＦＰの１位から８位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマーＸＦＰ−Ｂｇｌは、５’末端の下線で示した制限酵素ＢｇｌＩＩの切断部位の塩基配列とＥＣＦＰのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域（２３１位から２３７位まで）に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列とからなる。
（ｉｖ）ｐＦｒｅｔ２の構築
前記（ｉ）で得られたｐＣＡＧＧＳ−Ｐ７を制限酵素ＸｈｏＩで切断し、ｄＴＴＰとｄＣＴＰの存在下にＫｌｅｎｏｗ酵素で処理した。また、前記（ｉｉ）で得られたＥＹＦＰのＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで切断し、次いでｄＧＴＰとｄＡＴＰの存在下にＫｌｅｎｏｗ酵素で処理した。得られた二つの遺伝子断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、プラスミドを得た。該プラスミドをＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで切断し、次いで、ＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで予め切断しておいた前記（ｉｉｉ）で得られたＥＣＦＰのＤＮＡ断片と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。得られたプラスミドをｐＦｒｅｔ２と命名した。
（３）Ｒａｓ活性モニタータンパク質遺伝子の発現プラスミドであるｐＲａｆｒａｓ１７２２の構築
前記（２）−（ｉｖ）で得られたｐＦｒｅｔ２をＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、次いで、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで予め切断しておいた前記（１）−（ｉｉｉ）で得られたキメラ遺伝子と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。得られたプラスミドをｐＲａｆｒａｓ１７２２と呼ぶ。ｐＲａｆｒａｓ１７２２の構造、その翻訳領域の塩基配列（配列番号：１１）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：１２）を第３図と第４図〜第６図にそれぞれ示す。
かかる塩基配列および予測されるアミノ酸配列を説明する：
ｎｔ １−７１７ ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＥＹＦＰ
ｎｔ ７１８−７２３ ：リンカー
ｎｔ ７２４−１２３９ ：Ｒａｓ
ｎｔ １２４０−１２５ ：リンカー
ｎｔ １２５８−１５００：Ｒａｆ
ｎｔ １５０１−１５０９：リンカー
ｎｔ １５１０−２２２０：オワンクラゲのＥＣＦＰ
（４）哺乳類細胞でのＲａｓ活性モニタータンパク質（Ｒａｆｒａｓ１７２２）の発現と分光光度法による解析
ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地（日本製薬社製）で培養した。該ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に前記（３）で得られたｐＲａｆｒａｓ１７２２とグアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｓ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓ）またはＧＴＰ水解促進酵素Ｇａｐ１ｍ発現ベクター（ｐＥＦ−Ｂｏｓ−Ｇａｐ１ｍ）をリン酸カルシウム法にてトランスフェクトした。トランスフェクト後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）で培養し、Ｒａｓ活性モニタータンパク質を発現させた。４８時間培養後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水にて洗浄し、溶解液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）にて溶解した。得られた細胞溶解液を１０，０００×ｇで遠心分離後、上清を回収した。
該上清を蛍光分光光度計（日本分光社製、ＦＰ−７５０）の１ｍｌキュベットに入れ、励起波長４３３ｎｍにて、４５０ｎｍから５５０ｎｍまでの蛍光強度を測定した。得られた蛍光プロフィールを第７図に示す。
なお、前記トランスフェクト後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３２Ｐｉ無機リン酸で標識した後に該細胞の溶解液を得、抗ＧＦＰ抗体を用い、発現させたＲａｓ活性モニタータンパク質を免疫沈降し、結合しているＧＴＰおよびＧＤＰを薄層クロマトグラフィーにて分離することにより、Ｒａｓ活性モニタータンパク質について得られた蛍光プロフィールのデータから得られるＦＲＥＴ効率〔波長４３３ｎｍで励起したときの、（波長５３０ｎｍにおける蛍光強度）を（波長４７５ｎｍにおける蛍光強度）で割った値〕と実際のＧＴＰ結合の程度とを対応付けることが可能である（第８図）。なお、第８図中、ＦＲＥＴ効率は「蛍光強度比（波長５３０／４７５）」と、ＧＴＰ結合の程度は「ＧＴＰ／（ＧＤＰ＋ＧＴＰ）（％）」として示した。
（５）哺乳類細胞でのＲａｓ活性モニタータンパク質の発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析
サル腎臓由来ＣＯＳ７細胞は１０％ウシ胎仔血清を含むフェノールレッド不含ＭＥＭ培地（日本製薬社製）で培養した。該ＣＯＳ７細胞に前記（３）で得られたｐＲａｆｒａｓ１７２２をリン酸カルシウム法にてトランスフェクトした。トランスフェクト後のＣＯＳ７細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むフェノールレッド不含ＭＥＭ培地（日水製薬社製）で培養し、Ｒａｓ活性モニタータンパク質を発現させた。トランスフェクションの４８時間後に、培養細胞をタイムラプス蛍光顕微鏡による観察に供した。
かかる顕微鏡は、回転式蛍光励起フィルター装置および回転式蛍光発光フィルター装置（ＬＵＤＬ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ社製）を備え、さらに高感度冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｘ社製、Ｍｉｃｒｏｍａｘ４５０）を備えた、キセノン光源を有する倒立型蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製、Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００）であり、観察の際は、該顕微鏡の制御ならびに観察結果の解析を日本ローパー社製メタモルフ（Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ）画像解析ソフトにより行うシステムを用いた。蛍光励起フィルター、蛍光発光フィルター、ダイクロイックミラーはオメガ社より購入した。
前記培養細胞に４３３ｎｍの励起光を照射し、４７５ｎｍのＥＣＦＰドナーの蛍光波長での画像をＣＣＤカメラにより撮影し、次いで、５３０ｎｍのＥＹＦＰアクセプターの蛍光波長での画像を撮影した。両画像データをもとに両者の蛍光強度の比を求めることにより各測定点でのＦＲＥＴ効率を計算した。
実施例２ Ｒａｓ活性を簡便に測定するための培養細胞株の取得
マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞は１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）で培養した。かかるＮＩＨ３Ｔ３細胞に、実施例１で得られたｐＲａｆｒａｓ１７２２とＧ４１８耐性遺伝子を含むベクターｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ：Ｕ０２４３４）とを、ＦｕＧｅｎｅ６（日本ロッシュ社製）を用いて共トランスフェクトした。該細胞を前記培地にて培養し、４８時間培養後に１：１０の希釈率で播きなおし、Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌになるように培地中に添加した。培地は３日に一度交換した。培養２週間後、よく分離したコロニーをクローニングし、３Ｔ３−Ｒａｆｒａｓ細胞と命名した。
かかる３Ｔ３−Ｒａｆｒａｓ細胞を１０％ウシ胎仔血清と０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８とを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）で培養し、Ｒａｓ活性モニタータンパク質を発現させた。次いで、かかるタンパク質の発現を抗Ｒａｓ抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂ社）を用いた通常のイムノブロッティング法にて解析した。その結果、約８０ｋＤａのタンパク質の発現が認められた（第９図）。
さらに、かかる細胞を上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（Ｓｉｇｍａ社製）で刺激し、実施例１の（４）に記載の方法によりＦＲＥＴ効率を求め、ＥＧＦ刺激前後で比較した。ＥＧＦ添加前後における蛍光プロフィールを第１０図に示す。
実施例３ Ｒａｉ−ｃｈｕ３１１によるＲａｐ１Ａ活性化の測定
（１）Ｒａｐ１ＡとＲａｌＧＤＳをコードするキメラ遺伝子の作成
（ｉ）Ｒａｐ１Ａ遺伝子の増幅
Ｒａｐ１ＡのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｘ１２５３３）を鋳型として、センスプライマーｈＲａｐ１Ｘｈ（５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＧＴＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＴＡＧＴＧＧ−３’）（配列番号：１３）およびアンチセンスプライマーＲａｐ１７２ＲａｌＧＤＳ（５’−ＧＣＧＧＡＴＧＡＴＡＣＡＧＣＡＧＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＴＴＧＡＴＣＴＴＴＧＡＣＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧ−３’）（配列番号：１４）と、前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲａｐ１Ａの１位から１７２位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分を増幅した。
センスプライマーｈＲａｐ１Ｘｈは、５’末端の下線で示した制限酵素ＸｈｏＩの切断部位の塩基配列とＲａｐ１Ａの１位から８位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマーＲａｐ１７２ＲａｌＧＤＳは、５’末端より、ＲａｌＧＤＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｕ１４４１７）のＲａｐ１Ａ結合領域のアミノ酸配列のアミノ末端領域（２１１位から２１７位まで）に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列、スペーサー配列（下線部）、Ｒａｐ１Ａの１６６位から１７２位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列とからなる。
（ｉｉ）ＲａｌＧＤＳ遺伝子の増幅
ＲａｌＧＤＳのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｕ１４４１７）を鋳型として、センスプライマーＲａｌＧＤＳ−Ｆ（５’−ＧＧＣＧＡＣＴＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＧＣ−３’）（配列番号：１５）およびアンチセンスプライマーＲａｌＧＤＳＲ（５’−ＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣ−３’）（配列番号：１６）と前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲａｌＧＤＳのｃＤＮＡを増幅した。
センスプライマーＲａｌＧＤＳ−Ｆは、ＲａｌＧＤＳのｃＤＮＡのＲａｐ１Ａ結合領域のアミノ酸配列のアミノ末端領域（２１１位から２１７位まで）に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列を有する。一方、アンチセンスプライマーＲａｌＧＤＳＲは、５’末端の下線で示した制限酵素ＮｏｔＩの切断部位の塩基配列とＲａｌＧＤＳのＲａｐ１Ａ結合領域のアミノ酸配列のカルボキシル末端領域（２９１位から２９７位まで）に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列の相補鎖の塩基配列とからなる。
（ｉｉｉ）Ｒａｐ１ＡとＲａｌＧＤＳをコードするキメラ遺伝子の増幅
前記（ｉ）および（ｉｉ）で増幅された遺伝子を混合したものを鋳型として、センスプライマーｈＲａｐ１ＸｈおよびアンチセンスプライマーＲａｌＧＤＳＲとＰｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲａｐ１ＡとＲａｌＧＤＳをコードするキメラ遺伝子からなるｃＤＮＡを増幅した。次いで、得られたＤＮＡ断片をｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯにライゲーションし、得られたプラスミド構築物で大腸菌を形質転換した。かかる大腸菌を培養後、公知のアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを精製した。
（２）Ｒａｐ１Ａ活性モニタータンパク質遺伝子の発現プラスミドであるｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１の構築
実施例１の（２）の（ｉｉ）において、アンチセンスプライマーＧＦＰ−Ｎ３に換えてアンチセンスプライマーＧＦＰ−ｄ１１Ｒ（５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧ−３’）（配列番号：１７）を用い同様の操作を行い、ＥＣＦＰと、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端のアミノ酸が１１個欠損したＥＹＦＰとをコードするｃＤＮＡを含むベクターを作成した。かかるベクターをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断した。次いで、該ベクターと、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで予め切断しておいた前記（１）で得られたキメラ遺伝子とをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。得られたプラスミドをｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１と命名した。得られたプラスミドの構造ならびに、その翻訳領域の塩基配列（配列番号：１８）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：１９）を第１１図と第１２図〜第１４図にそれぞれ示す。
かかる塩基配列および予測されるアミノ酸配列を説明する：
ｎｔ １−６８４ ：オワンクラゲのＥＹＦＰ
ｎｔ ６８５−６９０ ：リンカー
ｎｔ ６９１−１２０６ ：Ｒａｐ１Ａ
ｎｔ １２０７−１２５７：リンカー
ｎｔ １２５８−１５１５：ＲａｌＧＤＳ
ｎｔ １５１６−１５２１：リンカー
ｎｔ １５２２−２２３５：オワンクラゲのＥＣＦＰ
（３）哺乳類細胞で、のＲａｐ１Ａ活性モニタータンパク質（Ｒａｉ−ｃｈｕ３１１）の発現と分光光度法による解析
実施例１の（４）に記載の方法により解析を行った。得られた蛍光プロフィールを第１５図に示す。
実施例４ Ｒａｉ−ｃｈｕ１５８によるＲ−Ｒａｓ活性化の測定
（１）ｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８の構築
（ｉ）Ｒ−Ｒａｓ遺伝子の増幅
Ｒ−ＲａｓのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｍ１４９４８，Ｍ１４９４９）を鋳型として、センスプライマーＲＲａｓ２８Ｆ（５’−ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣ−３’）（配列番号：２０）およびアンチセンスプライマーＲＲａｓ２０４Ｒ（５’−ＧＣＣＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＴＧＧＧＡＧ−３’）（配列番号：２１）と、前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲ−Ｒａｓの２８位から２０４位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分を増幅した。
センスプライマーＲＲａｓ２８Ｆは、５’末端の下線で示した制限酵素ＸｈｏＩの切断部位の塩基配列とＲ−Ｒａｓの２８位から３３位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマーＲＲａｓ２０４Ｒは、５’末端より、ＫｐｎＩ切断部位を含むスペーサー配列（下線部）、Ｒ−Ｒａｓの１９８位から２０４位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列とからなる。
（ｉｉ）制限酵素断片の作製
前記（ｉ）で得られたＰＣＲ産物をＸｈｏＩとＫｐｎＩとで切断した。
（ｉｉｉ）Ｒ−Ｒａｓ活性モニタータンパク質遺伝子の発現プラスミドであるｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８の構築
実施例１で得られたｐＲａｆｒａｓ１７２２をＸｈｏＩで完全消化したのち、ＫｐｎＩで部分消化し、Ｒａｓ部分を除去したＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ断片と前記（ｉｉ）で得られたＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。得られたプラスミドをｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８と命名した。該プラスミドの構造ならびに、その翻訳領域における塩基配列（配列番号：２２）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：２３）を第１６図と第１７図〜第１９図にそれぞれ示す。
かかる塩基配列および予測されるアミノ酸配列を説明する：
ｎｔ １−７１７ ：オワンクラゲのＥＹＦＰ
ｎｔ ７１８−７２３ ：リンカー
ｎｔ ７２４−１２５１ ：Ｒ−Ｒａｓ
ｎｔ １２５２−１２５７：リンカー
ｎｔ １２５８−１５００：Ｒａｆ
ｎｔ １５０１−１５０９：リンカー
ｎｔ １５１０−２２２０：オワンクラゲのＥＣＦＰ
（２）哺乳類細胞でのＲ−Ｒａｓ活性モニタータンパク質（Ｒａｉ−ｃｈｕ１５８）の発現と分光光度法による解析
実施例１の（４）に記載の方法により解析を行った。得られた蛍光プロフィールを第２０図に示す。
実施例５ Ｒａｓの標的タンパク質結合ドメインに温度感受性変異を有するモニタータンパク質をコードする遺伝子の構築
（１）ｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９の構築
（ｉ）変異を有するＲａｓ遺伝子の増幅
実施例１にて用いたＲａｓのｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーｈＲａｓＸｈ（実施例１にて使用）とアンチセンスプライマーＲａｓＩ３６ＬＲ（５’−ＧＧＡＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号：２４）と前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲａｓの１位から３９位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分を増幅した。
アンチセンスプライマーＲａｓＩ３６ＬＲは、Ｒａｓの３５位から４２位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の配列を有し、下線で示した部分にＩｌｅのＬｅｕへの点突然変異を有している。この変異はＲａｓの活性を温度感受性にすることが知られている（文献８）。
同様に、ＲａｓのｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーＲａｓＩ３６ＬＦ（５’−ＣＧＡＣＣＣＣＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＣＣ−３’）（配列番号：２５）とアンチセンスプライマーＲａｓ１７２Ｒａｆ（実施例１にて使用）と前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲａｓのアミノ酸配列の３２位から１７２位に対応するｃＤＮＡ部分を増幅した。
得られた２つのＤＮＡ断片を混合し、センスプライマーｈＲａｓＸｈとアンチセンスプライマーＲａｓ１７２Ｒａｆとを用い、前記と同様にしてＰＣＲを行い、Ｒａｓのアミノ酸配列の１位から１７２位に対応し、かつＩｌｅ３６のＬｅｕへの点突然変異を含むＤＮＡを増幅した。
（ｉｉ）制限酵素断片の作製
上記ＰＣＲ産物をＸｈｏＩとＫｐｎＩとで切断した。
（ｉｉｉ）実施例１で得られたｐＲａｆｒａｓ１７２２をＸｈｏＩで完全消化したのち、ＫｐｎＩで部分消化し、Ｒａｓの部分を除去したＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ断片と前記（ｉｉ）で得られたＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。得られたプラスミドをｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９と命名した。該プラスミドの翻訳領域における塩基配列（配列番号：２６）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：２７）を第２１図〜第２３図にそれぞれ示す。
（２）哺乳類細胞でのモニタータンパク質（Ｒａｉ−ｃｈｕ１１９）の発現と分光光度法による解析
ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）で培養した。該ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、実施例１において作成したｐＲａｆｒａｓ１７２２またはｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９と、グアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｓ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓ）とをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトした。前記同培地にて２４時間培養後に３３℃および４０℃のインキュベータに移し、さらに２４時間、培養した。該細胞をリン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した後、溶解液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）にて溶解した。得られた細胞溶解液を１０，０００×ｇで遠心分離し上清を回収した。
該上清を蛍光分光光度計（日本分光社製、ＦＰ−７５０）の１ｍｌキュベットに入れ、励起波長４３３ｎｍにて、４５０ｎｍから５５０ｎｍまでの蛍光強度を測定した。得られた蛍光プロフィールを第２４図に示す。
実施例６ Ｒａｆｒａｓ１７２２を発現するトランスジェニックマウスの作成およびこのマウスの心筋培養細胞におけるＲａｓ活性化の測定
（１）実施例１で得られたｐＲａｆｒａｓ１７２２を制限酵素ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、これをアガロース電気泳動にかけ、約４．５ｋｂのプロモーター、イントロン、コーディング配列、ポリＡ付加シグナルを含む領域のＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡは電気溶出法にてゲルより取り出した後、Ｑｉａｇｅｎ２０チップ（キアゲン社）を用いて精製した。このＤＮＡを定法に従い、マウス受精卵（ＤＢＦ１、日本エスエルシー社）の前核に注入し、偽妊娠させたＩＣＲマウス（日本エスエルシー社）の卵管内に移植した。得られたマウスの離乳後、尾を１ｃｍ切断し、プロテイナーゼＫを含むＤＮＡ抽出液（ＡＢＩ社）中で３７℃にて一晩維持し、ここから、フェノールおよびフェノールクロロホルムにてタンパク質を除いた後に、等量のイソプロパノールを加えて、析出したＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを水にいれ、３７℃で溶解させた。
（２）このマウスＤＮＡを鋳型にして、センスプライマーＲａｆＲＢＤｘ（５’−ＣＴＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＡＡＧＡＣＡＡＧＣＡＡＣＡＣＴ−３’）（配列番号：２８）とアンチセンスプライマーＸＦＰＮｓｅｑ（５’−ＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＣＴＣＧＡＣＣＡＧ−３’）（配列番号：２９）とを用い、ＰＣＲ法にてＤＮＡを増幅した。このプライマーにより、Ｒａｆｒａｓ１７２２遺伝子のうちのＲａｆ遺伝子とＥＣＦＰ遺伝子の連結領域に相当するＤＮＡが増幅できる。予期される３１４ｂｐのバンドが現れるものを、Ｒａｆｒａｓ１７２２のＤＮＡの組み込みがあると判定した。３５匹の仔マウスのうち７匹にこのバンドが確認できた。
（３）つぎに、このＦ１マウスをＣ５７／Ｂｌａｃｋマウス（日本エスエルシー社）と交配させた。Ｆ２のマウス新生児（０日齢）より、心室をとり、眼科用ハサミで細切した。ここに、０．０５％トリプシンと０．５ｍＭ ＥＤＴＡとを含むＰＢＳを加え、３７℃で細胞を１０分間処理し、剥離してきた心筋細胞を回収した。この操作を６回繰り返し、心筋細胞を集めた。ここに、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地を加え、低速遠心にて心筋細胞を沈殿させ、上清を捨てた。回収した心筋細胞養１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭで培養した。
（４）得られた心筋細胞をガラス底の培養皿（φ３５ｍｍ）に移して底面に付着させ、無血清培地（日本製薬製）中で６時間培養を行った。次いで、当該心筋培養細胞にＥＧＦを１００ｎｇ／ｍｌ添加し、実施例１の（５）に記載の蛍光顕微鏡システムで観察した。ＥＧＦ添加による細胞内におけるＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光強度の経時的変化の結果を第２５図に示す。トランスジェニックマウス由来の初代培養細胞でもＥＧＦ依存的にＲａｓの活性化が測定できることを確認した。
実施例７ Ｒａｆｒａｓ１７２２のグアニンヌクレオチド交換因子およびＧＴＰ水解促進酵素に対する特異性
実施例１の（４）の実験において、グアニンヌクレオチド交換因子およびＧＴＰ水解促進酵素を多数の種類を用いてＲａｆｒａｓ１７２２の特異性を検討した。ＧＴＰ水解促進酵素およびグアニンヌクレオチド交換因子としては、（文献９）に記載のＧＡＰ１ｍ、Ｒ−ＲａｓＧＡＰ、ｒａｐ１ＧＡＰＩＩ、ｍＳｏｓ１、ＲａｓＧＲＦ、ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩ、Ｃ３Ｇ、ＰＤＺ−ＧＥＦ１、ＫＩＡＡ０３５１の発現ベクターを用いた。第２６図に示す如く、Ｒａｓに対するＧＴＰ水解促進酵素であるＧＡＰ１ｍによりＦＲＥＴ効率の低下が認められるが、Ｒ−ＲａｓやＲａｐ１に対するＧＴＰ水解促進酵素であるＲ−ＲａｓＧＡＰやｒａｐ１ＧＡＰＩＩによってはＦＲＥＴ効率は低下しない。また、ｍＳｏｓ１、ＲａｓＧＲＦ、ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩといったＲａｓに対するグアニンヌクレオチド交換因子によりＦＲＥＴ効率は上昇するが、ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩ、Ｃ３Ｇ、ＰＤＺ−ＧＥＦ１、ＫＩＡＡ０３５１といった他のＲａｓファミリーＧタンパク質を基質とするグアニンヌクレオチド交換因子によってはＦＲＥＴ効率は上昇しなかった。これは、Ｒａｆｒａｓ１７２２がＲａｓと同じグアニンヌクレオチド交換因子およびＧＴＰ水解促進酵素によってそのＦＲＥＴ効率が特異的に制御されていることを示している。
実施例８ Ｒａｐ １モニターであるＲａｉ−ｃｈｕ４０４の作成とそのグアニンヌクレオチド交換因子およびＧＴＰ水解促進酵素に対する特異性
（１） Ｒａｐ１ＡとＲａｆをコードするキメラ遺伝子Ｒａｉ−ｃｈｕ４０４の作成
公知のＥＧＦＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｕ７６５６１）に対し、ＰＣＲ法を用いる公知の方法により７つのアミノ酸置換（Ｔｈｒ６６Ｇｌｙ；Ｖａｌ６９Ｌｅｕ；Ｓｅｒ７３Ａｌａ；Ｍｅｔ１５４Ｔｈｒ；Ｖａｌ１６４Ａｌａ；Ｓｅｒ１７６Ｇｌｙ；Ｔｈｒ２０４Ｔｙｒ）をいれたものを、実施例３に記載のｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１のＥＹＦＰと制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩとを用いる切断およびライゲーションによる方法で置換した。次に、Ｒａｆｒａｓ１７２２のＲａｆ領域を含むＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ断片を、このｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１由来のプラスミドのＲａｌＧＤＳ領域を含むＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ断片と置換した。このベクターをｐＲａｉ−ｃｈｕ４０４と命名した。その翻訳領域の塩基配列を配列番号：３０として、また当該塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号：３１として示す。
