JP5389307B2 - 単細胞レベルでの生物発光性Ca++リポーターとしてのキメラ性GFP−エクオリン - Google Patents
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Description
本願は、2000年6月1日付け米国仮出願第60/208,314号(代理人整理番号第03495.6051)、2000年6月6日付け同第60/210,526号(代理人整理番号第03495.6052)、および2000年12月14日付け同第60/255,111号(代理人整理番号第03495.6059)の恩典に基づき、かつこれをクレームする。参照によって、これらの出願のそれぞれの開示全体は、根拠とされ、かつ本明細書に組み込まれる。
本発明は、化学発光共鳴エネルギー移動(CRET)によるエネルギーの移動を可能にする、共有結合で発光タンパク質と結合された蛍光性分子を含む、改変された生物発光系に関する。本発明は、該改変された生物発光系のin vivoおよびin vitroアッセーにおける使用にも関する。
したがって、本発明は、発光タンパク質に共有結合で結合された蛍光分子を含む、改変された生物発光系であって、該2種類のタンパク質間の結合が、該改変された生物発光系を安定させ、化学発光共鳴エネルギー移動(CRET)によるエネルギーの移動を許すための機能を有する系を提供する。好適実施態様では、該生物発光系は、エクオリンというタンパク質に共有結合で結合されたGFPというタンパク質を含み、該2タンパク質間の結合が、該改変された生物発光系を安定させ、化学発光共鳴エネルギー移動(CRET)によるエネルギーの移動を可能にするための機能を有する。
(a)異なるサンプル中に、問題の被検体を含有する反応系中の本発明による生物発光系を与える工程と;
(b)光が生成されるか否かを測定する工程と;
(c)光の生成に基づく変化を検出する工程と
を含む。
(a)本発明による生物発光系を含む、許容され得る組成物を哺乳動物に投与する工程と;
(b)光が生成されるか否かを測定する工程と;
(c)場合により、カルシウム流束のイオン濃度を測定する工程と場合により、カルシウム流束のイオン濃度を測定する工程と
を含む。
で示される融合タンパク質を提供する。
を含む。リンカーは、アミノ酸配列Ser Gly Leu Arg Ser 〔配列番号26〕を含むこともできる。
を有して;該融合タンパク質は、Ca++イオンに対する親和性、および少なくとも24時間の半減期を有する。リンカーは、アミノ酸配列Ser Gly Leu Arg Ser 〔配列番号26〕を含むことができる。加えて、該融合タンパク質は、細胞または細胞下区画を融合タンパク質の標的にさせるためのペプチドシグナル配列をさらに含むことができる。
腔腸動物のうちには、生物発光する種が存在する。数多くの研究が、生物発光は、カルシウムに対して感受性を有する発光タンパク質によって生成されることを示している。これらのタンパク質は、カルシウムイオンの濃度の上昇に応答して、閃光または光を発する。これらの発光タンパク質のうち、エクオリンは、最も充分に研究された一つである〔Blinks et al., 1976〕。
本発明によれば、エクオリンおよびGFPによって融合タンパク質を構成して、Ca++誘導生物発光の量子収率を増大させている。この活性は、GFPとエクオリンと融合との単なる同時発現によって上昇させることができない(データ示さず)。C末端のプロリン残基は、Ca++活性化生物発光過程に関与することが示されていることから、耐熱性GFP(Gm)を、アポエクオリンのNH2末端領域と枠内で融合させた(図1)。
1.37℃でのGFPの配座変化の誘導を改良して、それが、哺乳動物細胞におけるGFPの、より高い放射へと導くこと;
2.哺乳動物細胞に適合させたエクオリンコドンの使用へと変化させて、その発現を増強すること;および
3.両タンパク質間の結合ペプチドを加えること。
UV、可視光またはIR中の原子もしくは分子からの電磁放射線の放射。この放射は、電子的に励起された状態から、より弱いエネルギーからの状態、一般的には基底状態に向けての移行の結果として生じる。
非常に短期の電子的に励起された一重項によって生成される蛍光。この発光は、励起からの発生源と同時に消滅する。
生きた生物が生成する可視的化学発光。本発明は、クラゲに天然に存在する系を、担体に固定することなく模倣する。
