KR101354601B1 - 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석 방법 및 키트 - Google Patents
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석 방법 및 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석용 키트 및 분석방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석용 키트 및 분석방법을 제공한다.
Description
본 발명은 단백질간 상호작용 분석 방법 및 키트에 관한 것으로서, 더 상세하게는 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석 방법 및 키트에 관한 것이다.
일반적으로 다양한 생리활성 물질간의 역동적인 상호작용에 의해서 여러 가지 생리적인 기능이 조절되고, 이러한 상호작용이 적절히 일어나지 못하거나, 상호작용이 일어나지 않아야 할 분자 사이에 상호작용 발생하는 비정상적인 상황에서 질병이 초래되기도 한다. 일반적으로 상보적인 구조의 두 개의 단백질은 상호작용하고, 생리활성 화합물은 단백질 3차 구조의 특정부위에 특이적으로 상호작용하는데, 이들 생리활성 화합물은 대상 단백질의 기능을 조절함으로써, 당해 단백질과 관련된 질환의 진단 또는 예방, 치료 및 경감시킬 수 있는 치료제 후보물질이 될 수 있다.
이러한 단백질간의 상호작용 및 단백질과 소분자 화합물 간의 상호작용을 분석함으로써, 질병 표적 또는 치료제를 스크리닝하고자 하는 연구가 지속되어 왔다. 그 예로, 파지디스플레이(Sche et al., Chem. Biol., 6: 707, 1999), 효모 2종-/3종-하이브리드 분석(Licitra et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 12817, 1996), 이종결손(heterologous deletions)이 일어난 효모균주의 평행분석(Zheng et al., Chem. Biol., 11: 609, 2004) 등과 같은 기술을 들 수 있다. 그러나, 이들 기술들은 높은 배경(high background), 위양성(false positive), 낮은 민감도(low sensitivity) 등과 같은 문제점을 가지고 있고, 시험관내 조건에서의 반응 또는 비포유동물 세포를 사용한 반응의 경우, 실험결과를 100% 신뢰하기 어려운 단점을 가지고 있다.
대한민국 공개특허 제2009-0018585호는 상기와 같은 문제점을 극복하기 위해 안출된 것으로서, 자기조립을 하는 페리틴 단백질에 형광단백질 및 미끼(bait) 단백질을 연결한 제1융합단백질과 페리틴 단백질에 동일 형광단백질 및 표적(prey) 단백질을 연결한 제2융합단백질을 하나의 세포주에서 동시에 발현시킨 후, 상기 미끼 단백질과 표적 단백질의 상호작용 여부를 자기조립된 형광 나노입자의 클러스터 형성에 따른 발광패턴의 차이로 확인하는 방법에 관한 것이다.
그러나 상기 대한민국 공개특허 제2009-0018585호에 개시된 기술은 하나의 나노입자 내에 미끼 단백질과 표적 단백질이 모두 존재하기 때문에, 단일 나노입자내에서 미끼 단백질과 표적 단백질이 상호작용함으로써 나노입자간의 상호작용이 저해되는 위음성(false-negative)이 나타날 수 있고, 반대로 다른 나노입자에 존재하는 미끼 단백질 또는 표적 단백질 사이의 동형이량체 형성(homodimerization)에 따른 위양성(false-positive)이 나타날 수 있다.
한편, 최근 빛에 의해 유도되는 단백질간 상호작용(protein-protein interaction)이 보고되었으며, 이를 이용한 단백질간 상호작용 분석방법들 역시 개발되어 오고 있다(Shimizu-Sato et al., Nat. Biotechnol., 20: 1041-1044, 2002; Levskaya et al., Nature. 461: 997-1001, 2009; Yazawa et al., Nat. Biotechnol., 27: 941-945, 2009; Tyszkiewicz et al., Nat. Methods, 5: 303-305, 2008).
그러나 상기 방법들은 실시간 분석이 불가능하거나, 위양성(false-psitive), 위음성(false-negative)의 가능성을 완전히 제거하지 못하고 있다는 단점이 있다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 광유도 나노클러스 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석 방법 및 키트을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, ⅰ) 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, ⅱ) 선택적으로 제2형광 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질, ⅲ) 제3형광 단백질을 포함하는 제3융합단백질, ⅳ) 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, ⅴ) 미끼 단백질, 및 ⅵ) 상기 미끼 단백질과의 상호작용 여부의 분석대상인 표적 단백질을 세포 내에서 동시에 발현시키되, 상기 짝 단백질은 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되고, 상기 미끼 단백질은 상기 제2융합단백질, 상기 제3융합단백질 또는 상기 제1자기조립단백질 및 상기 제1형광단백질을 포함하는 제4융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되며, 상기 표적 단백질은 상기 미끼 단백질이 포함된 융합단백질을 제외한 다른 융합단백질 또는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질에 포함되어 발현되는 것을 특징으로 하는 융합단백질 발현단계;
상기 융합단백질들이 동시에 발현된 세포에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 짝 단백질의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 나노 클러스터 형성을 유도하는 광유도 나노클러스터 형성단계; 및
상기 형광단백질들의 형광의 패턴과 강도를 관찰하는 형광 관찰단계를 포함하며,
다만, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질이 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 경우에는, 상기 제2융합단백질은 생략될 수 있고, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제1자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 방법에 있어서, 상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), TagCFP, Ds-Red 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제2자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제3형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제4형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, ⅰ) 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, ⅱ) 선택적으로 제2형광 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질, ⅲ) 제3형광 단백질을 포함하는 제3융합단백질, ⅳ) 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, ⅴ) 미끼 단백질, 및 ⅵ) 상기 미끼 단백질과의 상호작용 여부의 분석대상인 표적 단백질을 세포 내에서 동시에 발현시키되, 상기 짝 단백질은 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되고, 상기 미끼 단백질은 상기 제2융합단백질, 상기 제3융합단백질 또는 상기 제1자기조립단백질 및 상기 제1형광단백질을 포함하는 제4융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되며, 상기 표적 단백질은 상기 미끼 단백질이 포함된 융합단백질을 제외한 다른 융합단백질 또는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질에 포함되어 발현되는 것을 특징으로 하는 융합단백질 발현단계;
상기 융합단백질들이 동시에 발현된 세포에 상기 미끼 단백질과 상기 표적 단백질 사이의 단백질 상호작용 조절 후보물질을 처리하는 단계;
상기 조절 후보물질 처리 전, 후 또는 동시에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 짝 단백질의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 나노 클러스터를 형성을 유도하는 광유도 나노클러스터 형성단계; 및
상기 형광단백질들의 형광의 패턴과 강도를 관찰하는 형광 관찰단계를 포함하며,
다만, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질이 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 경우에는, 상기 제2융합단백질은 생략될 수 있고, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법이 제공된다.
상기 방법에 있어서, 상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제1자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 방법에 있어서, 상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), TagCFP, Ds-Red 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제2자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제3형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 제4형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
선택적으로 제2형광 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터,
제3형광 단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터,
선택적으로 상기 제1자기조립단백질, 상기 제1형광단백질 및 미끼 단백질을 포함하는 제4융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며,
상기 제4발현벡터가 포함되지 않는 경우, 상기 미끼 단백질은 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되고, 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 광 조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질이 포함되며, 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 미끼 단백질이 포함되지 않은 융합단백질 또는 선택적으로 발현되는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질에 상기 미끼 단백질과의 단백질간 상호작용 여부 확인대상인 표적 단백질이 포함되고,
다만, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질이 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 경우에는, 상기 제2융합단백질은 생략될 수 있고, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 키트에 있어서, 상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 제1자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다. 상기 짝 단백질 중 CRY 또는 PHR은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 짝 단백질이다.