（２） 実施例７と同様にＲａｉ−ｃｈｕ４０４のＦＲＥＴ効率に及ぼすグアニンヌクレオチド交換因子の影響を調べた。Ｒａｐ１に対するグアニンヌクレオチド交換因子としてはＰＤＺ−ＧＥＦ１、Ｃ３Ｇ、ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩ、ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩＩを用いた。また、対照としてＲａｓに対するグアニンヌクレオチド交換因子であるＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩ、ｍＳｏｓ１、ＲａｓＧＲＦおよびＲａｌに対するグアニンヌクレオチド交換因子であるＫＩＡＡ０８５１を用いた。これらのグアニンヌクレオチド交換因子は（文献９）に記載がある。実験の結果を第２７図に示すように、Ｒａｐ１に対するグアニンヌクレオチド交換因子のみがＲａｉ−ｃｈｕ４０４のＦＲＥＴ効率を上昇せしめることがわかった。
実施例９ Ｋｉ−Ｒａｓタンパク質のＣＡＡＸボックスを有する活性モニタータンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１ＸとＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘの作成
実施例１においてアンチセンスプライマーＸＦＰ−Ｂｇｌのかわりに制限酵素ＸｂａＩの認識部位を含むプライマー（配列番号：３２）を用いてＥＣＦＰを増幅し、（文献１１）に記載の方法で、ＥＣＦＰのカルボキシル末端にＫｉ−Ｒａｓタンパク質のＣＡＡＸボックスを融合せしめた。これをＲａｆｒａｓ１７２２およびＲａｉ−ｃｈｕ４０４のＥＣＦＰと制限酵素とＴ４リガーゼを用いる方法で置換した。得られたベクターをそれぞれｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１ＸおよびｐＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘと命名した。それぞれの翻訳領域の塩基配列を配列番号：３３および配列番号：３５として、また当該塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号：３４および配列番号：３６として示す。
実施例１０ Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１ＸおよびＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘを発現するＣＯＳ１細胞におけるＲａｓ活性化の可視化
ＣＯＳ１細胞をガラス底の培養皿に巻きなおす。実施例９で得られたＲａｉ−ｃｈｕ１０１ＸおよびＲａｉ−ｃｈｕ４０４ＸをＣＯＳ １細胞に、定法に従いトランスフェクトした。２４時間後に、実施例１の（５）に記載の蛍光顕微鏡システムで観察した。ＥＧＦ添加による細胞内におけるＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光強度比（ＥＹＦＰ／ＥＣＦＰ）の経時的変化の結果を第２８図に示す。本図では蛍光比の高いところを赤で、低いところを青色で表し、ＥＣＦＰの蛍光強度を明度として表わすＩＭＤモードを用いて図を提示している。すなわち、原図においては赤いところがＲａｓあるいはＲａｐ１の活性化が高い部位を示している。第２８図では細胞増殖因子による刺激でＲａｓが細胞の周辺部より活性化され、Ｒａｐ１は核周囲から活性化される様子が画像化できた。同様の実験を、細胞がやや密集した状態で行うと、第２９図に示すように、細胞が接触した部位においてはＲａｓの活性化が起きず、細胞が接触していないところにおいて辺縁部よりＲａｓが活性化されることが明らかとなった。このように、本発明の活性モニタータンパク質を用いることにより、細胞内でＲａｓファミリーＧタンパク質の活性に関する時間的、空間的情報を取得することができる。
実施例１１ Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１ＸおよびＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘを発現するＰＣ１２細胞におけるＲａｓ活性化の可視化
ガラス底の培養皿に増殖しているＰＣ１２細胞に、実施例９で得られたＲａｉ−ｃｈｕ１０１ＸおよびＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘを定法に従いトランスフェクトし、実施例１の（５）に記載の蛍光顕微鏡システムで観察した。神経成長因子にて添加による細胞内におけるＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光強度比（ＥＹＦＰ／ＥＣＦＰ）の経時的変化の結果を第３０図に示す。原図では蛍光比の高いところを赤で、低いところを青色で表し、ＥＣＦＰの蛍光強度を明度として表わすＩＭＤモードを用いて図を提示している。すなわち、原図においては赤いところがＲａｓあるいはＲａｐ１の活性化が高い部位を示している。ＰＣ１２細胞の神経様分化においては、分化の誘導期にはＲａｓは細胞体で辺縁部から活性化されるのに対し、分化が完成した時期においては、細胞の生存に必要なＲａｓの活性は神経突起においてのみ維持されていることがわかった。すなわち、Ｒａｓの活性化が細胞の分化の段階により、細胞内の異なる部位で起きていることが明らかとなった。Ｒａｓとは全く対照的にＲａｐ１は神経成長因子の添加により核周囲ぶより活性化され、分化した神経突起においてはその活性は低く抑えられていることが明らかとなった。これはＲａｓファミリーＧタンパク質の活性が細胞内の異なる場所では異なる制御を受けていることを示すものである。
実施例１２ Ｒａｃ１の活性モニタータンパク質であるＲａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘの作成
（１）Ｒａｃ１とＰａｋ１とをコードするキメラ遺伝子の作成
Ｒａｃ１のｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｍ２９８７０）およびＰａｋ１のｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：ＮＭ００２５７６）を鋳型として、ＰＣＲ法により、実施例１および実施例９の方法に従い、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘを得た。ｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘの構造（第３１図）、その翻訳領域の塩基配列（配列番号：３７）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：３８）を示す。
かかる塩基配列および予測されるアミノ酸配列を説明する：
ｎｔ １−６８４ ：オワンクラゲのＥＹＦＰ
ｎｔ ６８５−６９０ ：リンカー
ｎｔ ６９１−９３９ ：Ｐａｋ１
ｎｔ ９４０−９６９ ：リンカー
ｎｔ ９７０−１４９７ ：Ｒａｃ１
ｎｔ １４９８−１５０６：リンカー
ｎｔ １５０７−２２１７：オワンクラゲのＥＣＦＰ
ｎｔ ２２１８−２２２９：リンカー
ｎｔ ２２３０−２２８９：Ｋ−Ｒａｓのカルボキシル末端領域（ＣＡＡＸボックス）
（２）キメラ遺伝子の変異体の作成
公知のＰＣＲを用いる方法にて、ｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘの塩基配列（配列番号：３７）における１００４位のＧをＴに置換し、予測されるアミノ酸ＧｌｙをＶａｌに置換したものをｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１２Ｘと命名した。同様に、１０１９位のＣをＡに置換し、予測されるアミノ酸ＴｈｒをＡｓｎに置換したものをｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１３Ｘと命名した。タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１２Ｘにおいては、Ｒａｃ１のＧＴＰ水解活性が減少し、恒常的活性化型になることが予想される。一方、Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１３Ｘにおいては、Ｒａｃ１のＧＴＰ結合能が減少し、非活性化型になることが予想される。
（３）ホ乳類細胞でのＲａｃ１の活性モニタータンパク質（Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘ）の発現と分光光度計による解析
実施例１の（４）に記載の方法により、Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘ、Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１２Ｘ、またはＲａｉ−ｃｈｕ１０１３Ｘを発現する細胞を用いて解析を行った。得られた蛍光プロフィールを第３４図に示す。活性化型と予想されるＲａｉ−ｃｈｕ１０１２Ｘと比較して野生型Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘおよび非活性化型と予想されるＲａｉ−ｃｈｕ１０１３Ｘでは、ＦＲＥＴの効率が低いことがわかる。
実施例１３ Ｃｄｃ４２の活性モニタータンパク質であるＲａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘの作成
（１）Ｃｄｃ４２とＰａｋ１とをコードするキメラ遺伝子の作成
Ｃｄｃ４２のｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｍ５７２９８）およびＰａｋ１のｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：ＮＭ００２５７６）を鋳型として、ＰＣＲ法により、実施例１の方法に従い、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘを得た。ｐＲａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘの構造（第３２図）、その翻訳領域の塩基配列（配列番号：３９）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：４０）を示す。
かかる塩基配列および予測されるアミノ酸配列を説明する：
ｎｔ １−６８４ ：オワンクラゲのＥＹＦＰ
ｎｔ ６８５−６９０ ：リンカー
ｎｔ ６９１−９３９ ：Ｐａｋ１
ｎｔ ９４０−９６９ ：リンカー
ｎｔ ９７０−１４９４ ：Ｃｄｃ４２
ｎｔ １４９５−１５０３：リンカー
ｎｔ １５０４−２２１４：オワンクラゲのＥＣＦＰ
ｎｔ ２２１５−２２２６：リンカー
ｎｔ ２２２７−２２８６：Ｋ−Ｒａｓのカルボキシル末端領域（ＣＡＡＸボックス）
（２）キメラ遺伝子の変異体の作成
公知のＰＣＲを用いる方法にて、ｐＲａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘの塩基配列（配列番号：３９）における１００１位のＧをＴに置換し、予測されるアミノ酸ＧｌｙをＶａｌに置換したものをｐＲａｉ−ｃｈｕ１０５２Ｘと命名した。タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１０５２Ｘにおいては、Ｒａｃ１のＧＴＰ水解活性が減少し、恒常的活性化型になることが予想される。
（３）ホ乳類培養細胞でのＣｄｃ４２の活性モニタータンパク質（Ｒａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘ）の発現と分光光度計による解析
実施例１の（４）に記載の方法により解析を行った。Ｒａｉ−ｃｈｕ１０５４ＸまたはＲａｉ−ｃｈｕ１０５２Ｘを発現する細胞を用いて解析を行った。得られた蛍光プロフィールを第３５図に示す。活性化型と予想されるＲａｉ−ｃｈｕ１０５２Ｘと比較して野生型Ｒａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘでは、ＦＲＥＴの効率が低いことがわかる。
実施例１４ ＲｈｏＡの活性モニタータンパク質であるＲａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘの作成
（１）ＲｈｏＡとｍＤｉａｌとをコードするキメラ遺伝子の作成
ＲｈｏＡのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｌ２５０８０）およびｍＤｉａｌのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｅ１７３６１）を鋳型として、ＰＣＲ法により、実施例１の方法に従い、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘを得た。ｐＲａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘの構造（第３３図）、その翻訳領域の塩基配列（配列番号：４１）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：４２）を示す。
かかる塩基配列および予測されるアミノ酸配列を説明する：
ｎｔ １−６８４ ：オワンクラゲのＥＹＦＰ
ｎｔ ６８５−６９６ ：リンカー
ｎｔ ６９７−１０９２ ：ｍＤｉａｌ
ｎｔ １０９３−１１１０：リンカー
ｎｔ １１１１−１６７７：ＲｈｏＡ
ｎｔ １６７８−１６８６：リンカー
ｎｔ １６８７−２３９７：オワンクラゲのＥＣＦＰ
ｎｔ ２３９８−２４０９：リンカー
ｎｔ ２４１０−２４６９：Ｋ−Ｒａｓのカルボキシル末端領域（ＣＡＡＸボックス）
（２）キメラ遺伝子の変異体の作成
公知のＰＣＲを用いる方法にて、ｐＲａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘの塩基配列（配列番号：４１）における１２９８位のＡをＴに、１２９９位のＧをＣに置換し、予測されるアミノ酸ＧｌｎをＬｅｕに置換したものをｐＲａｉ−ｃｈｕ１２２０Ｘと命名した。タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１２２０Ｘにおいては、ＲｈｏＡのＧＴＰ水解活性が減少し、恒常的活性化型になることが予想される。
（３）ホ乳類細胞でのＲｈｏＡの活性モニタータンパク質（Ｒａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘ）の発現と分光光度計による解析
実施例１の（４）に記載の方法により解析を行った。Ｒａｉ−ｃｈｕ１２１４ＸまたはＲａｉ−Ｃｈｕ１２２０Ｘを発現する細胞を用いて解析を行った。得られた蛍光プロフィールを第３６図に示す。活性化型と予想されるＲａｉ−ｃｈｕ１２２０Ｘと比較して野生型Ｒａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘでは、ＦＲＥＴの効率が低いことがわかる。
実施例１５ Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１１ＸおよびＲａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘを発現するＣＯＳ１細胞におけるＲａｃ１活性化の可視化
ＣＯＳ１細胞をガラス底の培養皿に巻きなおす。実施例１２で得られたｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１１ＸをＣＯＳ１細胞に、定法に従いトランスフェクトした。２４時間後に実施例１の（５）に記載の蛍光顕微鏡システムで観察した。ＥＧＦ添加による細胞内におけるＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光強度比（ＥＹＦＰ／ＥＣＦＰ）の経時的変化の結果を第３７図に示す。第３７図では、ＥＧＦ刺激により、Ｒａｃ１が１分間以内に速やかに細胞全体に活性化され、やがて、細胞辺縁部のラッフリングと呼ばれる細胞膜が運動している部分に活性化が収斂されていく様子が観察できた。このように、本発明の活性モニタータンパク質を用いることにより、細胞内でＲｈｏファミリーＧＴＰ結合タンパク質の活性に関する時間的、空間的定法を取得することができる。また、これはＲａｓやＲａｐ１の活性化とも異なるものであり、これらの活性モニタータンパク質分子の特異性を裏付ける結果でもある。
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、制限酵素ＸｈｏＩの切断部位の塩基配列とヒトＨ−Ｒａｓの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：２は、ヒトｃ−Ｒａｆ１の塩基配列とヒトＨ−Ｒａｓの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：３は、制限酵素ＫｐｎＩの切断部位の塩基配列とヒトｃ−Ｒａｆ１の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：４は、制限酵素ＮｏｔＩの切断部位の塩基配列とヒトｃ−Ｒａｆ１の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：５は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫＩＩ（＋）のマルティプルクローニングサイトの５’側の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：６は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫＩＩ（＋）のマルティプルクローニングサイトの３’側の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：７は、制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位の塩基配列とＥＹＦＰの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：８は、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩの各々の切断部位の塩基配列とＥＣＦＰの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：９は、制限酵素ＮｏｔＩの切断部位の塩基配列とＥＣＦＰの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：１０は、制限酵素ＢｇｌＩＩの切断部位の塩基配列とＥＣＦＰの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：１１は、ヒトＨ−Ｒａｓ、ヒトｃ−Ｒａｆ１、ＥＹＦＰおよびＥＣＦＰの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：１２は、配列番号：１１のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：１３は、制限酵素ＸｈｏＩの切断部位の塩基配列とヒトＲａｐ１Ａの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：１４は、ヒトＲａｌＧＤＳの塩基配列とヒトＲａｐ１Ａの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：１５は、ヒトＲａｌＧＤＳの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：１６は、制限酵素ＮｏｔＩの切断部位の塩基配列とヒトＲａｌＧＤＳの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：１７は、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩの各々の切断部位の塩基配列とＥＣＦＰの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：１８は、ヒトＲａｐ１Ａ、ヒトＲａｌＧＤＳ、ＥＹＦＰおよびＥＣＦＰの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：１９は、配列番号：１８のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：２０は、制限酵素ＸｈｏＩの切断部位の塩基配列とヒトＲ−Ｒａｓの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：２１は、制限酵素ＫｐｎＩの切断部位の塩基配列とヒトＲ−Ｒａｓの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：２２は、ヒトＲ−Ｒａｓ、ヒトｃ−Ｒａｆ１、ＥＹＦＰおよびＥＣＦＰの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：２３は、配列番号：２２のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：２４は、ヒトＨ−Ｒａｓの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：２５は、ヒトＨ−Ｒａｓの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：２６は、ヒトＨ−Ｒａｓ、ヒトｃ−Ｒａｆ１、ＥＹＦＰおよびＥＣＦＰの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：２７は、配列番号：２６のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：２８は、ヒトｃ−Ｒａｆ１のヒトＨ−Ｒａｓ結合領域の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：２９は、ＥＣＦＰの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：３０は、ヒトＲａｐ１Ａ、ヒトｃ−Ｒａｆ１、ＥＹＦＰおよびＥＣＦＰの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：３１は、配列番号：３０のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：３２は、ＥＣＦＰの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：３３は、ヒトＨ−Ｒａｓ、ヒトｃ−Ｒａｆ１、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰおよびヒトＫ−Ｒａｓの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：３４は、配列番号：３３のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：３５は、ヒトＲａｐ１Ａ、ヒトｃ−Ｒａｆ１、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰおよびヒトＫ−Ｒａｓの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：３６は、配列番号：３５のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：３７は、ヒトＲａｃ１、ヒトＰａｋ１、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰおよびヒトＫ−Ｒａｓの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：３８は、配列番号：３７のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：３９は、ヒトＣｄｃ４２、ヒトＰａｋ１、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰおよびヒトＫ−Ｒａｓの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：４０は、配列番号：３９のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：４１は、ヒトＲｈｏＡ、ヒトｍＤｉａｌ、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰおよびヒトＫ−Ｒａｓの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：４２は、配列番号：４１のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
産業上の利用可能性
本発明によれば、非侵襲的な低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定を可能にする低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質、該タンパク質を発現し、非侵襲的な低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定に有用な細胞およびトランスジェニック動物、前記タンパク質を用いる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法、より詳しくは生細胞においても使用可能な、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のＧＴＰ結合型とＧＤＰ結合型の量比を測定する方法、ならびに低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法が提供される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第１図は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性制御機構を示す。本図では、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質としてＲａｓを例にとり、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性制御機構を模式的に示してある。低分子量ＧＴＰ結合タンパク質はＧＤＰに結合していると不活性化型であり、ここにグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）が作用するとＧＤＰがＧＴＰに置換され、活性化型となる。活性化されたＧＴＰ結合タンパク質は構造変化を起こし、その特異的な標的タンパク質と結合し、それを活性化できるようになる。活性化型の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質はＧＴＰ水解促進酵素（ＧＡＰ）存在下にＧＴＰがＧＤＰに水解され、無機リン酸（Ｐｉ）を遊離し、もとの不活性化型に戻る。
第２図は、ＦＲＥＴを利用した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化測定法の原理を示す。この図では低分子量ＧＴＰ結合タンパク質としてＲａｓを、標的タンパク質としてＲａｆを例にとっている。ＧＦＰドナータンパク質として例示するＣＦＰ（ｃｙａｎ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＧＦＰ）は４３３ｎｍの光で励起され、４７５ｎｍを極大とする光を放射する。一方、ＧＦＰアクセプタータンパク質として例示するＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＧＦＰ）は５０５ｎｍの光で励起され５３０ｎｍを極大とする光を放射する。なお、本発明においては、ＧＦＰアクセプタータンパク質および／またはＧＦＰドナータンパク質として、これらを用いることもできる。第２図中の下図に示すように、Ｒａｓの活性化前には、モニタータンパク質において、アミノ末端側に存在するＹＦＰとカルボキシル末端側に存在するＣＦＰとが離れているのでＣＦＰからＹＦＰへのエネルギーの移行はあまり起きない。ところが、何らかの刺激を受けて〔たとえば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の添加〕Ｒａｓが活性化型になると、標的タンパク質ＲａｆのＲａｓ結合領域（ＲＢＤ）に結合するので、ＹＦＰとＣＦＰが近傍に来て、その結果、ＣＦＰからＹＦＰへのエネルギーの移行、それに伴うＹＦＰからの５３０ｎｍの蛍光が観察されるようになる。従って、刺激前後（すなわち、Ｒａｓの活性化前後）におけるＦＲＥＴ効率を測定することにより、Ｒａｓの活性化を測定することができる。
第３図は、プラスミドｐＲａｆｒａｓ１７２２の構造を示す。発現ベクターはすでに報告されているｐＣＡＧＧＳを用いた。図中のＣＡＧプロモーターの下流にＥＹＦＰ−Ｒａｓ−ＲａｆＲＢＤ（Ｒａｓ結合領域）−ＥＣＦＰの順となる融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを結合した。
第４図は、プラスミドｐＲａｆｒａｓ１７２２の翻訳領域の塩基配列および予測されるアミノ酸配列を示す。
