JP5370890B2 - 細胞周期可視化プローブ - Google Patents
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- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
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Description
(1) 細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも1以上の遺伝子発現産物をマーカーにより可視化して、前記マーカーを検出することによって細胞周期の増殖期と休止期とを識別することを特徴とする、細胞周期の検出方法。
(2) 細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも1以上の遺伝子発現産物として、細胞周期依存的な存在量の変化が異なるパターンを示す少なくとも2以上の遺伝子発現産物を使用する、(1)に記載の方法。
(4) 細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも1以上の遺伝子発現産物として、G1期で存在量が増加し、S/G2/M期で存在量が減少する第一の発現産物と、G1期で存在量が減少し、S/G2/M期で存在量が増加する第二の発現産物とを使用し、上記第一の発現産物と第二の発現産物とをそれぞれ異なるマーカーで標識して可視化する、(1)から(3)の何れかに記載の方法。
(6) 第一の発現産物が、Cdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片である、(5)に記載の方法。
(7) 第一の発現産物が、Cdt1の30から120番目のアミノ酸からなる部分断片である、(5)又は(6)に記載の方法。
(9) 第二の発現産物が、Gemininの1から110番目のアミノ酸からなる部分断片である、(5)から(8)の何れかに記載の方法。
(10) マーカーが蛍光タンパク質又は発光タンパク質である、(1)から(9)の何れかに記載の方法。
(12) 細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子が、Cdt1遺伝子又はGeminin遺伝子である、(11)に記載の遺伝子構築物。
(13) 細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子の部分断片が、Cdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子、又はGemininからCdt1結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子である、(11)又は(12)に記載の遺伝子構築物。
(15) マーカーをコードする遺伝子が、蛍光タンパク質又は発光タンパク質をコードする遺伝子である、(11)から(14)の何れかに記載の遺伝子構築物。
(17) (11)から(15)の何れかに記載の遺伝子構築物を有する、遺伝子導入非ヒト動物。
(18) (11)から(15)の何れかに記載の遺伝子構築物の少なくとも1種類以上を細胞に導入し、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片とマーカーとを発現させ、前記マーカーを検出することによって細胞周期の増殖期と休止期とを識別することを特徴とする、細胞周期の検出方法。
(19) 細胞周期阻害剤、又は細胞周期が関与する疾患用の薬剤の候補物質の存在下において細胞を培養し、該細胞について(1)から(10)又は(18)に記載の細胞周期の検出方法を行うことによって細胞周期に影響を及ぼす候補物質を選択することを特徴とする、細胞周期阻害剤、又は細胞周期が関与する疾患用の薬剤のスクリーニング方法。
(20) 細胞周期阻害剤、または細胞周期が関与する疾患用の薬剤の候補物質、あるいは特定の遺伝子発現を抑制する試薬を、(17)に記載の遺伝子導入非ヒト動物に投与し、それらの、腫瘍の増殖、免疫系、血球系などの細胞の細胞周期、生存などに影響を及ぼす候補物質を選択することを特徴とする、疾患治療薬のスクリーニング方法あるいは化合物、薬剤、試薬の効能、作用機序について検定する方法。
本発明による細胞周期の検出方法は、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する少なくとも1以上の遺伝子発現産物をマーカーにより可視化して、前記マーカーを検出することによって細胞周期の増殖期と休止期とを識別することを特徴とする方法である。