本発明による生物発光系は、中央にペプチドリンカーおよび補酵素を有する、キメラの三部構成分子(すなわちセレンテラジン)である。リンカーによって共有結合で結合された、第一の分子および第二の分子は、第一に供与体部位を、第二にそれに結合した受容体部位を有するならば(受容体−リンカー−リンガンド、抗体−リンガンド−抗原)、いかなるものであることもできる。このキメラタンパク質は、Coen, L.、Osta, R.、Maury, M.およびBrulet, P.〔Construction of hybrid proteins that migrate retrogradely and transynaptically into the centaral nervous system, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 94 (1997) 9400-9405〕によって、破傷風毒素のフラグメントに、軸索上でのその逆行およびシナプス貫通輸送のために融合させるか、または膜受容体に融合することができる。
エクオリンがカルシウムイオンによって結合されているとき、エクオリンからGTPヘの光子の放射は皆無である(したがって、本発明におけるエクオリンによる青色光の伝達は皆無であり、エネルギー移動は、二つのタンパク質間で直接実施される)。
蛍光による共鳴による(すなわちGFPの二つの変異体間の)エネルギーの移動。
緑色蛍光タンパク質およびカルモジュリンに基づく、Ca2+のための蛍光指示薬;Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R, McCaffery, J.M., Adams, J.A., Ikura, M. & Tsien, R.Y., Nature (1997) Vol. 388 pp. 882-887
カルモジュリン結合配列によって結合された2種類の緑色蛍光タンパク質変異体で構成される、指示薬の蛍光放射のCa2+依存性の変化の、生細胞における検出:蛍光指示薬の新たな一分類群;Romoser, V.A., Hinkle, P.M. & Persechini, A., J. Biol. Chem., (1997) Vol. 272, pp. 13270-13274
化学発光による共鳴(すなわち、リンカーまたはGFP−オベリンではなく、GFP−エクオリン(オワンクラゲ属のクラゲ)との融合タンパク質)によるエネルギーの移動。
化学発光エネルギー移動;Campbell, A.K., in Chemiluminescence: Principles and application in Biology and Medicine, Eds. Ellis Horwood, Chichester、英国、1988, pp. 475-534
生物発光による共鳴(すなわち、GFPとルシフェラーゼ(ウミシイタケ属のクラゲ)との間の相互作用)によるエネルギーの移動。
生物発光共鳴エネルギー移動(BRET)系:相互作用性概日時計タンパク質への応用;Xu, Y., Piston, D.W. & Johnson, C.H., Proc. Natl. Acad. Sci., (USA) (1999) Vol. 96, pp. 151-156;
細胞集団、または特定の組織におけるカルシウムに感受性を有する生物発光タンパク質の標的化は、特定のプロモーターの制御下での、相同的組換え、または遺伝子導入によって達成されるであろう。マウスの胚細胞における相同的組換えによって、遺伝子、たとえばHoxc-8およびOtxlをこの新たなマーカーと置き換えることは、突然変異マウスの新たな系統を得るのを可能にすると思われる。この取組み方は、一群の神経細胞における電気的活性の検出を許し、LacZ遺伝子を置き換えることによって得られる突然変異種の表現型の研究〔Le Mouellic et al., 1990, 1992;Acampora et al., 1996〕を完遂するのを可能にすると思われる。Hoxc-8遺伝子座については、マーカーの発現は、セクションC7で始めて、脊髄前角に位置しなければならない〔Le Mouellic et al., 1990〕。これらの筋に分布する運動ニューロンの体性感覚的機構の異常が解明されていて〔Tiret et al., 1998〕、そのため、発生の際のこれらの神経接続の確立における、カルシウム流束の役割の研究が着手されるであろう。Otxlモデルでは、大脳皮質の第V層および第VI層に、また間脳、中脳および小脳の領域に局在化した発現が、示されているところから、導入遺伝子は、前脳の特定の領域で発現されなければならない〔Frantz et al., 1994〕。この遺伝子をLacZ遺伝子に置き換えることによって得られた突然変異マウスは、大脳皮質の厚さの現象、および海馬、中脳および小脳の異常を示す〔Acampora et al., 1996〕。これらのマウスで観察された平衡および回転運動の喪失は、おそらく、感覚器官、具体的には目および内耳における異常に帰すことができる。また、これらのマウスは、全身性てんかんの発作を生じやすい。不完全な接続、および/または異常な電気的活性の確立が、これらの病理学的過程の形成に関与している可能性がある〔McNamara, 1992〕。この新たなマーカーの使用は、一方では、これらの仮説を、機能的かつ動的な取組み方を通じて確認すること、他方では、成体はもとより、発生の際のてんかんの発症に対処することを可能にすると思われる。