상기 키트에 있어서, 상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), TagCFP, Ds-Red 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 제2자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 제3형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 키트에 있어서, 상기 제4형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면,
제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
선택적으로 제2형광 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터,
제3형광 단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터,
선택적으로 상기 제1자기조립단백질, 상기 제1형광단백질를 포함하는 제4융합단백질을 암호화하는 제4폴리뉴클레오티드 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제4폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위를 포함하는 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며,
상기 제4발현벡터가 포함되지 않는 경우, 상기 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위는 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되고, 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 광 조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질이 포함되며, 상기 제2발현벡터 또는 상기 제3발현벡터 중 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위가 포함되지 않은 발현벡터 또는 선택적으로 발현되는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질을 암호화하는 제5폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제5발현벡터에 상기 미끼 단백질과의 단백질간 상호작용 여부 확인대상인 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제5폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위가 포함되고,
다만, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질이 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 경우에는, 상기 제2융합단백질은 생략될 수 있고, 상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
본 발명의 일 실시예에 따른 방법 및 키트는 종래의 단백질 상호작용 분석방법 및 키트와는 달리, 자석과 같은 추가 기술 없이 현미경의 기본기능을 이용할 수 있고, 단일세포 및 다세포의 넓은 면적(예를 들어 줄기세포의 Colony)중 원하는 부위만 나노클러스터 형성시킬 수 있으며, 단일세포 내에서의 특정 세포내 소기관을 대상으로만 광조사를 함으로써 소기관 특이적 광유도 나노클러스터를 형성시킬 수 있고, 종래의 rapamycin과 같은 화학물질 기반의 나노클러스터 형성 유도와는 달리, 가역적으로 나노클러스터를 형성시킬 수 있을 뿐만 아니라, 빛의 세기 및 시간을 자유자재로 조절하여 나노클러스터를 형성할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 단백질 상호작용을 살아 있는 세포 내에서 실시간으로 분석하고, 단백질간 상호작용을 조절하는 물질을 탐색하는데 매우 유용하게 사용될 수 있다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 효율적인 단백질간 상호작용 분석을 수행할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 광조사에 의해 유도되는 나노클러스터 형성 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 2는 상기 도 1에 도시된 나노클러스터의 형성이 실제 가능함을 보여주는 실험결과에 대한 형광현미경 사진이다.
도 3은 시간의 경과에 따른 광유도 나노클러스터의 형성 및 해체 과정을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 5는 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 6은 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 7은 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 8은 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법을 이용하여 Hras와 RBDraf1, 그리고 Hras와 RBDp110 사이의 상호작용을 분석한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 2는 상기 도 1에 도시된 나노클러스터의 형성이 실제 가능함을 보여주는 실험결과에 대한 형광현미경 사진이다.
도 3은 시간의 경과에 따른 광유도 나노클러스터의 형성 및 해체 과정을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 5는 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 6은 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 7은 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 8은 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법을 이용하여 Hras와 RBDraf1, 그리고 Hras와 RBDp110 사이의 상호작용을 분석한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.
본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.
본 문서에서 사용되는 "미끼(bait) 단백질"이란, 다른 단백질과의 상호작용을 탐색하는데 이용되는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "표적(prey) 단백질"이란, 상기 "미끼 단백질"의 잠재적 상호작용 파트너로서 탐색(분석) 또는 검출하고자 하는 대상이 되는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "상호작용 조절 후보물질"이란 "미끼 단백질"과 "표적 단백질" 사이의 상호작용을 촉진, 유도, 억제 또는 저해할 것으로 예상되는 물질이다.
본 문서에서 사용되는 "자기조립단백질"은 매개물질의 도움 없이 단백질 발현과 동시에 자가조립(self-assembly)되는 단백질을 의미하며, 대표적인 자기조립단백질로는 페리틴(ferritin)을 들 수 있다.
본 문서에서 사용되는 "나노클러스터(nanocluster)"는 자기조립단백질의 자가조립에 의해 형성된 나노입자가 나노입자간 상호작용에 의해 군집을 형성한 군집체를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "광유도 이형 이합체 형성 단백질(light-induced heterodimerized protein)"는 특정 파장의 빛을 조사할 경우 다른 단백질과 이형 이합체(heterodimer)를 형성하는 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "짝 단백질(partner protein)"은 특정 파장의 빛을 조사할 경우 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 대상 단백질을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "이형 이합체(heterodimer)"는 서로 다른 두 가지 단백질이 상호작용에 의해 하나의 복합체(complex)를 형성한 것을 의민한다.
본 문서에서 사용되는 "동형 이합체(homodimer)"는 같은 단백질이 서로 두 개가 상호작용하여 하나의 복합체(complex)를 형성한 것을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"는 특정 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터의 작용에 의해 mRNA로 전사되고 당해 단백질로 번역까지 될 수 있게 연결되었다는 것을 의미하고, 특정 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 다른 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되었다는 것은 당해 특정 단백질이 다른 단백질과 융합단백질의 형태로 발현될 수 있게 연결되었다는 것을 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "CIB"는 크립토크롬-상호작용 염기성 헬릭스-루프-헬릭스 단백질(cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix protein)을 의미하며, 대표적으로 애기장대의 CIB1(GenBank No.: NM_119618)가 있다.
본 문서에서 사용되는 "CIBN"은 상기 CIB의 N-말단으로서 광조사시 크립토크롬(cryptochrome, CRY)와 상호작용하는 부위를 의미한다.
본 문서에서 사용되는 "CRY"는 크립토크롬(chryptochrome) 단백질을 의미하며, 대표적으로 애기장대의 CRY2(GenBank No.: NM_100320)가 있다.
본 문서에서 사용되는 "PHR"은 상기 CRY의 N-말단 부위로서 파이토라이아제 상동성 지역(phytolyase homolgous region)을 의미하며, 광조사시 상기 CIB 또는 CIBN과 상호작용한다(Kennedy et al., Nat. Methods, 7(12): 973-975, 2010).
본 문서에서 사용되는 "Phy"는 파이토크롬(phytochrome) 단백질을 의미하고, 대표적으로 애기장대의 PhyA(GenBank No.: NM_001123784), PhyB(GenBank No.: NM_127435) 등이 있으며, PIF(phytochrome interacting factor)와 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Min et al., Nature, 400: 781-784, 1999)
본 문서에서 사용되는 "PIF"는 파이토크롬 상호작용 인자(phytochrome interacting factor)을 의미하며, 대표적으로 애기장대의 PIF1(GenBank No.: NM_001202630), PIF3(GenBank No.: NM_179295), PIF4(GenBank No.: NM_180050), PIF5(GenBank No.: NM_180690), PIF6(GenBank No.: NM_001203231) 또는 PIF7(GenBank No.: NM_125520)이 있다.