本発明の遺伝子導入非ヒト動物の作製方法は特に限定されないが、例えば、本発明の遺伝子構築物を受精卵などに導入することにより作製することができる。遺伝子導入非ヒト動物の作製のために導入遺伝子として用いる本発明の遺伝子構築物としては、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する発現産物の遺伝子又はその部分断片と、マーカーをコードする遺伝子とを、適当な哺乳動物用プロモーターの下流に連結した組換え遺伝子を使用することが好ましい。本発明の遺伝子導入非ヒト動物は、例えば、非ヒト動物の受精卵に、本発明の遺伝子構築物を導入し、当該受精卵を偽妊娠雌性非ヒト動物に移植し、当該非ヒト動物から本発明の遺伝子構築物が導入された非ヒト動物を分娩させることにより作製することができる。非ヒト動物としては、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類の他、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ等を使用することができるが、作製、育成及び使用の簡便さなどの観点から見て、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類が好ましく、そのなかでもマウスが最も好ましい。
(1)mKO2-Cdt1の構築
(a)蛍光蛋白質単量体Kusabira-Orange(mKO)の早期蛍光発光能獲得変異体の開発
細胞周期をはじめ、細胞内の生理的なシグナルを検出する際に、蛍光タンパク質をレポーターとして使用する場合は、その蛍光タンパク質が翻訳されてから素早く蛍光を発することが必要とされる。細胞内の可視化したい事象と蛍光タンパク質の蛍光発光能を獲得するまでの時間に大きな開きがある場合には、その検出系自体が意味を持たないことになりかねない。そのため、レポーターとして使用する蛍光タンパク質において、翻訳後に素早く成熟して蛍光発光能を獲得できる変異体(早期蛍光発光能獲得変異体)の作製を行なった。材料としてイシサンゴ類のクサビライシより単離された蛍光蛋白質Kusabira-Orange(KO)の単量体変異体であるmKOを使用した。mKOは(株)医学生物学研究所、Amalgaam(有)より製品名mKO1として市販されている。
mKOの一次構造配列から構造を予測し、早期蛍光発光能を獲得できそうな部位(点)をいくつか選択し、なおかつ蛍光特性を保持するようmKO遺伝子にアミノ酸置換点変異を導入した。mKO遺伝子を挿入した大腸菌発現ベクタープラスミド(pRSET B Invitrogen)を鋳型にアミノ酸置換点変異導入プライマーをもちいてアミノ酸置換点変異導入を行なった。サーマルサイクリングにより、鋳型DNAの解離、プライマーの会合、プライマーの伸長を繰り返し、アミノ酸置換点変異導入されたDNAを増幅した。増幅に用いたプライマーは5'側のリン酸化を行った。
100μM primer 2μl
10× T4 polynucleotide kinase buffer 5μl
100μM ATP 0.5μl
滅菌水 41.5μl
T4 polynucleotide kinase (10 U/μl) 1μl
37℃で30分間インキュベートした。
5'リン酸化プライマーミックス final 4μl
template(mKO−pRSET B) 100ng
10× polymerase buffer 2.5μl
10× DNA ligase buffer 2.5μl
2.5mM dNTPs 1μl
polymerase(pfu)2.5U/μl 1μl
Taq DNA ligase 40U/μl 0.5μl
滅菌水で計50μlとする。
サーマルサイクラーはGeneAmp PCR system 9700を使用した。
反応条件
65℃ 5min (ライゲーション)
95℃ 2min (変性)
95℃ 20sec (変性)
52℃ 20sec (プライマーの鋳型へのアニーリング)
65℃ 8min (プライマー伸長及びライゲーション)
上記3ステップを25サイクル行った。
75℃ 7min (最後の伸長)
4℃ 保存
5'- cgcgtcacaatggccgasggcgggccaatgcct -3'(配列番号1)
5'- cgcgtcacaatggccragggcgggccaatgcct -3' (配列番号2)
5'- tacggccacagavtntttactaaatatcca -3' (配列番号3)
5'- aatcacaaatgccaannsaagactacttacaag -3' (配列番号4)
5'- cttaaaatgccaggagancattacatcagccat -3' (配列番号5)
5'- aacattactgagvwsgtagaagatgcagta -3' (配列番号6)
5'- tacaaggcggcaraaragattcttraaatgccagga -3' (配列番号7)