第５図は、プラスミドｐＲａｆｒａｓ１７２２の翻訳領域の塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第６図は、プラスミドｐＲａｆｒａｓ１７２２の翻訳領域の塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第７図は、発現タンパク質Ｒａｆｒａｓ１７２２の蛍光プロフィールを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｆｒａｓ１７２２とグアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｓ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓ）あるいはＧＴＰ水解促進酵素Ｇａｐ１ｍ発現ベクター（ｐＥＦ−Ｂｏｓ−Ｇａｐ１ｍ）をリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、４８時間培養後に細胞を可溶化し、遠心分離後、上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。第７図に示すグラフの右囲みにおけるＳｏｓはｐＲａｆｒａｓ１７２２とｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｆｒａｓ１７２２の蛍光プロフィールであることを、Ｇａｐ１ｍはｐＲａｆｒａｓ１７２２とｐＥＦ−Ｂｏｓ−Ｇａｐ１ｍを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｆｒａｓ１７２２の蛍光プロフィールであることを示す。
第８図は、発現タンパク質Ｒａｆｒａｓ１７２２のＧＴＰ結合タンパク質上のＧＴＰとＧＤＰの比〔ＧＴＰ／（ＧＤＰ＋ＧＴＰ）（％）〕に対する励起波長４３３ｎｍでの波長４７５ｎｍと波長５３０ｎｍの蛍光強度比（波長５３０／４７５）を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｆｒａｓ１７２２と様々な量のグアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｓ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓ）あるいはＧＴＰ水解促進酵素Ｇａｐ１ｍ発現ベクター（ｐＥＦ−Ｂｏｓ−Ｇａｐ１ｍ）をトランスフェクトした。４８時間培養後に３２Ｐｉ標識し、Ｒａｆｒａｓ１７２２を抗ＧＦＰ抗体で免疫沈降した後に、Ｒａｆｒａｓ１７２２に結合しているＧＴＰおよびＧＤＰを薄層クロマトグラフィーで分離、定量した。一方、同様に処理した細胞可溶化液について蛍光プロフィールを測定し、励起波長４３３ｎｍでの波長４７５ｎｍと波長５３０ｎｍの蛍光強度比を測定した。Ｒａｆｒａｓ１７２２上のＧＴＰの量に依存して蛍光強度比が増強されることが分かる。
第９図は、発現タンパク質Ｒａｆｒａｓ１７２２を発現する細胞株が得られたことを示す。ＮＩＨ３Ｔ３細胞にｐＲａｆｒａｓ１７２２をトランスフェクトし、細胞株３Ｔ３−Ｒａｆｒａｓを樹立した。細胞を可溶化し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロッティングにてＲａｆｒａｓ１７２２の発現について解析した。第９図に示すイムノブロッティングの左には分子量マーカーを示す。
第１０図は、３Ｔ３−Ｒａｆｒａｓ細胞を用いたＲａｓ活性化の解析を示す。３Ｔ３−Ｒａｆｒａｓ細胞をＥＧＦ（１μｇ／ｍｌ）で刺激し、その前後で４３３ｎｍの波長で励起した蛍光プロフィール（波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍ）を測定した。
第１１図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１の構造を示す。バックボーンとなるベクターの構造は第３図と同一である。
第１２図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列を示す。
第１３図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第１４図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第１５図は、発現タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ３１１の蛍光プロフィールを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１とグアニンヌクレオチド交換因子Ｃ３Ｇ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−Ｃ３Ｇ；文献９に記載）あるいはＧＴＰ水解促進酵素ｒａｐ１ＧＡＰＩＩ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｒａｐ１ＧＡＰＩＩ；文献９に記載）とをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、４８時間培養後に細胞を可溶化し、遠心分離後、上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。第１５図に示すグラフの右囲みにおけるＣ３ＧはｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１とｐＣＡＧＧＳ−Ｃ３Ｇを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｉ−ｃｈｕ３１１の蛍光プロフィールであることを、ｒａｐ１ＧＡＰＩＩはｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１とｐＣＡＧＧＳ−ｒａｐ１ＧＡＰＩＩを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｉ−ｃｈｕ３１１の蛍光プロフィールであることを示す。
第１６図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８の構造を示す。バックボーンとなるベクターの構造は第３図と同一である。
第１７図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列を示す。
第１８図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第１９図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第２０図は、発現タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１５８の蛍光プロフィールを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８とグアニンヌクレオチド交換因子ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩＩ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩＩ；文献１０に記載）あるいはＧＴＰ水解促進酵素Ｇａｐ１ｍ発現ベクター（ｐＥＦ−Ｂｏｓ−Ｇａｐ１ｍ）をリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、４８時間培養後に細胞を可溶化し、遠心分離後、上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。第２０図に示すグラフの右囲みにおけるＧａｐ１ｍはｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８とｐＥＦ−Ｂｏｓ−Ｇａｐ１ｍを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｉ−ｃｈｕ１５８の蛍光プロフィールであることを、ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩＩはｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８とｐＣＡＧＧＳ−ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩＩを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｉ−ｃｈｕ１５８の蛍光プロフィールであることを示す。
第２１図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列を示す。
第２２図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第２３図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第２４図は、発現タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１１９の蛍光プロフィールを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９またはｐＲａｆｒａｓ１７２２とグアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｓ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓ）とをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、２４時間培養後に３３℃および４０℃に移し、さらに２４時間培養を加えた後、細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。第２１図に示すグラフの右囲みにおける対照はｐＲａｆｒａｓ１７２２とｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｉ−ｃｈｕ１１９の蛍光プロフィールであることを、変異ありはｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９とｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｉ−ｃｈｕ１１９の蛍光プロフィールであることを示す。Ｒａｉ−ｃｈｕ１１９では野生型（Ｒａｆｒａｓ１７２２）より、グアニンヌクレオチド交換因子に対する反応性が増加していた。
第２５図は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）添加による細胞内におけるＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光強度の経時的変化の結果を示す。実施例１に記載の蛍光顕微鏡システムを用いて、波長４３０ｎｍの励起光を照射して蛍光波長４７５ｎｍおよび５３０ｎｍでの画像を経時的に取得し、当該画像からＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光強度を求めた。
第２６図は、種々のグアニンヌクレオチド交換因子およびＧＴＰ水解促進酵素による発現タンパク質Ｒａｆｒａｓ１７２２におけるＥＣＦＰとＥＹＦＰの蛍光強度比の変化を示すグラフである。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｆｒａｓ１７２２とグアニンヌクレオチド交換因子発現ベクターあるいはＧＴＰ水解促進酵素発現ベクターとをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、２４時間以上培養後に細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４７５ｎｍおよび５３０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。後者の前者に対する比（蛍光強度比）をグラフに示してある。
第２７図は、種々のグアニンヌクレオチド交換因子およびＧＴＰ水解促進酵素による発現タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ４０４におけるＥＣＦＰとＥＹＦＰの蛍光強度比の変化を示すグラフである。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ４０４とグアニンヌクレオチド交換因子発現ベクターあるいはＧＴＰ水解促進酵素発現ベクターとをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、２４時間以上培養後に細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４７５ｎｍおよび５３０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。後者の前者に対する比（蛍光強度比）をグラフに示してある。
第２８図は、ＥＧＦ添加によるｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１ＸまたはｐＲａｉ−ｃｈｕ４０４ＸをトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞内におけるＥＹＦＰのＥＣＦＰに対する蛍光強度比の経時的変化ならびに、細胞内分布を示す写真である。ＣＯＳ１細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１ＸあるいはｐＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘをトランスフェクトし、２４時間以上培養後に、培地をフェノールレッドおよび血清を含まない培地に交換した。ついで、キセノン光源を有する倒立型蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００）に回転式蛍光励起フィルターおよび回転式蛍光発光フィルター装置（ＬＵＤＬ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ社）を備え、高感度冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｘ社、Ｍｉｃｒｏｍａｘ４５０）を備え、日本ローパー社製Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ画像解析ソフトにて制御ならびに解析できるシステムを用いて画像を取得した。細胞に４３０ｎｍの励起光を照射し、４７５ｎｍのＥＣＦＰドナーの蛍光波長での画像をＣＣＤカメラにより撮影し、ついで、５３０ｎｍのＥＹＦＰアクセプターの蛍光波長での画像を撮影した。これを３０秒間隔で行った。データ取得後、デジタル画像上の各ピクセルについて、ＥＹＦＰ／ＥＣＦＰの蛍光強度比を８段階に分け、青から赤までの色を割り当てた。一方、ＥＣＦＰの蛍光強度を明度として割り当てることによりビデオ画像が作成できる。本図ではこのうちの図に示す時間の画像を示してある。Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１Ｘ発現細胞にＥＧＦを添加すると、ＦＲＥＴ効率を反映する蛍光強度比が細胞の辺縁部から徐々に中央部に向かって上昇していく過程が見える。一方、Ｒａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘを発現する細胞においては、中央部から辺縁部に向かって活性が上昇するのがわかる。このように、本発明の活性モニタータンパク質は、ＲａｓファミリーＧタンパク質の活性化に関する時間情報と、細胞内の空間情報の双方を同時に得ることを可能とする。
第２９図は、ＥＧＦ添加によるｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１Ｘをトランスフェクトしたサブコンフルエントな状態のＣＯＳ１細胞内におけるＥＹＦＰのＥＣＦＰに対する蛍光強度比の経時的変化ならびに、細胞内分布を示す写真である。サブコンフルエントな状態のＣＯＳ１細胞を用いた以外は第２８図の説明に記載したのと同様の方法により実験を行った。Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１Ｘ発現細胞にＥＧＦを添加すると、ＦＲＥＴ効率を反映する蛍光強度比が他の細胞には接着していない辺縁部から上昇していく過程が見える。一方、隣の細胞と接着している部位ではこのＦＲＥＴ効率の上昇が抑制されているのがわかる。
第３０図は、神経成長因子添加によるｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１ＸまたはｐＲａｉ−ｃｈｕ４０４ＸをトランスフェクトしたＰＣ１２細胞内におけるＥＹＦＰのＥＣＦＰに対する蛍光強度比の経時的変化ならびに、細胞内分布を示す写真である。ＰＣ１２細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１ＸあるいはｐＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘをトランスフェクトし、２４時間以上培養後に、培地をフェノールレッドおよび血清を含まない培地に交換し、さらに神経成長因子を加え、第２８図の説明に記載したのと同様の方法により観察した。本図ではこの連続する画像のうち、図に示す時間の画像のみを示してある。Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１Ｘ発現細胞に神経成長因子を添加すると、ＦＲＥＴ効率を反映する蛍光強度比が細胞の辺縁部から徐々に中央部に向かって上昇していく過程が見える。そして、神経様突起の進展が明らかな１８０分以後においては、ＦＲＥＴ効率の上昇はこの神経様突起に主に限局していることがわかる。一方、Ｒａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘを発現する細胞においては、逆に中央部から辺縁部に向かって活性が上昇し、分化した神経様突起ではこのＦＲＥＴ効率が抑制されているのがわかる。このことは、分化誘導の過程においてＲａｓが細胞辺縁部より、Ｒａｐ１が細胞の中心部より活性化され、分化が完成した後は、Ｒａｓは神経様突起において高い活性が持続していることを示している。このことは、ＲａｓファミリーＧタンパク質が細胞内の異なる部位では異なる活性化状態にあることを明らかにするもので、本発明の活性モニタータンパク質群がＲａｓファミリーＧタンパク質活性化に関する時間的、空間的情報を得るのに至適な分子プローブであることを示すものである。
第３１図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘの構造を示す。バックボーンとなるベクターの構造は第３図と同一である。
第３２図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘの構造を示す。バックボーンとなるベクターの構造は第３図と同一である。
第３３図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘの構造を示す。バックボーンとなるベクターの構造は第３図と同一である。
第３４図は、発現タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１１ｘ（野生型）、Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１２Ｘ（活性化型）、Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１３Ｘ（非活性化型）の蛍光プロフィールを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１１ｘ、ｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１２Ｘ、またはｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１３Ｘをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、４８時間後に細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。
第３５図は、発現タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１０５４ｘ（野生型）、Ｒａｉ−ｃｈｕ１０５２Ｘ（活性化型）の蛍光プロフィールを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ１０５４ｘまたはｐＲａｉ−ｃｈｕ１０５２Ｘをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、４８時間後に細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。
第３６図は、発現タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘ（野生型）およびＲａｉ−ｃｈｕ１２２０Ｘ（活性化型）の蛍光プロフィールを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ１２１４ＸまたはｐＲａｉ−ｃｈｕ１２２０Ｘをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、４８時間後に細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。
第３７図は、ＥＧＦ添加によるｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１１ＸをトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞内におけるＥＹＦＰのＥＣＦＰに対する蛍光強度比の経時的変化ならびに、細胞内分布を示す写真である。第２８図の説明に記載したのと同様の方法により実験を行った。Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘ発現細胞にＥＧＦを添加すると、まず、１分間以内に一過性に細胞全体にＦＲＥＴ効率を反映する蛍光強度比が上昇し、ついで、細胞膜のラッフリングが起こっている部位で蛍光強度比の上昇と中心部での蛍光強度比の低下が観察される。これは、Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１Ｘを用いて調べたＲａｓの活性化やＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘを用いて調べたＲａｐ１の活性化とは異なる時間経過、空間的分布を示す結果であり、本発明の活性モニタータンパク質群がＲｈｏファミリーＧＴＰ結合タンパク質の活性化に関しても時間的、空間的情報を得るのに至適な分子プローブであることを示すものである。
本発明は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質、該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を含む発現ベクター、該発現ベクターを保持する形質転換された細胞およびトランスジェニック動物、前記タンパク質を用いる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法、ならびに低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法に関する。
背景技術
細胞内情報伝達分子には非常に多くの種類が知られており、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質（以下、ＧＴＰ結合タンパク質という場合がある）はその中でも種類が多いこと、重要な分子スイッチとして働いていることから非常に詳しく解析されてきている。低分子量ＧＴＰ結合タンパク質群はＲａｓファミリー、Ｒｈｏファミリー、Ｒａｂファミリー、Ｒａｎファミリーなどからなる（文献１）。これらの低分子量ＧＴＰ結合タンパク質は、細胞増殖、細胞骨格、細胞内輸送、核輸送など細胞内での多様な情報伝達を制御する重要な分子スイッチである。低分子量ＧＴＰ結合タンパク質は、ＧＤＰに結合している不活性化型とＧＴＰに結合している活性化型との間をサイクルしている（第１図）。ＧＴＰ結合型はそれぞれのＧＴＰ結合タンパク質に特異的な標的タンパク質に結合し、該標的タンパク質を活性化する。ＧＤＰ結合型をＧＴＰ結合型にする反応を触媒するタンパク質はグアニンヌクレオチド交換因子であり、ＧＴＰ結合型をＧＤＰ結合型に戻す反応を触媒するタンパク質はＧＴＰ水解促進酵素（ＧＴＰアーゼ活性化因子）である。該ＧＴＰ水解促進酵素は、結合したＧＴＰの加水分解を促進し、無機リン酸を遊離させてＧＤＰを生じさせるように働く。
最近、多くの低分子量ＧＴＰ結合タンパク質およびその活性化因子と不活性化因子が単離されるにおよび、これら低分子量ＧＴＰ結合タンパク質が細胞内および個体内でどのような機能的差異があるのかに注目が集まっている。その機能的差異を明らかにするためには、細胞内および個体内での低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化状態をモニターする必要がある。
細胞内での低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の程度を調べるには、細胞内での低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のＧＴＰ結合型とＧＤＰ結合型の量比を知る必要がある。現在、細胞内での低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のＧＴＰ結合型とＧＤＰ結合型の量比を調べる方法としては次の二つがよく用いられている。
（１） ラジオアイソトープ３２Ｐｉによる標識を利用する方法：細胞を３２Ｐｉで標識したのち低分子量ＧＴＰ結合タンパク質を精製し、結合しているＧＴＰおよびＧＤＰを薄層クロマトグラフィーにて分離し定量する（文献２）。
（２） プルダウン法：低分子量ＧＴＰ結合タンパク質に結合する標的タンパク質を固層に結合させておき、可溶化した細胞抽出液と混合する。ＧＴＰ結合型のものは標的タンパク質に高いアフィニティーで結合するので、ＧＴＰ結合型のみを選択的に回収することができる。これを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて分離した後に、イムノブロッティングにて定量する（文献３）。しかしながら、いずれの方法も細胞を一旦可溶化する必要があり、生細胞で直接、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を調べる方法はこれまでなかった。
細胞内には、細胞膜、細胞質以外にも多くの細胞内小器官が存在するだけでなく、細胞質の中でも異なる場所では異なる生化学的現象が起きていることが近年明らかにされている。また、個体レベルでも低分子量ＧＴＰ結合タンパク質が高次神経機能や器官形成に非常に重要であるということがわかっている。したがって、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化状態を細胞内あるいは個体内で非侵襲的に知ることは、生命現象の理解のみならず、薬剤開発などにおいても必須である。しかし、これまでの生化学的方法では細胞を可溶化してしまうため、細胞内のどの場所で低分子量ＧＴＰ結合タンパク質が活性化されているのか、また、どの細胞で低分子量ＧＴＰ結合タンパク質が活性化されているのかを知ることはできなかった。
一方、生細胞においてタンパク質を可視化する技術としてはＧＦＰ（ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いる方法が知られている（文献４）。ＧＦＰは発光クラゲなどより単離されるタンパク質群で、主に緑色の蛍光を発するタンパク質である。現在、細胞内でのタンパク質の局在を調べるのに広く用いられている。ＧＦＰとしてはＣＦＰ（ｃｙａｎ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＧＦＰ）、ＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＧＦＰ）などがあり、また、それらを改良したタンパク質としてＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＣＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ＣＦＰ）、ＥＹＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ＹＦＰ）、ＥＢＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｂｌｕｅ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＧＦＰ）など（本明細書において、これらをまとめてＧＦＰ関連タンパク質という）がある。これらは、それぞれ異なる波長の光で励起され、異なる波長の蛍光を放出する。
さらにＧＦＰを応用した技術としてＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）を用いるものがある（文献５）。ＦＲＥＴとは以下の現象を指す。蛍光物質ＡおよびＢという物質がそれぞれλａｅｘおよびλｂｅｘで励起され、λａｅｍおよびλｂｅｍの光をそれぞれ発光するとする。この時、ＡおよびＢがごく近傍に存在し、λａｅｍがλｂｅｘに充分に近い時、ＡおよびＢの混合物にλａｅｘの光を照射すると、物質ＡのエネルギーがＢに吸収されλｂｅｍの発光が観察される。これをＦＲＥＴという。この方法を利用して、２分子間の距離を推定することもできる。この時、蛍光物質Ａをドナー、蛍光物質Ｂをアクセプターという。
さらにこの技術の応用として、二つの蛍光物質を一つのタンパク質内に標識することにより、タンパク質の構造変化を検出することが可能である。ＥＢＦＰおよびＥＧＦＰ、ＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの２セットのＧＦＰ関連タンパク質は、至適なＦＲＥＴのためのドナーとアクセプターの組み合わせを作ることが知られている。たとえば、ＥＢＦＰとＥＧＦＰとの二つのタンパク質とカルシウム結合タンパク質カルモジュリンとの融合タンパク質で、このＦＲＥＴ技術を応用してカルシウムの濃度を測りうることが知られている（文献６）。しかしながら、ＧＦＰタンパク質とＦＲＥＴ技術とを応用した１分子モニターによる測定法は、前記カルシウム測定ならびにサイクリックＡＭＰ依存性リン酸化酵素の活性測定以外には、現時点では成功していない。
発明の開示