カルシウムは、非常に多くの細胞性機構、たとえば細胞移動、膜興奮性、ミトコンドリア代謝、分泌、有糸分裂、およびシナプス可塑性に関与する〔Berridge et al., 1998〕。細胞および細胞下レベルでのカルシウム情報のコーディングは、複雑であって、空間的、時間的および定量的因子を含む。異なる細胞下区画を本発明のマーカーの標的にさせることは、ペプチドシグナル、たとえばシナプトタグミンとの融合によって可能である。
破傷風毒素のフラグメントC(TTC)、またはヘルペスウイルスのVP22のような、細胞内輸送特性を有するタンパク質の、GFPおよびエクオリンとの三重融合は、接続された細胞の集団、たとえば神経ネットワークにおけるカルシウム活性を観察するのを可能にすると思われる。
KpnIおよびSmaIという酵素によるpEGFP−Clプラスミド〔Clontech、図を参照されたい〕の二重消化。KpnI外延を「ヤエナリ」ヌクレアーゼで末端平滑化した後、二つの突起を結合した。
pEGFP−CIdKSを用いて製造した一本鎖分子に対して、4種類の突然変異オリゴヌクレオチドを用いた。オリゴヌクレオチドは、それぞれ、1カ所または数カ所の誤対合を含んでいて(下記に小文字で特定した)、望みの突然変異を生じた。選ばれ、AgeI酵素ではなく、SacII酵素で切断されたpEGFP−Clmutというプラスミドでは、すべての突然変異を、配列決定によって確認した。
エクオリン(Aeq)コーディング枠を含むベクターに対してなされた4回のPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)は、A、B、CおよびDフラグメントを、それぞれ、プライマーoAE5AおよびoAE3A、oAE5BおよびoAE3B、oAE5CおよびoAE3C、oAE5DおよびoAE3Dを用いて増幅するのを可能にする。重複領域を用いて、連続PCRの際に異なる部分を組み立てる〔Ho, S.N., Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen, J.K. & Pease, L.R. "Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polimerase chain reaction" Gene, 77 (1989) 51-59〕。AおよびBフラグメントの混合物、ならびにプライマーoAE5AおよびoAE3Bで出発して、A+Bフラグメントを増幅する。同様に、CおよびDフラグメントの混合物によって、プライマーoAESAおよびoAE3Dを用いて、C+Dフラグメントを増幅する。最後に、完全なコーディング枠、すなわちA+B+C+Dを、プライマーoAE5AおよびoAE3Dによって開発した。
pEGFPmur−Aeqプラスミドでは、GFPとエクオリンののコーディング枠の間に、5アミノ酸の配列が存在する。観察は、BspEL部位に配列を差し込むことによる、この領域の伸長へと導いた。9アミノ酸の配列に対する二つの相補的なオリゴヌクレオチドのコーディングは、グリシンおよびセリンが豊富なために、大量の柔軟性を組成物に与える。挿入の後、新たな差込み配列が連続的に加えられてよいが、BspEL部位は、一方の側にのみ保存する。工程のそれぞれにおいて、BspEI酵素によって制御した。この配列の二つのコピーは、GFPの正常な蛍光を回復するのに必要とされるが、エクオリンとGFPとの間のエネルギー移動は、5コピーで最適である。pGCAプラスミドの差込配列の全体(5x9+l最初の5アミノ酸=50aa)を、配列決定によって確認した。
励起されたオキシルシフェリンとGFP発色団との間の非放射性エネルギー移動は、それらの全体的な幾何学、およびそれらの個々の運動に強く依存すると思われる。そのため、主としてセリンおよびグリシン残基で構成されるリンカーを、様々な長さの柔軟な要素を差し込むよう設計した。