5'- gaccattacatcrrscatcgcctcgtcagg -3' (配列番号8)
混合塩基表記 w=a/t, r=a/g, s=g/c, v= a/g/c,n=a/t/g/c
PCR後のサンプルにDpnIを1μl加えて37℃に1時間インキュベートして鋳型発現ベクタープラスミドを切断した。
DpnI処理後のサンプルを大腸菌JM109(DE3)に形質転換して形質転換体を得た。蛍光タンパク質を発現している形質転換体の蛍光強度を比較し、候補クローンをピックアップした。ピックアップしたクローンの発現ベクタープラスミドをWizard Plus SV Minipreps DNA Purification System(Promega)で精製し、その発現ベクタープラスミドを鋳型にアミノ酸置換点変異導入を繰り返し、mKOを進化させた。発現ベクタープラスミドの精製はキットのプロトコールに準じた。
最終的に選択した形質転換体クローンを培養して発現ベクタープラスミドをWizard Plus SV Minipreps DNA Purification System(Promega)で精製した。発現ベクタープラスミドの精製はキットのプロトコールに準じた。精製した発現ベクタープラスミド内のmKO変異体の塩基配列を解析し、アミノ酸配列を決定した。塩基配列解析にはBigDye Terminator ver.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)を使用し、方法はキットのプロトコールに準じた。その結果、49番目のリジン(K)をグルタミン酸(E)に、70番目のプロリン(P)をバリン(V)に、176番目のフェニルアラニン(F)をメチオニン(M)に、185番目のリジン(K)をグルタミン酸(E)に、188番目のリジン(K)をグルタミン酸(E)に、192番目のセリン(S)をアスパラギン酸(D)に、196番目のセリン(S)をグリシン(G)に、210番目のロイシン(L)をグルタミン(Q)に置換されていた。この変異体をmKO2とした。蛍光タンパク質mKO2の塩基配列を配列番号20に示し、アミノ酸配列を配列番号21に示す。
大腸菌を用いてmKO2にHis-Tagを付加したリコンビナント蛋白質を発現させNi-NTA Agarose(QIAGEN)を用いて精製した。精製方法はキットのプロトコールに準じた。20uM蛍光タンパク質、150mM KCl、50mM HEPES-KOH pH7.4溶液の吸収スペクトルを分光高度計(U-3310 HITACHI)にて測定し、吸収スペクトルのピークの値よりモル吸光係数を算出した。500nmの吸収値が0.005となるようにmKO、mKO2を150mM KCl、50mM HEPES-KOH pH7.4溶液で調整して、蛍光分光光度計(F-2500 HITACHI)にて500nmの光で励起した際の蛍光スペクトルを取得し、その面積を算出した。mKOの蛍光の量子収率を0.6としてその面積比からmKO2の蛍光の量子収率を算出した。mKO2のpH感受性(pKa)に関しては100mM緩衝液100μlに2μlのmKO2タンパク質溶液(19.1mg/ml)を加えての吸収スペクトルを測定し、算出した。
pH4、5 :酢酸緩衝液
pH6 :リン酸緩衝液
pH7、8 :HEPES緩衝液
pH9、10 :グリシン緩衝液
mKOとmKO2の蛍光特性の比較を表6に記載する。
“モル吸光係数×量子収率=蛍光タンパク質分子としての絶対的な明るさ”より、
mKO=51600×0.6=30.9k
mKO2=63800×0.57=36.3k
となり、蛍光タンパク質分子として約1.2倍明るくなった。
蛍光タンパク質発現ベクタープラスミドpmKO1-MN1((株)医学生物学研究所)より、制限酵素NotI、XbaIでmKO(mKO1)遺伝子部分を切り出し、5’側にNotIサイト、3’側にXbaIサイトを付加したmKO2遺伝子を替わりに挿入した。制限酵素配列の付加はPCRで行なった。サーマルサイクラーはGeneAmp PCR system 9700を使用した。
テンプレート(mKO2-pRSET B) 1ul
X10 pfu バッファー 5ul
2.5mM dNTPs 3ul
20uM フォワードプライマー 1ul
20uM リバースプライマー 1ul
DMSO 5ul
ミリQ 33ul
pfu polymerase(2.5U/ul) 1ul
94℃ 1min(PAD)
94℃ 30sec (変性)
52℃ 30sec (プライマーの鋳型へのアニーリング)
72℃ 1min (プライマー伸長)
上記3ステップを30サイクル行った。
72℃ 7min (最後の伸長)
4℃ 保存
5'- ataagaatgcggccgcggggaccatggtgagtgtgattaaaccagag -3' (配列番号9)
リバースプライマー
