JP2002253261A - 蛍光タンパク質 - Google Patents
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 常温においてカルシウムイオン濃度を定量化
するための指示薬として使用できる蛍光タンパク質の提
供。 【解決手段】 Ｎ末端からＣ末端方向に以下のアミノ酸
配列（１）〜（３）を順番に有する蛍光タンパク質にカ
ルシウム結合タンパク質とその標的ペプチドとを融合し
て得られる融合蛍光タンパク質がＣａ2+イオンの量に依
存した蛍光を発することができる、蛍光タンパク質。
（１）緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シア
ン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タン
パク質及びそれらの変異体から成る群から選択される蛍
光タンパク質のＮ末端からｎ番目のアミノ酸からＣ末端
までのアミノ酸配列（ただし、ｎは１４０から１５０ま
での整数を示す）；（２）２〜２０個のアミノ酸配列か
ら成るリンカー配列；及び（３）上記（１）に記載した
蛍光タンパク質のＮ末端の1番目からｎ−１番目のアミ
ノ酸配列：
するための指示薬として使用できる蛍光タンパク質の提
供。 【解決手段】 Ｎ末端からＣ末端方向に以下のアミノ酸
配列（１）〜（３）を順番に有する蛍光タンパク質にカ
ルシウム結合タンパク質とその標的ペプチドとを融合し
て得られる融合蛍光タンパク質がＣａ2+イオンの量に依
存した蛍光を発することができる、蛍光タンパク質。
（１）緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シア
ン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タン
パク質及びそれらの変異体から成る群から選択される蛍
光タンパク質のＮ末端からｎ番目のアミノ酸からＣ末端
までのアミノ酸配列（ただし、ｎは１４０から１５０ま
での整数を示す）；（２）２〜２０個のアミノ酸配列か
ら成るリンカー配列；及び（３）上記（１）に記載した
蛍光タンパク質のＮ末端の1番目からｎ−１番目のアミ
ノ酸配列：
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｃａ2+イオン指示
薬として有用な蛍光タンパク質に関する。より詳細に
は、本発明は、緑色蛍光タンパク質や黄色蛍光タンパク
質などの蛍光タンパク質にサーキュラーパーミュテーシ
ョンを施すことによって調製される、Ｃａ2+イオンの量
に依存した蛍光を発することができる蛍光タンパク質に
関する。
薬として有用な蛍光タンパク質に関する。より詳細に
は、本発明は、緑色蛍光タンパク質や黄色蛍光タンパク
質などの蛍光タンパク質にサーキュラーパーミュテーシ
ョンを施すことによって調製される、Ｃａ2+イオンの量
に依存した蛍光を発することができる蛍光タンパク質に
関する。
【０００２】
【従来の技術】緑色蛍光タンパク質（GFP）の蛍光共鳴
エネルギー転移（FRET）の利用により、単一の生細胞に
おけるタンパク質のヘテロマー化および立体構造変化を
視覚化することができる（Tsien, R. Y. & Miyawaki,
A. (1998) Science 280, 1954-1955）。FRETは色が異な
る２種のGFPを使用するものである。
エネルギー転移（FRET）の利用により、単一の生細胞に
おけるタンパク質のヘテロマー化および立体構造変化を
視覚化することができる（Tsien, R. Y. & Miyawaki,
A. (1998) Science 280, 1954-1955）。FRETは色が異な
る２種のGFPを使用するものである。
【０００３】野生型GFP（WT-GFP）は、発色団のプロト
ン化状態および脱プロトン化状態に各々対応する、２つ
の最大ピーク395nmおよび475nmを伴なう二峰性吸収スペ
クトルを有する（Tsien, R. Y. (1998) Annu. Rev. Bio
chem. 67, 509-44）。イオン化状態は、発色団とそれを
取り囲む複数のアミノ酸との間の極性相互作用の複雑な
ネットワークを含むプロトンネットワークにより調節さ
れる。WT-GFPとは対照的に、ほとんどのGFP変異体の発
色団は単一のpKa値で滴定される。これは、外部操作の
結果、内部のプロトン平衡が破壊されたことを示す（Ll
opis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquha
r, M. G. & Tsien, R. Y. (1998) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 95. 6803-6808）。GFP変異体の１つとして黄色
蛍光タンパク質（YFP）がある。YFPは、528nmでのレッ
ドシフト発光をもたらすT203Y置換を有する。203番目の
アミノ酸位置に導入されたチロシンは発色団とのπスタ
ッキング相互作用に関与することが予測されたが（Orm
o, M., Cubitt, A.B., Kallio, K., Gross, L. A., Tsi
en, R. Y. & Remington, S. J. (1996) Science 273,13
92-1395）、これはＸ線結晶測定により証明された(Wach
ter, R. M., Elsliger, M. A., Kallio, K., Hanson,
G. T. & Remington S. J. (1998) Structure 6,1267-12
77)。
ン化状態および脱プロトン化状態に各々対応する、２つ
の最大ピーク395nmおよび475nmを伴なう二峰性吸収スペ
クトルを有する（Tsien, R. Y. (1998) Annu. Rev. Bio
chem. 67, 509-44）。イオン化状態は、発色団とそれを
取り囲む複数のアミノ酸との間の極性相互作用の複雑な
ネットワークを含むプロトンネットワークにより調節さ
れる。WT-GFPとは対照的に、ほとんどのGFP変異体の発
色団は単一のpKa値で滴定される。これは、外部操作の
結果、内部のプロトン平衡が破壊されたことを示す（Ll
opis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquha
r, M. G. & Tsien, R. Y. (1998) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 95. 6803-6808）。GFP変異体の１つとして黄色
蛍光タンパク質（YFP）がある。YFPは、528nmでのレッ
ドシフト発光をもたらすT203Y置換を有する。203番目の
アミノ酸位置に導入されたチロシンは発色団とのπスタ
ッキング相互作用に関与することが予測されたが（Orm
o, M., Cubitt, A.B., Kallio, K., Gross, L. A., Tsi
en, R. Y. & Remington, S. J. (1996) Science 273,13
92-1395）、これはＸ線結晶測定により証明された(Wach
ter, R. M., Elsliger, M. A., Kallio, K., Hanson,
G. T. & Remington S. J. (1998) Structure 6,1267-12
77)。
【０００４】GFP変異体の緻密な「β-can」構造（Yang,
F., Moss, L. G. & Phillips, G.N., Jr. (1996) Nat.
Biotech. 14, 1246-1251）内に、Bairdらは、ポリペプ
チドの２つの部分が中央部位の周りにフリップするサー
キュラーパーミュテーション（circular permutation
s）を許容する可能性がある部位を見出した（Baird,G.
S., Zacharias, D.A. & Tsien, R. Y. (1999) Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 96,11241-11246）。β-canの開裂のた
め、サーキュラーパーミュテーションを行ったGFP（cpG
FP）の発色団はタンパク質の外側のプロトンにはこれ以
上接近できないと思われた。cpGFPの使用は、２つのタ
ンパク質ドメイン間の相互作用シグナルを発色団の静電
気的変化に変換する上で、即ち、相互作用の情報を蛍光
シグナルに変換する上で興味深い。
F., Moss, L. G. & Phillips, G.N., Jr. (1996) Nat.