GFP−アポエクオリン構成体の細胞内局在を調べた。図3は、Neuro2A細胞における一過性トランスフェクションの48時間後のGFP活性を示す。突然変異GFP単独の発現(Gm)は、GFPが、核内に拡散できる非委細タンパク質であることから予期されたとおり、細胞質ゾルはもとより、核内でも均質な蛍光を示した。突然変異V163Aは、本来のEGFP(データ示さず)と比較したとき、おそらく、適正に折り畳まれたタンパク質の比較的高い濃度のために、蛍光シグナルを顕著に向上させ、光漂白を減少させた。Neuro2A細胞(図3A〜D)はもとより、COS−7細胞でも、すべてのGFP−アポエクオリン構成について、均等な分布も観察された。最短のリンカー:すなわちGA、G1AおよびG2Aを有する融合タンパク質では、しばしば、細胞質ゾル中に輝点が出現した。これらの輝点は、G4Aでは、より少なく、GmおよびG5Aでは、決して観察されなかった。一過性トランスフェクションの際に発現された高濃度のタンパク質は、GFPの凝集を誘導することができて(24)、エクオリンタンパク質の存在、およびそれらを隔てる距離によっても影響されようとしている。
Neuro2A細胞をpA、pGA、pG2A、pG5Aで一過的にトランスフェクションするか、またはpAおよびpGmで同時トランスフェクションした(図1)。Ca++を含まない緩衝液中の天然セレンテラジンによるエクオリン再構成の後、CaCl2溶液(5mM)を加えて、光子の放出を古典的な増感CCDカメラで測定した(図4A.1および4A.4)。無視し得るバックグラウンドにより(図4A.2)、融合タンパク質のいずれかを発現する単一細胞のシグナル(図4A.1)を記録するには、1秒の積分時間が充分である。エクオリン単独でか、または同時発現させた遊離GFPでは、可視化できたシグナルは皆無であった(データは示さず)。未結合GFPの存在は、本発明者らがin vitroで観察したとおりのエクオリン化学発光を改良しなかった。生成された光のレベルが低いため、in situで発現されたエクオリンは、単一細胞では、ミトコンドリアを標的化したとき以外は決して検出されなかった。冷却増感CCDカメラを用いて、Rutterら(1996)(27)は、エクオリンをシトクロームcオキシダーゼと融合させたときに、ミトコンドリア内Ca++シグナルを検出するのに成功している。細胞質エクオリンをコードしている導入遺伝子は、より鋭敏ではあるが、単一細胞分析のための空間解像力を欠く、光電子増倍管(PMT)を用いたときにのみ、細胞の単層内のカルシウム活性をリポートできるにすぎない。本発明のGFP−エクオリン融合の安定性、および改良された発光は、単一細胞のレベルで生理学的Ca++シグナルを検出するのを可能にした。
構成体は、すべて、pEGFP−Clベクター(Clontech)中に作成した。EGFP遺伝子を、哺乳動物細胞での最大発現にコドン最適化した。それは、クロモホアF64LおよびS65Tに、励起スペクトルを変更し、蛍光強度を増強する二つの突然変異も有する(17)。EGFPのバリン163番も、一本鎖突然変異誘発を用いて、アラニンに置き換えて、タンパク質の適正な折り畳みを改良し、371Cにおける蛍光を強めた(18、19)。エクオリンコーディング配列は、M.-T. Nicolasによる寛大な贈与品であって、pEGFP−ClのBgIII/SaII部位で、EGFP遺伝子の3’末端の枠内で融合した。哺乳動物細胞でより充分に発現させるため、重複外延を有するPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)を用い、部位指向性突然変異誘発によって7コドンを改変した。、次いで、相補的オリゴヌクレオチド:5'-CCGGCGGGAGCGGATCCGGCGGCCAGT-3'〔配列番号23〕および5'-CCGGACTGGCCGCCGGATCCGCTCCCG-3'〔配列番号24〕を、GFPとエクオリンとの間の15bpの配列中のBspEI部位に挿入した。末端のみでのBspEI部位の保存は、1〜5個のリンカー配列(pG1A〜pG5A)の逐次付加を許す。
神経芽細胞腫の細胞(Neuro2A、マウス)を、10体積%熱処理ウシ胎児血清;2mMグルタミン(Life Technologies - Gibco、英国)、および100単位のストレプトマイシン−ペニシリン(Life Technologies - Gibco、英国)を補強した、ダルベッコのイーグル培地(Life Technologies - Gibco、英国)中で増殖させた。培養体を、8%CO2を含む加湿雰囲気中、37℃で温置し、CaPO4手法またはFuGENE 6(登録商標)トランスフェクション試薬(Roche)のいずれかを用いて、一過的にトランスフェクションした。