5'-cgctctagattaggaatgagctactgcatcttctacca-3' (配列番号10)
以下に示すプライマー1及び2を用いて蛍光タンパク質mKO2をPCRで増幅し、pcDNA3 vector のEcoRI - EcoRVサイトに導入した。その後、以下に示すプライマー3とプライマー4の組み合わせ(Cdt1の30〜100番目のアミノ酸からなる断片を増幅する)、又はプライマー3とプライマー5(Cdt1の30〜120番目のアミノ酸からなる断片を増幅する)の組み合わせを用いて、Cdt1(Genbank Accession No.; NM_030928)の断片をPCRで増幅し、Xho I- XbaI サイトに導入した。また、レンチウイルスベクター(CSII-EF-MCS)へは、上記EcoRI - XbaIサイトを用いて移し変えた。なお、上記PCRは以下の条件で行った。
テンプレートDNA; 1〜10 ng / 1μl
10× polymerase buffer 10μl
2.5mM dNTP mix; 8μl
forward primer (20 μM); 1μl
reverse primer (20 μM); 1μl
DMSO; 5μl
Pfu porymerase 2.5U/μl 1μl
Mili Q 73μl
反応条件:
94℃ 2分
94℃ 1分
50℃ 30秒
72℃ 1.5分
上記3つの反応を28サイクル
その後、72℃ 7分
4℃ 保存
蛍光タンパク質mAGはイシサンゴ類のアザミサンゴより単離されたAzami Green(AG)の単量体変異体で、(株)医学生物学研究所、Amalgaam(有)より製品名mAG1として市販されている。
テンプレートDNA; 1〜10 ng / 1μl
10× polymerase buffer 10μl
2.5mM dNTP mix; 8μl
forward primer (20 μM); 1μl
reverse primer (20 μM); 1μl
DMSO; 5μl
Pfu porymerase 2.5U/μl 1μl
Mili Q 73μl
反応条件:
94℃ 2分
94℃ 1分
50℃ 30秒
72℃ 1.5分
上記3つの反応を28サイクル
その後、72℃ 7分
4℃ 保存
プライマー2:mKO2 reverse primer (m11-AGCter-EcoV-R) : 5'- atg gat atc cgc cct ggg aag gca aca ttg agt aat gag cta ctg cat ctt cta c(配列番号12)
プライマー4:Hu.Cdt(100)ter.XbaI(R): 5'- gca tct aga tta ttt ctt tat ctt ctg gcc cgg aga(配列番号14)
プライマー5:Hu.Cdt(120)ter.XbaI(R): 5'- gca tct aga tta gat ggt gtc ctg gtc ctg cgc(配列番号15)
プライマー7:mAG reverse primer (hM12-EcoV-R) : 5'- atg gat atc cct tgg cct ggc tgg gca gca t (配列番号17)
プライマー9:Hu.geminin(110)ter.XbaI(R): 5'- gca tct aga tta cag cgc ctt tct ccg ttt ttc tgc (配列番号19)
細胞培養法
HeLa細胞およびCOS7細胞を、10%ウシ胎児血清及びペニシリン/ストレプトマイシンを追加したDMEMで培養した。マウスNMuMG乳腺上皮細胞を、10%ウシ胎児血清、ペニシリン/ストレプトマイシン及び10 μg/mlインシュリン(シグマ)を追加したDMEM(高グルコース)で培養した。EGFとTGFβ1をR&Dから購入した。
Lipofectin 法を用いて、HeLa 細胞へ、実施例1で作製した遺伝子構築物をトランスフェクションを行った。具体的には、以下の通りである。細胞を10%ウシ胎児血清(FBS)を含むフェノールレッド無添加ダルベッコ修飾イーグル培地を加えた35mmガラス底ディッシュ上で培養した。A液(プラスミド1μg、Opti-MEM 100 μl)とB液(lipofectin 4 μl、Opti-MEM 100μl)をそれぞれ作成し、混合後、室温で15分静置した。ガラスボトムディッシュにあらかじめ準備しておいた細胞の培養上清を Opti-MEMに置き換える。A液とB液の混合液を細胞の培養液上に加えた。4時間後に培養上清を新しい培養液に置き換えた。
HEK293細胞を用いて、mKO2-Cdt1#10、mAG-Geminin#2それぞれのレンチウイルスを作成し、様々な細胞へのトランスダクションを行った。具体的には、以下の通りである。
レンチウイルス作成の手順については、理化学研究所BRC生体情報統合技術開発チーム細胞運命情報解析技術開発サブチームの三好先生の方法を改変して行った。すなわち;
