JP2007531514A - 非侵襲的でリアルタイムでインビボでの生きた生物における局所Ca2+動態の生物発光による画像化 - Google Patents
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Abstract
Description
腔腸動物の中に、生物発光種が存在する。数多くの研究により、生物発光は、カルシウムに感受性であることが多い光タンパク質により発生することが示された。タンパク質に言及する場合に本明細書で使用した感受性は、該感受性タンパク質のそのコンフォメーション、他の分子に対する親和性、局在、または光放射のあらゆる改変を意味する。この種の特定のタンパク質は、カルシウムイオン濃度の増加に応答して、一瞬の光を放射する。これらの光タンパク質の中で、エクオリン(Aequorin)は、最もよく研究されているものの1つである(Blinksら、1976)。
電気生理的記録は、マイクロピペットが近づける細胞体または大きな樹状突起領域に限定される。
−DNA構造物(DNA construct)を、非ヒト動物の胚幹細胞に導入すること、ここで、該DNA構造物は、カルシウム濃度に感受性の組換えポリペプチドをコードする配列、いわゆる導入遺伝子を含むかまたはからなり、該組換えポリペプチドは、蛍光タンパク質に連結させた化学発光タンパク質を含むかまたはからなり、該導入遺伝子は、プロモーターおよび場合により条件的発現配列の制御下に置かれている、
−該DNA構造物が該胚幹細胞のゲノムに挿入されている、陽性クローンを選択すること、
−該陽性クローンを胚盤胞に注入し、キメラ胚盤胞を回収すること、そして
−該キメラ胚盤胞を育成して、非ヒトトランスジェニック動物を得ること
を含む。
−DNA構造物を、非ヒト動物の胚幹細胞に導入し、ここで、該DNA構造物は、カルシウム濃度に感受性の組換えポリペプチドをコードしている配列、いわゆる導入遺伝子を含むかまたはからなり、該組換えポリペプチドは、蛍光タンパク質に連結させた化学発光タンパク質を含むかまたはからなり、該導入遺伝子は、プロモーターおよび場合により条件的発現配列の制御下に置かれている、
−該DNA構造物が該胚幹細胞のゲノムに挿入されている、陽性クローンを選択し、
−該陽性クローンを胚盤胞に注入し、キメラ胚盤胞を回収し、
−該キメラ胚盤胞を育成して、非ヒトトランスジェニック動物を得、
−得られた第一の該トランスジェニック非ヒト動物を、該組換えポリペプチドの発現が必要とされる組織または細胞において、条件的発現配列に作用するエンドヌクレアーゼを発現している動物と交雑させ、
−特定の組織または細胞において該組換えポリペプチドを発現しているトランスジェニック非ヒト動物を回収する。
a)カルシウム濃度に感受性の組換えポリペプチドを発現しているトランスジェニック動物において、本発明の光学的検出法により、Ca2+の動態を検出すること、
b)対象の分子を、該トランスジェニック動物に投与または該トランスジェニック動物において発現させること、
c)ステップa)を繰り返すこと、
d)注入前後のCa2+の位置、動態、場合により量を比較すること、ここで、Ca2+の位置、動態、および/または量の変動は、該分子がCa2+トランジェントをモデュレート(modulate)できることを示唆している、
を含む。
標的化ベクターの作製(図1および2)
GAは、2つのタンパク質間に5回反復の柔軟性リンカーを含む、G5Aと称される、標的化されていないGFP−エクオリンを示す。GFP−エクオリン(GA)およびシナプトタグミン−G5A(SynGA)の作製は、以前に記載されている(WO01/92300)。GFP−エクオリンキメラをシナプス後ドメインに標的化するために、本発明者らは、PSD95のN末端領域とGAの融合物を創造した。この構造物では、PSD95遺伝子(図12)の全長を、pGA(C.N.C.M.I−2507、2000年6月22日に寄託)のHindIII/EcoRIにクローニングし、プラスミドPSDGAを得た。その後、以下の配列5’A ATT CGG TCC GGC GGG AGC GGA TCC GGC GGC CAG TCC CCG C’3(図11)からなる柔軟性リンカーを、PSD95とGFPの開始部位の間に加えた。
培養液を、ガラス底の皿に入れ、ブラックボックスに据え付けた完全自動化倒立顕微鏡のステージアダプターに固定した。GFP−エクオリンを、2.5〜5μMのコエレンテラジンを用いて37℃で30分間かけて再構成した。SynGAでトランスフェクトさせておいた細胞とコエレンテラジンを共に室温でインキュベートし、再構成過程中の光タンパク質の消費を減少させた。細胞を、タイロード緩衝液で灌流した。NMDAの溶液を適用前に、細胞を、Mg2+の非存在下で1分間灌流した。記録は全て室温(22〜25℃)で行なった。顆粒状の外見を持たない位相の明るい10〜15μmの細胞体直径有する細胞を測定用に選択した。SynGAでトランスフェクトさせ野生型コエレンテラジンで再構成した細胞は、規則的に、静止状態で低レベルの生物発光活性を示した。活性は、均一のようであり、細胞体領域ではより明確のようであった。このことは、このように標的化したGAが、高濃度のCa2+を付与されたドメイン内にあることを示唆する。2つの場合において、PSDGAでトランスフェクトさせた細胞が、自発的活性を示し、これは樹状突起領域に局在していた。