細胞を、PBS中10mMのβ−メルカプトエタノール、4mMのEDTA、5μMのセレンテラジンの250μl中で4℃で2〜4時間トランスフェクションした後に採集した。細胞を、PBS中1mMのEDTA中で洗浄し、低浸透圧緩衝液(製造者Rocheに従って、プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えた、20mMトリス−HCl、pH7.5/5mMEDTA/5mMβ−メルカプトエタノール)400μl中、4℃で30分〜1時間で採集した。30ゲージの針を通過させることによって、細胞膜を破壊し、13,000rpm、40℃で1時間の遠心分離後に、細胞抽出物を得た。すべての構成体について上清を採集したが、SGSAだけは、膜ペレットをさらに再懸濁させた。ルミノメーター(Lumat LB95501 E&EG Berthold)内で、カルシウム感受性化学発光活性を測定した。アリコート(10μl)を、ルミノメーター内のサンプル管(90mlの10mMトリス−HCl、pH7.5)に入れ、相対光単位(R.L.U.)で表される光強度を、50mMCaCl2/10mMトリス−HCl、pH7.5の溶液100μlを注入した後に測定した。
Neuro2A細胞を、PBS、pH7.4中4%のパラホルムアルデヒド中でのトランスフェクションの48時間後に固定し、PBS中で洗浄し、載せた。マルチラインモードで作動する、アルゴン−クリプトンレーザーを用いる、共焦点レーザー走査顕微鏡(Zeiss, Heidelberg、ドイツ国)、または表面発光系によるAxiophot顕微鏡(Zeiss, Heidelberg、ドイツ国)下で、GFP蛍光を可視化した。標的化されたGFP−エクオリンの免疫定位のためには、固定された細胞を、PBS、pH7.4中50mMのNH4Clで室温で5分間前処理し、PBS中の2%BSA/0.02%トリトン/ヤギ血清溶液中で1時間、浸透性化した。次いで、シナプトタグミンに対する抗体(StressGen SYA-130)を、2〜4時間加えた。次いで、細胞をPBS中で洗浄し、1/100に希釈した二次抗体(TRITC結合抗体)とともに、PBS中2%のBSA/0.02%トリトン中で温置した。次いで、細胞を、PBS中で洗浄し、載せた。
トランスフェクションの48時間後に、細胞を、124mMNaCl/5mMKCl/15mMHepes、pH7.4/5mMNaHCO3/1mMNaH2PO4/0.5mMMgSO4/1.5mMCaCl2/5.5mMグルコース中で洗浄し、その後、CaCl2なしで、5μMのセレンテラジンを含む同じ緩衝液中で、37℃で2〜4時間温置して、エクオリンを再構成し、次いで洗浄した。カルシウムシグナルは、BH2−RFCA表面蛍光ユニットを取り付け、平面x40のOlympus長作業距離水浸レンズ(N.A.0.7)越しに記録される、改変Olympusアップライト顕微鏡(BHS)で可視化した。GFP蛍光は、トランスフェクションされた細胞上の記録域を選ぶことを許した。励起灯を消灯し、カメラの利得を増加させた。画像は、冷却されたPhotonic Science extended ISISビデオカメラで、毎秒、積分した。図4の描像は、それぞれ、Axon Imaging Workbench 2214というソフトウェアを用いて、個々の細胞の本体の周囲に本発明者らが定義した部域全体から放射された光の量を表す。蛍光の強さ、およびCRET活性を、目盛りつき擬似色彩に翻訳した。対照は、模擬トランスフェクションされたNeuro2A細胞上でFluo−3AMを用いて作成して、実験条件を確認した。
異なる細胞質タンパク質の代謝回転時間を、ピューロマイシン(50μg/ml)で6時間処理することによって、COS7細胞で一過性発現について推計した。Ca2+誘導化学発光活性は、5μMセレンテラジンの存在下でエクオリンを再構成した後に得られた細胞抽出物で実施した。カルシウム感受性化学発光活性は、ルミノメーターLumat LB95501 E&EG Berthold)内で測定した。アリコート(10μl)を、ルミノメーター内のサンプル管(90mlの10mMトリス−HCl、pH7.5)に入れ、相対光単位(R.L.U)で表される光強度をアリコート(10μl)を、ルミノメーター内のサンプル管(90mlの10mMトリス−HCl、pH7.5)に入れ、相対光単位(R.L.U.)で表される光強度をアリコート(10μl)を、ルミノメーター内のサンプル管(90mlの10mMトリス−HCl、pH7.5)に入れ、相対光単位(RLU)で表される光強度を、50mMCaCl2/10mMトリス−HCl、pH7.5の溶液100μlを注入した後に測定した。相対化学発光活性は、ゼロ時点での活性(100%)の百分率として表す。結果は、図5に示したとおりである。図5から理解されるとおり、この期間にわたって、ほとんどの融合タンパク質は、単独のときのアポエクオリンの80%の喪失と比較して、活性の30%の低下を示した。