A液;
pCAG-HIVgp plasmid 10 μg
pCMV-VSV-G-RSV-Rev plasmid 10 μg
CSII-EF-MCS-mKO-Cdt1#10 or CSII-EF-MCS-mAG-Geminin#2 17 μg
Opti-MEM 1.5 ml
B液;
Lipofectamine 2000 36 μl
Opti-MEM 1.5 ml
任意の細胞を準備する。プラスチックディッシュに張り付いている細胞、または浮遊している細胞の培養上清に、ウイルス液を加える。30〜300 μl / 3.5 cm dish 位がおおまかな目安になる。2から3日後に蛍光顕微鏡にて観察すると、トランスダクション(ウイルスが感染して、遺伝子がゲノムにインテグレート)された細胞が蛍光を発するのが観察できる。2種類のウイルス mKO-Cdt1#10 と mAG-Geminin#2 を同時にトランスダクションし、1週間後からシングルセルクローニングを始める。4週間くらいかけて、シングルから細胞が成長し、2色の蛍光を発するコロニーを回収し、インディケータ発現細胞とする。HeLa_LV_mKO2-Cdt1#10 & mAG-Geminin#2 におけるクローンの蛍光顕微鏡観察の結果を図2に示す。
分析方法
カバーグラス上で培養したFucci発現HeLa細胞を、37℃で5分間BrdU(シグマ)で処理した。PBS(-)で洗浄した後に、細胞を、4℃で10分間4%PFAで固定した後、室温で5分間0.1%TritonX-100/PBS(-)で処理した。
使用した抗体は次の通りである:アレクサ・フルーアー633(モレキュラープローブ)とコンジュゲートしたヤギ抗マウスIgG、マウス抗BrdU mAb(イムロジカルダイレクト)、及びマウス抗PCNA mAb(ダコ)。イメージの入手を488nm(Ar)、543nm(He/Ne)および633nm(He/Ne)のレーザー線を装備したFV500(オリンパス)共焦点顕微鏡システムを用いて実施した。
ヘキスト33342溶液(1mg/mlストックの56μl)(ドージンドー)を、親又はFucci発現HeLa細胞を含む10cmディッシュに加えた。30分間のインキュベーション後、細胞を集め、及びBDTMLSR(ベクトンデッキンソン)を用いて分析した。mKO2及びmAGを488nmのレーザー線(Ar)で励起し、ヘキスト33342を325nmのレーザー線(HeCd)で励起した。蛍光信号は、mAGに対して530 nm (530/28 BP)(FL1)、mKO2に対して575 nm (575/26 BP)(FL2)、ヘキスト33342に対して400 nm (380 LP) (FL5)で集めた。データはFlowJoソフトウェア(ツリースター)を用いて分析した。
上皮間充織転移(EMT)は、胚発生、創傷治癒及び多細胞性組織における腫瘍進行において、間葉細胞が上皮から形成される基本的な形態形成プロセスである。in vitroで、EMTは細胞−細胞間結合の分解、細胞骨格の転位、及び培養細胞の運動性の増加によって特徴付けられる。細胞周期の特定のステージがプロセスに含まれる可能性がある。確かに、トランスフォーミング成長因子β(TGFβ)は、G1/S期で同期されたAML−12肝細胞においてEMTを効率的に誘導するが、G2/M期で同期された細胞においてはその活性はない。さらに、NMuMG細胞は、TGFβに応じてEMTを受ける。EMT中の細胞周期進行を調査するために、Fucciを発現し、安定して形質転換されたNMuMG細胞を検査した。
mKO-Cdt1#10 及び mAG-Geminin#2をそれぞれpCAGGS ベクターに組み込んだプラスミドの名前をpCAGGS_mKO-Cdt1#10 、pCAGGS_mAG-Geminin#2 とする。それらプラスミドから、マウス卵細胞にインジェクションするためのフラグメントを生成した。
pCAGGS_mKO-Cdt1#10 or pCAGGS_mAG-Geminin#2 20μg / 40 μl
10x H buffer 10 μl
H2O 50 μl
制限酵素 Sal I、Pst I、Pvu I
マウスの全身イメージング方法
ホフマンおよびヤングらの文献(Nat. Protocol, (2006), 3, 1429-1438)に記載され
ている通りに、培養細胞の皮下及び静脈注射、並びにOV100(オリンパス)を備えた全身
イメージングを実施した。血管を視覚化するために、アンジオセンス−IVM750(ヴィス
エンメディカル)を投入し、又は、内皮細胞を抗CD31 mAb(ケミコン)を用いて染色した
。
i産生マウス系統を生成し、すべての体細胞核は赤色又は緑色の何れかの蛍光を示した
。
脳スライスを、E13でFucci発現マウス(#596/#504)で準備し、及びミヤタらの文献(J.