器官型海馬切片を、4〜5日令の子マウスから調製した。簡潔には、脳を、氷冷ハンク緩衝液中で迅速に取り出し、組織チョッパーで200μmの切片にスライスした。海馬切片を、立体顕微鏡を使用して同定し、無菌トランスウェルコラーゲン被膜チャンバー(直径12mm、孔径3.0μm)に移した。切片を、37℃で、5%CO2を含む加湿雰囲気中、B27で補充した神経基礎培地中で維持した。切片を、9日目にアデノウイルス−GFP−エクオリンベクターで感染させ、さらに4または5日間培養中で維持し、その後、画像化した。この段階で、切片は健康のようであり、個々の細胞は、GFP蛍光により明らかに識別できた。コエレンテラジンと共にインキュベートした後、切片を、室温で、9時間まで倒立顕微鏡上に維持でき、その9時間目の時点で、生物発光活性の大きな増加および細胞蛍光の消失により示される細胞死が明らかとなった。Ca2+リポーターの検出に光励起が必要とされないので、光線力学傷害を引き起こすことなく長期画像化を実施することができる。長時間におよぶ画像化は連続的である。積分期間を選択する必要はない。バックグラウンドは、256×256画素領域(665.6×665.6μm)において極めて低く、1光子/秒未満である。いくつかの実験では、トランスジェニックマウスの体性感覚皮質の400〜450μm冠状切片を、振動器を使用して切り出し、画像化の前に4〜5日間培養中に入れた。切片を、95%O2および5%CO2で泡立てたACSFで灌流した。1時間インキュベートした後、切片をMg2+を含まないACSFで灌流した。室温(25〜28℃)で記録した。薬物を灌流液を通して加えた。
本発明者らは、遺伝子工学した新しいリポーター分子を有し、これによれば、GAは、トランスジェニックマウスの細胞下ドメインに標的化されている。GA導入遺伝子は、任意の細胞型および/または任意の発達段階で発現させることができる。発現は、強力なプロモーターであるβ−アクチン(CAG)の直後にあるLox−stop−Lox配列を使用して条件的とした。発現細胞の選択は、特異的プロモーターにより駆動される、適切なエンドヌクレアーゼCreを使用して行なう。転写が開始される時点は、遺伝子Cre−ERT2を使用する場合にはタモキシフェンを注入することにより開始される。最後に、任意の細胞で発現できるように、転写単位を、ES細胞の再構成HPRT遺伝子座(X染色体)に相同的組換えにより導入し、発現レベルに対する組込み部位の影響を最小限にした。ここに示した実験において、非常に初期の胚においてGA導入遺伝子を活性化するPGK Creトランスジェニックマウスを使用した。
ミトコンドリアに標的化されたGFP−エクオリンリポーターを発現している皮質ニューロンまたは脳切片を、PBS中4%ホルムアルデヒド中で室温で20分間固定した。PBSで洗浄した後、細胞膜を、0.1%Triton−X100およびBSAを含むPBSで透過性とした。その後、細胞を、一次抗体と共に室温で1〜2時間インキュベートした。標的化を、抗チトクロムc(1:500; BD Biosciences Pharmingen、米国CA州)およびMito Tracker(登録商標)Red CMXRos(200nM;Molecular Probes社)と比較した。抗体の結合は、Alexa Fluor(登録商標)546(Molecular Probes社)にコンジュゲートさせた二次抗体中で1時間インキュベートした後に測定した。洗浄後、細胞を、フルオロマウント(Fluoromount)のスライドにのせ、共焦点解析により可視化した。画像を、LP560およびBP505−550フィルターを使用して油浸対物レンズ(63倍/1.4NA)を通して、Axiovert 200Mレーザー走査共焦点顕微鏡(Zeiss LSM-510;バージョン3.2)で獲得した。ピンホール開口部を98Tmで設定し、画像を、8ビット解像度で512×512アレイにデジタル化した。