Biotech. 14, 1246-1251）内に、Bairdらは、ポリペプ
チドの２つの部分が中央部位の周りにフリップするサー
キュラーパーミュテーション（circular permutation
s）を許容する可能性がある部位を見出した（Baird,G.
S., Zacharias, D.A. & Tsien, R. Y. (1999) Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 96,11241-11246）。β-canの開裂のた
め、サーキュラーパーミュテーションを行ったGFP（cpG
FP）の発色団はタンパク質の外側のプロトンにはこれ以
上接近できないと思われた。cpGFPの使用は、２つのタ
ンパク質ドメイン間の相互作用シグナルを発色団の静電
気的変化に変換する上で、即ち、相互作用の情報を蛍光
シグナルに変換する上で興味深い。
【０００５】しかしながら、カルシウムイオンに感受性
のあるcpGFP、特に３７℃においてカルシウムイオン濃
度を定量化するための指示薬として使用できるcpGFPに
ついては未だ報告されていない。
のあるcpGFP、特に３７℃においてカルシウムイオン濃
度を定量化するための指示薬として使用できるcpGFPに
ついては未だ報告されていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、カルシウム
イオンに感受性のある新規な蛍光タンパク質、特に３７
℃においてカルシウムイオン濃度を定量化するための指
示薬として使用できる蛍光タンパク質を提供することを
解決すべき課題とした。
イオンに感受性のある新規な蛍光タンパク質、特に３７
℃においてカルシウムイオン濃度を定量化するための指
示薬として使用できる蛍光タンパク質を提供することを
解決すべき課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に本発明者らは鋭意検討を重ね、カルモジュリン（Ca
M）およびM13（骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼのCaM結合
領域に由来する26残基ペプチド）（Blumenthal, D. K.,
& Krebs, E. G. (1987) Methods Enzymol. 139,115-12
6）を融合したcpYFPを構築した。なお、Ca2+が結合した
CaM（Ca2+-CaM）およびM13ペプチドは安定かつ緻密な複
合体を形成し、この複合体の溶液構造は多次元NMRによ
り測定されている（Ikura, M., Clore, G. M., Gronenb
orn A. M., Zhu, G., Klee, C. B. & Bax, A.(1992) Sc
ience 256, 632-638）。
に本発明者らは鋭意検討を重ね、カルモジュリン（Ca
M）およびM13（骨格筋ミオシン軽鎖キナーゼのCaM結合
領域に由来する26残基ペプチド）（Blumenthal, D. K.,
& Krebs, E. G. (1987) Methods Enzymol. 139,115-12
6）を融合したcpYFPを構築した。なお、Ca2+が結合した
CaM（Ca2+-CaM）およびM13ペプチドは安定かつ緻密な複
合体を形成し、この複合体の溶液構造は多次元NMRによ
り測定されている（Ikura, M., Clore, G. M., Gronenb
orn A. M., Zhu, G., Klee, C. B. & Bax, A.(1992) Sc
ience 256, 632-638）。
【０００８】さらに本発明者らは、M13、cpYFPおよびCa
Mから構成されるキメラ融合タンパク質の蛍光特性を調
べた結果、この蛍光特性は、CaMとM13との間のCa2+依存
性相互作用に応じて変化することが判明した。さらに、
スペクトル変化の挙動は、cpYFPのプロトンネットワー
クに影響し得る変異により変動することも判明した。本
発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
Mから構成されるキメラ融合タンパク質の蛍光特性を調
べた結果、この蛍光特性は、CaMとM13との間のCa2+依存
性相互作用に応じて変化することが判明した。さらに、
スペクトル変化の挙動は、cpYFPのプロトンネットワー
クに影響し得る変異により変動することも判明した。本
発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００９】即ち、本発明によれば、Ｎ末端からＣ末端
方向に以下のアミノ酸配列（１）〜（３）を順番に有す
る蛍光タンパク質において、当該蛍光タンパク質にカル
シウム結合タンパク質とその標的ペプチドとを融合して
得られる融合蛍光タンパク質がＣａ2+イオンの量に依存
した蛍光を発することができることを特徴とする、蛍光
タンパク質が提供される。 （１）緑色蛍光タンパク質又はその変異体、黄色蛍光タ
ンパク質またはその変異体、シアン蛍光タンパク質また
はその変異体、赤色蛍光タンパク質またはその変異体、
及び青色蛍光タンパク質またはその変異体から成る群か
ら選択される蛍光タンパク質のＮ末端からｎ番目のアミ
ノ酸からＣ末端までのアミノ酸配列（ただし、ｎは１４
０から１５０までの整数を示す）； （２）２〜２０個のアミノ酸配列から成るリンカー配
列；及び （３）上記（１）に記載した蛍光タンパク質のＮ末端の
1番目からｎ−１番目のアミノ酸配列：
方向に以下のアミノ酸配列（１）〜（３）を順番に有す
る蛍光タンパク質において、当該蛍光タンパク質にカル
シウム結合タンパク質とその標的ペプチドとを融合して
得られる融合蛍光タンパク質がＣａ2+イオンの量に依存
した蛍光を発することができることを特徴とする、蛍光
タンパク質が提供される。 （１）緑色蛍光タンパク質又はその変異体、黄色蛍光タ
ンパク質またはその変異体、シアン蛍光タンパク質また
はその変異体、赤色蛍光タンパク質またはその変異体、
及び青色蛍光タンパク質またはその変異体から成る群か
ら選択される蛍光タンパク質のＮ末端からｎ番目のアミ
ノ酸からＣ末端までのアミノ酸配列（ただし、ｎは１４
０から１５０までの整数を示す）； （２）２〜２０個のアミノ酸配列から成るリンカー配
列；及び （３）上記（１）に記載した蛍光タンパク質のＮ末端の
1番目からｎ−１番目のアミノ酸配列：
【００１０】本発明において好ましくは、融合蛍光タン
パク質はＣａ2+イオンの存在下においてその量に依存し
て異なる強度の蛍光を発することができるか、又は融合
蛍光タンパク質はＣａ2+イオンの存在下においてその量
に依存して異なる波長の励起を示すことができる。好ま
しくは、リンカー配列のアミノ酸配列がGly-Gly-Ser-Gl
y-Gly又はVal-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Thr-Glyであ
る。
パク質はＣａ2+イオンの存在下においてその量に依存し
て異なる強度の蛍光を発することができるか、又は融合
蛍光タンパク質はＣａ2+イオンの存在下においてその量
に依存して異なる波長の励起を示すことができる。好ま
しくは、リンカー配列のアミノ酸配列がGly-Gly-Ser-Gl
y-Gly又はVal-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Thr-Glyであ
る。
【００１１】本発明の蛍光タンパク質の具体例として
は、以下の何れかの蛍光タンパク質が挙げられる。 （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７５番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７５番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７５番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質： （Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７８番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質：又は （Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７８番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質：
は、以下の何れかの蛍光タンパク質が挙げられる。 （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７５番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７５番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７５番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質： （Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７８番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質：又は （Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７８番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質：
【００１２】本発明の別の側面によれば、Ｎ末端からＣ
末端方向に以下のアミノ酸配列（１）〜（５）を順番に
有する融合蛍光タンパク質において、Ｃａ2+イオンの量
に依存した蛍光を発することができることを特徴とす
る、融合蛍光タンパク質が提供される。 （１）カルシウム結合タンパク質の標的ペプチドのアミ
ノ酸配列； （２）緑色蛍光タンパク質又はその変異体、黄色蛍光タ
ンパク質またはその変異体、シアン蛍光タンパク質また
はその変異体、赤色蛍光タンパク質またはその変異体、
及び青色蛍光タンパク質またはその変異体から成る群か
ら選択される蛍光タンパク質のＮ末端からｎ番目のアミ
ノ酸からＣ末端までのアミノ酸配列（ただし、ｎは１４
０から１５０までの整数を示す）； （３）２〜２０個のアミノ酸配列から成るリンカー配
列；及び （４）上記（２）に記載した蛍光タンパク質のＮ末端の
1番目からｎ−１番目のアミノ酸配列： （５）カルシウム結合タンパク質のアミノ酸配列：
末端方向に以下のアミノ酸配列（１）〜（５）を順番に
有する融合蛍光タンパク質において、Ｃａ2+イオンの量
に依存した蛍光を発することができることを特徴とす
る、融合蛍光タンパク質が提供される。 （１）カルシウム結合タンパク質の標的ペプチドのアミ
ノ酸配列； （２）緑色蛍光タンパク質又はその変異体、黄色蛍光タ
ンパク質またはその変異体、シアン蛍光タンパク質また
はその変異体、赤色蛍光タンパク質またはその変異体、
及び青色蛍光タンパク質またはその変異体から成る群か
ら選択される蛍光タンパク質のＮ末端からｎ番目のアミ
ノ酸からＣ末端までのアミノ酸配列（ただし、ｎは１４
０から１５０までの整数を示す）； （３）２〜２０個のアミノ酸配列から成るリンカー配
列；及び （４）上記（２）に記載した蛍光タンパク質のＮ末端の
1番目からｎ−１番目のアミノ酸配列： （５）カルシウム結合タンパク質のアミノ酸配列：
【００１３】本発明の融合蛍光タンパク質は好ましく
は、Ｃａ2+イオンの存在下においてその量に依存して異
なる強度の蛍光を発することができるか、又はＣａ2+イ
オンの存在下においてその量に依存して異なる波長の励
起を示すことができる。好ましくは、リンカー配列のア
ミノ酸配列はGly-Gly-Ser-Gly-Gly又はVal-Asp-Gly-Gly
-Ser-Gly-Gly-Thr-Glyである。カルシウム結合タンパク
質は好ましくは、カルモジュリン、トロポニンＣ、カル
シニューリンＢ、ミオシン軽鎖、レコベリン、Ｓ−モジ
ュリン、ビシニン、ＶＩＬＩＰ、ニューロカルシン、ヒ
ポカルシン、フレクエニン、カルトラクチン、カルパイ
ン・ラージ・サブユニット、Ｓ１００プロテイン、パル
バルブミン、カルビンジンＤ9K、カルビンジンＤ28K及
びカルレチニンから成る群から選ばれるタンパク質であ
る。
は、Ｃａ2+イオンの存在下においてその量に依存して異
なる強度の蛍光を発することができるか、又はＣａ2+イ
オンの存在下においてその量に依存して異なる波長の励
起を示すことができる。好ましくは、リンカー配列のア
ミノ酸配列はGly-Gly-Ser-Gly-Gly又はVal-Asp-Gly-Gly
-Ser-Gly-Gly-Thr-Glyである。カルシウム結合タンパク
質は好ましくは、カルモジュリン、トロポニンＣ、カル
シニューリンＢ、ミオシン軽鎖、レコベリン、Ｓ−モジ
ュリン、ビシニン、ＶＩＬＩＰ、ニューロカルシン、ヒ
ポカルシン、フレクエニン、カルトラクチン、カルパイ
ン・ラージ・サブユニット、Ｓ１００プロテイン、パル
バルブミン、カルビンジンＤ9K、カルビンジンＤ28K及
びカルレチニンから成る群から選ばれるタンパク質であ
る。
【００１４】本発明の融合蛍光タンパク質の具体例とし
ては、以下の何れかの融合蛍光タンパク質が挙げられ
る。 （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質： （Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号２に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質：又は （Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質：
ては、以下の何れかの融合蛍光タンパク質が挙げられ
る。 （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質： （Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号２に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質：又は （Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質：
【００１５】本発明のさらに別の側面によれば、上記融