Ca2+誘導化学発光活性を、5μMセレンテラジンの存在下でエクオリンを再構成した後に得られた細胞抽出物で実施した。ルミノメーター(Lumat LB95501 E&EG Berthold)内で、カルシウム感受性化学発光活性を測定した。アリコート(10μl)を、ルミノメーター内のサンプル管(90mlの10mMトリス−HCl、pH7.5)に入れ、相対光単位(RLU)で表される光強度を、異なるCa/EGTA溶液100μlの注入後に測定した。結果を図6に示す。図6で理解されるとおり、G5Aは、38nMという低いCa++濃度で、バックグラウンドに優る有意なシグナルを与えるのに対して、エクオリンは、匹敵するシグナルを生じるのに、28倍も多くのカルシウム(1M)を必要とする。
キメラ性GFP−エクオリンカルシウムカルシウム感受性生物発光リポーターに関しては、新たな用途を開発し、いくつかの予備データが、Ca2+イオンに対するGFP−エクオリンタンパク質の感受性について得られた。
二つの構成体G5AおよびSG5AのCa2+感受性の測定を、5μMセレンテラジンの存在下でエクオリンを再構成した後に得られた細胞抽出物で実施した。カルシウム化学発光活性を、ルミノメーター(Lumat LB95501 E&EG Berthold)内で測定した。アリコート(10μl)を、ルミノメーター内の90μlの10mMトリス−HCl、pH7.5を有するサンプル管に入れ、相対光単位(RLU)で表される光強度を、異なるCa/EGTA溶液100mlの注入後に測定した(Molecular Probes Calcium Calibration Buffer Kit)。図7は、G5A、SG5AおよびエクオリンのCa2+応答曲線を示す。曲線は、L/Lmax比と〔Ca2+〕との間の関係を表す。Lは、与えられたいずれかの〔Ca2+〕でのRLUの比率であり、Lmaxは、飽和〔Ca2+〕でのRLUの比率である。これらの結果は、様々な形態のGFP−エクオリンのCa2+に対する、エクオリンよりはるかに高い親和性を示す。
GFP−エクオリンを有するアデノウイルスベクターを開発した。これらの新奇な構成体を用いて、培養体中のラット脊髄からの解離したニューロンを、より高い効率でトランスフェクションすることができる。図8および9は、解離ニューロン細胞において単一細胞レベルで検出されたCa2+誘導生物発光シグナルを示す。アデノウイルスベクターによって、G5A(図8)またはSG5A(図9)に感染させたニューロン細胞を、無Ca2+緩衝液中で5μMのセレンテラジンとともに前温置した。蛍光および生物発光の強さを、擬似色彩に翻訳した。5mMおよび2.5mMのCaCl2を、それぞれ、図8a〜cおよび9aについて12および19秒間加えた後に、選ばれた視野の代表的な画像を示す。図8d〜eおよび9bは、イオノマイシン、および高濃度のCaCl2(100mM)を加えた後に得られた。
アフリカツメガエル属における初期および後期胚発生の際のカルシウム発信を調べた。図10は、アフリカツメガエル属の胚の単細胞期における、GAプラスミドの注入後の神経誘導の際の、細胞内カルシウムの変化を示す。図11は、GFP−エクオリンを有するトランスジェニックなアフリカツメガエル属の幼生を示す。これらの手法は、ゼブラダニオおよびマウスの核酸移入にも用いることができる。これらの結果は、これらのカルシウムリポーターが、非常に様々な生物または組織に用いて、カルシウム活性を可視化し、カルシウム濃度を測定することができる。
該リンカーの異なるアミノ酸配列およびペプチド配列を記載した。その長さは、4〜9アミノ酸という最小の大きさを含み、それが、7〜12アミノ酸の群によって伸長することができる(好適実施態様では9アミノ酸)。該群は、63アミノ酸まで、すなわち9x6倍に拡張することができる。実験は、たとえば、5アミノ酸、次いで1〜5倍のアミノ酸を含むペプチドリンカーで実施した。
その第一の機能は、二つの分子の供与体部位と受容体部位とを近づけて、エネルギーを直接伝達することである。このリンカーは、CRETによるエネルギー移動に最適の環境を与える。
生物発光系では、タンパク質−タンパク質相互作用に適性あり。
キメラタンパク質は、分子の半減期の延長によって、より安定的になる。