본 문서에서 사용되는 "FKF"는 플라빈-결합, 켈치 반복, F-박스(Flavin-binding, Kelch repeat, F-box) 단백질을 의미하고, 대표적으로 애기장대의 FKF1(GenBank No.: NM_105475)이 있으며, 광조사시 GIGANTEA 단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Sawa et al., Science, 318(5848): 261-265, 2007).
본 문서에서 사용되는 "GIGANTEA"는 파이토크롬 신호전달에 관련되어 있고, 꽃의 개화시기를 조절하는 단백질로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 키트 및 방법은 광조사에 의해 유도되는 단백질-단백질 상호작용을 이용하여, 자기조립단백질의 자기조립에 의해 형성되는 나노입자 사이의 나노클러스터 형성을 빛의 조사에 의해 유도함으로써, 다른 단백질-단백질 상호작용의 분석은 물론 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 조절물질을 탐색하는데 유용하게 사용될 수 있다. 더 나아가 본 발명의 일 실시예에 따른 키트 및 방법에 의하면 광유도 단백질-단백질 상호작용을 가역적으로 유도할 수 있기 때문에, 살아 있는 세포의 손상을 최소화하여 실시간으로 단백질-단백질 상호작용에 따른 효과를 관찰하는데 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따른 단백질 상호작용 분석방법을 첨부되는 도면을 통해 설명하기로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 제1자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 포로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터; 및 표적단백질 및 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제4폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질 중 적어도 하나 이상은 제1형광단백질을 포함하고, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않고, 상기 제1형광단백질 또는 상기 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다(도 4).
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1융합단백질 내의 미끼단백질, 제1자기조립단백질 및 선택적으로 제1형광단백질의 순서는 어느 것이라도 무방하다. 예를 들어 상기 제1융합단백질은 미끼단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질의 순으로 구성될 수도 있고, 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 미끼단백질의 순으로 구성될 수도 있다. 마찬가지로, 상기 제2융합단백질 내의 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1자기조립단백질 및 선택적으로 제1형광단백질의 순서 역시 어느 것이라도 무방하다. 예를 들어 상기 제2융합단백질은 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질의 순으로 구성될 수도 있고, 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질의 순으로 구성될 수도 있다. 마찬가지로 제3융합단백질에 있어서도, 짝 단백질과 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질의 순서는 어떤 순서가 되더라도 무방하다. 예를 들어, N-말단부터 짝 단백질, 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질의 순일 수도 있고, 제2자기조립단백질, 제2형광단백질 및 짝 단백질의 순서가 될 수 있다. 마지막으로 제4융합단백질의 경우에도 표적 단백질이 N-말단에 위치할 수도 있고, 제3형광단백질이 N-말단에 위치할 수 있다.
상기 모든 융합단백질들은 각 융합단백질을 구성하는 단위체 단백질들 사이에 링커가 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1폴리뉴클레오티드 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제1폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중클로닝 부위를 포함하는 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 제1자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 제2형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 포로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터; 및 제3형광단백질을 포함하는 제4융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제4폴리뉴클레오티드 및 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제4폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있는 다중클로닝 부위를 포함하는 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질 중 적어도 하나 이상은 제1형광단백질을 포함하고, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않고, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), TagCFP, Ds-Red 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제2자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 제3형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터일 수 있다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 광유도 나노 클러스터는 광유도 이형 이합체 형성 단백질(예를 들어, CIBN)을 포함하는 제1나노입자와 빛의 조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질와 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질(예를 들어, PHR)을 포함하는 제2나노입자 사이의 광유도 상호작용에 의해 형성될 수 있다.
이때, 제1나노입자는 두 가지 유전자 컨스트럭트에 의해 각각 발현된 두 융합단백질(제1융합단백질 및 제2융합단백질)의 자기조립에 의해 형성되는데, 상기 제1융합단백질 및 상기 제2융합단백질은 공통의 자기조립단백질(제1자기조립단백질, 1st self-assembled protein, 1st SAP)을 가지고 있기 때문에, 이형조립 나노입자가 생성된다. 단백질의 발현 및 나노 클러스터 형성 여부 확인을 위해, 상기 제1융합단백질 및/또는 상기 제2융합단백질에는 제1형광단백질이 포함된다. 한편, 제2나노입자는 상기 제1자기조립단백질과 상호작용하지 않는 별도의 제2자기조립단백질(2nd SAP)과 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 빛 조사에 의해 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제3융합단백질의 자기조립에 의해 형성되는 동형조립 나노입자이다. 상기 제3융합단백질 역시 단백질의 발현 여부 및 나노클러스터 형성 여부를 확인하기 위하여, 상기 제1형광단백질과 상이한 파장의 빛을 방출하는 제2형광단백질을 포함한다. 한편, 상기 미끼 단백질과의 상호작용 여부를 확인하고자 하는 표적 단백질은 상기 제1형광단백질 및 상기 제2형광단백질과 상이한 파장의 빛을 방출하는 제3형광단백질과의 융합단백질 형태로 발현되게 된다. 만일, 상기 미끼 단백질과 상기 표적 단백질 사이에 상호작용이 있을 경우, 빛의 조사에 의해 광유도 이형 이합체 형성단백질과 짝 단백질 간의 상호작용에 의한 나노클러스터의 위치와 상기 표적 단백질의 위치가 동일하게 나타나게 된다. 만일 표적 단백질이 미끼 단백질과 상호작용을 하지 않는다면, 표적단백질을 나타내는 형광은 제1나노입자에 의한 형광, 제2나노입자에 의한 형광과 달리 점의 형태로 나타나지 않고 세포질 내에 분산된 형태로 나타날 것이다. 한편, 나노클러스터가 형성되더라도 제1나노입자 사이의 동형 상호작용에 의해 나노클러스터가 형성될 수 있는데, 이 경우 제1나노입자에 의한 형광 패턴과 제2나노입자에 의한 형광 패턴이 일치하지 않기 때문에, 이를 제1나노입자와 제2나노입자 사이에 형성된 나노클러스터와 구분할 수 있다.
도 4에 도시된 CIBN은 애기장대(A. thaliana)의 전사인자 bHLH63 단백질의 N 말단(1-170 aa)을 의미하며 상기 CIBN은 488 nm의 청색광을 조사할 경우 애기장대 크립토크롬 2(cryptochrome 2)의 N-말단 부위인 PHR(photolyase homologous region, 1-488 aa)와 상호작용을 하는 것으로 알려져 있는(Liu et al., Science, 322(5907): 1535-1539, 2009), 대표적인 광유도 이형 이합체 형성 단백질이다. 이하, 편의상 도면상에서 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIBN으로 표기되고, 짝 단백질은 CRY2 또는 PHR로 표기된다. 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질로는 CIB 또는 CIBN 외에 PhyB, PIF3, PIF6, FKF1, GIGANTEA 등이 사용될 수 있다. PhyB는 애기장대의 피토크롬 B(phytochrome B) 단백질로서, 적색광 조사시 PIF(phytochrome-interacting factor)와 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Castillon et al., Trends Plant Sci., 12(11): 514-521, 2007). FKF1(flavin-binding, kelch repat, F-box 1)은 시간에 의해 조절되며, 개화를 조절하는 기능을 담당하는 것으로 알려져 있고, 청색광 조사시 GIGANTEA 단백질과 상호작용하는 것으로 알려져 있다(Sawa et al., Science. 318(5848): 261-265, 2007). GIGANTEA는 애기장대에서 피토크롬 신호전달에 관여하는 핵 단백질로 알려져 있다(Huq et al, Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A., 97(17): 9789-9794, 2000).