蛍光/生物発光広視野顕微鏡システムは、ScienecWares社に特別注文して製造された。該システムは、完全自動化倒立顕微鏡(200M、Zeiss、ドイツ)を含み、光を通さない暗いボックスに入れられている。メカニカルシャッターが、ボックスの外に据え付けられ、ファイバーオプティックケーブルを介して顕微鏡に接続されている、ハロゲンおよびHBOアークランプの両方からの照射を制御する。低レベル光放射(光子速度<100kHz)を、顕微鏡のベースポートに接続されたImage Photon Detector(IPD3、Photek社)を使用して収集し、これは各々の検出された光子のX、Y座標および時点を割り当てる(Millerら、1994)。該システムは、データ取得ソフトウェアにより完全に制御されており、これはまた単一の光子事象を画像に変換し、これを、Cポートへと接続されたCCDカメラにより作成された明視野または蛍光画像と重ね合わせることができる(Coolsnap HQ、Roper Scientific)。それ故、可視化されるあらゆるCa2+活性を、対象の領域を選択し、光子データを出力することにより、より詳細に解析できる。実験が完了した後、記録したムービーファイルを再生し、データをユーザーの必要性に応じて抽出できる。IPDは、ミリ秒未満の時間解像度を提供でき、取得のために積分時間が明確である必要はない。本発明者らが使用する該システムは、256×256画素領域において、<1光子/秒という、非常に低いバックグラウンド光子計数レベルを有する。
いくつかの実験において、電気パルスを、ホウケイ酸塩ガラス(World Precision Instruments、米国フロリダ州)から引き伸ばした、古典的なパッチピペット(5〜10MΩ)を介して、試験下の細胞に送達した。実験室内で作成された電気作動するリレーシステムにより、隔絶された刺激器(DS2A、Digitimer社、英国)により送達される刺激間のピペット抵抗性の測定が可能となった(図14参照)。Ca2+波の伝播速度は、刺激後に放射される光の最大値の半分に対応する時点をとり、解析した2つの領域の中心間で測定された距離で割ることにより計算した。
天然のコエレンテラジン(体重1gあたり4μg;Interchim、フランス)を、腹腔内注入によりP1〜P4マウスに導入した。マウスの画像化は、基質(コエレンテラジン)注入の1〜1.5時間後に開始した。リアルタイムの画像化を可能とし、生きた生物内の細胞活性をモニタリングおよび記録することのできるIVIS(登録商標)画像化システム100シリーズを、これらの研究で使用し、動物完全体レベルでの局所Ca2+変化を検出した。該システムは、光を通さない低バックグラウンド画像化チャンバー内の、冷却された背面の薄い背面照射のCCDカメラを特徴とする。マウスのグレースケール表面画像を、最初に、10cmの撮像視野、0.2秒間の露光時間、2というビニング解像度係数、16f/stop(開口部)およびオープンフィルターを使用して獲得した。生物発光画像は、グレースケール画像の直後に獲得した。生物発光画像の獲得時間は、1〜5秒間、ビニング8および16、撮像視野10cm;f/stop1の範囲であった。インビボでの生物発光から伝達される光の相対強度は、紫(最も強度が低い)から赤(最も強力)の範囲の偽色画像として表示した。対応するグレースケール写真およびカラーのルシフェラーゼ画像を、LivingImage(Xenogen)およびIgor(Wavemetrics、Lake Oswego、オレゴン州)画像解析ソフトウェアを用いて重ね合わせた。
結果1:GAを細胞下ドメインに標的化
特定の細胞下区画において発現させるために、様々なGAリポーターを、対象のシグナルペプチドまたはタンパク質と融合させることにより作成した(図1および2)。GAは、シナプス伝達に重要なドメイン:ミトコンドリアマトリックス、小胞体、シナプス小胞、およびシナプス後肥厚部に標的化された。共焦点解析により、ミトコンドリアマトリックスに標的化させるためにチトクロムcのシグナルペプチドに融合させた後(mtGA)、ER腔に標的化させるためにIgG重鎖に融合させた後(erGA)、シナプス小胞膜のサイトゾル側に標的化させるためにシナプトタグミンIタンパク質に融合させた後(SynGA)、またはシナプス後肥厚部に標的化させるためにPSD−95に融合させた後に(PSDGA)、期待されるGAリポーター発現パターンが示された(図4)(Christophersonら、2003;Conroyら、2003)。
本発明者らは、ニューロンに均一に分布している標的化されていないGAを用いてこれらの研究を開始した(図5)。GAをhコエレンテラジン(高親和性型のルシフェリン)を用いて再構成した後、NMDA(100μM)およびKCl(90mM)で刺激すると、皮質ニューロンにおいて強力なシグナルが発生した(図5BおよびC)。これは、小さな哺乳動物ニューロンにおけるCa2+応答が、単一および細胞下レベルにおいて、生物発光リポーターを用いて直接可視化された始めての例であった。実験の最後にジギトニンおよび高濃度のCa2+を適用することにより、依然として十分な量の光タンパク質が残存していることが示された(図5D)。実験の最後に高濃度Ca2+およびジギトニンも加えて、データを標準化するために全体の利用可能なGFP−エクオリン(Lmax)を測定した(方法の章のLmaxの定義を参照)。