合蛍光タンパク質から成るカルシウムイオン指示薬、並
びに上記融合蛍光タンパク質を用いて細胞内のカルシウ
ムイオンの濃度又は分布を測定する方法が提供される。
合蛍光タンパク質から成るカルシウムイオン指示薬、並
びに上記融合蛍光タンパク質を用いて細胞内のカルシウ
ムイオンの濃度又は分布を測定する方法が提供される。
【００１６】本発明のさらに別の側面によれば、上記蛍
光タンパク質をコードするＤＮＡが提供され、その具体
例としては、以下の何れかのＤＮＡが提供される。 （Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち９４番目から
８２５番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号１に記載のアミノ酸配列のうち９４番目から８２５番
目までの塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置
換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号１
に記載の塩基配列のうち９４番目から８２５番目までの
塩基配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等
以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａ； （Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列のうち９４番目から
８３４番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号２に記載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目ま
での塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及
び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号２に記
載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目までの塩基
配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等以上
の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又
は （Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列のうち９４番目から
８３４番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号３に記載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目ま
での塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及
び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号２に記
載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目までの塩基
配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等以上
の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
光タンパク質をコードするＤＮＡが提供され、その具体
例としては、以下の何れかのＤＮＡが提供される。 （Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち９４番目から
８２５番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号１に記載のアミノ酸配列のうち９４番目から８２５番
目までの塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置
換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号１
に記載の塩基配列のうち９４番目から８２５番目までの
塩基配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等
以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａ； （Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列のうち９４番目から
８３４番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号２に記載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目ま
での塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及
び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号２に記
載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目までの塩基
配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等以上
の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又
は （Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列のうち９４番目から
８３４番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号３に記載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目ま
での塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及
び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号２に記
載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目までの塩基
配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等以上
の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
【００１７】本発明のさらに別の側面によれば、上記融
合蛍光タンパク質をコードするＤＮＡが提供され、その
具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが提供される。 （Ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号１に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ； （Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号２に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ；又は （Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号３に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号３に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ；
合蛍光タンパク質をコードするＤＮＡが提供され、その
具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが提供される。 （Ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号１に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ； （Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号２に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ；又は （Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号３に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号３に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ；
【００１８】本発明のさらに別の側面によれば、上記Ｄ
ＮＡを有する組み換えベクターが提供される。本発明の
さらに別の側面によれば、上記ＤＮＡ又は上記組み換え
ベクターを有する形質転換体が提供される。本発明のさ
らに別の側面によれば、上記形質転換体を用いて、該形
質転換体中のカルシウムイオン濃度又は分布を当該形質
転換体が発する蛍光を指標にして測定する方法が提供さ
れる。本発明のさらに別の側面によれば、上記蛍光タン
パク質、上記融合蛍光タンパク質、上記カルシウムイオ
ン指示薬、上記ＤＮＡ、上記組み換えベクター、上記形
質転換体から選択される少なくとも1種以上を含むこと
を特徴とする、カルシウムイオンを測定するためのキッ
トが提供される。
ＮＡを有する組み換えベクターが提供される。本発明の
さらに別の側面によれば、上記ＤＮＡ又は上記組み換え
ベクターを有する形質転換体が提供される。本発明のさ
らに別の側面によれば、上記形質転換体を用いて、該形
質転換体中のカルシウムイオン濃度又は分布を当該形質
転換体が発する蛍光を指標にして測定する方法が提供さ
れる。本発明のさらに別の側面によれば、上記蛍光タン
パク質、上記融合蛍光タンパク質、上記カルシウムイオ
ン指示薬、上記ＤＮＡ、上記組み換えベクター、上記形
質転換体から選択される少なくとも1種以上を含むこと
を特徴とする、カルシウムイオンを測定するためのキッ
トが提供される。
【００１９】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施方法および実
施態様について詳細に説明する。（１）本発明の蛍光タンパク質 本発明は、Ｎ末端からＣ末端方向に以下のアミノ酸配列
（１）〜（３）を順番に有する蛍光タンパク質におい
て、当該蛍光タンパク質にカルシウム結合タンパク質と
その標的ペプチドとを融合して得られる融合蛍光タンパ
ク質がＣａ2+イオンの量に依存した蛍光を発することが
できることを特徴とする、蛍光タンパク質に関する。 （１）緑色蛍光タンパク質又はその変異体、黄色蛍光タ
ンパク質またはその変異体、シアン蛍光タンパク質また
はその変異体、赤色蛍光タンパク質またはその変異体、
及び青色蛍光タンパク質またはその変異体から成る群か
ら選択される蛍光タンパク質のＮ末端からｎ番目のアミ
ノ酸からＣ末端までのアミノ酸配列（ただし、ｎは１４
０から１５０までの整数を示す）； （２）２〜２０個のアミノ酸配列から成るリンカー配
列；及び （３）上記（１）に記載した蛍光タンパク質のＮ末端の
1番目からｎ−１番目のアミノ酸配列：
施態様について詳細に説明する。（１）本発明の蛍光タンパク質 本発明は、Ｎ末端からＣ末端方向に以下のアミノ酸配列
（１）〜（３）を順番に有する蛍光タンパク質におい
て、当該蛍光タンパク質にカルシウム結合タンパク質と
その標的ペプチドとを融合して得られる融合蛍光タンパ
ク質がＣａ2+イオンの量に依存した蛍光を発することが
できることを特徴とする、蛍光タンパク質に関する。 （１）緑色蛍光タンパク質又はその変異体、黄色蛍光タ
ンパク質またはその変異体、シアン蛍光タンパク質また
はその変異体、赤色蛍光タンパク質またはその変異体、
及び青色蛍光タンパク質またはその変異体から成る群か
ら選択される蛍光タンパク質のＮ末端からｎ番目のアミ
ノ酸からＣ末端までのアミノ酸配列（ただし、ｎは１４
０から１５０までの整数を示す）； （２）２〜２０個のアミノ酸配列から成るリンカー配
列；及び （３）上記（１）に記載した蛍光タンパク質のＮ末端の
1番目からｎ−１番目のアミノ酸配列：
【００２０】本明細書で言う、緑色蛍光タンパク質又は
その変異体、黄色蛍光タンパク質またはその変異体、シ
アン蛍光タンパク質またはその変異体、赤色蛍光タンパ
ク質またはその変異体、及び青色蛍光タンパク質または
その変異体とは、各々公知の蛍光タンパク質またはその
変異体の全てを包含する意味である。例えば、また、Ｇ
ＦＰ遺伝子は単離され配列も決定されている(Prasher，
D.C．ら(1992)，"Primary structure of the Aequorea
victoria green fluorescent protein"，Gene111：229
−233)。その他の蛍光タンパク質又はその変異体のアミ
ノ酸配列も多数報告されており、例えば、Roger Y.Tsi
n, Annu.Rev.Biochem.1998. 67:509-44、並びにその引
用文献に記載されている。Delagrave，S．他（1995），
Red-shifted excitation mutants of the green fluore
scent protein，Bio/Technology 13：151-154は、赤に
シフトした励起スペクトルを有するクローン化されたア
エクオレア・ビクトリアGFPの変異体を単離している。H
eim，R．ら（1994），Wavelength mutations and postt
ranslational autoxidation of green fluorescent pro
tein, Proc．Nat1．Acad．Sci．USA 91：12501-12504
は、そこでBFP(Tyr66→His)で示される青色蛍光を有す
る変異体(Tyr66からHis)を報告している。
その変異体、黄色蛍光タンパク質またはその変異体、シ
アン蛍光タンパク質またはその変異体、赤色蛍光タンパ
ク質またはその変異体、及び青色蛍光タンパク質または
その変異体とは、各々公知の蛍光タンパク質またはその
変異体の全てを包含する意味である。例えば、また、Ｇ