本発明は、非侵襲的な低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定を可能にする低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質；該タンパク質をコードする遺伝子；該遺伝子を含む発現ベクター；前記タンパク質を発現し、非侵襲的な低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定に有用な前記発現ベクターを保持する形質転換された細胞およびトランスジェニック動物；前記タンパク質を用いる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法、より詳しくは生細胞においても使用可能な、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のＧＴＰ結合型とＧＤＰ結合型の量比を測定する方法；ならびに低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕 低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の全部または一部、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質の全部または一部、ＧＦＰアクセプタータンパク質の全部または一部、及びＧＦＰドナータンパク質の全部または一部が、各タンパク質の機能を発揮し得る状態で直接または間接的に連結されてなる融合タンパク質からなる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質、
〔２〕 前記〔１〕記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質をコードする遺伝子、
〔３〕 前記〔２〕記載の遺伝子を含む発現ベクター、
〔４〕 前記〔３〕記載の発現ベクターを保持してなる形質転換された細胞、
〔５〕 前記〔３〕記載の発現ベクターを保持してなるトランスジェニック動物、
〔６〕 前記〔１〕記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質におけるＦＲＥＴを検出する工程を含む低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法、
〔７〕 前記〔４〕記載の細胞または前記〔５〕記載のトランスジェニック動物におけるＦＲＥＴを検出する工程を含む低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法、ならびに
〔８〕 （ａ）前記〔４〕記載の細胞と被検物質とを接触させる工程、および
（ｂ）低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性の変化を検出する工程、
を含む、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質（以下、モニタータンパク質という）は、ＧＴＰ結合型の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質が特異的にその標的タンパク質のみに結合するという性質を利用したものであり、非侵襲的な低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定に非常に有用なタンパク質である。本発明のモニタータンパク質は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質、ＧＦＰアクセプタータンパク質、およびＧＦＰドナータンパク質からなる融合タンパク質であり、各タンパク質が適切に、すなわち個々に本来のコンフォメーションを形成して各タンパク質が有する機能を完全な程度に発揮し得るような状態で、前記各タンパク質が直接または間接的に連結されてなる。従って、かかる融合タンパク質のアミノ酸配列は、前記各タンパク質のアミノ酸配列部分が直接または間接的に連結されてなる構造を有する。なお、本発明のモニタータンパク質を構成する各タンパク質は、当該タンパク質が有する機能を完全な程度に発揮し得るようであれば当該タンパク質の一部であってもよい。
本明細書においては、モニタータンパク質内に含まれる各タンパク質をいう場合、例えば、標的タンパク質を例にあげると、標的タンパク質そのものと区別し、標的タンパク質部分というべきところ、かかる区別なく、簡易に標的タンパク質と表現する。
本発明のモニタータンパク質では、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のＧＴＰとの結合による活性化（ＧＤＰ結合型の、グアニンヌクレオチド交換因子によるＧＴＰ結合型への変換による低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を含む）に伴いモニタータンパク質内で低分子量ＧＴＰ結合タンパク質とその標的タンパク質とが結合し、その結果、ＧＦＰドナータンパク質からＧＦＰアクセプタータンパク質へのＦＲＥＴ効率に変化が生ずることになる。第２図に、本発明のモニタータンパク質の一例を模式的に示し、該モニタータンパク質を用いる、ＦＲＥＴを利用した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法の原理を示す。なお、本明細書においてＦＲＥＴ効率とは、ＧＦＰドナータンパク質に対する励起光を本発明のモニタータンパク質に照射した場合の、ＧＦＰドナータンパク質の蛍光波長における蛍光強度とＧＦＰアクセプタータンパク質の蛍光波長における蛍光強度との比（蛍光強度比）をいう。詳しくは後述する。
ＦＲＥＴを実現するためには、ｉ）ＧＦＰドナーの発光スペクトラムとＧＦＰアクセプターの吸光スペクトラムとの重なり、ｉｉ）ドナーとアクセプター間の距離、ｉｉｉ）ドナーの発光モーメントとアクセプターの吸光モーメントの配向の３因子を考慮しなければならない。また、ＧＦＰを他のタンパク質と融合する場合、他のタンパク質と融合することがストレスとなってＧＦＰのミスフォールディングが生じ、その結果、発色団形成の効率が低下し、無蛍光のＧＦＰとなる可能性をも考慮しなければならない。このように、ＧＦＰドナーとＧＦＰアクセプターを利用して両者間にＦＲＥＴの良好な発現を生じさせるには厳格な条件が存在し、未だ両者間の配置等に一定の規則も見出されておらず、ＦＲＥＴの実現は一般に困難である。すなわち、ＦＲＥＴの実現は公知の技術常識に基づき容易になし得るものではなく、期待し得る程度を超える試行錯誤や複雑高度の実験等を要するものである。本発明のモニタータンパク質は、前記タンパク質を、本発明の所望の効果が得られ得るように適切に組み合わせたものであり、ＧＴＰ結合型の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質が特異的にその標的タンパク質のみに結合するという性質を利用し、ＧＴＰの低分子量ＧＴＰ結合タンパク質への結合に応じて変化し得るＧＦＰドナータンパク質とＧＦＰアクセプタータンパク質との間で生ずるＦＲＥＴを実現させたもので、その技術的価値は非常に大きい。
本発明のモニタータンパク質における各構成タンパク質の結合の順序は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化前後におけるＦＲＥＴ効率の差（以下、単にＦＲＥＴ効率の差という）の増大を考慮して適宜選択され得る。低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化前後におけるＦＲＥＴ効率の差が大きい程、当該タンパク質の活性化状態をより的確に捉えることができ、従って、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定精度を向上させることができるので好ましい。該モニタータンパク質における低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質との結合の好ましい態様としては、アミノ末端側に存在する低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質結合部位のカルボキシル末端が、カルボキシル末端側に存在する標的タンパク質のアミノ末端に直接または間接的に結合される態様（１）、アミノ末端側に存在する標的タンパク質のカルボキシル末端が、カルボキシル末端側に存在する低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質結合部位のアミノ末端に直接または間接的に結合される態様（２）が挙げられる。特に、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲａｓファミリーに属するものである場合は態様（１）が、Ｒｈｏファミリーに属するものである場合は態様（２）が好ましい。ＧＦＰアクセプタータンパク質およびＧＦＰドナータンパク質は各々、それらのアミノ末端またはカルボキシル末端が低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と標的タンパク質とが連結されたもの（連結物）のアミノ末端またはカルボキシル末端に直接または間接的に連結されて連結される。中でも、前記連結物のアミノ末端にＧＦＰアクセプタータンパク質のカルボキシル末端が、カルボキシル末端にＧＦＰドナータンパク質のアミノ末端が直接または間接的に連結されてなるモニタータンパク質が好ましい。従って、本発明のモニタータンパク質としては、該モニタータンパク質において、アミノ末端側より、ＧＦＰアクセプタータンパク質、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質、ＧＦＰドナータンパク質となるように、あるいはアミノ末端側より、ＧＦＰアクセプタータンパク質、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、ＧＦＰドナータンパク質となるように、それぞれ直接または間接的に連結されてなるものが特に好ましい。なお、「間接的に連結」とは、各タンパク質間の連結を、たとえば、後述するスペーサーとしてのペプチド等を介して行う態様をいう。
本発明のモニタータンパク質の構成要素である低分子量ＧＴＰ結合タンパク質としては、当該タンパク質として知られるものであれば特に限定されるものではないが、有用性の観点からＲａｓスーパーファミリーに属するものが好ましく、中でもＲａｓファミリーまたはＲｈｏファミリーに属するものがより好ましい。より詳しくは、Ｈ−Ｒａｓ、Ｋ−Ｒａｓ、Ｎ−Ｒａｓ、Ｒ−Ｒａｓ、Ｒａｐ１Ａ、Ｒａｐ１Ｂ、Ｒａｐ２Ａ、およびＲａｐ２Ｂからなる群、またはＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ、ＲｈｏＣ、Ｒａｃ１、Ｒａｃ２、およびＣｄｃ４２からなる群より選ばれる１種が好ましい。
一方、前記低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質は、前記例示するような各低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＧＴＰ結合型となった際に特異的に結合するものであれば特に限定されるものではない。有用性の観点から、好ましくはＲａｆまたはＲａｌＧＤＳ、あるいはＰａｋまたはｍＤｉａである。
さらに、前記低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と前記標的タンパク質の組み合わせとしては、有用性ならびに特異性の観点から、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＨ−Ｒａｓであり、標的タンパク質がＲａｆである組み合わせ、または低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲａｐ１Ａであり、標的タンパク質がＲａｌＧＤＳである組み合わせ、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲａｃ１であり、標的タンパク質がＰａｋである組み合わせ、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＣｄｃ４２であり、標的タンパク質がＰａｋである組み合わせ、あるいは低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲｈｏＡであり、標的タンパク質がｍＤｉａである組み合わせが特に好ましい。
また、ＧＦＰアクセプタータンパク質としては前記例示したＧＦＰ関連タンパク質のいずれを使用することもできるが、機能的観点から、好ましくはＥＧＦＰまたはＥＹＦＰである。一方のＧＦＰドナータンパク質も同様に前記例示したＧＦＰ関連タンパク質のいずれを使用することもできるが、機能的観点から、好ましくはＥＣＦＰまたはＥＢＦＰである。
前記した本発明のモニタータンパク質の構成要素それぞれの特に好ましい組み合わせとしては、有効性、特異性および感度の観点から、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＨ−Ｒａｓであり、標的タンパク質がＲａｆであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰであるか、または、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲａｐ１Ａであり、標的タンパク質がＲａｌＧＤＳであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰであるか、または低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲａｃ１であり、標的タンパク質がＰａｋであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰであるか、または低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＣｄｃ４２であり、標的タンパク質がＰａｋであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰであるか、または低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲｈｏＡであり、標的タンパク質がｍＤｉａであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰである。
また、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質、標的タンパク質、ＧＦＰドナータンパク質、およびＧＦＰアクセプタータンパク質の結合の順序は、ＦＲＥＴ効率の差の増大の観点から、本発明のモニタータンパク質において、好ましくはアミノ末端側よりＥＹＦＰ−Ｈ−Ｒａｓ−Ｒａｆ−ＥＣＦＰまたはＥＹＦＰ−Ｒａｐ１Ａ−ＲａｌＧＤＳ−ＥＣＦＰ、あるいはＥＹＦＰ−Ｐａｋ−Ｒａｃ１−ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ−Ｐａｋ−Ｃｄｃ４２−ＥＣＦＰまたはＥＹＦＰ−ｍＤｉａ−ＲｈｏＡ−ＥＣＦＰが挙げられる。また、これらにおいてＥＹＦＰとＥＣＦＰとが互いに交換されてなるものも好適に使用できる。
低分子量ＧＴＰ結合タンパク質は、その標的タンパク質に結合することができれば該タンパク質の一部でもよく、必ずしも、その全部（全長）である必要はない。ここで、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の一部とは、たとえば、公知の方法に従って当該タンパク質分子を大腸菌で生産し、試験管内でＧＴＰと結合せしめるという方法により、標的タンパク質との結合が検出され得るタンパク質部分をいう。なお、検出は、たとえば、標的タンパク質に対する抗体で免疫沈澱させ、ＧＴＰ結合タンパク質の一部が共沈するかをイムノブロッティングで調べる方法により行うことができる。たとえば、Ｈ−ＲａｓおよびＲａｐ１Ａであれば、好ましくは１〜１８０位、より好ましくは１〜１７２位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を、Ｒ−Ｒａｓであれば、好ましくは１〜２０４位、より好ましくは２８〜２０４位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分、Ｒａｃ１であれば、好ましくは１〜１７７位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を、Ｃｄｃ４２であれば、好ましくは１〜１７６位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を、ＲｈｏＡであれば好ましくは１〜１７６位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を挙げることができる。
一方、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の全部よりはむしろ、そのアミノ酸配列のアミノ末端あるいはカルボキシル末端を一部削ることでしばしばＦＲＥＴ効率の差の増大が生ずる。それゆえ、当該タンパク質の一部としては、そのアミノ酸配列のアミノ末端領域および／またはカルボキシル末端領域に、好ましくは少なくとも１個、より好ましくは１〜２８個、さらに好ましくは１７〜２８個のアミノ酸の欠損を有してなるものも含まれる。なお、かかる領域におけるアミノ酸の欠損部位には特に限定はない。たとえば、Ｈ−Ｒａｓの場合、Ｃ末端を１７２位まで削ったものが１８０位まで削ったものよりＦＲＥＴ効率の差を増大させた。すなわち、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域において好ましくは少なくとも１個、より好ましくは９〜２０個、さらに好ましくは１７個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。また、Ｒ−Ｒａｓの場合、アミノ末端から２８個のアミノ酸を削ったものが削らないものよりもＦＲＥＴ効率の差を増大させた。すなわち、そのアミノ酸配列のアミノ末端領域において好ましくは少なくとも１個、より好ましくは１〜２８個、さらに好ましくは２８個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。
なお、前記アミノ末端領域またはカルボキシル末端領域とは、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のアミノ酸配列において、そのアミノ末端またはカルボキシル末端から、アミノ酸の個数で好ましくは３０個までの領域をいう。
また、標的タンパク質も、対応する低分子量ＧＴＰ結合タンパク質に結合することができれば該タンパク質の一部でもよく、必ずしも、その全部（全長）である必要はない。ここで、標的タンパク質の一部とは、前記低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と同様の方法において、その対応する低分子量ＧＴＰ結合タンパク質との結合が検出され得るタンパク質部分をいう。たとえば、Ｒａｆ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｘ０３４８４）であれば、好ましくはＲａｓ結合領域（ＲＢＤ）、詳しくは、好ましくは５１〜２０４位、より好ましくは５１〜１３１位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を、ＲａｌＧＤＳ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｕ１４４１７）であれば、好ましくは２０２〜３０９位、より好ましくは２１１〜２９７位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を、Ｐａｋ１（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：ＮＭ００２５７６）であれば、好ましくはＲａｃ１結合領域、詳しくは６８〜１５０位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を、ｍＤｉａｌ（ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｅ１７３６１）であれば、好ましくはＲｈｏ結合領域、詳しくは６８〜２４０位、さらに好ましくは、６８〜１８０位に相当するアミノ酸配列部分からなるタンパク質部分を挙げることができる。
一方、ＧＦＰドナータンパク質および／またはＧＦＰアクセプタータンパク質も、ＦＲＥＴのペアーとなる機能が保たれていればそれらタンパク質の一部でもよく、必ずしも全部（全長）である必要はない。しばしば、それらのアミノ酸配列のカルボキシル末端を短くすることにより、ＦＲＥＴ効率の差の増大が生ずる。たとえば、ＧＦＰアクセプタータンパク質および／またはＧＦＰドナータンパク質の一部としては、それらのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域に好ましくは少なくとも１個、より好ましくは１〜１１個の欠損を有してなるものを挙げることができる。なお、かかる領域におけるアミノ酸の欠損部位には特に限定はない。たとえば、ＥＹＦＰの場合、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域において好ましくは少なくとも１個、より好ましくは１〜１１個、さらに好ましくは１１個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。また、ＥＣＦＰの場合、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域において好ましくは少なくとも１個、より好ましくは１〜１１個、さらに好ましくは１１個のアミノ酸の欠損を有してなるものが好ましい。ここで、カルボキシル末端領域とは、本発明に使用するＧＦＰ関連タンパク質のアミノ酸配列において、そのカルボキシル末端から、アミノ酸の個数で好ましくは１〜２０個までの、より好ましくは１１個までの領域をいう。なお、ＦＲＥＴのペアーとなる機能が保たれているか否かは、たとえば、公知の方法に従いＦＲＥＴのペアを形成すると想定される１対のタンパク質分子を共に大腸菌で生産し、当該１対のタンパク質を含む細胞抽出液において、当該タンパク質それぞれの想定される励起波長での蛍光強度を観察するという方法により評価することができる。
さらに、ＧＦＰアクセプタータンパク質および／またはＧＦＰドナータンパク質は変異を有していてもかまわない。かかる変異の導入は、ＦＲＥＴのペアーとなる機能が保たれている限り、ＧＦＰアクセプタータンパク質および／またはＧＦＰドナータンパク質のアミノ酸配列における任意の部位に対し行うことができる。たとえば、変異の態様としては複数のアミノ酸の置換が挙げられ、かかるアミノ酸置換の具体的態様としては、たとえば、Ｐｈｅ６４Ｌｅｕ、Ｖａｌ６８Ｌｅｕ、Ｓｅｒ７２Ａｌａ、Ｉｌｅ１６７Ｔｈｒなどが挙げられる。このような変異を導入することで発色団形成効率の上昇や、ＦＲＥＴ効率の上昇などの効果が得られるので好ましい。変異の導入は、公知の制限酵素を用いる方法や、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いる方法により行うことができる。
また、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質および／またはその標的タンパク質に変異を導入したものも本発明において好適に使用することができる。例えば点突然変異を導入することにより、グアニンヌクレオチド交換因子やＧＴＰアーゼ活性化因子に対する感受性を向上させたものを得ることができる。かかる変異の導入は、互いに結合する機能が保たれている限り、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質および／またはその標的タンパク質のアミノ酸配列における任意の部位に対し行うことができる。たとえば、変異の態様としてはアミノ酸の置換、挿入、欠失などが挙げられ、具体的には、たとえば、Ｈ−Ｒａｓのアミノ酸配列においてＩｌｅ３６をＬｅｕに変化させる態様（Ｉｌｅ３６Ｌｅｕ）が挙げられる。かかるＨ−Ｒａｓにおける変異により、当該Ｈ−Ｒａｓは、多数の変異の中でもＧＴＰアーゼ活性化因子に対し最も高い感受性を示すようになる。その結果、モニタータンパク質のダイナミックレンジを変化させることができる。かかる変異を有するＨ−Ｒａｓは、本発明のモニタータンパク質において好適に使用することができる。なお、変異の導入は、公知の制限酵素を用いる方法や、ＰＣＲを用いる方法により行うことができる。
本発明のモニタータンパク質においては、構成要素である各タンパク質の空間的な配置は、その機能発現に関連する因子である。かかる配置を変化させることによりＦＲＥＴ効率の差を非常に増大させることができる。たとえば、モニタータンパク質における各構成タンパク質間にスペーサーとなるペプチド配列を入れ、ＦＲＥＴ効率の差を調節することができる。かかるスペーサーは、ＦＲＥＴ効率の差を増大させる観点から、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と標的タンパク質との間に挿入することが好ましい。スペーサーとなるペプチド配列としては、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個の連続した任意のアミノ酸からなるペプチドを挙げることができる。かかるペプチドを低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と標的タンパク質との間に挿入した場合、ＦＲＥＴ効率の差が増大すること、ＧＦＰ関連タンパク質自身の折りたたみの効率が上昇することなどが期待できる。また、各構成タンパク質が、本発明のモニタータンパク質内において適切なコンフォメーションをとり得る観点から、好ましくはグリシンを主とする低分子で二次構造を形成しにくいという性質を有するアミノ酸からなるペプチドをスペーサーとして用いることが好ましい。
また、本発明のモニタータンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端および／またはカルボキシル末端に他のタンパク質あるいはペプチドを融合することも好ましい態様の１つである。特に、該モニタータンパク質に、細胞内局在シグナル、たとえば、公知の小胞体（ＥＲ）移行シグナル、細胞膜局在シグナルなどを付加することにより、細胞内の局所でのＧＴＰ結合タンパク質の活性化を直接測定することが可能となり好ましい。また、後述するように、細胞内の局所でのＧＴＰ結合タンパク質のＧＴＰ結合型とＧＤＰ結合型の量比（ＧＴＰ／ＧＤＰ比）（モル比）を直接測定することも可能となり好ましい。
本発明のモニタータンパク質では、ＧＴＰが結合し低分子量ＧＴＰ結合タンパク質が活性化された場合、該モニタータンパク質内で低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と標的タンパク質との結合が誘導され全体のコンフォメーションが変化することになり、ＧＦＰアクセプタータンパク質とＧＦＰドナータンパク質との距離と方向とが変化する。次いで、特定の波長の光を照射すると、かかるアクセプタータンパク質とドナータンパク質との間でＦＲＥＴ効率の増加が検出されるようになる（第２図）。このようなＦＲＥＴ効率の変化には、前記モニタータンパク質のコンフォメーション変化後におけるＧＦＰアクセプタータンパク質とＧＦＰドナータンパク質の配置が影響する。たとえば、ＧＦＰドナータンパク質とＧＦＰアクセプタータンパク質との距離が短くなるとＦＲＥＴ効率は増加し、距離が長くなるとＦＲＥＴ効率は減少する。ＦＲＥＴ効率の変化の幅、すなわち、ＦＲＥＴ効率の差の増減は、たとえば、用いる各構成タンパク質の性質により、スペーサーペプチド等の挿入により、所望により適宜調節することができる。
なお、上述する本発明のモニタータンパク質が本発明の所望の効果を発現し得るか否かについての評価は、たとえば、後述の実施例１に記載の方法に準じて評価することができる。
本発明はまた、本発明のモニタータンパク質をコードする遺伝子を提供する。かかる遺伝子は、該タンパク質の前記各構成タンパク質の遺伝子情報をＧｅｎＢａｎｋ等から入手し、公知のＰＣＲを用いた方法により、あるいは制限酵素とリガーゼとを用いた方法により常法に従って作製することができる。
本発明のモニタータンパク質の構成タンパク質として好適に用いられる各タンパク質のＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬにおけるアクセッション番号を以下に示す。なお、アクセッション番号は各タンパク質名の後の括弧内に示す。
（１）低分子量ＧＴＰ結合タンパク質
Ｈ−Ｒａｓ（Ｖ００５７４）、Ｋ−Ｒａｓ（Ｌ０００４５〜Ｌ０００４９）、Ｎ−Ｒａｓ（Ｌ０００４０〜Ｌ０００４３）、Ｒ−Ｒａｓ（Ｍ１４９４８，Ｍ１４９４９）、Ｒａｐ１Ａ（Ｘ１２５３３）、Ｒａｐ１Ｂ（Ｘ０８００４）、Ｒａｐ２Ａ（Ｘ１２５３４）、Ｒａｐ２Ｂ（Ｘ５２９８７）、ＲｈｏＡ（Ｌ２５０８０）、ＲｈｏＢ（Ｘ０６８２０）、ＲｈｏＣ（Ｘ０６８２１）、Ｒａｃ１（Ｍ２９８７０）、Ｒａｃ２（ＮＭ００２８７２）、Ｒａｃ３（ＮＭ００５０５２）、Ｃｄｃ４２（Ｍ５７２９８）
（２）標的タンパク質
Ｒａｆ（Ｘ０３４８４）、ＲａｌＧＤＳ（Ｕ１４４１７）、Ｐａｋ１（ＮＭ００２５７６）、ｍＤｉａ１（Ｅ１７３６１）
（３）ＧＦＰドナータンパク質とＧＦＰアクセプタータンパク質
ＥＧＦＰ（Ｕ７６５６１）、ＥＹＦＰ（ＡＶＵ７３９０１ １）、ＥＣＦＰ（ＡＢ０４１９０４）
なお、ＥＢＦＰ（ＧＦＰに以下の３つの変異を有するものである：Ｐｈｅ６４Ｌｅｕ、Ｔｙｒ６６Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１４５Ｐｈｅ）については文献６に記載されている。
本発明はさらに、前記遺伝子を含む発現ベクターを提供する。かかるベクターは、公知の方法に従い、本発明のモニタータンパク質をコードする遺伝子を公知の原核細胞発現ベクター、例えばｐＧＥＸ−２Ｔ（アマシャム−ファルマシア バイオテック社製）、真核細胞発現ベクター、例えばｐＣＡＧＧＳ（文献７）に、あるいはウイルスベクター、例えばｐＳｈｕｔｔｌｅ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）に挿入することにより得ることができる。発現ベクターとしては発現プラスミドが好ましい。