본 발명의 일 관점에 따르면, 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 제2형광단백질 및 미끼단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 포로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및 표적단백질, 제3형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 상이한 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않으며, 상기 제1형광단백질 또는 상기 제3형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다(도 5).
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 및 제2형광단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2폴리뉴클레오티드 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제2폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결될 수 있게 하는 다중클로닝 부위를 포함하는 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및 제3형광단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하고, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3폴리뉴클레오티드 및 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제3폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위를 포함하는 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 상이한 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1자기조립단백질과 상기 제2자기조립단백질은 서로 상호작용을 하지 않으며, 상기 제1형광단백질 또는 상기 제3형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우 상기, 상기 DsRed를 포함하는 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, Ds-Red 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제2자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제3형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터일 수 있다.
도 5는 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다. 도 5에 나타난 바와 같이, 나노 클러스터는 제1나노입자와 제2나노입자 사이에 직접적으로 형성되지 않고, 클러스터 형성 링커(cluster formation linker)에 의해 간접적으로 형성된다. 구체적으로, 제1나노입자는 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1형광단백질 및 제1자기조립단백질(1st SAP)을 포함한 제1융합단백질의 자기조립에 의해 형성된다. 제2나노입자는 표적단백질, 상기 제1형광단백질과 다른 파장의 빛을 방출하는 제3형광단백질 및 제2자기조립단백질(2nd SAP)을 포함하는 제3융합단백질의 자기조립에 의해 형성된다. 상기 제1나노입자 및 상기 제2나노입자 외에 짝 단백질, 제2형광단백질 및 미끼 단백질을 포함하는 제2융합단백질이 세포 내에서 동시에 발현될 경우, 특정 파장에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상기 짝 단백질이 이형 이합체를 형성하고, 상기 미끼 단백질과 제2나노입자 표면에 제시된 표적 단백질 사이에 상호작용이 일어날 경우, 상기 제2융합단백질을 매개로 한 나노클러스터가 형성되며, 각 융합단백질이 갖는 특유의 형광 패턴을 통해 이러한 나노클러스터의 형성 여부 및 위양성 또는 위음성 여부를 판정할 수 있게 된다. 만약 미끼 단백질과 표적 단백질 사이에 상호작용이 일어나지 않는다면, 나노클러스터 아예 형성되지 않는다. 반대로 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 미끼 단백질 E또는 표적 단백질의 동형 이합체 형성에 의해 나노클러스터가 형성될 경우에는 각 형광 단백질에 따른 형광 패턴이 상이하게 되므로, 위양성 및 위음성을 구분할 수 있게 된다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 미끼 단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질이 적어도 두 개 이상 반복되고, 제2형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 포로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터; 및 표적단백질 및 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제4폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질 중 적어도 하나 이상은 제1형광단백질을 포함하고, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질이 DsRed인 경우, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질에서 상기 자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다(도 6).
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제1폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중클로닝 부위를 포함하는 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광유도 이형이합체 형성 단백질 및 상기 자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질이 적어도 두 개 이상 반복되고, 제2형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 포로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터; 및 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제4폴리뉴클레오티드 및 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제4폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중클로닝 부위를 포함하는 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질 중 적어도 하나 이상은 제1형광단백질을 포함하고, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1형광단백질이 DsRed인 경우, 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질에서 상기 자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CIB 또는 CIBN일 경우 CRY 또는 PHR이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PhyB일 경우 PIF이고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 FKF1일 경우 GIGANTEA이며, 반대로 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 CRY 또는 PHR일 경우 CIB 또는 CIBN일 수 있고, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 PIF일 경우 PhyB이며, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질이 GIGANTEA일 경우 FKF1이다. 상기 PIF는 PIF3 또는 PIF6일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, Ds-Red 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 제3형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터일 수 있다.
도 6은 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 상기 실시예에 의하면 단일한 나노입자가 사용된다. 상기 나노입자는 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질과 미끼단백질 및 상기 자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질의 이형조립 나노입자를 형성한다. 이 때, 단백질의 발현 및 나노 클러스터 형성 여부를 확인하기 위해 상기 제1융합단백질 또는 상기 제2융합단백질 중 적어도 하나에는 제1형광단백질이 포함된다. 상기 나노입자의 클러스터 형성은 짝 단백질과 제2형광단백질을 포함하는 제3융합단백질의 짝 단백질과 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 사이의 광유도 상호작용에 의해 달성된다. 상기 제3융합단백질은 짝 단백질을 적어도 두 개 이상 반복체로 포함할 수도 있고, PHR과 같이 동형이합체를 형성하는 단백질이 짝 단백질로 사용되는 경우에는 짝 단백질이 단일 카피만 존재해도 제3융합단백질의 동형 이합체 형성에 의해 나노 클러스터를 형성할 수 있게 된다. 미끼 단백질과 표적 단백질 사이의 상호작용 여부는 상기 제1 내지 제3융합단백질과 별도로 발현되는 표적단백질 및 제3형광단백질을 포함하는 제4융합단백질과 상기 나노입자사이의 상호작용 여부를 확인함으로써 분석될 수 있다. 이 경우 광 조사에 의해 나노 클러스터는 항상 형성되는데, 미끼 단백질과 표적 단백질 사이의 상호작용이 있으면, 표적 단백질을 포함하는 제4융합단백질의 형광 패턴이 나노 클러스터의 형성에 따라 나타나는 형광 패턴과 동일하게 나온다. 반대로, 미끼 단백질과 표적 단백질 사이의 상호작용이 없는 경우에는 제4융합단백질의 형광 패턴은 나노클러스터 형성에 따른 형광 패턴과 달리 제4융합단백질이 발현된 위치에서 분산되어 나타나게 된다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1형광 단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하고, 스스로 동형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 제2형광단백질 및 미끼 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및 표적 단백질 및 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1형광단백질이 DsRed인 경우, 상기 제1융합단백질에서 상기 자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다(도 7).
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1형광 단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하고, 스스로 동형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 제2형광단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2폴리뉴클레오티드 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제2폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 연결될 수 있는 다중클로닝 부위를 포함하는 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터; 및 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하고 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3폴리뉴클레오티드 및 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제3폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중클로닝 부위를 포함하는 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1형광단백질, 상기 제2형광단백질 및 상기 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하고, 상기 제1형광단백질이 DsRed인 경우, 상기 제1융합단백질에서 상기 자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CIB 또는CIBN일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있고 광유도와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 단백질로서, CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, Ds-Red 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 제3형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP)P, TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터일 수 있다.