ＦＰ遺伝子は単離され配列も決定されている(Prasher，
D.C．ら(1992)，"Primary structure of the Aequorea
victoria green fluorescent protein"，Gene111：229
−233)。その他の蛍光タンパク質又はその変異体のアミ
ノ酸配列も多数報告されており、例えば、Roger Y.Tsi
n, Annu.Rev.Biochem.1998. 67:509-44、並びにその引
用文献に記載されている。Delagrave，S．他（1995），
Red-shifted excitation mutants of the green fluore
scent protein，Bio/Technology 13：151-154は、赤に
シフトした励起スペクトルを有するクローン化されたア
エクオレア・ビクトリアGFPの変異体を単離している。H
eim，R．ら（1994），Wavelength mutations and postt
ranslational autoxidation of green fluorescent pro
tein, Proc．Nat1．Acad．Sci．USA 91：12501-12504
は、そこでBFP(Tyr66→His)で示される青色蛍光を有す
る変異体(Tyr66からHis)を報告している。
【００２１】本発明の蛍光タンパク質では、上記した蛍
光タンパク質のＮ末端からｎ番目のアミノ酸からＣ末端
までのアミノ酸配列（ただし、ｎは１４０から１５０ま
での整数を示す）をＮ末端側に有し、リンカー配列を挟
んで、上記した蛍光タンパク質のＮ末端の1番目からｎ
−１番目のアミノ酸配列をＣ末端側に有する構造をとっ
ている。このようにタンパク質の構造を変化させること
をサーキュラーパーミュテーションとも称する。本発明
では、上記したような公知の蛍光タンパク質にサーキュ
ラーパーミュテーションを施すことによって、カルシウ
ムイオン指示薬として有用な新規な蛍光タンパク質を作
製することに初めて成功した。
光タンパク質のＮ末端からｎ番目のアミノ酸からＣ末端
までのアミノ酸配列（ただし、ｎは１４０から１５０ま
での整数を示す）をＮ末端側に有し、リンカー配列を挟
んで、上記した蛍光タンパク質のＮ末端の1番目からｎ
−１番目のアミノ酸配列をＣ末端側に有する構造をとっ
ている。このようにタンパク質の構造を変化させること
をサーキュラーパーミュテーションとも称する。本発明
では、上記したような公知の蛍光タンパク質にサーキュ
ラーパーミュテーションを施すことによって、カルシウ
ムイオン指示薬として有用な新規な蛍光タンパク質を作
製することに初めて成功した。
【００２２】リンカー配列のアミノ酸配列は、作製され
る融合蛍光タンパク質がカルシウムイオン指示薬として
所望の効果を発揮する限り、特に限定されないが、側鎖
が比較的小さいアミノ酸配列を主として含むことが好ま
しく、また親水性の側鎖を有するアミノ酸が好ましい。
アミノ酸の個数は通常２〜２０個程度であり、好ましく
は３〜１０個程度であり、特に好ましくは５〜１０個程
度である。リンカー配列の具体例としては、Gly-Gly-Se
r-Gly-Gly（配列番号４）又はVal-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly
-Gly-Thr-Gly（配列番号５）等が挙げられるが、これら
に限定されるものでもない。
る融合蛍光タンパク質がカルシウムイオン指示薬として
所望の効果を発揮する限り、特に限定されないが、側鎖
が比較的小さいアミノ酸配列を主として含むことが好ま
しく、また親水性の側鎖を有するアミノ酸が好ましい。
アミノ酸の個数は通常２〜２０個程度であり、好ましく
は３〜１０個程度であり、特に好ましくは５〜１０個程
度である。リンカー配列の具体例としては、Gly-Gly-Se
r-Gly-Gly（配列番号４）又はVal-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly
-Gly-Thr-Gly（配列番号５）等が挙げられるが、これら
に限定されるものでもない。
【００２３】本発明の蛍光タンパク質の具体例として
は、以下の何れかの蛍光タンパク質が挙げられる。 （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７５番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７５番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７５番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質： （Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７８番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質：又は （Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７８番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質：
は、以下の何れかの蛍光タンパク質が挙げられる。 （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７５番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７５番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７５番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質： （Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７８番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質：又は （Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７８番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質：
【００２４】本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の
欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」にお
ける「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例
えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好
ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特
に好ましくは１から３個程度を意味する。本明細書で言
う「同等以上の蛍光特性を有する」とは、当該蛍光タン
パク質にカルシウム結合タンパク質とその標的ペプチド
とを融合して得られる融合蛍光タンパク質がＣａ2+イオ
ンの量に依存して発する蛍光の特性が同等以上であるこ
とを意味する。
欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」にお
ける「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例
えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好
ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特
に好ましくは１から３個程度を意味する。本明細書で言
う「同等以上の蛍光特性を有する」とは、当該蛍光タン
パク質にカルシウム結合タンパク質とその標的ペプチド
とを融合して得られる融合蛍光タンパク質がＣａ2+イオ
ンの量に依存して発する蛍光の特性が同等以上であるこ
とを意味する。
【００２５】本発明の蛍光タンパク質の取得方法につい
ては特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク
質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み
換えタンパク質でもよい。組み換えタンパク質を作製す
る場合には、先ず当該タンパク質をコードするＤＮＡを
入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番
号１〜３に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報を
利用することにより適当なプライマーを設計し、それら
を用いて上記したような各種の公知の蛍光タンパク質の
ｃＤＮＡクローンを鋳型にしてＰＣＲを行うことによ
り、本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを構築
するのに必要なＤＮＡ断片を作製することができる。次
いで、これらのＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術
により連結することにより、所望の蛍光タンパク質をコ
ードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当
な発現系に導入することにより、本発明の蛍光タンパク
質を産生することができる。発現系での発現については
本明細書中後記する。
ては特に制限はなく、化学合成により合成したタンパク
質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み
換えタンパク質でもよい。組み換えタンパク質を作製す
る場合には、先ず当該タンパク質をコードするＤＮＡを
入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番
号１〜３に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報を
利用することにより適当なプライマーを設計し、それら
を用いて上記したような各種の公知の蛍光タンパク質の
ｃＤＮＡクローンを鋳型にしてＰＣＲを行うことによ
り、本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを構築
するのに必要なＤＮＡ断片を作製することができる。次
いで、これらのＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術
により連結することにより、所望の蛍光タンパク質をコ
ードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当
な発現系に導入することにより、本発明の蛍光タンパク
質を産生することができる。発現系での発現については
本明細書中後記する。
【００２６】（２）本発明の融合蛍光タンパク質及びそ
の利用 本発明はさらに、上記の（１）で説明した蛍光タンパク
質にＮ末端にカルシウム結合タンパク質の標的ペプチド
のアミノ酸配列を有し、Ｃ末端にカルシウム結合タンパ
ク質のアミノ酸配列を有することを特徴とする、融合蛍
光タンパク質に関する。本発明で用いるカルシウム結合
タンパク質としては、カルモジュリン、トロポニンＣ、
カルシニューリンＢ、ミオシン軽鎖、レコベリン、Ｓ−
モジュリン、ビシニン、ＶＩＬＩＰ、ニューロカルシ
ン、ヒポカルシン、フレクエニン、カルトラクチン、カ
ルパイン・ラージ・サブユニット、Ｓ１００プロテイ
ン、パルバルブミン、カルビンジンＤ9K、カルビンジン
Ｄ28K及びカルレチニンなどが挙げられ、この中でも特
にカルモジュリンを用いることが好ましい。
の利用 本発明はさらに、上記の（１）で説明した蛍光タンパク
質にＮ末端にカルシウム結合タンパク質の標的ペプチド
のアミノ酸配列を有し、Ｃ末端にカルシウム結合タンパ
ク質のアミノ酸配列を有することを特徴とする、融合蛍
光タンパク質に関する。本発明で用いるカルシウム結合
タンパク質としては、カルモジュリン、トロポニンＣ、
カルシニューリンＢ、ミオシン軽鎖、レコベリン、Ｓ−
モジュリン、ビシニン、ＶＩＬＩＰ、ニューロカルシ
ン、ヒポカルシン、フレクエニン、カルトラクチン、カ
ルパイン・ラージ・サブユニット、Ｓ１００プロテイ
ン、パルバルブミン、カルビンジンＤ9K、カルビンジン
Ｄ28K及びカルレチニンなどが挙げられ、この中でも特
にカルモジュリンを用いることが好ましい。
【００２７】本発明の融合蛍光タンパク質のＮ末端側に
存在するカルシウム結合タンパク質の標的ペプチドのア
ミノ酸配列は、Ｃ末端側に存在するカルシウム結合タン
パク質に応じて当業者であれば適宜選択することができ
る。例えば、カルシウム結合タンパク質がカルモジュリ
ンの場合には、カルモジュリンの標的物質として知られ
る各種のタンパク質やペプチド中に存在することが知ら
れているカルモジュリン結合ドメインのアミノ酸配列
を、本発明の融合蛍光タンパク質のＮ末端側に存在させ
ることができる。このようなカルモジュリン結合ドメイ
ンのアミノ酸配列は、これまで１２００種類以上が知ら
れている。カルモジュリン結合ドメインデータベース(h
ttp://calcium.oci.utoronto.ca/ctdb)で検索可能であ
る。
存在するカルシウム結合タンパク質の標的ペプチドのア
ミノ酸配列は、Ｃ末端側に存在するカルシウム結合タン
パク質に応じて当業者であれば適宜選択することができ
る。例えば、カルシウム結合タンパク質がカルモジュリ
ンの場合には、カルモジュリンの標的物質として知られ
る各種のタンパク質やペプチド中に存在することが知ら
れているカルモジュリン結合ドメインのアミノ酸配列
を、本発明の融合蛍光タンパク質のＮ末端側に存在させ
ることができる。このようなカルモジュリン結合ドメイ
ンのアミノ酸配列は、これまで１２００種類以上が知ら
れている。カルモジュリン結合ドメインデータベース(h
ttp://calcium.oci.utoronto.ca/ctdb)で検索可能であ
る。
【００２８】本発明の融合蛍光タンパク質の具体例とし