本発明はさらに、前記発現ベクターを保持する形質転換された細胞およびトランスジェニック動物を提供する。かかる細胞は、前記発現ベクターを対象とする細胞に導入することにより得られる。細胞への導入法としては公知のトランスフェクション法やウイルス感染法が使用でき特に制限はないが、たとえばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、あるいはエレクトロポレーション法等が使用できる。該細胞としては真核細胞あるいは原核細胞を用いることができ、特に制限はない。たとえば、真核細胞としては、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、サル腎臓由来ＣＯＳ細胞、ヒト臍帯由来ＨＵＶＥＣ細胞、酵母など、原核細胞としては、大腸菌など、培養細胞や、その他、各種細胞を使用できる。一方、前記発現ベクターを公知の方法、たとえば、マウス受精卵の核内にプラスミドＤＮＡをマイクロインジェクションする方法などにより、マウス等の個体に直接導入することでトランスジェニック動物を得ることができる。
本発明においてはさらに、本発明のモニタータンパク質を用いる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法を提供する。かかる方法によれば、本発明のモニタータンパク質におけるＦＲＥＴを検出することで低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定することができる。また、前記する本発明の形質転換された細胞またはトランスジェニック動物においてＦＲＥＴを検出し、当該細胞または動物における低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を直接測定することもできる。かかる場合、別途、ＧＴＰの結合した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質とＧＴＰからの無機リン酸の遊離によって生じるＧＤＰの結合した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質とを測定してＧＴＰ／ＧＤＰ比〔またはＧＴＰ／（ＧＤＰ＋ＧＴＰ）比〕（いずれもモル比）を算出し、さらに対応するＦＲＥＴ効率を測定して予め検量線を作成しておけば、当該細胞または動物におけるＦＲＥＴ効率に基づいて、ＧＴＰ／ＧＤＰ比を算出することができる。
たとえば、具体的には以下のような方法が例示される。
（１）分光光度計を用いた測定法
モニタータンパク質を発現し得る本発明の形質転換細胞を、当該タンパク質の発現が可能な条件下に培養する。次いで、当該細胞を可溶化する。細胞の可溶化の方法に特に制限はないが、界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ１００を含む溶液を用いて可溶化する方法が好ましい。可溶化した溶液に、ＧＦＰドナータンパク質に対する励起光（たとえば、波長４３３ｎｍ）を照射し、たとえば、波長４５０ｎｍから５５０ｎｍの範囲で蛍光プロフィールを公知の蛍光分光光度計を用いて測定する。得られた蛍光プロフィールのデータを基に、たとえば、波長４７５ｎｍにおけるＧＦＰドナータンパク質の蛍光強度と波長５３０ｎｍにおけるＧＦＰアクセプタータンパク質の蛍光強度との比〔（波長５３０ｎｍにおける蛍光強度）／（波長４７５ｎｍにおける蛍光強度）〕を算出し、それをＧＦＰドナータンパク質からＧＦＰアクセプタータンパク質へのＦＲＥＴ効率とする。ＧＴＰの低分子量ＧＴＰ結合タンパク質への結合前に比べ、結合後（すなわち、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化後）にＦＲＥＴ効率が上昇するため、それを指標として低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する。なお、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化と不活性化は、たとえば、前者については、グアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｓ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓ；文献９に記載）を本発明のモニタータンパク質を発現し得る細胞にトランスフェクトすることにより、また、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）による当該細胞の刺激により行うことが、後者については、たとえば、ＧＴＰ水解促進酵素Ｇａｐ１ｍ発現ベクター（ｐＥＦ−Ｂｏｓ−Ｇａｐ１ｍ；文献９に記載）を当該細胞にトランスフェクトすることにより行うことができる。一方、ＦＲＥＴ効率はＧＦＰドナータンパク質とＧＦＰアクセプタータンパク質との距離および方向の変化により生ずるため、ＦＲＥＴ効率の変化によりモニタータンパク質の構造変化をも検出することができる。
（２）顕微鏡を用いた測定法
モニタータンパク質を発現した本発明の形質転換細胞またはトランスジェニック動物を蛍光顕微鏡で観察し、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化前後に生ずるＦＲＥＴ効率の変化を直接的に検出する。なお、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化と不活性化は前記（１）分光光度計を用いた測定法の場合と同様にして行うことができる。
用いる蛍光顕微鏡には特に制限はないが、公知のキセノン光源を有する倒立型蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００）に回転式蛍光励起フィルターおよび回転式蛍光発光フィルターを備え、高感度冷却ＣＣＤカメラを備えたものが好ましい。さらにフィルターおよびカメラ画像は、日本ローパー社製Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ画像解析ソフトにて制御ならびに解析できるシステムが望ましい。
前記細胞または動物にＧＦＰドナータンパク質の励起光を照射し、ＧＦＰドナータンパク質の蛍光波長での画像をＣＣＤカメラにより撮影し、その後、ＧＦＰアクセプタータンパク質の蛍光波長での画像を撮影する。両画像の蛍光強度の比を測定することにより各測定点でのＦＲＥＴ効率を算出できる。また、たとえば、グアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｓ発現ベクターをモニタータンパク質を発現し得る細胞または動物に種々の量で導入して低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の種々の活性化状態（すなわち、活性化の程度が異なる状態）を構築する。次いで、各状態における細胞または動物を蛍光顕微鏡で観察し、前記と同様にしてＦＲＥＴ効率を求める。また、各状態における細胞（当該動物から得られた、ＦＲＥＴ効率を求めた部位に由来する細胞を含む）を可溶化し、別途、ＧＴＰの結合した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質とＧＤＰの結合した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質とを測定してＧＴＰ／ＧＤＰ比を算出する。詳しくは、公知の方法（文献２）により低分子量ＧＴＰ結合タンパク質へのＧＴＰ結合量およびＧＤＰ結合量を測定してＧＴＰ／ＧＤＰ比を求める。次いで、得られたＧＴＰ／ＧＤＰ比を、予め求めておいたＦＲＥＴ効率と関連付ける。すなわち、各状態での測定時点におけるＦＲＥＴ効率とＧＴＰ／ＧＤＰ比を測定し、それらを基に検量線を作成する。このようにして別途、検量線を作成しておけば、モニタータンパク質を発現した細胞または動物におけるＦＲＥＴ効率を蛍光顕徹鏡を用いて直接測定するだけで、各測定時点でのＦＲＥＴ効率からＧＴＰ／ＧＤＰ比を求めることが可能となる。従って、非侵襲的に細胞内または個体内における低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化状態を容易に把握することができ、しかも、かかる状態におけるＧＴＰ／ＧＤＰ比を具体的に得ることができる。なお、かかる検量線を用いる方法は、前記（１）の方法においても同様に使用することができる。
本発明によれば、非侵襲的な低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定を可能にする低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質、その遺伝子等が提供される。また、かかるモニタータンパク質を発現し、非侵襲的な低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定に有用な前記発現ベクターを保持する形質転換された細胞およびトランスジェニック動物、ならびに前記タンパク質を用いる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法が提供される。従って、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化状態を細胞内または個体内で非侵襲的に知ることが可能となり、生命現象の理解のみならず、薬剤開発（たとえば、癌、自己免疫疾患、アレルギー性疾患等の治療剤または予防剤）において多大な利益をもたらし得る。
さらに本発明の別の態様として、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。すなわち、
（ａ）低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質を発現する、当該タンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを保持する形質転換された細胞と被検物質とを接触させる工程、ならびに
（ｂ）低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性の変化を検出する工程、
を含む、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法によれば、本発明の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質を発現する細胞を構築し、バイオアッセイ系を用いることによって、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を変化させる物質またはその塩（すなわち、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質）を効率よくスクリーニングすることができる。当該方法における被検物質としては特に限定されるものではないが、たとえば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性物質、合成物質、発酵生産物等を挙げることができる。
本発明のスクリーニング方法は、（ｉ）低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性化物質の存在下、あるいは（ｉｉ）当該活性化物質の非存在下において行うことができる。なお、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質活性化物質とは、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質を活性化する物質であり、たとえば、上皮細胞増殖因子等の細胞増殖因子、インターロイキン等のサイトカイン類を挙げることができ、またこれらに限定されない。低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質は、（ｉ）の場合、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を増強あるいは減少させる物質として、（ｉｉ）の場合、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を増強させる物質としてスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のスクリーニング方法は、前記活性化物質の存在下または非存在下に、工程（ａ）において、本発明の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質を発現する細胞と被検物質とを接触させる（態様１）。接触させる方法は特に限定されるものではなく、たとえば、被検物質の存在下に当該細胞を培養することにより行うことができる。また、平行して、対照として、同条件下、本発明の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質を発現する細胞と被検物質とを接触させない場合（態様２）を行う。次いで、工程（ｂ）において、それぞれの場合における低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を測定し、態様２と比較した態様１における低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性の変化を検出することにより低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニングを行う。なお、当該活性の測定は、各々の場合におけるＦＲＥＴ効率を測定することにより行なうことができる。
すなわち、前記（ｉ）の場合に、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性をより増強する物質は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を増強し得る活性調節物質であり、逆に当該活性を減少する物質は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を減少し得る活性調節物質である。また、前記（ｉｉ）の場合に、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を増強する物質は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性を増強し得る活性調節物質である。
以上の方法により、簡便かつ迅速に低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質を得ることができる
参照文献
以下に、本明細書において記載する参照文献を列挙する。かかる参照文献は参照により、その全教示が本明細書中に取り込まれる。なお、本明細書中では〔文献（数字）〕として参照する各文献の文献番号を示す。
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６．Ｍｉｙａｗａｋｉ，Ａ．，Ｊ．Ｌｌｏｐｉｓ，Ｒ．Ｈｅｉｍ，Ｊ．Ｍ．ＭｃＣａｆｆｅｒｙ，Ｊ．Ａ．Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｉｋｕｒａ，ａｎｄ Ｒ．Ｙ．Ｔｓｉｅｎ．１９９７．「グリーンフルオレセントプロテインとカルモジュリンに基づくＣａ２＋の蛍光インディケーター（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａ２＋ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）Ｎａｔｕｒｅ ３８８：８８２−８８７．
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１０．Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｓ．，Ｎ．Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，Ｙ．Ｏｈｂａ，Ｍ．Ｔｏｂｉｕｍｅ，Ｙ．Ｏｋａｄａ，Ｈ．Ｓａｗａ，Ｋ．Ｎａｇａｓｈｉｍａ，ａｎｄ Ｍ．Ｍａｔｓｕｄａ．「ＧａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩＩによるＲａｓ、Ｒ−Ｒａｓ、Ｒａｐ１の活性化（ＧａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩＩ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｓ，Ｒ−Ｒａｓ，ａｎｄ Ｒａｐ１．）」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２５４８８−２５４９３，２０００．
１１．Ｔ．Ｇｏｔｏｈ，Ｓ．Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｓ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．Ｋｉｔａｙａｍａ，Ｍ．Ｎｏｄａ，Ｙ．Ｔａｋａｉ，Ｋ．Ｋａｉｂｕｃｈｉ，Ｈ．Ｍａｔｓｕｉ，Ｏ．Ｈａｔａｓｅ，Ｈ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｔ．Ｋｕｒａｔａ，ａｎｄ Ｍ．Ｍａｔｓｕｄａ．「Ｃｒｋ ＳＨ３ドメインバインディンググアニンヌクレオチドリリーシングファクター、Ｃ３ＧのターゲットとしてのＲａｐ１の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｐ１ ａｓ ａ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ｃｒｋ ＳＨ３ ｄｏｍａｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ，Ｃ３Ｇ）」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：６７４６−６７５３，１９９５．
実施例
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明の範囲はかかる実施例のみに限定されるものではない。なお、以下においては、ヒトＨ−ＲａｓをＲａｓと、ヒトｃ−Ｒａｆ１をＲａｆと、ヒトＲａｐ１ＡをＲａｐ１Ａと、ヒトＲａｌＧＤＳをＲａｌＧＤＳと、ヒトＲ−ＲａｓをＲ−Ｒａｓという。また、ヒトＲａｃ１をＲａｃ１と、ヒトＣｄｃ４２をＣｄｃ４２と、ヒトＲｈｏＡをＲｈｏＡと、ヒトＰａｋ１をＰａｋ１と、ヒトｍＤｉａｌをｍＤｉａｌという。
実施例１ Ｒａｆｒａｓ１７２２によるＲａｓ活性化の測定
（１）ＲａｓとＲａｆをコードするキメラ遺伝子の作成
（ｉ）Ｒａｓ遺伝子の増幅
ＲａｓのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｖ００５７４）を鋳型として、センスプライマーｈＲａｓＸｈ（５’−ＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＣＧＧＡＡＴＡＴＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧ−３’）（配列番号：１）およびアンチセンスプライマーＲａｓ１７２Ｒａｆ（５’−ＡＧＴＧＴＴＧＣＴＴＧＴＣＴＴＡＧＡＡＧＧＧＧＴＡＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＴＧＴＧ−３’）（配列番号：２）と、耐熱性ＤＮＡ複製酵素Ｐｆｘ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｕ．Ｓ．Ａ）とを用い、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法によりＲａｓの１位から１７２位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分を増幅した。
センスプライマーｈＲａｓＸｈは、５’末端の下線で示した制限酵素ＸｈｏＩの切断部位の塩基配列とＲａｓの１位から８位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマーＲａｓ１７２Ｒａｆは、５’末端より、ＲａｆのＲａｓ結合領域のアミノ酸配列のアミノ末端領域（６１位から６７位まで）に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列、スペーサー配列（下線部）、Ｒａｓの１６６位から１７２位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列とからなる。
（ｉｉ）Ｒａｆ遺伝子の増輻
ＲａｆのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｘ０３４８４）を鋳型として、センスプライマーＲａｆＲＢＤ−Ｆ１（５’−ＧＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＴＡＡＧＡＣＡＡＧＣＡＡＣＡＣＴ−３’）（配列番号：３）およびアンチセンスプライマーＲａｆＲＢＤｎ２（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＧＧＡＡＡＴＣＴＡＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣ−３’）（配列番号：４）と前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲａｆの５１位から１３１位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分を増幅した。
センスプライマーＲａｆＲＢＤ−Ｆ１は、５’末端の下線で示した制限酵素ＫｐｎＩの切断部位の塩基配列とＲａｆの５１位から５７位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマーＲａｆＲＢＤｎ２は、５’末端の下線で示した制限酵素ＮｏｔＩの切断部位の塩基配列とＲａｆのＲａｓ結合領域のアミノ酸配列のカルボキシル末端領域（１２５位から１３１位まで）に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列とからなる。
（ｉｉｉ）ＲａｓとＲａｆをコードするキメラ遺伝子の増幅
前記（ｉ）および（ｉｉ）で増幅された遺伝子を混合したものを鋳型として、センスプライマーｈＲａｓＸｈおよびアンチセンスプライマーＲａｆＲＢＤｎ２と前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲａｓとＲａｆをコードするキメラ遺伝子からなるｃＤＮＡを増幅した。次いで、得られたＤＮＡ断片をｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にライゲーションし、得られたプラスミド構築物で大腸菌を形質転換した。かかる大腸菌を培養後、公知のアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを精製した。
（２）ＥＹＦＰおよびＥＣＦＰを発現するベクターｐＦｒｅｔ２の構築
（ｉ）ｐＣＡＧＧＳ−Ｐ７の構築
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫＩＩ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のマルティプルクローニングサイトをプライマーＰ７（５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ−３’）（配列番号：５）とプライマーＰ８（５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣ−３’）（配列番号：６）とを用い、前記と同様にしてＰＣＲ法により増幅し、ＤＮＡ断片を得た。
一方、哺乳類細胞発現ベクターｐＣＡＧＧＳ（文献７）をＥｃｏＲＩで切断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端化処理した。次いで、前記ＤＮＡ断片と前記処理後のｐＣＡＧＧＳとをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。得られたベクターをｐＣＡＧＧＳ−Ｐ７と呼ぶ。
（ｉｉ）ＥＹＦＰ遺伝子の増幅
本実施例においては、公知のＥＧＦＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｕ７６５６１）に対し、ＰＣＲ法を用いる公知の方法により６つのアミノ酸置換（Ｌｅｕ６５Ｐｈｅ；Ｔｈｒ６６Ｇｌｙ；Ｖａｌ６９Ｌｅｕ；Ｇｌｎ７０Ｌｙｓ；Ｓｅｒ７３Ａｌａ；Ｔｈｒ２０４Ｔｙｒ）を導入したものをＥＹＦＰとして用いた。このＥＹＦＰのｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーＧＦＰ−Ｎ２（５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ−３’）（配列番号：７）およびアンチセンスプライマーＧＦＰ−Ｎ３（５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧ−３’）（配列番号：８）と前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＥＹＦＰの全長アミノ酸配列に対応するｃＤＮＡを増幅した。
センスプライマーＧＦＰ−Ｎ２は、５’末端の下線で示した制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位の塩基配列と３塩基のスペーサーとＥＹＦＰの１位から７位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマーＧＦＰ−Ｎ３は、５’末端の下線で示した制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩの各々の切断部位の塩基配列と後述のＥＣＦＰのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域（２３３位から２３９位まで）に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列とからなる。
（ｉｉｉ）ＥＣＦＰ遺伝子の増幅
本実施例においては、ＥＧＦＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｕ７６５６１）に対し、ＰＣＲ法を用いる公知の方法により４つのアミノ酸置換（Ｔｙｒ６７Ｔｒｐ；Ａｓｎ１４７Ｉｌｅ；Ｍｅｔ１５４Ｔｈｒ；Ｖａｌ１６４Ａｌａ）を導入したものをＥＣＦＰとして用いた。このＥＣＦＰのｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーＸＦＰＮｏｔ２（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣ−３’）（配列番号：９）およびアンチセンスプライマーＸＦＰ−Ｂｇｌ（５’−ＡＧＡＴＣＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＧＡＧＡＧ−３’）（配列番号：１０）と前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＥＣＦＰの全長アミノ酸配列に対応するｃＤＮＡを増幅した。
センスプライマーＸＦＰＮｏｔ２は、５’末端の下線で示した制限酵素ＮｏｔＩの切断部位の塩基配列とＥＣＦＰの１位から８位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマーＸＦＰ−Ｂｇｌは、５’末端の下線で示した制限酵素ＢｇｌＩＩの切断部位の塩基配列とＥＣＦＰのアミノ酸配列のカルボキシル末端領域（２３１位から２３７位まで）に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列とからなる。
（ｉｖ）ｐＦｒｅｔ２の構築
前記（ｉ）で得られたｐＣＡＧＧＳ−Ｐ７を制限酵素ＸｈｏＩで切断し、ｄＴＴＰとｄＣＴＰの存在下にＫｌｅｎｏｗ酵素で処理した。また、前記（ｉｉ）で得られたＥＹＦＰのＤＮＡ断片をＢａｍＨＩで切断し、次いでｄＧＴＰとｄＡＴＰの存在下にＫｌｅｎｏｗ酵素で処理した。得られた二つの遺伝子断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、プラスミドを得た。該プラスミドをＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで切断し、次いで、ＮｏｔＩとＢｇｌＩＩで予め切断しておいた前記（ｉｉｉ）で得られたＥＣＦＰのＤＮＡ断片と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。得られたプラスミドをｐＦｒｅｔ２と命名した。
（３）Ｒａｓ活性モニタータンパク質遺伝子の発現プラスミドであるｐＲａｆｒａｓ１７２２の構築
前記（２）−（ｉｖ）で得られたｐＦｒｅｔ２をＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断し、次いで、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで予め切断しておいた前記（１）−（ｉｉｉ）で得られたキメラ遺伝子と、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて結合した。得られたプラスミドをｐＲａｆｒａｓ１７２２と呼ぶ。ｐＲａｆｒａｓ１７２２の構造、その翻訳領域の塩基配列（配列番号：１１）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：１２）を第３図と第４図〜第６図にそれぞれ示す。
かかる塩基配列および予測されるアミノ酸配列を説明する：
ｎｔ １−７１７ ：オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）のＥＹＦＰ
ｎｔ ７１８−７２３ ：リンカー
ｎｔ ７２４−１２３９ ：Ｒａｓ
ｎｔ １２４０−１２５ ：リンカー
ｎｔ １２５８−１５００：Ｒａｆ
ｎｔ １５０１−１５０９：リンカー
ｎｔ １５１０−２２２０：オワンクラゲのＥＣＦＰ
（４）哺乳類細胞でのＲａｓ活性モニタータンパク質（Ｒａｆｒａｓ１７２２）の発現と分光光度法による解析
ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地（日本製薬社製）で培養した。該ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に前記（３）で得られたｐＲａｆｒａｓ１７２２とグアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｓ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓ）またはＧＴＰ水解促進酵素Ｇａｐ１ｍ発現ベクター（ｐＥＦ−Ｂｏｓ−Ｇａｐ１ｍ）をリン酸カルシウム法にてトランスフェクトした。トランスフェクト後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）で培養し、Ｒａｓ活性モニタータンパク質を発現させた。４８時間培養後に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水にて洗浄し、溶解液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）にて溶解した。得られた細胞溶解液を１０，０００×ｇで遠心分離後、上清を回収した。