도 7은 본 발명의 다른 일실시예에 따른 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 분석방법의 원리를 개략적으로 도시한 개요도이다. 도 7에 나타난 바와 같이, 상기 실시예의 경우 단일한 나노입자가 사용된다. 상기 나노입자는 광유도 이형 이합체 형성 단백질, 제1형광단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 제1융합단백질의 자기조립에 의해 형성된다. 상기 나노입자는 나노입자 표면에 제시된 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 짝 단백질, 제2형광단백질 및 미끼단백질을 포함하는 제2융합단백질의 짝 단백질 사이의 상호작용에 의해 나노클러스터를 형성하게 된다. 이 경우 상기 짝 단백질은 광유도와 무관하게 동형 이형 이합체를 형성하는 단백질을 사용하며, 이러한 단백질로는 CRY2 또는 이의 N-말단 도메인인 PHR이 사용될 수 있다. 짝 단백질의 동형 이합체 형성 후 상기 나노입자와의 상호작용에 의해 두 개 이상의 나노입자가 서로 상호작용을 통해 나노클러스터가 형성된다. 미끼 단백질과 표적 단백질 사이의 상호작용 여부는 다른 실시예와 마찬가지로 표적단백질에 제3형광단백질이 연결된 제3융합단백질에 의해 나타나는 형광의 패턴을 통해 확인 가능하다. 즉, 제3융합단백질에 의해 나타나는 형광 패턴이 나노클러스터를 구성하고 있는 제1융합단백질에 의해 나타나는 형광 패턴 및 나노입자 사이의 가교 역할을 수행하는 제2융합단백질에 의해 나타나는 형광 패턴과 동일할 경우, 이는 미끼 단백질과 표적 단백질이 동일한 위치에 존재함을 간접적으로 증명하는 것이고, 이는 결국 미끼 단백질과 표적 단백질 사이의 상호작용에 대한 증거가 된다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하는 짝 단백질, 제2형광단백질 및 미끼단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2발현벡터; 및 상기 미끼 단백질과 상호작용 여부 확인대상인 표적 단백질 및 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3발현벡터를 포함하며,
다만, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하고, 상기 광 유도 이형 이합체 형성 단백질은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 단백질이며, 상기 자기조립단백질이 DsRed인 경우, 상기 제1융합단백질에서 제1형광단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다(도 8).
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면 자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1발현벡터; 광조사에 의해 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하는 짝 단백질 및 제2형광단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 상기 제2폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위를 포함하는 제2발현벡터; 및 제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 상기 미끼 단백질과 상호작용 여부 확인대상인 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제3폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위를 포함하는 제3발현벡터를 포함하며, 다만, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하고, 상기 광 유도 이형 이합체 형성 단백질은 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 단백질이며, 상기 자기조립단백질이 DsRed인 경우, 상기 제1융합단백질에서 제1형광단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트가 제공된다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질은 CRY 또는 PHR일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 짝 단백질은 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 광조사에 의해 이형 이합체를 형성할 수 있는 단백질로서, CIB 또는 CIBN 일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, Ds-Red 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 제3형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed일 수 있고, 상기 바이러스 캡시드 단백질은 CCMV(cowpea chlorotic mottle virus) 캡시드 단백질, 노르워크 바이러스(Norwalk virus) 캡시드 단백질, SV40 주요 캡시드 단백질, 또는 유두종 바이러스(papilloma virus) 캡시드 단백질일 수 있다.
상기 분석용 키트에 있어서, 상기 프로모터는 진핵 프로모터일 수 있다.
도 8에서 보는 바와 같이, 본 발명은 광조사에 의해 짝 단백질과 이형 이합체를 형성함은 물론, 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 이용하여, 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 자기조립단백질을 포함하는 단일 나노입자를 이용하여 구현될 수 있다. 구체적으로, 자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질로 구성되는 제1융합단백질을 발현할 수 있는 제1발현벡터; 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 상호작용하는 짝 단백질, 제2형광단백질 및 미끼 단백질로 구성된 제2융합단백질을 발현할 수 있는 제2발현벡터; 상기 미끼 단백질과 상호작용 여부 확인대상이 되는 표적단백질 및 제3형광단백질로 구성되는 제3융합단백질을 발현할 수 있는 제3발현벡터를 제작함으로써 구현될 수 있다. 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성할 수 있는 광유도 이형 이합체 형성 단백질로는 CRY나 이의 N-말단 도메인인 PHR을 사용할 수 있고, 이에 대한 짝 단백질로는 CIB나 이의 N-말단인 CIBN을 사용할 수 있다. 상기 발현벡터들을 세포내에 공형질도입한 후, 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 짝 단백질 사이의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사할 경우, 광유도 나노클러스터가 형성되고 이 경우 제1형광단백질과 제2형광단백질에 의한 형광 패턴이 동일하게 나타난다. 즉, 나노클러스터 형성에 따라 제1형광단백질에 의한 형광은 당해 융합단백질이 발현된 장소에서 다수의 강한 점의 형태로 나타나게 되고, 이와 동 위치에 제2형광단백질에 의한 형광 역시 강한 점의 형상으로 나타나게 된다. 한편, 표적 단백질과 연결된 제3형광단백질에 의한 형광은 상기 미끼 단백질과 상기 표적 단백질 사이의 상호작용 여부에 따라 다르게 나타난다. 즉, 상기 표적 단백질과 상기 미끼 단백질 사이에 상호작용이 일어나면, 제3형광단백질에 의한 형광 역시 상기 제1형광단백질 및 상기 제2형광단백질에 의한 형광과 동일한 위치에 동일한 양상으로 나타나고, 상호작용이 일어나지 않으면, 제3형광단백질에 의한 형광은 광조사 이전과 변함없이, 당해 제3융합단백질의 발현장소에서 분산된 형태의 형광으로 나타나게 된다.
아울러, 상기 단백질간 상호작용 분석방법은 단백질간 상호작용의 조절물질 즉, 특정 단백질간의 상호작용을 촉진하는 물질 또는 특정 단백질간의 상호작용을 억제하는 물질을 탐색하기 위한 용도로 사용될 수 있다. 생명 현상은 특정 단백질간의 상호작용, 예를 들어 수용체와 이에 특이적으로 결합하는 리간드 간의 상호작용의 결과로 나타나는 경우가 많고 이러한 단백질간 상호작용이 비정상적으로 이루어질 때 병리현상으로 발전할 수 있다. 따라서, 특정 단백질간의 상호작용을 촉진 또는 억제하는 물질은 해당 단백질간 상호작용과 관련된 질병의 치료제가 될 가능성이 높다. 따라서, 본 발명의 키트 및 방법은 질병 치료제 후보물질의 세포수준의 스크리닝 방법으로 매우 효율적으로 사용될 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 벡터의 제작
1-1: CIBN-CFP-AD 컨스트럭트의 제작
CaMKIIα 유전자(GenBank No.: NM_012920)의 자기조립에 관여하는 결합도메인(Association domain (AD), CaMKIIα의 315-478 아미노산 잔기)의 N-말단에 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP)와 CIB1(cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix 1) 유전자(GenBank No.: NM_119618) 광유도 단백질 상호작용에 참여하는 N-말단(CIBN, CIB1의 1-170 아미노산 잔기)를 순차적으로 융합시킨 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pCFP-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 CIBN-CFP-AD 컨스트럭트를 제작하였다(도 1).
1-2: PHR
CRY2
-mCherry 컨스트럭트의 제작
CRY2 유전자(GenBank No.: NM_100320)의 PHR 도메인(photolysase-related domain)에 해당하는 1-498 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 pmCherry-N1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 PHRCRY2-mCherry 컨스트럭트를 제작하였다. CRY 단백질 또는 PHR은 세포 내에서 발현시킬 경우 동형 이합체를 형성한다(도 1).