Neurosci. Res. (2002), 69, 861-868)に記載されている通りに、コラーゲンゲルで
培養した。スライスを5%CO2及び40%O2に暴露した。3DイメージングはFV1000多重位置ス
テージシステムを用いて、xyz-tモードで行なった。記録間隔を10分とした。各時間ポ
イントでは、Z軸(2μmステップ)に沿った20の焦点を共有するイメージが得られた。緑
および赤信号のクロス検知を回避するために、イメージは488nm(Ar)および543nm(H
e/Ne)で連続して得られた。緑及び赤のイメージは個々の焦点を共有するイメージのた
めに統合された。2レーザー線及び検知チャンネルを備えたFV1000の正確なイメージ登
録及び適切な整列は、二重に標識された蛍光性ビーズ(テトラスペック蛍光マイクロス
フェアスタンダード、直径0.5μm、モレキュラープローブ)を用いて確認された。デー
タ分析は、Volocityソフトウェア(インプロヴィジョン)及びMETAMORPFソフトウェア(ユ
ニバーサルイメージング、メディア、PA)を用いて行なわれた。
蛍光性タンパク質で遺伝学的標識した培養腫瘍細胞を注入したマウスの全身及び生存中の細胞のイメージングは、腫瘍発生を調査するための強力な技術である。ヌードマウスの乳腺皮下へFucci発現NMuMG細胞を皮下注射することにより、腫瘍発生をモニターするためにFucciを使用した(図5A)。接種1日後に、緑色及び赤色の細胞が観察された(図5B)。しかしながら、16日後には、赤色を示す細胞だけが見られ(図5C)、NMuMG細胞が増殖を停止したことを示した。次に、Fucci発現HeLa細胞を、同様の方法でヌードマウスに注入した(図5D)。注入細胞は徐々に増殖し、常に緑色及び赤色蛍光を発し、腫瘍進行を示唆した(図5E及び5F)。拡大像は、接種27日後に顕微鏡(オリンパス、IV100、10X、UplanFL N N.A.=0.30)下で皮膚を通して観察された(図5G)。非常に発達した腫瘍容積が遠赤外の蛍光を放射するアンジオセンス750をロードすることにより視覚化された。3色のライブイメージは、G1及びS/G2期にあるHeLa細胞を識別するが、容積と関連のあるそれらの位置は低い空間分解能により明らかではなかった。腫瘍を固定及び分離し、CD31に対する抗体で染色した。Fucciの赤色及び緑色蛍光は、4%PFAにおける固定を含む従来の免疫染色手順後に留まった。血管のまわりのHeLa細胞の細胞周期パターンは、明白に視覚化された(図5H)。パターンは、容積の成熟及び周囲の組織中の壊死の程度を含むいくつかの要因に依存するように見えた。
遺伝学的にコード化されたプローブの主な1つの利点は、転写調節に依存する必要がないということである;その転写は構成的恒常的なプロモーターを使用して動くことを可能とする。したがって、容易に細胞周期分析用の遺伝子組み換え生物を生成作製できる。FucciトランスジェニックE13胎期マウスを固定化し、脳の冠状断切片を用意した。赤色及びまたは緑色蛍光は共焦点走査顕微鏡を用いて、すべての部分において検査された。3つの代表的な部分の蛍光イメージを図6A、6E及び6Iの中で示した。赤色及び緑色シグナルは、胚形成期でよく平衡に保たれるように見える。しかし、マウスが成長するとともに、赤色に対する緑色シグナルの全体比率は減少する。
Fucciを恒常的に発現する良性腫瘍細胞(NMuMG細胞)および、Fucciを恒常的に発現する悪性腫瘍細胞(HeLa細胞)を用い、抗がん剤などに対する反応を観察した(図10)。コントロールとしたDMSO処理の細胞からのデータは、赤色と緑色が混在し、通常の増殖を示した。CDK4 inhibitor(G1期阻害剤)は、良性腫瘍細胞のNMuMG細胞には十分に作用するが、悪性腫瘍細胞のHeLa細胞には効果がなかった。etoposide(topoisomerase 2 の阻害剤)は、悪性腫瘍細胞には十分作用し、S/G2 期での細胞周期停止が起きるが、NMuMG細胞では効果が強く、apotosisが誘導された。Nocodazole(M期阻害剤)は、いずれの細胞もM期で丸くなった状態で停止した。
mKO2-Cdt1#10およびmAG-Geminin#2などのDNA構築物、それらの安定した形質転換体細胞系統、およびこの明細書中で記載されたトランスジェニックマウス系統は、MBLインターナショナル(Amalgaam) (http://www.mblintl.com/mbli/index.asp).からのmKO2又はmAGに対するcDNAの付随購入で供給されうる。
Claims (15)
- 細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する2以上の遺伝子発現産物をマーカーにより可視化して、前記マーカーを検出することによって細胞周期の増殖期と休止期とを識別することを特徴とする、細胞周期の検出方法において、