カルシウムイオンに対する感度の増大も重要である。
Claims (46)
- 下記:
(a)蛍光分子、
(b)エクオリンタンパク質(AEQ)、及び
(c)配列(Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gln Ser〔配列番号25〕)n
〔式中、nは、1〜5である〕又は
配列Ser Gly Leu Arg Ser〔配列番号26〕
のいずれかを含む、4〜63アミノ酸のポリペプチドであり、蛍光分子とAEQとの間の化学発光共鳴エネルギー移動(CRET)によるエネルギーの移動を可能にする、リンカー
を含む、融合タンパク質。
- 該蛍光分子が、緑色蛍光タンパク質(GFP)である、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 下記:
(a)緑色蛍光タンパク質(GFP)、
(b)エクオリンタンパク質(AEQ)及び
(c)配列(Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gln Ser〔配列番号25〕)n
〔式中、nは、1〜5である〕又は
配列Ser Gly Leu Arg Ser〔配列番号26〕
のいずれかを含む、4〜63アミノ酸のポリペプチドであり、GFPとAEQとの間の化学発光共鳴エネルギー移動(CRET)によるエネルギーの移動を可能にする、リンカー
からなる、請求項1又は2に記載の融合タンパク質。
- 該リンカーが、Ser Gly Leu Arg Ser 〔配列番号26〕からなる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 該リンカーが、長さで14〜50アミノ酸残基である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 該リンカーが、配列(Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gln Ser〔配列番号25〕)n
〔式中、nは、1〜5である〕を含む、請求項5に記載の融合タンパク質。
- 細胞または細胞より小さい区画を融合タンパク質の標的にさせるためのペプチドシグナル配列をさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 破傷風毒素のフラグメントをさらに含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の融合タンパク質。
- 配列番号1のアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド。
- 配列番号3のアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド。
- 配列番号4のアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド。
- 配列番号5のアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド。
- 配列番号6のアミノ酸配列を含む、精製されたポリペプチド。
- 配列番号18のアミノ酸配列からなるペプチドリンカー。
- 配列番号19のアミノ酸配列からなるペプチドリンカー。
- 配列番号20のアミノ酸配列からなるペプチドリンカー。
- 配列番号21のアミノ酸配列からなるペプチドリンカー。
- 配列番号22のアミノ酸配列からなるペプチドリンカー。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド。
- 配列番号7の配列を含む、精製されたポリヌクレオチド。
- 配列番号8の配列を含む、精製されたポリヌクレオチド。
- 配列番号9の配列を含む、精製されたポリヌクレオチド。
- 配列番号10の配列を含む、精製されたポリヌクレオチド。
- 配列番号11の配列を含む、精製されたポリヌクレオチド。
- 配列番号12の配列を含む、精製されたポリヌクレオチド。
- 配列番号13のポリヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドリンカー。
- 配列番号14のポリヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドリンカー。
- 配列番号15のポリヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドリンカー。