該上清を蛍光分光光度計（日本分光社製、ＦＰ−７５０）の１ｍｌキュベットに入れ、励起波長４３３ｎｍにて、４５０ｎｍから５５０ｎｍまでの蛍光強度を測定した。得られた蛍光プロフィールを第７図に示す。
なお、前記トランスフェクト後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３２Ｐｉ無機リン酸で標識した後に該細胞の溶解液を得、抗ＧＦＰ抗体を用い、発現させたＲａｓ活性モニタータンパク質を免疫沈降し、結合しているＧＴＰおよびＧＤＰを薄層クロマトグラフィーにて分離することにより、Ｒａｓ活性モニタータンパク質について得られた蛍光プロフィールのデータから得られるＦＲＥＴ効率〔波長４３３ｎｍで励起したときの、（波長５３０ｎｍにおける蛍光強度）を（波長４７５ｎｍにおける蛍光強度）で割った値〕と実際のＧＴＰ結合の程度とを対応付けることが可能である（第８図）。なお、第８図中、ＦＲＥＴ効率は「蛍光強度比（波長５３０／４７５）」と、ＧＴＰ結合の程度は「ＧＴＰ／（ＧＤＰ＋ＧＴＰ）（％）」として示した。
（５）哺乳類細胞でのＲａｓ活性モニタータンパク質の発現とタイムラプス蛍光顕微鏡による解析
サル腎臓由来ＣＯＳ７細胞は１０％ウシ胎仔血清を含むフェノールレッド不含ＭＥＭ培地（日本製薬社製）で培養した。該ＣＯＳ７細胞に前記（３）で得られたｐＲａｆｒａｓ１７２２をリン酸カルシウム法にてトランスフェクトした。トランスフェクト後のＣＯＳ７細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むフェノールレッド不含ＭＥＭ培地（日水製薬社製）で培養し、Ｒａｓ活性モニタータンパク質を発現させた。トランスフェクションの４８時間後に、培養細胞をタイムラプス蛍光顕微鏡による観察に供した。
かかる顕微鏡は、回転式蛍光励起フィルター装置および回転式蛍光発光フィルター装置（ＬＵＤＬ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ社製）を備え、さらに高感度冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｘ社製、Ｍｉｃｒｏｍａｘ４５０）を備えた、キセノン光源を有する倒立型蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製、Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００）であり、観察の際は、該顕微鏡の制御ならびに観察結果の解析を日本ローパー社製メタモルフ（Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ）画像解析ソフトにより行うシステムを用いた。蛍光励起フィルター、蛍光発光フィルター、ダイクロイックミラーはオメガ社より購入した。
前記培養細胞に４３３ｎｍの励起光を照射し、４７５ｎｍのＥＣＦＰドナーの蛍光波長での画像をＣＣＤカメラにより撮影し、次いで、５３０ｎｍのＥＹＦＰアクセプターの蛍光波長での画像を撮影した。両画像データをもとに両者の蛍光強度の比を求めることにより各測定点でのＦＲＥＴ効率を計算した。
実施例２ Ｒａｓ活性を簡便に測定するための培養細胞株の取得
マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３細胞は１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）で培養した。かかるＮＩＨ３Ｔ３細胞に、実施例１で得られたｐＲａｆｒａｓ１７２２とＧ４１８耐性遺伝子を含むベクターｐＳＶ２ｎｅｏ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ：Ｕ０２４３４）とを、ＦｕＧｅｎｅ６（日本ロッシュ社製）を用いて共トランスフェクトした。該細胞を前記培地にて培養し、４８時間培養後に１：１０の希釈率で播きなおし、Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を０．５ｍｇ／ｍｌになるように培地中に添加した。培地は３日に一度交換した。培養２週間後、よく分離したコロニーをクローニングし、３Ｔ３−Ｒａｆｒａｓ細胞と命名した。
かかる３Ｔ３−Ｒａｆｒａｓ細胞を１０％ウシ胎仔血清と０．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８とを含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）で培養し、Ｒａｓ活性モニタータンパク質を発現させた。次いで、かかるタンパク質の発現を抗Ｒａｓ抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂ社）を用いた通常のイムノブロッティング法にて解析した。その結果、約８０ｋＤａのタンパク質の発現が認められた（第９図）。
さらに、かかる細胞を上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）（Ｓｉｇｍａ社製）で刺激し、実施例１の（４）に記載の方法によりＦＲＥＴ効率を求め、ＥＧＦ刺激前後で比較した。ＥＧＦ添加前後における蛍光プロフィールを第１０図に示す。
実施例３ Ｒａｉ−ｃｈｕ３１１によるＲａｐ１Ａ活性化の測定
（１）Ｒａｐ１ＡとＲａｌＧＤＳをコードするキメラ遺伝子の作成
（ｉ）Ｒａｐ１Ａ遺伝子の増幅
Ｒａｐ１ＡのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｘ１２５３３）を鋳型として、センスプライマーｈＲａｐ１Ｘｈ（５’−ＧＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＧＴＧＡＧＴＡＣＡＡＧＣＴＡＧＴＧＧ−３’）（配列番号：１３）およびアンチセンスプライマーＲａｐ１７２ＲａｌＧＤＳ（５’−ＧＣＧＧＡＴＧＡＴＡＣＡＧＣＡＧＴＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＧＧＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＴＴＧＡＴＣＴＴＴＧＡＣＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧ−３’）（配列番号：１４）と、前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲａｐ１Ａの１位から１７２位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分を増幅した。
センスプライマーｈＲａｐ１Ｘｈは、５’末端の下線で示した制限酵素ＸｈｏＩの切断部位の塩基配列とＲａｐ１Ａの１位から８位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマーＲａｐ１７２ＲａｌＧＤＳは、５’末端より、ＲａｌＧＤＳ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｕ１４４１７）のＲａｐ１Ａ結合領域のアミノ酸配列のアミノ末端領域（２１１位から２１７位まで）に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列、スペーサー配列（下線部）、Ｒａｐ１Ａの１６６位から１７２位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列とからなる。
（ｉｉ）ＲａｌＧＤＳ遺伝子の増幅
ＲａｌＧＤＳのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｕ１４４１７）を鋳型として、センスプライマーＲａｌＧＤＳ−Ｆ（５’−ＧＧＣＧＡＣＴＧＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣＣＧＣ−３’）（配列番号：１５）およびアンチセンスプライマーＲａｌＧＤＳＲ（５’−ＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＴＴＧＡＧＧＡＣＡＡＡＧＴＣ−３’）（配列番号：１６）と前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲａｌＧＤＳのｃＤＮＡを増幅した。
センスプライマーＲａｌＧＤＳ−Ｆは、ＲａｌＧＤＳのｃＤＮＡのＲａｐ１Ａ結合領域のアミノ酸配列のアミノ末端領域（２１１位から２１７位まで）に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列を有する。一方、アンチセンスプライマーＲａｌＧＤＳＲは、５’末端の下線で示した制限酵素ＮｏｔＩの切断部位の塩基配列とＲａｌＧＤＳのＲａｐ１Ａ結合領域のアミノ酸配列のカルボキシル末端領域（２９１位から２９７位まで）に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列の相補鎖の塩基配列とからなる。
（ｉｉｉ）Ｒａｐ１ＡとＲａｌＧＤＳをコードするキメラ遺伝子の増幅
前記（ｉ）および（ｉｉ）で増幅された遺伝子を混合したものを鋳型として、センスプライマーｈＲａｐ１ＸｈおよびアンチセンスプライマーＲａｌＧＤＳＲとＰｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲａｐ１ＡとＲａｌＧＤＳをコードするキメラ遺伝子からなるｃＤＮＡを増幅した。次いで、得られたＤＮＡ断片をｐＣＲ−ｂｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯにライゲーションし、得られたプラスミド構築物で大腸菌を形質転換した。かかる大腸菌を培養後、公知のアルカリＳＤＳ法によりプラスミドを精製した。
（２）Ｒａｐ１Ａ活性モニタータンパク質遺伝子の発現プラスミドであるｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１の構築
実施例１の（２）の（ｉｉ）において、アンチセンスプライマーＧＦＰ−Ｎ３に換えてアンチセンスプライマーＧＦＰ−ｄ１１Ｒ（５’−ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＴＣＧＡＧＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧ−３’）（配列番号：１７）を用い同様の操作を行い、ＥＣＦＰと、そのアミノ酸配列のカルボキシル末端のアミノ酸が１１個欠損したＥＹＦＰとをコードするｃＤＮＡを含むベクターを作成した。かかるベクターをＸｈｏＩとＮｏｔＩで切断した。次いで、該ベクターと、ＸｈｏＩとＮｏｔＩで予め切断しておいた前記（１）で得られたキメラ遺伝子とをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。得られたプラスミドをｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１と命名した。得られたプラスミドの構造ならびに、その翻訳領域の塩基配列（配列番号：１８）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：１９）を第１１図と第１２図〜第１４図にそれぞれ示す。
かかる塩基配列および予測されるアミノ酸配列を説明する：
ｎｔ １−６８４ ：オワンクラゲのＥＹＦＰ
ｎｔ ６８５−６９０ ：リンカー
ｎｔ ６９１−１２０６ ：Ｒａｐ１Ａ
ｎｔ １２０７−１２５７：リンカー
ｎｔ １２５８−１５１５：ＲａｌＧＤＳ
ｎｔ １５１６−１５２１：リンカー
ｎｔ １５２２−２２３５：オワンクラゲのＥＣＦＰ
（３）哺乳類細胞で、のＲａｐ１Ａ活性モニタータンパク質（Ｒａｉ−ｃｈｕ３１１）の発現と分光光度法による解析
実施例１の（４）に記載の方法により解析を行った。得られた蛍光プロフィールを第１５図に示す。
実施例４ Ｒａｉ−ｃｈｕ１５８によるＲ−Ｒａｓ活性化の測定
（１）ｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８の構築
（ｉ）Ｒ−Ｒａｓ遺伝子の増幅
Ｒ−ＲａｓのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｍ１４９４８，Ｍ１４９４９）を鋳型として、センスプライマーＲＲａｓ２８Ｆ（５’−ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＡＣＡＣＡＣＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣ−３’）（配列番号：２０）およびアンチセンスプライマーＲＲａｓ２０４Ｒ（５’−ＧＣＣＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＣＴＧＧＧＡＧＧＧＣＴＣＧＧＴＧＧＧＡＧ−３’）（配列番号：２１）と、前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲ−Ｒａｓの２８位から２０４位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分を増幅した。
センスプライマーＲＲａｓ２８Ｆは、５’末端の下線で示した制限酵素ＸｈｏＩの切断部位の塩基配列とＲ−Ｒａｓの２８位から３３位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の塩基配列とからなる。一方、アンチセンスプライマーＲＲａｓ２０４Ｒは、５’末端より、ＫｐｎＩ切断部位を含むスペーサー配列（下線部）、Ｒ−Ｒａｓの１９８位から２０４位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の相補鎖の塩基配列とからなる。
（ｉｉ）制限酵素断片の作製
前記（ｉ）で得られたＰＣＲ産物をＸｈｏＩとＫｐｎＩとで切断した。
（ｉｉｉ）Ｒ−Ｒａｓ活性モニタータンパク質遺伝子の発現プラスミドであるｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８の構築
実施例１で得られたｐＲａｆｒａｓ１７２２をＸｈｏＩで完全消化したのち、ＫｐｎＩで部分消化し、Ｒａｓ部分を除去したＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ断片と前記（ｉｉ）で得られたＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。得られたプラスミドをｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８と命名した。該プラスミドの構造ならびに、その翻訳領域における塩基配列（配列番号：２２）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：２３）を第１６図と第１７図〜第１９図にそれぞれ示す。
かかる塩基配列および予測されるアミノ酸配列を説明する：
ｎｔ １−７１７ ：オワンクラゲのＥＹＦＰ
ｎｔ ７１８−７２３ ：リンカー
ｎｔ ７２４−１２５１ ：Ｒ−Ｒａｓ
ｎｔ １２５２−１２５７：リンカー
ｎｔ １２５８−１５００：Ｒａｆ
ｎｔ １５０１−１５０９：リンカー
ｎｔ １５１０−２２２０：オワンクラゲのＥＣＦＰ
（２）哺乳類細胞でのＲ−Ｒａｓ活性モニタータンパク質（Ｒａｉ−ｃｈｕ１５８）の発現と分光光度法による解析
実施例１の（４）に記載の方法により解析を行った。得られた蛍光プロフィールを第２０図に示す。
実施例５ Ｒａｓの標的タンパク質結合ドメインに温度感受性変異を有するモニタータンパク質をコードする遺伝子の構築
（１）ｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９の構築
（ｉ）変異を有するＲａｓ遺伝子の増幅
実施例１にて用いたＲａｓのｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーｈＲａｓＸｈ（実施例１にて使用）とアンチセンスプライマーＲａｓＩ３６ＬＲ（５’−ＧＧＡＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＧＧＴＣＧ−３’）（配列番号：２４）と前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲａｓの１位から３９位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分を増幅した。
アンチセンスプライマーＲａｓＩ３６ＬＲは、Ｒａｓの３５位から４２位のアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ部分の配列を有し、下線で示した部分にＩｌｅのＬｅｕへの点突然変異を有している。この変異はＲａｓの活性を温度感受性にすることが知られている（文献８）。
同様に、ＲａｓのｃＤＮＡを鋳型として、センスプライマーＲａｓＩ３６ＬＦ（５’−ＣＧＡＣＣＣＣＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＣＣ−３’）（配列番号：２５）とアンチセンスプライマーＲａｓ１７２Ｒａｆ（実施例１にて使用）と前記Ｐｆｘとを用い、ＰＣＲ法によりＲａｓのアミノ酸配列の３２位から１７２位に対応するｃＤＮＡ部分を増幅した。
得られた２つのＤＮＡ断片を混合し、センスプライマーｈＲａｓＸｈとアンチセンスプライマーＲａｓ１７２Ｒａｆとを用い、前記と同様にしてＰＣＲを行い、Ｒａｓのアミノ酸配列の１位から１７２位に対応し、かつＩｌｅ３６のＬｅｕへの点突然変異を含むＤＮＡを増幅した。
（ｉｉ）制限酵素断片の作製
上記ＰＣＲ産物をＸｈｏＩとＫｐｎＩとで切断した。
（ｉｉｉ）実施例１で得られたｐＲａｆｒａｓ１７２２をＸｈｏＩで完全消化したのち、ＫｐｎＩで部分消化し、Ｒａｓの部分を除去したＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡ断片と前記（ｉｉ）で得られたＤＮＡ断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合した。得られたプラスミドをｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９と命名した。該プラスミドの翻訳領域における塩基配列（配列番号：２６）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：２７）を第２１図〜第２３図にそれぞれ示す。
（２）哺乳類細胞でのモニタータンパク質（Ｒａｉ−ｃｈｕ１１９）の発現と分光光度法による解析
ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）で培養した。該ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、実施例１において作成したｐＲａｆｒａｓ１７２２またはｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９と、グアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｓ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓ）とをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトした。前記同培地にて２４時間培養後に３３℃および４０℃のインキュベータに移し、さらに２４時間、培養した。該細胞をリン酸緩衝生理食塩水にて洗浄した後、溶解液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，５ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）にて溶解した。得られた細胞溶解液を１０，０００×ｇで遠心分離し上清を回収した。
該上清を蛍光分光光度計（日本分光社製、ＦＰ−７５０）の１ｍｌキュベットに入れ、励起波長４３３ｎｍにて、４５０ｎｍから５５０ｎｍまでの蛍光強度を測定した。得られた蛍光プロフィールを第２４図に示す。
実施例６ Ｒａｆｒａｓ１７２２を発現するトランスジェニックマウスの作成およびこのマウスの心筋培養細胞におけるＲａｓ活性化の測定
（１）実施例１で得られたｐＲａｆｒａｓ１７２２を制限酵素ＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、これをアガロース電気泳動にかけ、約４．５ｋｂのプロモーター、イントロン、コーディング配列、ポリＡ付加シグナルを含む領域のＤＮＡ断片を得た。該ＤＮＡは電気溶出法にてゲルより取り出した後、Ｑｉａｇｅｎ２０チップ（キアゲン社）を用いて精製した。このＤＮＡを定法に従い、マウス受精卵（ＤＢＦ１、日本エスエルシー社）の前核に注入し、偽妊娠させたＩＣＲマウス（日本エスエルシー社）の卵管内に移植した。得られたマウスの離乳後、尾を１ｃｍ切断し、プロテイナーゼＫを含むＤＮＡ抽出液（ＡＢＩ社）中で３７℃にて一晩維持し、ここから、フェノールおよびフェノールクロロホルムにてタンパク質を除いた後に、等量のイソプロパノールを加えて、析出したＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを水にいれ、３７℃で溶解させた。
（２）このマウスＤＮＡを鋳型にして、センスプライマーＲａｆＲＢＤｘ（５’−ＣＴＣＧＡＧＣＣＴＴＣＴＡＡＧＡＣＡＡＧＣＡＡＣＡＣＴ−３’）（配列番号：２８）とアンチセンスプライマーＸＦＰＮｓｅｑ（５’−ＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＣＴＣＧＡＣＣＡＧ−３’）（配列番号：２９）とを用い、ＰＣＲ法にてＤＮＡを増幅した。このプライマーにより、Ｒａｆｒａｓ１７２２遺伝子のうちのＲａｆ遺伝子とＥＣＦＰ遺伝子の連結領域に相当するＤＮＡが増幅できる。予期される３１４ｂｐのバンドが現れるものを、Ｒａｆｒａｓ１７２２のＤＮＡの組み込みがあると判定した。３５匹の仔マウスのうち７匹にこのバンドが確認できた。
（３）つぎに、このＦ１マウスをＣ５７／Ｂｌａｃｋマウス（日本エスエルシー社）と交配させた。Ｆ２のマウス新生児（０日齢）より、心室をとり、眼科用ハサミで細切した。ここに、０．０５％トリプシンと０．５ｍＭ ＥＤＴＡとを含むＰＢＳを加え、３７℃で細胞を１０分間処理し、剥離してきた心筋細胞を回収した。この操作を６回繰り返し、心筋細胞を集めた。ここに、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ培地を加え、低速遠心にて心筋細胞を沈殿させ、上清を捨てた。回収した心筋細胞養１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭで培養した。
（４）得られた心筋細胞をガラス底の培養皿（φ３５ｍｍ）に移して底面に付着させ、無血清培地（日本製薬製）中で６時間培養を行った。次いで、当該心筋培養細胞にＥＧＦを１００ｎｇ／ｍｌ添加し、実施例１の（５）に記載の蛍光顕微鏡システムで観察した。ＥＧＦ添加による細胞内におけるＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光強度の経時的変化の結果を第２５図に示す。トランスジェニックマウス由来の初代培養細胞でもＥＧＦ依存的にＲａｓの活性化が測定できることを確認した。
実施例７ Ｒａｆｒａｓ１７２２のグアニンヌクレオチド交換因子およびＧＴＰ水解促進酵素に対する特異性
実施例１の（４）の実験において、グアニンヌクレオチド交換因子およびＧＴＰ水解促進酵素を多数の種類を用いてＲａｆｒａｓ１７２２の特異性を検討した。ＧＴＰ水解促進酵素およびグアニンヌクレオチド交換因子としては、（文献９）に記載のＧＡＰ１ｍ、Ｒ−ＲａｓＧＡＰ、ｒａｐ１ＧＡＰＩＩ、ｍＳｏｓ１、ＲａｓＧＲＦ、ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩ、Ｃ３Ｇ、ＰＤＺ−ＧＥＦ１、ＫＩＡＡ０３５１の発現ベクターを用いた。第２６図に示す如く、Ｒａｓに対するＧＴＰ水解促進酵素であるＧＡＰ１ｍによりＦＲＥＴ効率の低下が認められるが、Ｒ−ＲａｓやＲａｐ１に対するＧＴＰ水解促進酵素であるＲ−ＲａｓＧＡＰやｒａｐ１ＧＡＰＩＩによってはＦＲＥＴ効率は低下しない。また、ｍＳｏｓ１、ＲａｓＧＲＦ、ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩといったＲａｓに対するグアニンヌクレオチド交換因子によりＦＲＥＴ効率は上昇するが、ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩ、Ｃ３Ｇ、ＰＤＺ−ＧＥＦ１、ＫＩＡＡ０３５１といった他のＲａｓファミリーＧタンパク質を基質とするグアニンヌクレオチド交換因子によってはＦＲＥＴ効率は上昇しなかった。これは、Ｒａｆｒａｓ１７２２がＲａｓと同じグアニンヌクレオチド交換因子およびＧＴＰ水解促進酵素によってそのＦＲＥＴ効率が特異的に制御されていることを示している。
実施例８ Ｒａｐ １モニターであるＲａｉ−ｃｈｕ４０４の作成とそのグアニンヌクレオチド交換因子およびＧＴＰ水解促進酵素に対する特異性
（１） Ｒａｐ１ＡとＲａｆをコードするキメラ遺伝子Ｒａｉ−ｃｈｕ４０４の作成
公知のＥＧＦＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｕ７６５６１）に対し、ＰＣＲ法を用いる公知の方法により７つのアミノ酸置換（Ｔｈｒ６６Ｇｌｙ；Ｖａｌ６９Ｌｅｕ；Ｓｅｒ７３Ａｌａ；Ｍｅｔ１５４Ｔｈｒ；Ｖａｌ１６４Ａｌａ；Ｓｅｒ１７６Ｇｌｙ；Ｔｈｒ２０４Ｔｙｒ）をいれたものを、実施例３に記載のｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１のＥＹＦＰと制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩとを用いる切断およびライゲーションによる方法で置換した。次に、Ｒａｆｒａｓ１７２２のＲａｆ領域を含むＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ断片を、このｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１由来のプラスミドのＲａｌＧＤＳ領域を含むＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ断片と置換した。このベクターをｐＲａｉ−ｃｈｕ４０４と命名した。その翻訳領域の塩基配列を配列番号：３０として、また当該塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号：３１として示す。
（２） 実施例７と同様にＲａｉ−ｃｈｕ４０４のＦＲＥＴ効率に及ぼすグアニンヌクレオチド交換因子の影響を調べた。Ｒａｐ１に対するグアニンヌクレオチド交換因子としてはＰＤＺ−ＧＥＦ１、Ｃ３Ｇ、ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩ、ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩＩを用いた。また、対照としてＲａｓに対するグアニンヌクレオチド交換因子であるＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩ、ｍＳｏｓ１、ＲａｓＧＲＦおよびＲａｌに対するグアニンヌクレオチド交換因子であるＫＩＡＡ０８５１を用いた。これらのグアニンヌクレオチド交換因子は（文献９）に記載がある。実験の結果を第２７図に示すように、Ｒａｐ１に対するグアニンヌクレオチド交換因子のみがＲａｉ−ｃｈｕ４０４のＦＲＥＴ効率を上昇せしめることがわかった。
実施例９ Ｋｉ−Ｒａｓタンパク質のＣＡＡＸボックスを有する活性モニタータンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１ＸとＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘの作成
実施例１においてアンチセンスプライマーＸＦＰ−Ｂｇｌのかわりに制限酵素ＸｂａＩの認識部位を含むプライマー（配列番号：３２）を用いてＥＣＦＰを増幅し、（文献１１）に記載の方法で、ＥＣＦＰのカルボキシル末端にＫｉ−Ｒａｓタンパク質のＣＡＡＸボックスを融合せしめた。これをＲａｆｒａｓ１７２２およびＲａｉ−ｃｈｕ４０４のＥＣＦＰと制限酵素とＴ４リガーゼを用いる方法で置換した。得られたベクターをそれぞれｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１ＸおよびｐＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘと命名した。それぞれの翻訳領域の塩基配列を配列番号：３３および配列番号：３５として、また当該塩基配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号：３４および配列番号：３６として示す。
実施例１０ Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１ＸおよびＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘを発現するＣＯＳ１細胞におけるＲａｓ活性化の可視化
ＣＯＳ１細胞をガラス底の培養皿に巻きなおす。実施例９で得られたＲａｉ−ｃｈｕ１０１ＸおよびＲａｉ−ｃｈｕ４０４ＸをＣＯＳ １細胞に、定法に従いトランスフェクトした。２４時間後に、実施例１の（５）に記載の蛍光顕微鏡システムで観察した。ＥＧＦ添加による細胞内におけるＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光強度比（ＥＹＦＰ／ＥＣＦＰ）の経時的変化の結果を第２８図に示す。本図では蛍光比の高いところを赤で、低いところを青色で表し、ＥＣＦＰの蛍光強度を明度として表わすＩＭＤモードを用いて図を提示している。すなわち、原図においては赤いところがＲａｓあるいはＲａｐ１の活性化が高い部位を示している。第２８図では細胞増殖因子による刺激でＲａｓが細胞の周辺部より活性化され、Ｒａｐ１は核周囲から活性化される様子が画像化できた。同様の実験を、細胞がやや密集した状態で行うと、第２９図に示すように、細胞が接触した部位においてはＲａｓの活性化が起きず、細胞が接触していないところにおいて辺縁部よりＲａｓが活性化されることが明らかとなった。このように、本発明の活性モニタータンパク質を用いることにより、細胞内でＲａｓファミリーＧタンパク質の活性に関する時間的、空間的情報を取得することができる。