実施例1:GAを、ミトコンドリアマトリックスなどの区画に標的化させると、Ca2+応答の反応速度特性の差異を細胞下で検出できた(図6)。NMDAの適用が、異なる時間プロファイルを有する、画定された細胞位置におけるCa2+応答を引き起こした代表例を示した。図6AおよびBは、慣用の蛍光と比べて低レベルの光放射および中程度の空間的解像度にも関わらず、特定の領域におけるCa2+応答を解析できたことを示す。リポーターを細胞下に標的化した場合、バックグラウンドと比べて1000倍以下の大きさのシグナルを依然として検出できた(15×15画素領域、1画素=0.65μm)。グラフで示される局所領域から導いたグラフデータは、ミトコンドリアCa2+変化の空間時間的特性の多様性を実証する。
Ca2+活性の動的画像は、インビボでの生きた被験者の動物完全体の生物発光による画像化により獲得できる(図15〜18)。生じた光は、哺乳動物の組織を貫通し、外的に検出でき、感度の高い光画像化システムを使用して定量できる。生きた動物内から発生するGFP−エクオリンシグナルにより、高い信号雑音比のCa2+流入画像が得られ、これは、高度な時間的解像度をもって追跡できた。この技術は、生きた被験者において非侵襲的な機能的アッセイを実施するための強力なツールを示し、前臨床試験研究のためのより予測的な動物データを提供するはずである。
したがって、本発明は、光タンパク質に共有結合的に連結した蛍光分子を含む、改変された生物発光システムを提供し、ここで、2つのタンパク質間の連結は、改変された生物発光システムを安定化させる機能を有し、化学発光共鳴エネルギー移動(CRET)によりエネルギーが移動することを可能とする。好ましい実施形態において、生物発光システムは、エクオリンタンパク質に共有結合的に連結したGFPタンパク質を含み、ここで、2つのタンパク質間の連結は、改変された生物発光システムを安定化させる機能を有し、化学発光共鳴エネルギー移動(CRET)によりエネルギーが移動することを可能とする。
GFP−リンカー−AEQ
の組換えポリペプチドを利用する。
(Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gln Ser)n(ここでnは1〜5である)
を含むことができる。好ましくは、nは1であるか、またはnは5である。リンカーはまた、アミノ酸配列Ser Gly Leu Arg Serを含むことができる。
GFP−リンカー−AEQ
を有する。
(Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gln Ser)n(ここでnは1〜5である)
を含み;ここで、融合タンパク質は、Ca2+イオンに対する親和性および少なくとも24時間の半減期を有する。リンカーは、アミノ酸配列Ser Gly Leu Arg Serを含むことができる。さらに、該組換えポリペプチドはさらに、組換えポリペプチドを細胞または細胞下区画に標的化させるためのペプチドシグナル配列を含むことができる。
以下の用語は、本明細書で使用する場合、以下の意味を有する。
原子または分子からのUV、可視、またはIRの電気磁気的放射線の放射。この放射は、電気的に励起された状態から、より弱いエネルギー状態、一般には基底状態への遷移により生じる。
非常に短い電気的に励起された一重線により生じる蛍光。この発光は、励起源と同時に消失する。
化学反応により生じる発光。
生きた生物により生じる可視的な化学発光。本発明は、支持体に固定することなく、クラゲに天然に存在するシステムを模倣した。
本発明に記載の生物発光システムは、真ん中にペプチドリンカーと補酵素(すなわちコエレンテラジン)を含むキメラ三量体分子である。リンカーと共有結合的に付着している第一分子および第二分子は、第一にドナー部位、第二にそれに付着したアクセプター部位を有していれば、どんなものでもよい(受容体−リンカー−リガンド、抗体−リンカー抗原)。該キメラタンパク質は、Coen.L.、Osta.R.、Maury,M.、およびBrulet,P.、Construction of hybrid proteins that migrate retrogradely and transynaptically into the central nervous system.、Proc.Natl.Acad.Sci.(米国)94(1997)9400-9405により、軸策での逆行的なシナプス経由輸送のために破傷風毒素断片に融合させても、または膜受容体に融合させてもよい。
エクオリンがカルシウムイオンと結合した時、エクオリンからGTPへの光子の放射はない。(それ故、本発明においてエクオリンによる青色光の伝達はなく、エネルギー移動は、2つのタンパク質間で直接なされる)。
蛍光による共鳴によるエネルギー移動(すなわち2つのGFP変種間での)。
緑色蛍光タンパク質およびカルモジュリンに基づいたCa2+の蛍光指示物質。
化学発光による共鳴エネルギー移動(すなわち、リンカーを含まないGFP−エクオリン(クラゲエクオリア(Aequorea))とのまたはGFP−オベライン(obeline)との融合タンパク質。