一つの細胞の中で、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する2以上の遺伝子発現産物として、G1期で存在量が増加し、S/G2/M期で存在量が減少する第一の発現産物、及び、G1期で存在量が減少し、S/G2/M期で存在量が増加する第二の発現産物を少なくとも使用し、
上記第一の発現産物はCdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片であり、上記第二の発現産物はGemininからCdt1結合部位を除いた部分断片であり、
上記第一の発現産物と第二の発現産物とはそれぞれ異なるマーカーで標識して可視化されている、ことを特徴とする、細胞周期の検出方法。 - 第一の発現産物が、Cdt1の30から120番目のアミノ酸からなる部分断片である、請求項1に記載の方法。
- 第二の発現産物が、Gemininの1から110番目のアミノ酸からなる部分断片である、請求項1又は2に記載の方法。
- マーカーが蛍光タンパク質又は発光タンパク質である、請求項1から3の何れかに記載の方法。
- 生きた細胞又は組織を対象としたタイムラプスイメージング観察により、上記マーカーを経時的に検出することを特徴とする請求項1から4の何れかに記載の方法。
- Cdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子とマーカーをコードする遺伝子とを含む第一の遺伝子構築物、及び、GemininからCdt1結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子とマーカーをコードする遺伝子とを含む第二の遺伝子構築物(ただし、前記マーカーは互いに異なるものである)を、細胞内で共発現する、形質転換体、又は遺伝子導入非ヒト動物。
- Cdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子が、Cdt1の30から120番目のアミノ酸からなる部分断片をコードする遺伝子である請求項6に記載の形質転換体、又は遺伝子導入非ヒト動物。
- GemininからCdt1結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子が、Gemininの1から110番目のアミノ酸からなる部分断片をコードする遺伝子である請求項6又は7に記載の形質転換体、又は遺伝子導入非ヒト動物。
- マーカーをコードする遺伝子が、蛍光タンパク質又は発光タンパク質をコードする遺伝子である、請求項6から8の何れかに記載の形質転換体、又は遺伝子導入非ヒト動物。
- 細胞周期阻害剤、又は細胞周期が関与する疾患用の薬剤の候補物質、あるいは特定の遺伝子発現を抑制する試薬の存在下において細胞を培養し、該細胞について請求項1から5の何れかに記載の細胞周期の検出方法を行うことによって細胞周期および/又は細胞死に影響を及ぼす候補物質を選択することを特徴とする、細胞周期阻害剤、又は細胞周期が関与する疾患用の薬剤のスクリーニング方法あるいは化合物、薬剤、試薬の効能、作用機序について検定する方法。
- 細胞周期阻害剤、または細胞周期が関与する疾患用の薬剤の候補物質、あるいは特定の遺伝子発現を抑制する試薬を、請求項6から9の何れかに記載の遺伝子導入非ヒト動物に投与し、それらの、腫瘍の増殖、免疫系、血球系などの細胞の細胞周期、生存などに影響を及ぼす候補物質を選択することを特徴とする、疾患治療薬のスクリーニング方法あるいは化合物、薬剤、試薬の効能、作用機序について検定する方法。
- 上記第一の発現産物が上記マーカーとしての赤色蛍光タンパク質で標識され、上記第二の発現産物が上記マーカーとしての緑色蛍光タンパク質で標識されていることを特徴とする請求項1に記載の細胞周期の検出方法。
- 上記第一の遺伝子構築物がコードする上記マーカーが赤色蛍光タンパク質であり、上記第二の遺伝子構築物がコードする上記マーカーが緑色蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項6から9の何れかに記載の形質転換体、又は遺伝子導入非ヒト動物。
- 請求項6から9の何れかに記載の形質転換体又は遺伝子導入非ヒト動物の作成に用いられる細胞周期指示薬であって、Cdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子とマーカーをコードする遺伝子とを含む上記第一の遺伝子構築物、及び、GemininからCdt1結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子とマーカーをコードする遺伝子とを含む上記第二の遺伝子構築物、とを備えることを特徴とする細胞周期指示薬。
- 上記第一の遺伝子構築物がコードする上記マーカーが赤色蛍光タンパク質であり、上記第二の遺伝子構築物がコードする上記マーカーが緑色蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項14に記載の細胞周期指示薬。
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