実施例１１ Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１ＸおよびＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘを発現するＰＣ１２細胞におけるＲａｓ活性化の可視化
ガラス底の培養皿に増殖しているＰＣ１２細胞に、実施例９で得られたＲａｉ−ｃｈｕ１０１ＸおよびＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘを定法に従いトランスフェクトし、実施例１の（５）に記載の蛍光顕微鏡システムで観察した。神経成長因子にて添加による細胞内におけるＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光強度比（ＥＹＦＰ／ＥＣＦＰ）の経時的変化の結果を第３０図に示す。原図では蛍光比の高いところを赤で、低いところを青色で表し、ＥＣＦＰの蛍光強度を明度として表わすＩＭＤモードを用いて図を提示している。すなわち、原図においては赤いところがＲａｓあるいはＲａｐ１の活性化が高い部位を示している。ＰＣ１２細胞の神経様分化においては、分化の誘導期にはＲａｓは細胞体で辺縁部から活性化されるのに対し、分化が完成した時期においては、細胞の生存に必要なＲａｓの活性は神経突起においてのみ維持されていることがわかった。すなわち、Ｒａｓの活性化が細胞の分化の段階により、細胞内の異なる部位で起きていることが明らかとなった。Ｒａｓとは全く対照的にＲａｐ１は神経成長因子の添加により核周囲ぶより活性化され、分化した神経突起においてはその活性は低く抑えられていることが明らかとなった。これはＲａｓファミリーＧタンパク質の活性が細胞内の異なる場所では異なる制御を受けていることを示すものである。
実施例１２ Ｒａｃ１の活性モニタータンパク質であるＲａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘの作成
（１）Ｒａｃ１とＰａｋ１とをコードするキメラ遺伝子の作成
Ｒａｃ１のｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｍ２９８７０）およびＰａｋ１のｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：ＮＭ００２５７６）を鋳型として、ＰＣＲ法により、実施例１および実施例９の方法に従い、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘを得た。ｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘの構造（第３１図）、その翻訳領域の塩基配列（配列番号：３７）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：３８）を示す。
かかる塩基配列および予測されるアミノ酸配列を説明する：
ｎｔ １−６８４ ：オワンクラゲのＥＹＦＰ
ｎｔ ６８５−６９０ ：リンカー
ｎｔ ６９１−９３９ ：Ｐａｋ１
ｎｔ ９４０−９６９ ：リンカー
ｎｔ ９７０−１４９７ ：Ｒａｃ１
ｎｔ １４９８−１５０６：リンカー
ｎｔ １５０７−２２１７：オワンクラゲのＥＣＦＰ
ｎｔ ２２１８−２２２９：リンカー
ｎｔ ２２３０−２２８９：Ｋ−Ｒａｓのカルボキシル末端領域（ＣＡＡＸボックス）
（２）キメラ遺伝子の変異体の作成
公知のＰＣＲを用いる方法にて、ｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘの塩基配列（配列番号：３７）における１００４位のＧをＴに置換し、予測されるアミノ酸ＧｌｙをＶａｌに置換したものをｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１２Ｘと命名した。同様に、１０１９位のＣをＡに置換し、予測されるアミノ酸ＴｈｒをＡｓｎに置換したものをｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１３Ｘと命名した。タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１２Ｘにおいては、Ｒａｃ１のＧＴＰ水解活性が減少し、恒常的活性化型になることが予想される。一方、Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１３Ｘにおいては、Ｒａｃ１のＧＴＰ結合能が減少し、非活性化型になることが予想される。
（３）ホ乳類細胞でのＲａｃ１の活性モニタータンパク質（Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘ）の発現と分光光度計による解析
実施例１の（４）に記載の方法により、Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘ、Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１２Ｘ、またはＲａｉ−ｃｈｕ１０１３Ｘを発現する細胞を用いて解析を行った。得られた蛍光プロフィールを第３４図に示す。活性化型と予想されるＲａｉ−ｃｈｕ１０１２Ｘと比較して野生型Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘおよび非活性化型と予想されるＲａｉ−ｃｈｕ１０１３Ｘでは、ＦＲＥＴの効率が低いことがわかる。
実施例１３ Ｃｄｃ４２の活性モニタータンパク質であるＲａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘの作成
（１）Ｃｄｃ４２とＰａｋ１とをコードするキメラ遺伝子の作成
Ｃｄｃ４２のｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｍ５７２９８）およびＰａｋ１のｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：ＮＭ００２５７６）を鋳型として、ＰＣＲ法により、実施例１の方法に従い、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘを得た。ｐＲａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘの構造（第３２図）、その翻訳領域の塩基配列（配列番号：３９）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：４０）を示す。
かかる塩基配列および予測されるアミノ酸配列を説明する：
ｎｔ １−６８４ ：オワンクラゲのＥＹＦＰ
ｎｔ ６８５−６９０ ：リンカー
ｎｔ ６９１−９３９ ：Ｐａｋ１
ｎｔ ９４０−９６９ ：リンカー
ｎｔ ９７０−１４９４ ：Ｃｄｃ４２
ｎｔ １４９５−１５０３：リンカー
ｎｔ １５０４−２２１４：オワンクラゲのＥＣＦＰ
ｎｔ ２２１５−２２２６：リンカー
ｎｔ ２２２７−２２８６：Ｋ−Ｒａｓのカルボキシル末端領域（ＣＡＡＸボックス）
（２）キメラ遺伝子の変異体の作成
公知のＰＣＲを用いる方法にて、ｐＲａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘの塩基配列（配列番号：３９）における１００１位のＧをＴに置換し、予測されるアミノ酸ＧｌｙをＶａｌに置換したものをｐＲａｉ−ｃｈｕ１０５２Ｘと命名した。タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１０５２Ｘにおいては、Ｒａｃ１のＧＴＰ水解活性が減少し、恒常的活性化型になることが予想される。
（３）ホ乳類培養細胞でのＣｄｃ４２の活性モニタータンパク質（Ｒａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘ）の発現と分光光度計による解析
実施例１の（４）に記載の方法により解析を行った。Ｒａｉ−ｃｈｕ１０５４ＸまたはＲａｉ−ｃｈｕ１０５２Ｘを発現する細胞を用いて解析を行った。得られた蛍光プロフィールを第３５図に示す。活性化型と予想されるＲａｉ−ｃｈｕ１０５２Ｘと比較して野生型Ｒａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘでは、ＦＲＥＴの効率が低いことがわかる。
実施例１４ ＲｈｏＡの活性モニタータンパク質であるＲａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘの作成
（１）ＲｈｏＡとｍＤｉａｌとをコードするキメラ遺伝子の作成
ＲｈｏＡのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｌ２５０８０）およびｍＤｉａｌのｃＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ アクセッション番号：Ｅ１７３６１）を鋳型として、ＰＣＲ法により、実施例１の方法に従い、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘを得た。ｐＲａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘの構造（第３３図）、その翻訳領域の塩基配列（配列番号：４１）および予測されるアミノ酸配列（配列番号：４２）を示す。
かかる塩基配列および予測されるアミノ酸配列を説明する：
ｎｔ １−６８４ ：オワンクラゲのＥＹＦＰ
ｎｔ ６８５−６９６ ：リンカー
ｎｔ ６９７−１０９２ ：ｍＤｉａｌ
ｎｔ １０９３−１１１０：リンカー
ｎｔ １１１１−１６７７：ＲｈｏＡ
ｎｔ １６７８−１６８６：リンカー
ｎｔ １６８７−２３９７：オワンクラゲのＥＣＦＰ
ｎｔ ２３９８−２４０９：リンカー
ｎｔ ２４１０−２４６９：Ｋ−Ｒａｓのカルボキシル末端領域（ＣＡＡＸボックス）
（２）キメラ遺伝子の変異体の作成
公知のＰＣＲを用いる方法にて、ｐＲａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘの塩基配列（配列番号：４１）における１２９８位のＡをＴに、１２９９位のＧをＣに置換し、予測されるアミノ酸ＧｌｎをＬｅｕに置換したものをｐＲａｉ−ｃｈｕ１２２０Ｘと命名した。タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１２２０Ｘにおいては、ＲｈｏＡのＧＴＰ水解活性が減少し、恒常的活性化型になることが予想される。
（３）ホ乳類細胞でのＲｈｏＡの活性モニタータンパク質（Ｒａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘ）の発現と分光光度計による解析
実施例１の（４）に記載の方法により解析を行った。Ｒａｉ−ｃｈｕ１２１４ＸまたはＲａｉ−Ｃｈｕ１２２０Ｘを発現する細胞を用いて解析を行った。得られた蛍光プロフィールを第３６図に示す。活性化型と予想されるＲａｉ−ｃｈｕ１２２０Ｘと比較して野生型Ｒａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘでは、ＦＲＥＴの効率が低いことがわかる。
実施例１５ Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１１ＸおよびＲａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘを発現するＣＯＳ１細胞におけるＲａｃ１活性化の可視化
ＣＯＳ１細胞をガラス底の培養皿に巻きなおす。実施例１２で得られたｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１１ＸをＣＯＳ１細胞に、定法に従いトランスフェクトした。２４時間後に実施例１の（５）に記載の蛍光顕微鏡システムで観察した。ＥＧＦ添加による細胞内におけるＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光強度比（ＥＹＦＰ／ＥＣＦＰ）の経時的変化の結果を第３７図に示す。第３７図では、ＥＧＦ刺激により、Ｒａｃ１が１分間以内に速やかに細胞全体に活性化され、やがて、細胞辺縁部のラッフリングと呼ばれる細胞膜が運動している部分に活性化が収斂されていく様子が観察できた。このように、本発明の活性モニタータンパク質を用いることにより、細胞内でＲｈｏファミリーＧＴＰ結合タンパク質の活性に関する時間的、空間的定法を取得することができる。また、これはＲａｓやＲａｐ１の活性化とも異なるものであり、これらの活性モニタータンパク質分子の特異性を裏付ける結果でもある。
配列表フリーテキスト
配列番号：１は、制限酵素ＸｈｏＩの切断部位の塩基配列とヒトＨ−Ｒａｓの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：２は、ヒトｃ−Ｒａｆ１の塩基配列とヒトＨ−Ｒａｓの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：３は、制限酵素ＫｐｎＩの切断部位の塩基配列とヒトｃ−Ｒａｆ１の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：４は、制限酵素ＮｏｔＩの切断部位の塩基配列とヒトｃ−Ｒａｆ１の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：５は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫＩＩ（＋）のマルティプルクローニングサイトの５’側の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：６は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫＩＩ（＋）のマルティプルクローニングサイトの３’側の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：７は、制限酵素ＢａｍＨＩの切断部位の塩基配列とＥＹＦＰの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：８は、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩの各々の切断部位の塩基配列とＥＣＦＰの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：９は、制限酵素ＮｏｔＩの切断部位の塩基配列とＥＣＦＰの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：１０は、制限酵素ＢｇｌＩＩの切断部位の塩基配列とＥＣＦＰの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：１１は、ヒトＨ−Ｒａｓ、ヒトｃ−Ｒａｆ１、ＥＹＦＰおよびＥＣＦＰの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：１２は、配列番号：１１のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：１３は、制限酵素ＸｈｏＩの切断部位の塩基配列とヒトＲａｐ１Ａの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：１４は、ヒトＲａｌＧＤＳの塩基配列とヒトＲａｐ１Ａの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：１５は、ヒトＲａｌＧＤＳの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：１６は、制限酵素ＮｏｔＩの切断部位の塩基配列とヒトＲａｌＧＤＳの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：１７は、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩの各々の切断部位の塩基配列とＥＣＦＰの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：１８は、ヒトＲａｐ１Ａ、ヒトＲａｌＧＤＳ、ＥＹＦＰおよびＥＣＦＰの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：１９は、配列番号：１８のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：２０は、制限酵素ＸｈｏＩの切断部位の塩基配列とヒトＲ−Ｒａｓの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：２１は、制限酵素ＫｐｎＩの切断部位の塩基配列とヒトＲ−Ｒａｓの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：２２は、ヒトＲ−Ｒａｓ、ヒトｃ−Ｒａｆ１、ＥＹＦＰおよびＥＣＦＰの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：２３は、配列番号：２２のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：２４は、ヒトＨ−Ｒａｓの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：２５は、ヒトＨ−Ｒａｓの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：２６は、ヒトＨ−Ｒａｓ、ヒトｃ−Ｒａｆ１、ＥＹＦＰおよびＥＣＦＰの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：２７は、配列番号：２６のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：２８は、ヒトｃ−Ｒａｆ１のヒトＨ−Ｒａｓ結合領域の塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：２９は、ＥＣＦＰの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：３０は、ヒトＲａｐ１Ａ、ヒトｃ−Ｒａｆ１、ＥＹＦＰおよびＥＣＦＰの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：３１は、配列番号：３０のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：３２は、ＥＣＦＰの塩基配列を基にデザインしたプライマーの塩基配列である。
配列番号：３３は、ヒトＨ−Ｒａｓ、ヒトｃ−Ｒａｆ１、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰおよびヒトＫ−Ｒａｓの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：３４は、配列番号：３３のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：３５は、ヒトＲａｐ１Ａ、ヒトｃ−Ｒａｆ１、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰおよびヒトＫ−Ｒａｓの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：３６は、配列番号：３５のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：３７は、ヒトＲａｃ１、ヒトＰａｋ１、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰおよびヒトＫ−Ｒａｓの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：３８は、配列番号：３７のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：３９は、ヒトＣｄｃ４２、ヒトＰａｋ１、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰおよびヒトＫ−Ｒａｓの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：４０は、配列番号：３９のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
配列番号：４１は、ヒトＲｈｏＡ、ヒトｍＤｉａｌ、ＥＹＦＰ、ＥＣＦＰおよびヒトＫ−Ｒａｓの各塩基配列を基にデザインしたプラスミドの塩基配列である。
配列番号：４２は、配列番号：４１のプラスミドの塩基配列から予測されるアミノ酸配列である。
産業上の利用可能性
本発明によれば、非侵襲的な低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定を可能にする低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質、該タンパク質を発現し、非侵襲的な低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化の測定に有用な細胞およびトランスジェニック動物、前記タンパク質を用いる低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法、より詳しくは生細胞においても使用可能な、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のＧＴＰ結合型とＧＤＰ結合型の量比を測定する方法、ならびに低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法が提供される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第１図は、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性制御機構を示す。本図では、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質としてＲａｓを例にとり、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性制御機構を模式的に示してある。低分子量ＧＴＰ結合タンパク質はＧＤＰに結合していると不活性化型であり、ここにグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）が作用するとＧＤＰがＧＴＰに置換され、活性化型となる。活性化されたＧＴＰ結合タンパク質は構造変化を起こし、その特異的な標的タンパク質と結合し、それを活性化できるようになる。活性化型の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質はＧＴＰ水解促進酵素（ＧＡＰ）存在下にＧＴＰがＧＤＰに水解され、無機リン酸（Ｐｉ）を遊離し、もとの不活性化型に戻る。
第２図は、ＦＲＥＴを利用した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化測定法の原理を示す。この図では低分子量ＧＴＰ結合タンパク質としてＲａｓを、標的タンパク質としてＲａｆを例にとっている。ＧＦＰドナータンパク質として例示するＣＦＰ（ｃｙａｎ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＧＦＰ）は４３３ｎｍの光で励起され、４７５ｎｍを極大とする光を放射する。一方、ＧＦＰアクセプタータンパク質として例示するＹＦＰ（ｙｅｌｌｏｗ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ＧＦＰ）は５０５ｎｍの光で励起され５３０ｎｍを極大とする光を放射する。なお、本発明においては、ＧＦＰアクセプタータンパク質および／またはＧＦＰドナータンパク質として、これらを用いることもできる。第２図中の下図に示すように、Ｒａｓの活性化前には、モニタータンパク質において、アミノ末端側に存在するＹＦＰとカルボキシル末端側に存在するＣＦＰとが離れているのでＣＦＰからＹＦＰへのエネルギーの移行はあまり起きない。ところが、何らかの刺激を受けて〔たとえば、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）の添加〕Ｒａｓが活性化型になると、標的タンパク質ＲａｆのＲａｓ結合領域（ＲＢＤ）に結合するので、ＹＦＰとＣＦＰが近傍に来て、その結果、ＣＦＰからＹＦＰへのエネルギーの移行、それに伴うＹＦＰからの５３０ｎｍの蛍光が観察されるようになる。従って、刺激前後（すなわち、Ｒａｓの活性化前後）におけるＦＲＥＴ効率を測定することにより、Ｒａｓの活性化を測定することができる。
第３図は、プラスミドｐＲａｆｒａｓ１７２２の構造を示す。発現ベクターはすでに報告されているｐＣＡＧＧＳを用いた。図中のＣＡＧプロモーターの下流にＥＹＦＰ−Ｒａｓ−ＲａｆＲＢＤ（Ｒａｓ結合領域）−ＥＣＦＰの順となる融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを結合した。
第４図は、プラスミドｐＲａｆｒａｓ１７２２の翻訳領域の塩基配列および予測されるアミノ酸配列を示す。
第５図は、プラスミドｐＲａｆｒａｓ１７２２の翻訳領域の塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第６図は、プラスミドｐＲａｆｒａｓ１７２２の翻訳領域の塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第７図は、発現タンパク質Ｒａｆｒａｓ１７２２の蛍光プロフィールを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｆｒａｓ１７２２とグアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｓ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓ）あるいはＧＴＰ水解促進酵素Ｇａｐ１ｍ発現ベクター（ｐＥＦ−Ｂｏｓ−Ｇａｐ１ｍ）をリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、４８時間培養後に細胞を可溶化し、遠心分離後、上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。第７図に示すグラフの右囲みにおけるＳｏｓはｐＲａｆｒａｓ１７２２とｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｆｒａｓ１７２２の蛍光プロフィールであることを、Ｇａｐ１ｍはｐＲａｆｒａｓ１７２２とｐＥＦ−Ｂｏｓ−Ｇａｐ１ｍを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｆｒａｓ１７２２の蛍光プロフィールであることを示す。
第８図は、発現タンパク質Ｒａｆｒａｓ１７２２のＧＴＰ結合タンパク質上のＧＴＰとＧＤＰの比〔ＧＴＰ／（ＧＤＰ＋ＧＴＰ）（％）〕に対する励起波長４３３ｎｍでの波長４７５ｎｍと波長５３０ｎｍの蛍光強度比（波長５３０／４７５）を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｆｒａｓ１７２２と様々な量のグアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｓ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓ）あるいはＧＴＰ水解促進酵素Ｇａｐ１ｍ発現ベクター（ｐＥＦ−Ｂｏｓ−Ｇａｐ１ｍ）をトランスフェクトした。４８時間培養後に３２Ｐｉ標識し、Ｒａｆｒａｓ１７２２を抗ＧＦＰ抗体で免疫沈降した後に、Ｒａｆｒａｓ１７２２に結合しているＧＴＰおよびＧＤＰを薄層クロマトグラフィーで分離、定量した。一方、同様に処理した細胞可溶化液について蛍光プロフィールを測定し、励起波長４３３ｎｍでの波長４７５ｎｍと波長５３０ｎｍの蛍光強度比を測定した。Ｒａｆｒａｓ１７２２上のＧＴＰの量に依存して蛍光強度比が増強されることが分かる。
第９図は、発現タンパク質Ｒａｆｒａｓ１７２２を発現する細胞株が得られたことを示す。ＮＩＨ３Ｔ３細胞にｐＲａｆｒａｓ１７２２をトランスフェクトし、細胞株３Ｔ３−Ｒａｆｒａｓを樹立した。細胞を可溶化し、抗ＧＦＰ抗体を用いてイムノブロッティングにてＲａｆｒａｓ１７２２の発現について解析した。第９図に示すイムノブロッティングの左には分子量マーカーを示す。
第１０図は、３Ｔ３−Ｒａｆｒａｓ細胞を用いたＲａｓ活性化の解析を示す。３Ｔ３−Ｒａｆｒａｓ細胞をＥＧＦ（１μｇ／ｍｌ）で刺激し、その前後で４３３ｎｍの波長で励起した蛍光プロフィール（波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍ）を測定した。
第１１図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１の構造を示す。バックボーンとなるベクターの構造は第３図と同一である。
第１２図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列を示す。
第１３図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第１４図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第１５図は、発現タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ３１１の蛍光プロフィールを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１とグアニンヌクレオチド交換因子Ｃ３Ｇ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−Ｃ３Ｇ；文献９に記載）あるいはＧＴＰ水解促進酵素ｒａｐ１ＧＡＰＩＩ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｒａｐ１ＧＡＰＩＩ；文献９に記載）とをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、４８時間培養後に細胞を可溶化し、遠心分離後、上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。第１５図に示すグラフの右囲みにおけるＣ３ＧはｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１とｐＣＡＧＧＳ−Ｃ３Ｇを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｉ−ｃｈｕ３１１の蛍光プロフィールであることを、ｒａｐ１ＧＡＰＩＩはｐＲａｉ−ｃｈｕ３１１とｐＣＡＧＧＳ−ｒａｐ１ＧＡＰＩＩを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｉ−ｃｈｕ３１１の蛍光プロフィールであることを示す。