실험예 1: 광유도에 의한 나노클러스터 형성 여부 확인
상기 실시예 1에서 제작한 CIBN-RFP-FT 컨스트럭트와 CRY2 컨스트럭트를 미리 배양한 Cos-7 세포(ATCC No. CRL-1651)에 공형질도입한 후, CIBN과 CRY2 사이의 상호작용을 유발하는 488 nm 파장의 청색광을 12초 간격으로 1초씩 총 5초 동안 조사한 후, 세포 내의 형광을 관찰하였다. 그 결과, 빛을 조사한 경우에는 세포질 내에 분산되어 있던 적색 형광이 다수의 강한 점의 형태로 나타났다가, 시간이 지나면 세포질 내로 다시 분산된 형태로 나타남을 알 수 있었다(도 2). 이를 형광을 띠는 점의 수를 세는 방식으로 분석한 경우에도 빛의 조사시 점의 갯수가 급격히 증가하였다가 시간이 지남에 따라 점의 수가 점진적으로 줄어드는 양상을 발견할 수 있다(도 3). 이로써, 본 발명자들은 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 자기조립단백질을 포함하는 융합단백질에 의해 형성된 나노입자가 빛의 조사에 의해 짝 단백질과의 상호작용을 통해 클러스터를 형성하여 이를 시각화할 수 있음을 증명하였다.
실시예 2: 단백질 상호작용 분석용 벡터의 제작
본 발명자들은 상기 실험예 1의 결과를 토대로 본 발명의 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 상호작용 분석방법을 다른 단백질간의 상호작용 분석에 활용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 미끼 단백질과 표적 단백질을 발현할 수 있는 발현벡터를 하기와 같이 제작하였다.
2-1: PHR-ECFP-Hras(active) 컨스트럭트의 제작
CRY2(GenBank No.: NM_100320) PHR 부분(1-498)을 ECFP의 N-말단에 연결하고, 상기 ECFP의 C-말단에 미끼 단백질로서 활성형 Hras(GenBank No.: NM_001130442.1, Q61L mutant, CAAX-deleted)가 위치하는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조한 후, 이를 pECFP-C1 벡터(Clontech, USA)에 삽입하여 PHR-ECFP-Hras(active) 컨스트럭트를 제작하였다.
2-2: YFP-RBD
raf1
컨스트럭트의 제작
pYFP 벡터(Clontech, USA)의 YFP를 암호화하는 유전자의 3'-말단에 Raf1(GenBank No.: NM_002880.3)의 Ras 결합 도메인(RBDraf1, 51-131 아미노산 잔기)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 프레임에 맞게 삽입하여 YFP-RBDraf1 컨스트럭트를 제작하였다.
2-3: YFP-RBD
p110
컨스트럭트의 제작
pYFP 벡터(Clontech, USA)의 YFP를 암호화하는 유전자의 3'-말단에 p110 alpha(GenBank No.: NM_006218.2)의 Ras 결합 도메인(RBDp100, 133-332 아미노산 잔기)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 프레임에 맞게 삽입하여 YFP-RBDp100 컨스트럭트를 제작하였다.
2-4: PHR-ECFP-Hras(inactive) 컨스트럭트의 제작
상기 실시예 2-1에서 제작한 PHR-ECFP-Hras(active) 컨스트럭트에서 Hras(active) 유전자를 Hras(inactive) 유전자(S17N mutant, CAAX-deleted)로 치환하여 PHR-ECFP-Hras(inactive) 컨스트럭트를 제작하였다.
2-5: YFP-CRIB
PAK1
컨스트럭트의 제작
상기 실시예 2-3에서 제작한 YFP-RBDp100 컨스트럭트에서 RBDp100 유전자를 CRIBPAK1 유전자(GenBank No.: NM_001128620.1 69-108 아미노산 잔기)로 치환하여 pYFP-CRIBPAK1 컨스트럭트를 제작하였다.
실험예 2: 단백질 상호작용 분석
2-1: CIBN-RFP-AD, PHR-ECFP-Hras(active) 및 YFP-RBD
raf1
의 공형질도입
미리 배양된 Cos-7 세포(ATCC No. CRL-1651)에 실시예 1-1에서 제작한 CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, 실시예 2-1에서 제작한 PHR-CFP-Hras(active) 컨스트럭트 및 실시예 2-2에서 제작한 YFP-RBDraf1 컨스트럭트를 전기천공법(electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses)을 사용하여 같이 도입시킨 후, 세포를 96-well glass bottom plate(Matrical Bioscience, USA)에 깔고 37℃로 고정된 10% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다.
2-2: CIBN-RFP-AD, PHR-ECFP-Hras(active) 및 YFP-RBD
p110
의 공형질도입
미리 배양된 Cos-7 세포(ATCC No. CRL-1651)에 실시예 1-1에서 제작한 CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, 실시예 2-1에서 제작한 PHR-CFP-Hras(active) 컨스트럭트 및 실시예 2-3에서 제작한 YFP-RBDp110 컨스트럭트를 전기천공법(electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses)을 사용하여 같이 도입시킨 후, 세포를 96-well glass bottom plate(Matrical Bioscience, USA)에 깔고 37℃로 고정된 10% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다.
2-3: CIBN-RFP-AD, PHR-ECFP-Hras(inactive) 및 YFP-RBD
raf1
의 공형질도입
음성 대조군으로서, 미리 배양된 Cos-7 세포(ATCC No. CRL-1651)에 실시예 1-1에서 제작한 CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, 실시예 2-4에서 제작한 PHR-CFP-Hras(inactive) 컨스트럭트 및 실시예 2-2에서 제작한 YFP-RBDraf1 컨스트럭트를 전기천공법(electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses)을 사용하여 같이 도입시킨 후, 세포를 96-well glass bottom plate(Matrical Bioscience, USA)에 깔고 37℃로 고정된 10% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다.
2-4: CIBN-RFP-AD, PHR-ECFP-Hras(active) 및 YFP-CRIB
PAK1
의 공형질도입
역시 음성 대조군으로서, 미리 배양된 Cos-7 세포(ATCC No. CRL-1651)에 실시예 1-1에서 제작한 CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, 실시예 2-1에서 제작한 PHR-CFP-Hras(active) 컨스트럭트 및 실시예 2-5에서 제작한 YFP-CRIBPAK1 컨스트럭트를 전기천공법(electroporation - 1000 V, 35 ms, 2 pulses)을 사용하여 같이 도입시킨 후, 세포를 96-well glass bottom plate(Matrical Bioscience, USA)에 깔고 37℃로 고정된 10% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하며 상기 융합 단백질을 발현시켰다.
2-5: 광조사에 따른 나노클러스 형성 여부 분석
상기 실험예 2-1 내지 2-4에서 공형질도입된 각각의 세포에 CIBN과 CRY2 사이의 상호작용을 유발하는 488 nm 파장의 청색광을 10초 간격으로 1초씩 총 7초 동안 조사한 후, 세포 내의 형광을 관찰하였다(도 9). 그 결과, CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, PHR-ECFP-Hras(active) 컨스트럭트 및 YFP-RBDraf1 컨스트럭트를 공형질도입한 세포에 빛을 조사한 경우 적색, 청록색 및 황색 형광 모두 분산된 형태에서 강한 점의 형태로 변화되어 나타났으며, 형광 점의 패턴이 각 색깔별로 동일하여, 이들 형광을 나타내는 형광단백질이 동일한 위치에 존재하고 있음을 알 수 있었다(도 9a). 이는 자기조립단백질인 CaMKIIα의 AD(집합 도메인)에 의해 자기조립된 나노입자가 서로 상호작용에 의해 나노클러스터를 형성하였음을 의미하며, 동형 이합체를 형성한 PHR-CFP-Hras(active) 융합단백질이 자기조립 나노입자를 형성하는 CIBN-RFP-AD 융합단백질과 상호작용하면서 미끼 단백질로 사용된 Hras(active) 단백질이 표적 단백질인 RBDraf1 단백질과 상호작용하였음을 증명하는 것이다.