ては、以下の何れかの蛍光タンパク質が挙げられる。 （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質： （Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号２に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質：又は （Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質：
ては、以下の何れかの蛍光タンパク質が挙げられる。 （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質： （Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号２に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質：又は （Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質：
【００２９】本発明の融合蛍光タンパク質の取得方法に
ついては特に制限はなく、化学合成により合成したタン
パク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した
組み換えタンパク質でもよい。組み換えタンパク質を作
製する場合には、先ず当該タンパク質をコードするＤＮ
Ａを入手することが必要である。本明細書の配列表の配
列番号１〜３に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情
報を利用することにより適当なプライマーを設計し、そ
れらを用いて上記したような各種の公知の蛍光タンパク
質のｃＤＮＡクローンを鋳型にしてＰＣＲを行うことに
より、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを構築するの
に必要なＤＮＡ断片を作製することができる。また、同
様に、適当なプライマーを使用するＰＣＲ等の公知の手
法により、カルシウム結合タンパク質と当該タンパク質
の標的ペプチドをそれぞれコードするＤＮＡ断片を作製
する。次いで、これらのＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み
換え技術により連結することにより、所望の融合蛍光タ
ンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。この
ＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の
融合蛍光タンパク質を産生することができる。発現系で
の発現については本明細書中後記する。
ついては特に制限はなく、化学合成により合成したタン
パク質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した
組み換えタンパク質でもよい。組み換えタンパク質を作
製する場合には、先ず当該タンパク質をコードするＤＮ
Ａを入手することが必要である。本明細書の配列表の配
列番号１〜３に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情
報を利用することにより適当なプライマーを設計し、そ
れらを用いて上記したような各種の公知の蛍光タンパク
質のｃＤＮＡクローンを鋳型にしてＰＣＲを行うことに
より、蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを構築するの
に必要なＤＮＡ断片を作製することができる。また、同
様に、適当なプライマーを使用するＰＣＲ等の公知の手
法により、カルシウム結合タンパク質と当該タンパク質
の標的ペプチドをそれぞれコードするＤＮＡ断片を作製
する。次いで、これらのＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み
換え技術により連結することにより、所望の融合蛍光タ
ンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。この
ＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の
融合蛍光タンパク質を産生することができる。発現系で
の発現については本明細書中後記する。
【００３０】本発明の融合蛍光タンパク質は、細胞内の
カルシウムイオン濃度を測定したり、カルシウムイオン
分布をモニターするために使用することができ、カルシ
ウムイオン指示薬として有用である。カルシウムイオン
濃度およびカルシウムイオン分布は、本発明の融合蛍光
タンパク質をコードする遺伝子を細胞内へ導入すること
によりモニターすることが可能となる。蛍光の測定は公
知の方法に準じて行うことができる。
カルシウムイオン濃度を測定したり、カルシウムイオン
分布をモニターするために使用することができ、カルシ
ウムイオン指示薬として有用である。カルシウムイオン
濃度およびカルシウムイオン分布は、本発明の融合蛍光
タンパク質をコードする遺伝子を細胞内へ導入すること
によりモニターすることが可能となる。蛍光の測定は公
知の方法に準じて行うことができる。
【００３１】（３）本発明のＤＮＡ さらに、本発明は、本発明の蛍光タンパク質または融合
蛍光タンパク質をコードする遺伝子を提供するものであ
る。本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡの具体
例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられる。 （Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち９４番目から
８２５番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号１に記載のアミノ酸配列のうち９４番目から８２５番
目までの塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置
換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号１
に記載の塩基配列のうち９４番目から８２５番目までの
塩基配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等
以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａ； （Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列のうち９４番目から
８３４番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号２に記載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目ま
での塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及
び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号２に記
載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目までの塩基
配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等以上
の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又
は （Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列のうち９４番目から
８３４番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号３に記載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目ま
での塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及
び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号２に記
載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目までの塩基
配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等以上
の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
蛍光タンパク質をコードする遺伝子を提供するものであ
る。本発明の蛍光タンパク質をコードするＤＮＡの具体
例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられる。 （Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち９４番目から
８２５番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号１に記載のアミノ酸配列のうち９４番目から８２５番
目までの塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置
換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号１
に記載の塩基配列のうち９４番目から８２５番目までの
塩基配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等
以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａ； （Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列のうち９４番目から
８３４番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号２に記載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目ま
での塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及
び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号２に記
載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目までの塩基
配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等以上
の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又
は （Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列のうち９４番目から
８３４番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号３に記載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目ま
での塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及
び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号２に記
載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目までの塩基
配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等以上
の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
【００３２】また、本発明の融合蛍光タンパク質をコー
ドするＤＮＡとしては、以下の何れかのＤＮＡが挙げら
れる。 （Ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号１に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ； （Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号２に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ；又は （Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号３に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号３に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ；
ドするＤＮＡとしては、以下の何れかのＤＮＡが挙げら
れる。 （Ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号１に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ； （Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号２に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ；又は （Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号３に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号３に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ；
【００３３】本明細書において「１から数個の塩基の欠
失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における
「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例え
ば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ま
しくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、
特に好ましくは１から５個程度を意味する。本発明のＤ