化学発光エネルギー移動
生物発光による共鳴によるエネルギー移動(すなわち、GFPとルシフェラーゼ(クラゲ・レニラ(Renilla))の間の相互作用)。
生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)システム:相互作用している生体時計タンパク質への適用。
以下の文献を本明細書に引用する。本明細書に引用したこれらの各々の文献および他の各々の文献の全開示を信頼し本明細書に取り込む。
第6,662,039 B2号。蛍光指示物質を用いての神経接続の光学的プロービング。2003年12月、Yusteら。
Claims (78)
- 生物系におけるCa2+動態の光学的検出法であって、前記方法は、前記生物系に存在する、蛍光タンパク質に連結した化学発光タンパク質を含むかまたはからなる、組換えCa2+感受性ポリペプチドにより放射される光子をモニタリングすることを含む、前記方法。
- 細胞内Ca2+シグナル伝達の光学的検出のための、請求項1に記載の方法。
- ある細胞から別の細胞への伝達を検出するためにCa2+シグナルの伝播を光学的に検出するための、請求項1に記載の方法。
- 前記検出を、インビボで行なう、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記検出を、生体外で行なう、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化学発光タンパク質が、カルシウムイオンと結合する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化学発光タンパク質が、エクオリンである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記エクオリンが、カルシウムイオンに対する低い親和性を有する変異エクオリンである、請求項7に記載の方法。
- 前記の変異エクオリンが、次の置換Asp407→Alaを有する、請求項8に記載の方法。
- 前記蛍光タンパク質が、GFPである、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記蛍光タンパク質が、異なる波長で発光するGFPの変種である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記のGFPの変種が、CFP、YFP、およびRFPからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
- 前記蛍光タンパク質が、前記組換えポリペプチドの光子放射強度および/または安定性を向上させる、GFPの変異体である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドが、エクオリンおよびGFPまたはそのそれぞれの変異体もしくは変種を含むかまたはからなり、前記エクオリンおよびGFPが、化学発光共鳴エネルギー移動(CRET)を可能とするリンカーにより連結されている、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リンカーが、4〜63アミノ酸、好ましくは14〜50アミノ酸を含む、請求項14に記載の方法。
- 前記リンカーが、配列[Gly−Gly−Ser−Gly−Ser−Gly−Gly−Gln−Ser]nを含むかまたはからなり、ここでのnは1〜5であり、好ましくはnは1であるか、またはnは5である、請求項14〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドがさらに、前記の得られる生物発光タンパク質を特定の細胞ドメインまたは細胞区画へと標的化させることのできる、ペプチド断片を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチド断片が、シナプトタグミン、PSD95、チトクロムCオキシダーゼのサブユニットVIII、免疫グロブリン重鎖を含む群より選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記の生物系が、細胞または細胞群より選択される、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の生物系が、組織またはその一部である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記の生物系が、動物完全体または植物である、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 光子放射をモニタリングする前に、エクオリンを活性とするために、コエレンテラジンを投与するステップを含む、請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 