第１６図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８の構造を示す。バックボーンとなるベクターの構造は第３図と同一である。
第１７図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列を示す。
第１８図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第１９図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第２０図は、発現タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１５８の蛍光プロフィールを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８とグアニンヌクレオチド交換因子ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩＩ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩＩ；文献１０に記載）あるいはＧＴＰ水解促進酵素Ｇａｐ１ｍ発現ベクター（ｐＥＦ−Ｂｏｓ−Ｇａｐ１ｍ）をリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、４８時間培養後に細胞を可溶化し、遠心分離後、上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。第２０図に示すグラフの右囲みにおけるＧａｐ１ｍはｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８とｐＥＦ−Ｂｏｓ−Ｇａｐ１ｍを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｉ−ｃｈｕ１５８の蛍光プロフィールであることを、ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩＩはｐＲａｉ−ｃｈｕ１５８とｐＣＡＧＧＳ−ＣａｌＤＡＧ−ＧＥＦＩＩＩを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｉ−ｃｈｕ１５８の蛍光プロフィールであることを示す。
第２１図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列を示す。
第２２図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第２３図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９の翻訳領域における塩基配列および予測されるアミノ酸配列（つづき）を示す。
第２４図は、発現タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１１９の蛍光プロフィールを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９またはｐＲａｆｒａｓ１７２２とグアニンヌクレオチド交換因子Ｓｏｓ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓ）とをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、２４時間培養後に３３℃および４０℃に移し、さらに２４時間培養を加えた後、細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。第２１図に示すグラフの右囲みにおける対照はｐＲａｆｒａｓ１７２２とｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｉ−ｃｈｕ１１９の蛍光プロフィールであることを、変異ありはｐＲａｉ−ｃｈｕ１１９とｐＣＡＧＧＳ−ｍＳｏｓを共にトランスフェクトした場合におけるＲａｉ−ｃｈｕ１１９の蛍光プロフィールであることを示す。Ｒａｉ−ｃｈｕ１１９では野生型（Ｒａｆｒａｓ１７２２）より、グアニンヌクレオチド交換因子に対する反応性が増加していた。
第２５図は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）添加による細胞内におけるＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光強度の経時的変化の結果を示す。実施例１に記載の蛍光顕微鏡システムを用いて、波長４３０ｎｍの励起光を照射して蛍光波長４７５ｎｍおよび５３０ｎｍでの画像を経時的に取得し、当該画像からＥＣＦＰおよびＥＹＦＰの蛍光強度を求めた。
第２６図は、種々のグアニンヌクレオチド交換因子およびＧＴＰ水解促進酵素による発現タンパク質Ｒａｆｒａｓ１７２２におけるＥＣＦＰとＥＹＦＰの蛍光強度比の変化を示すグラフである。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｆｒａｓ１７２２とグアニンヌクレオチド交換因子発現ベクターあるいはＧＴＰ水解促進酵素発現ベクターとをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、２４時間以上培養後に細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４７５ｎｍおよび５３０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。後者の前者に対する比（蛍光強度比）をグラフに示してある。
第２７図は、種々のグアニンヌクレオチド交換因子およびＧＴＰ水解促進酵素による発現タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ４０４におけるＥＣＦＰとＥＹＦＰの蛍光強度比の変化を示すグラフである。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ４０４とグアニンヌクレオチド交換因子発現ベクターあるいはＧＴＰ水解促進酵素発現ベクターとをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、２４時間以上培養後に細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４７５ｎｍおよび５３０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。後者の前者に対する比（蛍光強度比）をグラフに示してある。
第２８図は、ＥＧＦ添加によるｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１ＸまたはｐＲａｉ−ｃｈｕ４０４ＸをトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞内におけるＥＹＦＰのＥＣＦＰに対する蛍光強度比の経時的変化ならびに、細胞内分布を示す写真である。ＣＯＳ１細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１ＸあるいはｐＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘをトランスフェクトし、２４時間以上培養後に、培地をフェノールレッドおよび血清を含まない培地に交換した。ついで、キセノン光源を有する倒立型蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ，Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００）に回転式蛍光励起フィルターおよび回転式蛍光発光フィルター装置（ＬＵＤＬ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ社）を備え、高感度冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｘ社、Ｍｉｃｒｏｍａｘ４５０）を備え、日本ローパー社製Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ画像解析ソフトにて制御ならびに解析できるシステムを用いて画像を取得した。細胞に４３０ｎｍの励起光を照射し、４７５ｎｍのＥＣＦＰドナーの蛍光波長での画像をＣＣＤカメラにより撮影し、ついで、５３０ｎｍのＥＹＦＰアクセプターの蛍光波長での画像を撮影した。これを３０秒間隔で行った。データ取得後、デジタル画像上の各ピクセルについて、ＥＹＦＰ／ＥＣＦＰの蛍光強度比を８段階に分け、青から赤までの色を割り当てた。一方、ＥＣＦＰの蛍光強度を明度として割り当てることによりビデオ画像が作成できる。本図ではこのうちの図に示す時間の画像を示してある。Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１Ｘ発現細胞にＥＧＦを添加すると、ＦＲＥＴ効率を反映する蛍光強度比が細胞の辺縁部から徐々に中央部に向かって上昇していく過程が見える。一方、Ｒａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘを発現する細胞においては、中央部から辺縁部に向かって活性が上昇するのがわかる。このように、本発明の活性モニタータンパク質は、ＲａｓファミリーＧタンパク質の活性化に関する時間情報と、細胞内の空間情報の双方を同時に得ることを可能とする。
第２９図は、ＥＧＦ添加によるｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１Ｘをトランスフェクトしたサブコンフルエントな状態のＣＯＳ１細胞内におけるＥＹＦＰのＥＣＦＰに対する蛍光強度比の経時的変化ならびに、細胞内分布を示す写真である。サブコンフルエントな状態のＣＯＳ１細胞を用いた以外は第２８図の説明に記載したのと同様の方法により実験を行った。Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１Ｘ発現細胞にＥＧＦを添加すると、ＦＲＥＴ効率を反映する蛍光強度比が他の細胞には接着していない辺縁部から上昇していく過程が見える。一方、隣の細胞と接着している部位ではこのＦＲＥＴ効率の上昇が抑制されているのがわかる。
第３０図は、神経成長因子添加によるｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１ＸまたはｐＲａｉ−ｃｈｕ４０４ＸをトランスフェクトしたＰＣ１２細胞内におけるＥＹＦＰのＥＣＦＰに対する蛍光強度比の経時的変化ならびに、細胞内分布を示す写真である。ＰＣ１２細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１ＸあるいはｐＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘをトランスフェクトし、２４時間以上培養後に、培地をフェノールレッドおよび血清を含まない培地に交換し、さらに神経成長因子を加え、第２８図の説明に記載したのと同様の方法により観察した。本図ではこの連続する画像のうち、図に示す時間の画像のみを示してある。Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１Ｘ発現細胞に神経成長因子を添加すると、ＦＲＥＴ効率を反映する蛍光強度比が細胞の辺縁部から徐々に中央部に向かって上昇していく過程が見える。そして、神経様突起の進展が明らかな１８０分以後においては、ＦＲＥＴ効率の上昇はこの神経様突起に主に限局していることがわかる。一方、Ｒａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘを発現する細胞においては、逆に中央部から辺縁部に向かって活性が上昇し、分化した神経様突起ではこのＦＲＥＴ効率が抑制されているのがわかる。このことは、分化誘導の過程においてＲａｓが細胞辺縁部より、Ｒａｐ１が細胞の中心部より活性化され、分化が完成した後は、Ｒａｓは神経様突起において高い活性が持続していることを示している。このことは、ＲａｓファミリーＧタンパク質が細胞内の異なる部位では異なる活性化状態にあることを明らかにするもので、本発明の活性モニタータンパク質群がＲａｓファミリーＧタンパク質活性化に関する時間的、空間的情報を得るのに至適な分子プローブであることを示すものである。
第３１図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘの構造を示す。バックボーンとなるベクターの構造は第３図と同一である。
第３２図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１０５４Ｘの構造を示す。バックボーンとなるベクターの構造は第３図と同一である。
第３３図は、プラスミドｐＲａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘの構造を示す。バックボーンとなるベクターの構造は第３図と同一である。
第３４図は、発現タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１１ｘ（野生型）、Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１２Ｘ（活性化型）、Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１３Ｘ（非活性化型）の蛍光プロフィールを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１１ｘ、ｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１２Ｘ、またはｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１３Ｘをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、４８時間後に細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。
第３５図は、発現タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１０５４ｘ（野生型）、Ｒａｉ−ｃｈｕ１０５２Ｘ（活性化型）の蛍光プロフィールを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ１０５４ｘまたはｐＲａｉ−ｃｈｕ１０５２Ｘをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、４８時間後に細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。
第３６図は、発現タンパク質Ｒａｉ−ｃｈｕ１２１４Ｘ（野生型）およびＲａｉ−ｃｈｕ１２２０Ｘ（活性化型）の蛍光プロフィールを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＲａｉ−ｃｈｕ１２１４ＸまたはｐＲａｉ−ｃｈｕ１２２０Ｘをリン酸カルシウム法にてトランスフェクトし、４８時間後に細胞を可溶化し、遠心分離して上清を得た。該上清について励起波長４３３ｎｍにて、波長４５０ｎｍ〜５５０ｎｍにおける蛍光強度を蛍光分光光度計にて測定した。
第３７図は、ＥＧＦ添加によるｐＲａｉ−ｃｈｕ１０１１ＸをトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞内におけるＥＹＦＰのＥＣＦＰに対する蛍光強度比の経時的変化ならびに、細胞内分布を示す写真である。第２８図の説明に記載したのと同様の方法により実験を行った。Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１１Ｘ発現細胞にＥＧＦを添加すると、まず、１分間以内に一過性に細胞全体にＦＲＥＴ効率を反映する蛍光強度比が上昇し、ついで、細胞膜のラッフリングが起こっている部位で蛍光強度比の上昇と中心部での蛍光強度比の低下が観察される。これは、Ｒａｉ−ｃｈｕ１０１Ｘを用いて調べたＲａｓの活性化やＲａｉ−ｃｈｕ４０４Ｘを用いて調べたＲａｐ１の活性化とは異なる時間経過、空間的分布を示す結果であり、本発明の活性モニタータンパク質群がＲｈｏファミリーＧＴＰ結合タンパク質の活性化に関しても時間的、空間的情報を得るのに至適な分子プローブであることを示すものである。
Claims (25)
- 低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の全部または一部、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質の全部または一部、ＧＦＰアクセプタータンパク質の全部または一部、及びＧＦＰドナータンパク質の全部または一部が、各タンパク質の機能を発揮し得る状態で直接または間接的に連結されてなる融合タンパク質からなり、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と該標的タンパク質とが、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＨ−Ｒａｓであり標的タンパク質がＲａｆである組み合わせ、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲａｐ１Ａであり標的タンパク質がＲａｌＧＤＳである組み合わせ、及び、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲ−Ｒａｓであり標的タンパク質がＲａｆである組み合わせのいずれかであり、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の一部がＧＴＰとの結合による活性化能を保有し前記活性化時に該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質に結合する機能を保有する一部であり、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質の一部が該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質に該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＧＴＰとの結合による活性化されたときに特異的に結合する機能を保有する一部であり、該ＧＦＰアクセプタータンパク質の一部及び該ＧＦＰドナータンパク質の一部がＦＲＥＴのペアーとなる機能が保たれている一部であり、
直接または間接的な連結の順序がアミノ末端側より、ＧＦＰアクセプタータンパク質とＧＦＰドナータンパク質とのいずれかのタンパク質の全部または一部、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の全部または一部、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質の全部または一部、ＧＦＰアクセプタータンパク質とＧＦＰドナータンパク質とのいずれかであってアミノ末端側で選択されなかったタンパク質の全部または一部である低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。 - 直接または間接的な連結の順序がアミノ末端側より、ＧＦＰアクセプタータンパク質の全部または一部、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の全部または一部、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質の全部または一部、ＧＦＰドナータンパク質の全部または一部である請求項１に記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。
- 低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の全部または一部、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質の全部または一部、ＧＦＰアクセプタータンパク質の全部または一部、及びＧＦＰドナータンパク質の全部または一部が、各タンパク質の機能を発揮し得る状態で直接または間接的に連結されてなる融合タンパク質からなり、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と該標的タンパク質とが、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲａｃ１であり標的タンパク質がＰａｋである組み合わせ、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＣｄｃ４２であり標的タンパク質がＰａｋである組み合わせ、及び、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲｈｏＡであり標的タンパク質がｍＤｉａある組み合わせのいずれかであり、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の一部がＧＴＰとの結合による活性化能を保有し前記活性化時に該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質に結合する機能を保有する一部であり、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質の一部が該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質に該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＧＴＰとの結合による活性化されたときに特異的に結合する機能を保有する一部であり、該ＧＦＰアクセプタータンパク質の一部及び該ＧＦＰドナータンパク質の一部がＦＲＥＴのペアーとなる機能が保たれている一部であり、
直接または間接的な連結の順序がアミノ末端側より、ＧＦＰアクセプタータンパク質とＧＦＰドナータンパク質とのいずれかのタンパク質の全部または一部、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質の全部または一部、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の全部または一部、ＧＦＰアクセプタータンパク質とＧＦＰドナータンパク質とのいずれかであってアミノ末端側で選択されなかったタンパク質の全部または一部である低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。 - 直接または間接的な連結の順序がアミノ末端側より、ＧＦＰアクセプタータンパク質の全部または一部、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の標的タンパク質の全部または一部、該低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の全部または一部、ＧＦＰドナータンパク質の全部または一部である請求項３に記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。
- さらに、細胞内局在シグナルを付加してなる請求項１〜４のいずれかに記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。
- さらに、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と標的タンパク質との間にスペーサーとなるペプチドを有してなる請求項１〜５のいずれかに記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。
- ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＧＦＰまたはＥＹＦＰである請求項１〜６のいずれかに記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。
- ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰまたはＥＢＦＰである請求項１〜７のいずれかに記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。
- 低分子量ＧＴＰ結合タンパク質および／または標的タンパク質が変異を有するものである請求項１〜８のいずれかに記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。
- 低分子量ＧＴＰ結合タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端領域および／またはカルボキシル末端領域に少なくとも１個のアミノ酸の欠損を有してなる請求項１〜９のいずれかに記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。
- ＧＦＰアクセプタータンパク質および／またはＧＦＰドナータンパク質のアミノ酸配列のカルボキシル末端領域に少なくとも１個のアミノ酸の欠損を有してなる請求項１〜１０のいずれかに記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。
- 低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＨ−Ｒａｓであり、標的タンパク質がＲａｆであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰである請求項１に記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。
- 低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲａｐ１Ａであり、標的タンパク質がＲａｌＧＤＳであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰである請求項１に記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。
- 低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲａｃ１であり、標的タンパク質がＰａｋであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰである請求項３に記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。
- 低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＣｄｃ４２であり、標的タンパク質がＰａｋであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰである請求項３に記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。
- 低分子量ＧＴＰ結合タンパク質がＲｈｏＡであり、標的タンパク質がｍＤｉａであり、ＧＦＰドナータンパク質がＥＣＦＰであり、ＧＦＰアクセプタータンパク質がＥＹＦＰである請求項３に記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質。
- 請求項１〜１６のいずれかに記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質をコードする遺伝子。
- 請求項１７に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
- 発現プラスミドである請求項１８に記載の発現ベクター。
- 請求項１８または１９に記載の発現ベクターを保持してなる形質転換された細胞。
- 請求項１８または１９に記載の発現ベクターを保持してなるトランスジェニック動物（ヒトを除く）。
- 請求項１〜１６のいずれかに記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質におけるＦＲＥＴを検出する工程を含む低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法。
- 低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性モニタータンパク質におけるＦＲＥＴを検出する工程が、請求項２０に記載の細胞または請求項２１に記載のトランスジェニック動物におけるＦＲＥＴを検出する工程である請求項２２に記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法。
- ＧＴＰの結合した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質およびＧＤＰの結合した低分子量ＧＴＰ結合タンパク質を測定することにより得られたＧＴＰ／ＧＤＰ比（モル比）と、対応するＦＲＥＴの検出値との予め作成された検量線に基づき、前記ＦＲＥＴを検出する工程において検出されたＦＲＥＴの検出値からＧＴＰ／ＧＤＰ比（モル比）を算出する工程をさらに含む請求項２３に記載の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性化を測定する方法。
- （ａ）請求項２０に記載の細胞と被検物質とを接触させる工程、ならびに（ｂ）低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性の変化を検出する工程、
を含む、低分子量ＧＴＰ結合タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
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