아울러, CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, PHR-ECFP-Hras(active) 컨스트럭트 및 YFP-RBDp110 컨스트럭트를 공형질도입시킨 세포에 빛을 조사한 경우에도, 상기와 같이, 적색, 청록색 및 황색 형광 모두 분산된 형태에서 강한 점의 형태로 변화되어 나타났으며, 형광 점의 패턴이 각 색깔별로 동일하여, 이들 형광을 나타내는 형광단백질이 동일한 위치에 존재하고 있음을 알 수 있었다(도 9c).
반면, CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, PHR-ECFP-Hras(inactive) 컨스트럭트 및 YFP-RBDraf1를 공형질도입시킨 세포(도 9b)와 CIBN-RFP-AD 컨스트럭트, PHR-ECFP-Hras(active) 컨스트럭트 및 YFP-CRIBPAK1 컨스트럭트를 공형질도입시킨 세포(도 9d)의 경우 빛 조사시 적색과 청록색 형광은 다수의 강한 점의 형태로 나타나고 그 패턴이 일치된 반면, 황색 형광은 아무런 변화가 없었다.
이는, 미끼 단백질과 표적 단백질 사이에 아무런 상호작용이 없는 경우 설명이 되는데(도 7), 자기조립된 광유도 이형 접합체 형성 단백질인 CIBN이 빛의 조사에 의해 동형 이합체를 형성한 PHR-ECFP-미끼단백질과 상호작용함으로써, 나노클러스터는 형성되었으나, 미끼단백질과 표적단백질 사이의 상호작용의 실패로 인하여, 표적단백질이 상기 나노클러스터와 복합체를 형성하지 못함으로 인하여 표적단백질에 연결된 형광이 그대로 분산된 형태로 나타나기 때문이다.
한편, 만일 광유도 이형 이합체 형성 단백질 사이의 동형 이합체 형성이 발생할 경우, 광유도 단백질 상호작용이 없는 경우에도 나노클러스터가 형성되고, 짝 단백질과의 상호작용이 저해되기 때문에, 이를 충분히 구분할 수 있게 된다.
이와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질 상호작용 분석용 키트 및 방법은 위양성 및 위음성의 가능성을 배제한 채 다른 단백질간의 상호작용 분석에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 상술한 실시예 및 실험예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
Claims (38)
- ⅰ) 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, ⅱ) 제2형광 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질, ⅲ) 제3형광 단백질을 포함하는 제3융합단백질, ⅳ) 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, ⅴ) 미끼 단백질, 및 ⅵ) 상기 미끼 단백질과의 상호작용 여부의 분석대상인 표적 단백질을 세포 내에서 동시에 발현시키되, 상기 짝 단백질은 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되고, 상기 미끼 단백질은 상기 제2융합단백질, 상기 제3융합단백질 또는 상기 제1자기조립단백질 및 상기 제1형광단백질을 포함하는 제4융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되며, 상기 표적 단백질은 상기 미끼 단백질이 포함된 융합단백질을 제외한 다른 융합단백질 또는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질에 포함되어 발현되는 것을 특징으로 하는 융합단백질 발현단계;
상기 융합단백질들이 동시에 발현된 세포에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 짝 단백질의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 나노 클러스터 형성을 유도하는 광유도 나노클러스터 형성단계; 및
상기 형광단백질들의 형광의 패턴과 강도를 관찰하는 형광 관찰단계를 포함하며,
상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법. - 제1항에 있어서,
상기 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR인,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법. - 제1항에 있어서,
상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), ECFP, TagCFP, Ds-Red 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법. - 제1항에 있어서,
상기 제2자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법. - 제1항에 있어서,
상기 제3형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법. - 제1항에 있어서,
상기 제4형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법. - ⅰ) 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, ⅱ) 제2형광 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질, ⅲ) 제3형광 단백질을 포함하는 제3융합단백질, ⅳ) 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, ⅴ) 미끼 단백질, 및 ⅵ) 상기 미끼 단백질과의 상호작용 여부의 분석대상인 표적 단백질을 세포 내에서 동시에 발현시키되, 상기 짝 단백질은 상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되고, 상기 미끼 단백질은 상기 제2융합단백질, 상기 제3융합단백질 또는 상기 제1자기조립단백질 및 상기 제1형광단백질을 포함하는 제4융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되며, 상기 표적 단백질은 상기 미끼 단백질이 포함된 융합단백질을 제외한 다른 융합단백질 또는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질에 포함되어 발현되는 것을 특징으로 하는 융합단백질 발현단계;
상기 융합단백질들이 동시에 발현된 세포에 상기 미끼 단백질과 상기 표적 단백질 사이의 단백질 상호작용 조절 후보물질을 처리하는 단계;
상기 조절 후보물질 처리 전, 후 또는 동시에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 짝 단백질의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 나노 클러스터를 형성을 유도하는 광유도 나노클러스터 형성단계; 및
상기 형광단백질들의 형광의 패턴과 강도를 관찰하는 형광 관찰단계를 포함하며,
상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법. - 제9항에 있어서,
상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법. - 제9항에 있어서,
상기 제1자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법. - 제9항에 있어서,
상기 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR인,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법. - 제9항에 있어서,
상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), ECFP, TagCFP, Ds-Red 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법. - 제9항에 있어서,
상기 제2자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법. - 제9항에 있어서,
상기 제3형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법. - 제9항에 있어서,
상기 제4형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법. - 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
제2형광 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터,
제3형광 단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터,
상기 제1자기조립단백질, 상기 제1형광단백질 및 미끼 단백질을 포함하는 제4융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며,
상기 제2융합단백질 또는 상기 제3융합단백질 중 어느 하나에 상기 미끼 단백질과의 단백질 상호작용 확인대상인 표적 단백질이 포함되거나 또는 제4형광단백질 및 상기 표적 단백질을 포함하는 제5융합단백질을 암호화하는 제5폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제5유전자 컨스트럭트를 포함하는 제5발현벡터가 추가적으로 포함되고,
상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제17항에 있어서,
상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제17항에 있어서,
상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF6, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR인,
단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제17항에 있어서,
상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, Ds-Red 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제17항에 있어서,
상기 제3형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제17항에 있어서,
상기 제1자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인,
단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제17항에 있어서,
상기 제2자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인,
단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제17항에 있어서,
상기 제4형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제1자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터;
제2형광 단백질 및 제2자기조립단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터,
제3형광 단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터,
상기 제1자기조립단백질, 상기 제1형광단백질을 포함하는 제4융합단백질을 암호화하는 제4폴리뉴클레오티드 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제4폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위를 포함하는 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하며,
상기 제2발현벡터 또는 상기 제3발현벡터 중 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위가 포함되지 않은 발현벡터 또는 추가적으로 포함되는 제4형광단백질을 포함하는 제5융합단백질을 암호화하는 제5폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제5발현벡터에 상기 미끼 단백질과의 단백질간 상호작용 여부 확인대상인 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하게 연결될 수 있는 다중 클로닝 부위가 포함되고,
상기 제1형광단백질 내지 제4형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하며, 상기 제1형광단백질 또는 제2형광단백질 중 어느 하나가 DsRed인 경우, DsRed가 포함된 융합단백질에서 상기 제1자기조립단백질 또는 상기 제2자기조립단백질은 생략이 가능한, 단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제25항에 있어서,