光子放射をモニタリングする前に、前記組換えポリペプチドを生物系に投与するステップを含む、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドを、生物系に、好ましくは静脈内、腹腔内、または筋肉内に注入する、請求項21〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドをコードする核酸を、生物系に導入する、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドをコードする前記核酸を、組換えベクターにより、特に組換えウイルスベクターにより、生物系に送達する、請求項25に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドをコードする前記核酸を、遺伝子導入により生物系に導入する、請求項25に記載の方法。
- 前記光学的検出を、ゲノムから前記組換えポリペプチドを発現している非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物で行なう、請求項21〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 前記非ヒトトランスジェニック動物が哺乳動物である、請求項28に記載の方法。
- 前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項29に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドの発現および/または局在が、特定の組織、単細胞型、または細胞区画もしくはドメインに限定される、請求項27〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記単細胞型が、神経細胞、心臓細胞、または肝臓細胞である、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞区画が、ミトコンドリアまたは葉緑体である、請求項31に記載の方法。
- a)GFP蛍光検出による、細胞群、組織、細胞、または細胞区画もしくはドメインの発達、形態、または機能の特徴づけ、および
b)請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法による、前記細胞群、前記組織、前記細胞、または前記細胞区画もしくはドメインにおけるCa2+動態の特徴づけ
を含む、生理的過程および/または病的過程の同定法。 - インビボでのCa2+動態のモニタリングが可能な条件において、蛍光タンパク質に連結した化学発光タンパク質を含むかまたはからなるカルシウム濃度に感受性の組換えポリペプチドを発現している、トランスジェニック非ヒト動物。
- 前記化学発光タンパク質がカルシウムイオンと結合する、請求項35に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- インビボで非侵襲性のモニタリングを実現させることのできる、請求項35〜36のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記組換えポリペプチドが、前記動物に遺伝子的にコードされている、請求項35〜37のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- カルシウム濃度に感受性の前記組換えポリペプチドが、前記トランスジェニック動物のゲノムに挿入されているポリヌクレオチドによりコードされている、請求項35〜38のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- カルシウム濃度に感受性の前記組換えポリペプチドをコードしている前記ポリヌクレオチドが、適切な転写系および/または翻訳系の制御下に置かれている、請求項39に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記組換えポリペプチドの発現および/または局在が、特定の組織に限定されている、請求項35〜40のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記組換えポリペプチドの発現および/または局在が、単細胞型に限定されている、請求項35〜40のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記単細胞型が、神経細胞、心臓細胞、または肝臓細胞である、請求項42に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記組換えポリペプチドの発現および/または局在が、特定の細胞区画またはドメインに限定されている、請求項35〜40のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記細胞区画が、ミトコンドリアである、請求項44に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- カルシウム濃度に感受性の前記組換えポリペプチドをコードしている前記ポリヌクレオチドの発現が、条件的である、請求項40〜45のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- カルシウム濃度に感受性の前記組換えポリペプチドをコードしている前記ポリヌクレオチドが、βアクチンプロモーターおよびLox−stop−Lox配列の制御下に置かれている、請求項40〜46のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記化学発光タンパク質が、エクオリンである、請求項35〜47のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記エクオリンが、カルシウムイオンに対する高い親和性を有する変異エクオリンである、請求項48に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記エクオリンが、変異エクオリンAsp407→Alaである、請求項49に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記蛍光タンパク質が、GFPである、請求項35〜50のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記蛍光タンパク質が、異なる波長で発光するGFPの変種である、請求項35〜51のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記のGFPの変種が、CFP、YFP、およびRFPからなる群より選択される、請求項52に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記蛍光タンパク質が、前記組換えポリペプチドの光子放射強度または安定性を向上させる、GFPの変異体である、請求項35〜51のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記組換えポリペプチドが、エクオリンおよびGFPまたはそのそれぞれの変異体もしくは変種を含むかまたはからなり、前記エクオリンおよびGFPは、化学発光共鳴エネルギー移動(CRET)を可能とするリンカーにより連結されている、請求項35〜54のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記リンカーが、4〜63アミノ酸、好ましくは14〜50アミノ酸を含む、請求項55に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記リンカーが、配列[Gly−Gly−Ser−Gly−Ser−Gly−Gly−Gln−Ser]nを含むかまたはからなり、ここでのnは1〜5であり、好ましくはnは1であるか、またはnは5である、請求項55〜56のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記組換えポリペプチドがさらに、前記の得られる生物発光タンパク質を特定の区画または細胞ドメインへと標的化させることのできる、ペプチド断片を含む、請求項35〜57のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記ペプチド断片が、シナプトタグミン、PSD95、チトクロムCオキシダーゼのサブユニットVIII、免疫グロブリン重鎖を含む群より選択される、請求項58に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記動物が、哺乳動物である、請求項35〜59のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 前記動物が、マウスである、請求項35〜60のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
- 請求項35〜61のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物のトランスジェニック子孫。
- 請求項45〜61のいずれか1項に記載の動物を、変異動物、特に既知の病態を有している動物モデルと交雑することにより得ることのできる、トランスジェニック動物。
- a)DNA構造物を、非ヒト動物の胚幹細胞に導入すること、ここで、前記DNA構造物は、カルシウム濃度に感受性の組換えポリペプチドをコードしている配列、いわゆる導入遺伝子を含むかまたはからなり、前記組換えポリペプチドは、蛍光タンパク質に連結した化学発光タンパク質を含むかまたはからなり、前記導入遺伝子は、プロモーターおよび場合により条件的発現配列の制御下に置かれている、