- 配列番号16のポリヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドリンカー。
- 配列番号17のポリヌクレオチド配列からなる、ポリヌクレオチドリンカー。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の融合タンパク質又は請求項9〜14のいずれか1項に記載の精製されたポリペプチドを含む、組成物。
- 哺乳動物への該組成物の許容され得る投与のための試薬をさらに含む、請求項32に記載の組成物。
- 配列番号7を含み、アクセッション番号I−2507で、2000年6月22日にC.N.C.M.に寄託された、プラスミド。
- 配列番号8を含み、アクセッション番号I−2508で、2000年6月22日にC.N.C.M.に寄託された、プラスミド。
- 配列番号9を含み、アクセッション番号I−2509で、2000年6月22日にC.N.C.M.に寄託された、プラスミド。
- 配列番号10を含み、アクセッション番号I−2510で、2000年6月22日にC.N.C.M.に寄託された、プラスミド。
- 配列番号11を含み、アクセッション番号I−2511で、2000年6月22日にC.N.C.M.に寄託された、プラスミド。
- 配列番号12を含み、アクセッション番号I−2512で、2000年6月22日にC.N.C.M.に寄託された、プラスミド。
- 配列番号12のシナプトタグミンIの最初の134N末端アミノ酸及びGFPをコードするヌクレオチド、配列番号17に定義のとおりのリンカーG5A及び配列番号12のエクオリンを5’から3’に含み、アクセッション番号I−2513で、2000年6月22日にC.N.C.M.に寄託された、プラスミド。
- インビボまたはインビトロでのエネルギーの移動を測定するためのキットであって、請求項9〜14のいずれか1項に記載の少なくとも1種類のポリペプチド、または請求項20〜26のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドと、試験しようとする問題の分子の存在もしくは不在下での該移動を可視化もしくは検出するのに必要な試薬とを含むキット。
- 物理的、化学的、生化学的または生物学的条件の変化をインビトロでふるい分ける方法であって、
(a)請求項32に記載の組成物を、試験しようとする問題の分子の存在または不在下で反応系に加える工程と;
(b)工程(a)で生成されたエネルギーの放射を可視化する工程と
を含む方法。
- 請求項32に記載の組成物におけるエネルギーを調整できる分子をインビトロでふるい分ける方法であって、
(a)試験しようとする分子を含有する反応系中の請求項32記載の組成物を、生物学的サンプル中に与える工程と;
(b)試験しようとする分子なしに請求項32記載の該組成物を含有する対照サンプルと比較することによって、エネルギーの調整を検出する工程と;
(c)該組成物のエネルギー移動を阻害または増強できる該分子の有効最低濃度を決定する工程と
を含む方法。
- 下記:
(a)配列番号18のアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、
(b)配列番号19のアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、
(c)配列番号20のアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、
(d)配列番号21のアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び
(e)配列番号22のアミノ酸配列からなるペプチドリンカー
からなる群より選択されるリンカーの、
該リンカーによって共有結合された、蛍光分子とエクオリンとの間の化学発光共鳴エネルギー移動(CRET)によるエネルギー移動における、使用。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の融合タンパク質、請求項9〜14のいずれか1項に記載の精製されたポリペプチド又は請求項32又は33に記載の組成物の、非ヒト生存動物におけるリアルタイムのカルシウム流束をモニターするための使用。
- 請求項20〜26のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの、非ヒト生存トランスジェニック動物におけるリアルタイムのカルシウム流束をモニターするための使用。
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