상기 제1형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제25항에 있어서,
상기 제1자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인,
단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제25항에 있어서,
상기 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질은 CIB, CIBN, PhyB, PIF, FKF1, GIGANTEA, CRY 또는 PHR인,
단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제25항에 있어서,
상기 제2형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), ECFP, TagCFP, Ds-Red 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제25항에 있어서,
상기 제2자기조립단백질은 페리틴(ferritin), 바이러스 캡시드 단백질, 페리틴 유사단백질, 마크네토좀, 칼모듈린 키나아제 IIα(CaMKIIα) 또는 DsRed인,
단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제25항에 있어서,
상기 제3형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
단백질간 상호작용 분석용 키트. - 제25항에 있어서,
상기 제4형광단백질은 녹색형광단백질(green fluorescent protein, GFP), 황색형광단백질(yellow fluorescent protein, YFP), 적색형광단백질(red fluorescent protein, RFP), 시안형광단백질(cyan fluorescent protein, CFP), 청색형광단백질(blue fluorescent protein, BFP), 개량시안형광단백질(enhanced cyan fluorescent protein, ECFP), TagCFP, DsRed 또는 테트라시스테인 형광 모티프(tetracystein fluorescent motif)인,
단백질간 상호작용 분석용 키트. - ⅰ) 자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하거나 DsRed 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, ⅱ) 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 및 제2형광단백질을 포함하는 제2융합단백질, ⅲ) 미끼 단백질, 및 ⅳ) 상기 미끼 단백질과의 상호작용 여부의 분석대상인 표적 단백질을 세포 내에서 동시에 발현시키되,
상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질 중 어느 하나는 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하고, 상기 미끼 단백질은 상기 제2융합단백질 또는 상기 자기조립단백질 및 상기 제1형광단백질을 포함하는 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되며, 상기 표적 단백질은 상기 미끼 단백질이 포함된 융합단백질을 제외한 다른 융합단백질 또는 제3형광단백질을 포함하는 제4융합단백질에 포함되어 발현되는 것을 특징으로 하는 융합단백질 발현단계;
상기 융합단백질들이 동시에 발현된 세포에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 짝 단백질의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 나노 클러스터 형성을 유도하는 광유도 나노클러스터 형성단계; 및
상기 형광단백질들의 형광의 패턴과 강도를 관찰하는 형광 관찰단계를 포함하며, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하는,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질 간 상호작용 분석방법. - ⅰ) 자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하거나 DsRed 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질, ⅱ) 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질 및 제2형광단백질을 포함하는 제2융합단백질, ⅲ) 미끼 단백질, 및 ⅳ) 상기 미끼 단백질과의 상호작용 여부의 분석대상인 표적 단백질을 세포 내에서 동시에 발현시키되,
상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질 중 어느 하나는 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하고, 상기 미끼 단백질은 상기 제2융합단백질 또는 상기 자기조립단백질 및 상기 제1형광단백질을 포함하는 제3융합단백질 중 어느 하나에 포함되어 발현되며, 상기 표적 단백질은 상기 미끼 단백질이 포함된 융합단백질을 제외한 다른 융합단백질 또는 제3형광단백질을 포함하는 제4융합단백질에 포함되어 발현되는 것을 특징으로 하는 융합단백질 발현단계;
상기 융합단백질들이 동시에 발현된 세포에 상기 미끼 단백질과 상기 표적 단백질 사이의 단백질 상호작용 조절 후보물질을 처리하는 단계;
상기 조절 후보물질 처리 전, 후 또는 동시에 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 및 상기 짝 단백질의 이형 이합체 형성을 유도하는 파장의 빛을 조사하여 나노 클러스터를 형성을 유도하는 광유도 나노클러스터 형성단계; 및
상기 형광단백질들의 형광의 패턴과 강도를 관찰하는 형광 관찰단계를 포함하며, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하는,
광유도 나노클러스터 형성을 이용한 단백질간 상호작용 조절물질의 스크리닝 방법. - 자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하거나 DsRed 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터,
제2형광단백질, 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질, 및 미끼 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터, 및
제3형광단백질 및 상기 미끼 단백질과 상호작용하는 표적 단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하고,
상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질 중 어느 하나는 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 동형 이합체 형성 단백질이고, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하는, 단백질간 상호작용 분석용 키트. - 자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하거나 DsRed 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터,
제2형광단백질, 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터,
상기 자기조립단백질, 제1형광단백질 및 미끼 단백질을 포함하거나 상기 DsRed 및 미끼 단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터, 및
제3형광단백질 및 상기 미끼 단백질과 상호작용하는 표적 단백질을 포함하는 제4융합단백질을 암호화하는 제4폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동가능하게 연결된 제4발현벡터를 포함하고,
상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질 중 어느 하나는 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 동형 이합체 형성 단백질이고, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하는, 단백질간 상호작용 분석용 키트. - 자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하거나 DsRed 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터,
제2형광단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드 및 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제2폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있도록 하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터, 및
제3형광단백질을 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드 및 상기 미끼 단백질과 상호작용 하는 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 상기 제3폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있도록 하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터를 포함하고,
상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질 중 어느 하나는 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 동형 이합체 형성 단백질이고, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하는, 단백질간 상호작용 분석용 키트. - 자기조립단백질, 제1형광단백질 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하거나 DsRed 및 광유도 이형 이합체 형성 단백질을 포함하는 제1융합단백질을 암호화하는 제1폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제1유전자 컨스트럭트를 포함하는 제1발현벡터,
제2형광단백질 및 광조사시 상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질과 이형 이합체를 형성하는 짝 단백질을 포함하는 제2융합단백질을 암호화하는 제2폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2유전자 컨스트럭트를 포함하는 제2발현벡터,
상기 자기조립단백질 및 제1형광단백질을 포함하거나 DsRed를 포함하는 제3융합단백질을 암호화하는 제3폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 미끼 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제3폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있도록 하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 제3유전자 컨스트럭트를 포함하는 제3발현벡터, 및
제3형광단백질을 포함하는 제4융합단백질을 암호화하는 제4폴리뉴클레오티드가 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 상기 미끼 단백질과 상호작용하는 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 상기 제4폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결될 수 있도록 하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 제4유전자 컨스트럭트를 포함하는 제4발현벡터를 포함하고,
상기 광유도 이형 이합체 형성 단백질 또는 상기 짝 단백질 중 어느 하나는 광조사와 무관하게 동형 이합체를 형성하는 동형 이합체 형성 단백질이고, 상기 제1형광단백질 내지 제3형광단백질은 서로 다른 파장의 빛을 방출하는, 단백질간 상호작용 분석용 키트.
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