b)前記DNA構造物が前記胚幹細胞のゲノムに挿入されている、陽性クローンを選択すること、
c)前記陽性クローンを胚盤胞に注入し、キメラ胚盤胞を回収すること、そして
d)前記キメラ胚盤胞を育成して、非ヒトトランスジェニック動物を得ること
を含む、請求項35〜60のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の作製法。 - a)請求項63の方法により第一のトランスジェニック非ヒト動物を作製すること、
b)前記の得られた第一のトランスジェニック非ヒト動物を、前記組換えポリペプチドの発現が必要とされる組織または細胞において、前記の条件的発現配列に作用するエンドヌクレアーゼを発現している動物と交雑させること、
c)特定の組織または細胞において前記組換えポリペプチドを発現しているトランスジェニック非ヒト動物を回収すること
を含む、請求項46〜61のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の作製法。 - 前記の条件的発現配列がLox部位であり、前記エンドヌクレアーゼがCreである、請求項65に記載の方法。
- 前記エンドヌクレアーゼをコードしている前記ポリヌクレオチドが、細胞特異的プロモーターの制御下に置かれている、請求項65〜66のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞特異的プロモーターが、肝臓、心臓、または脳において活性である、請求項65〜67のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNA構造物が、プロモーター、条件的発現配列、およびカルシウム濃度に感受性の前記組換えポリペプチドをコードしている導入遺伝子を含むかまたはからなる、請求項65〜68のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNA構造物が、β−アクチンプロモーター、Lox−stop−Lox配列、およびカルシウム濃度に感受性の前記組換えポリペプチドをコードしている導入遺伝子を含むかまたはからなる、請求項65〜69のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNA構造物が、相同的組換えにより、前記胚幹細胞のゲノムに挿入される、請求項65〜70のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNA構造物が、再構成されたHPRT遺伝子座に挿入される、請求項65〜71のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化学発光タンパク質が、エクオリンである、請求項64〜72のいずれか1項に記載の方法。
- 前記蛍光タンパク質が、GFPである、請求項64〜73のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えポリペプチドが、エクオリンおよびGFPを含むかまたはからなり、前記エクオリンおよびGFPが、化学発光共鳴エネルギー移動(CRET)を可能とするリンカーにより連結されている、請求項64〜74のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リンカーが、4〜63アミノ酸、好ましくは14〜50アミノ酸を含む、請求項64〜75のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リンカーが、配列[Gly−Gly−Ser−Gly−Ser−Gly−Gly−Gln−Ser]nを含むかまたはからなり、ここでのnは1〜5であり、好ましくはnは1であるか、またはnは5である、請求項64〜76のいずれか1項に記載の方法。
- a)請求項35〜61のいずれか1項に記載のカルシウム濃度に感受性の組換えポリペプチドを発現しているトランスジェニック動物において、請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法により、Ca2+の動態を検出し、場合によりCa2+を定量すること、
b)対象の分子を、前記トランスジェニック動物に投与または前記トランスジェニック動物において発現させること、
c)ステップa)を繰り返すこと、
d)注入前後のCa2+の位置、動態、場合により量を比較すること、ここで、Ca2+の位置、動態、および/または量の変動は、前記分子がCa2+をモデュレートできることを示唆している、
を含む、請求項35〜61のいずれか1項に記載のトランスジェニック非ヒト動物におけるCa2+をモデュレートできる分子をスクリーニングする方法。
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