ＮＡ又はその断片は、例えばホスホアミダイト法などに
より合成することができるし、特異的プライマーを用い
たポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造するこ
ともできる。本発明のＤＮＡ又はその断片の作製方法に
ついては、本明細書中の（１）本発明の蛍光タンパク質
及び（２）本発明の融合蛍光タンパク質及びその利用、
において上述した通りである。
失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における
「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例え
ば、１から６０個、好ましくは１から３０個、より好ま
しくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、
特に好ましくは１から５個程度を意味する。本発明のＤ
ＮＡ又はその断片は、例えばホスホアミダイト法などに
より合成することができるし、特異的プライマーを用い
たポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造するこ
ともできる。本発明のＤＮＡ又はその断片の作製方法に
ついては、本明細書中の（１）本発明の蛍光タンパク質
及び（２）本発明の融合蛍光タンパク質及びその利用、
において上述した通りである。
【００３４】また、所定の核酸配列に所望の変異を導入
する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変
異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核
酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知
の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮ
Ａを構築することができる。このような公知の技術は、
例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2
nd Ed., Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY.,1989、並びにCurrent Protocolsin Molecu
lar Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons
(1987-1997)に記載されている。
する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変
異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核
酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知
の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮ
Ａを構築することができる。このような公知の技術は、
例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2
nd Ed., Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, NY.,1989、並びにCurrent Protocolsin Molecu
lar Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons
(1987-1997)に記載されている。
【００３５】（４）本発明の組み換えベクター 本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用する
ことができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限
定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えば
プラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入
された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれ
た染色体と共に複製されるものであってもよい。好まし
くは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。
発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な
要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されて
いる。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤ
ＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することがで
きる。
ことができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限
定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えば
プラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入
された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれ
た染色体と共に複製されるものであってもよい。好まし
くは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。
発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な
要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されて
いる。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤ
ＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することがで
きる。
【００３６】細菌細胞で作動可能なプロモータとして
は、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニ
ック・アミラーゼ遺伝子(Bacillusstearothermophilus
maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミス
αアミラーゼ遺伝子(Bacilluslicheniformis alpha-amy
lase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BAN
アミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN am
ylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテ
アーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease
gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺
伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモー
タ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰ Lプロモー
タ、大腸菌の lac、trp若しくはtacプロモータなどが挙
げられる。
は、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニ
ック・アミラーゼ遺伝子(Bacillusstearothermophilus
maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミス
αアミラーゼ遺伝子(Bacilluslicheniformis alpha-amy
lase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BAN
アミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN am
ylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテ
アーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease
gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺
伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモー
タ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰ Lプロモー
タ、大腸菌の lac、trp若しくはtacプロモータなどが挙
げられる。
【００３７】哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例
としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオ
ネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主
後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロ
モータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０
プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘド
ロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス
即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイ
ルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母
宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解
糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-
4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能
なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたは
ｔｐｉＡプロモータなどがある。
としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオ
ネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主
後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロ
モータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０
プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘド
ロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス
即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイ
ルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母
宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解
糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-
4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能
なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたは
ｔｐｉＡプロモータなどがある。
【００３８】また、本発明のＤＮＡは必要に応じて、例
えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主につ
いてはＴＰＩ１ターミネータ若しくはＡＤＨ３ターミネ
ータのような適切なターミネータに機能的に結合されて
もよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニ
レーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイ
ルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列
（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配
列（例えばアデノウイルス ＶＡ ＲＮＡ をコードする
もの）のような要素を有していてもよい。本発明の組み
換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製す
ることを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その
一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞
のとき）が挙げられる。
えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主につ
いてはＴＰＩ１ターミネータ若しくはＡＤＨ３ターミネ
ータのような適切なターミネータに機能的に結合されて
もよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニ
レーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイ
ルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列
（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配
列（例えばアデノウイルス ＶＡ ＲＮＡ をコードする
もの）のような要素を有していてもよい。本発明の組み
換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製す
ることを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その
一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞
のとき）が挙げられる。
【００３９】本発明の組み換えベクターはさらに選択マ
ーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例え
ば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾ
サッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその
補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアン
ピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラム
フェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンの
ような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の
ＤＮＡ、プロモータ、および所望によりターミネータお
よび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これ
らを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知であ
る。
ーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例え
ば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾ
サッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその
補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアン
ピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラム
フェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンの
ような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の
ＤＮＡ、プロモータ、および所望によりターミネータお
よび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これ
らを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知であ
る。
【００４０】（５）本発明の形質転換体 本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導
入することによって形質転換体を作製することができ
る。本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入され
る宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任
意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞
等が挙げられる。
入することによって形質転換体を作製することができ
る。本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入され
る宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任
意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞
等が挙げられる。
【００４１】細菌細胞の例としては、バチルスまたはス
トレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラ
ム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロ
トプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を
用いることにより行なえばよい。哺乳類細胞の例として
は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｂ
ＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられ
る。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮ
Ａ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレク
トロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェ
クション法等を用いることができる。
トレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラ
ム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロ
トプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を
用いることにより行なえばよい。哺乳類細胞の例として
は、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｂ
ＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられ
る。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮ
Ａ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレク
トロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェ
クション法等を用いることができる。
【００４２】酵母細胞の例としては、サッカロマイセス
またはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、
例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces
cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓa
ccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への
組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレク
トロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウ
ム法等を挙げることができる。
またはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、
例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces
cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓa
ccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への
組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレク
トロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウ
ム法等を挙げることができる。
【００４３】他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアス
ペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリ
コデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を
用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組
換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことがで
きる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知
の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えによ
り行うことができる。
ペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリ
コデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を
用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組
換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことがで
きる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知
の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えによ
り行うことができる。
【００４４】昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組
換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫
細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルス
を得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染さ
せ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Ba
culovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua
1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラ
ー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に
記載）。
換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫
細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルス
を得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染さ
せ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Ba
culovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua
1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラ
ー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に
記載）。
【００４５】バキュロウイルスとしては、例えば、ヨト
ウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・
カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイル
ス(Autographa californica nuclear polyhedrosis vir
us)等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodo
ptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１
〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクター
ズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイ
チ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman a
nd Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Tri
choplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビト
ロジェン社製)等を用いることができる。組換えウイル
スを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベ
クターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、
例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等
を挙げることができる。
ウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・
カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイル
ス(Autographa californica nuclear polyhedrosis vir
us)等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodo
ptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１
〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクター
ズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイ
チ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman a
nd Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Tri
choplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビト
ロジェン社製)等を用いることができる。組換えウイル
スを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベ
クターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、
例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等
を挙げることができる。
【００４６】上記の形質転換体は、導入されたＤＮＡ構
築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培
養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛍光融合タ
ンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単
離、精製法を用いればよい。例えば、本発明のタンパク
質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了
後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、
超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得
る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた
上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒
抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による
沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等の
レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-
Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽
イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロー
ス、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性ク
ロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフ
ィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシ
ング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独
あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができ
る。
築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培
養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛍光融合タ
ンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単
離、精製法を用いればよい。例えば、本発明のタンパク
質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了
後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、
超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得
る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた
上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒
抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による
沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等の
レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-
Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽
イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロー
ス、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性ク
ロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフ
ィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシ
ング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独
あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができ
る。
【００４７】（６）細胞内のカルシウムイオンの濃度又
は分布を測定する方法 本発明の方法においては、本発明のＤＮＡ構築物で形質
転換またはトランスフェクトされた細胞を分光光度計ま
たは蛍光顕微鏡で測定し、光励起および光放出の走査と
して、液体培養中の細胞のスペクトル特性を決定するこ
とができる。これにより、該形質転換体中のカルシウム
イオン濃度又は分布を測定することが可能になる。具体
的には、本発明の融合蛍光タンパク質をコードするＤＮ
Ａを含むＤＮＡ構築物を細胞内へ導入することによりモ
ニター可能となる。ＤＮＡの細胞への導入、細胞の培
養、並びに蛍光タンパク質の検出の方法は、当業者に公
知である。本発明の蛍光タンパク質を検出するための簡
単な方法は、蛍光光度計、すなわち本発明の蛍光タンパ
ク質を励起するための光源および蛍光強度を測定するた
めの測光計を備えた装置を使用するものである。蛍光光
度計は周知であり、市販されている。また、蛍光顕微鏡
を用いて蛍光を画像化することでカルシウムイオンの分
布を測定することも可能である。
は分布を測定する方法 本発明の方法においては、本発明のＤＮＡ構築物で形質
転換またはトランスフェクトされた細胞を分光光度計ま
たは蛍光顕微鏡で測定し、光励起および光放出の走査と
して、液体培養中の細胞のスペクトル特性を決定するこ
とができる。これにより、該形質転換体中のカルシウム
イオン濃度又は分布を測定することが可能になる。具体
的には、本発明の融合蛍光タンパク質をコードするＤＮ
Ａを含むＤＮＡ構築物を細胞内へ導入することによりモ
ニター可能となる。ＤＮＡの細胞への導入、細胞の培
養、並びに蛍光タンパク質の検出の方法は、当業者に公
知である。本発明の蛍光タンパク質を検出するための簡
単な方法は、蛍光光度計、すなわち本発明の蛍光タンパ
ク質を励起するための光源および蛍光強度を測定するた
めの測光計を備えた装置を使用するものである。蛍光光
度計は周知であり、市販されている。また、蛍光顕微鏡
を用いて蛍光を画像化することでカルシウムイオンの分
布を測定することも可能である。
【００４８】（７）本発明のキット 本発明によれば、本明細書に記載した蛍光タンパク質、
融合蛍光タンパク質、当該タンパク質から成るカルシウ
ムイオン指示薬、ＤＮＡ、組み換えベクター又は形質転
換体から選択される少なくとも1種以上を含むことを特
徴とする、カルシウムイオンを測定するためのキットが
提供される。本発明のキットは、それ自体既知の通常用
いられる材料及び手法で調製することができる。蛍光タ
ンパク質又はＤＮＡなどの試薬は、適当な溶媒に溶解す
ることにより保存に適した形態に調製することができ
る。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などを
用いることができる。以下の実施例により本発明を具体
的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるも
のではない。
融合蛍光タンパク質、当該タンパク質から成るカルシウ
ムイオン指示薬、ＤＮＡ、組み換えベクター又は形質転
換体から選択される少なくとも1種以上を含むことを特
徴とする、カルシウムイオンを測定するためのキットが
提供される。本発明のキットは、それ自体既知の通常用
いられる材料及び手法で調製することができる。蛍光タ
ンパク質又はＤＮＡなどの試薬は、適当な溶媒に溶解す
ることにより保存に適した形態に調製することができ
る。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などを
用いることができる。以下の実施例により本発明を具体
的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるも
のではない。
【００４９】
【実施例】（Ａ）材料および方法 （Ａ−１）遺伝子構築 cpEYFP（V68L/Q69K）のcDNAを３回のPCRにより構築し
た。まず、PstI部位を含む順方向プライマーと、ペプチ
ドリンカーGGSGGをコードする逆方向プライマーとを用
いて、EYFP（V68L/Q69K）（Miyawaki, A., Griesbeck,
O., Heim, R. & Tsien, R. Y. (1999) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 96, 2135-2140）の3'部分のcDNAを増幅し
た。次に、ペプチドリンカーGGSGGと、それぞれ5'およ
び3'末端までのKpnI部位をコードする配列を用いて、EY
FP（V68L/Q69K）の5'部分のcDNAを増幅した。最後に、
最初のPCR断片および二番目のPCR断片の混合物を鋳型と
して用いて、PstIおよびKpnI部位を含有するプライマー
により、cpEYFP（V68L/Q69K）の完全なcDNAを増幅し
た。制限処理した産物を、pRSETB（Invitrogen）のPstI
/KpnI部位にインフレームでクローニングし、cpEYFP（V
68L/Q69K）/ pRSETBを得た。次に、5'BamHIと3'PstI部
位、ならびに5'KpnIと3'EcoRI部位をそれぞれ含むプラ
イマーを用いて、M13およびCaMをコードするcDNAを増幅
した。制限処理したPCR断片をpRSETB中のcpEYFP（V68L/
Q69K）遺伝子の5'および3'末端に連結して、細菌発現用
のペリカム（pericam）の構築物を作製した。既報の通
り（Sawano, A.& Miyawaki, A. (2000) Nucleic Acids
Res. 28, e78）、リンカーの改変とcpEYFP（V68L/Q69
K）中の148および203位での部位特異的突然変異誘発を
実施することにより、フラッシュ（flash）ペリカム
（配列表の配列番号１）、レシオメトリック（ratiomet
ric）ペリカム（配列表の配列番号２）およびインバー
ス（inverse）ペリカム（配列表の配列番号３）を作製
した。ペリカム遺伝子の5'末端をPCRで改変して、HindI
II部位とその後にコザックコンセンサス配列（CCACCAT
G）を導入した。該ペリカムをコードするHindIII/EcoRI
断片を哺乳動物発現ベクターpcDNA3（Invitrogen）にサ
ブクローニングした。M13- EYFP（V68L/Q69K）（145-23
8）およびEYFP（V68L/Q69K）（1-144）-CaMをコードす
るcDNAをフラッシュペリカムcDNAから取得し、pcDNA3に
クローニングした。シトクロムcオキシダーゼのサブユ
ニットIVのN末端の12アミノ酸プレ配列をコードする配
列（Rizzuto,R., Simpson, A. W., Brini, M. & Pozza
n, T. (1992) Nature 358, 325-327）を用いて、レシオ
メトリックペリカムcDNAの5'末端を、また、核局在化シ
グナル：PKKKRKVEDAを用いてその3'末端をそれぞれ伸長
することにより、レシオメトリックペリカムmtおよびレ
シオメトリックペリカムnuを取得した。
た。まず、PstI部位を含む順方向プライマーと、ペプチ
ドリンカーGGSGGをコードする逆方向プライマーとを用
いて、EYFP（V68L/Q69K）（Miyawaki, A., Griesbeck,
O., Heim, R. & Tsien, R. Y. (1999) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 96, 2135-2140）の3'部分のcDNAを増幅し
た。次に、ペプチドリンカーGGSGGと、それぞれ5'およ
び3'末端までのKpnI部位をコードする配列を用いて、EY
FP（V68L/Q69K）の5'部分のcDNAを増幅した。最後に、
最初のPCR断片および二番目のPCR断片の混合物を鋳型と
して用いて、PstIおよびKpnI部位を含有するプライマー
により、cpEYFP（V68L/Q69K）の完全なcDNAを増幅し
た。制限処理した産物を、pRSETB（Invitrogen）のPstI
/KpnI部位にインフレームでクローニングし、cpEYFP（V
68L/Q69K）/ pRSETBを得た。次に、5'BamHIと3'PstI部
位、ならびに5'KpnIと3'EcoRI部位をそれぞれ含むプラ
イマーを用いて、M13およびCaMをコードするcDNAを増幅
した。制限処理したPCR断片をpRSETB中のcpEYFP（V68L/
Q69K）遺伝子の5'および3'末端に連結して、細菌発現用
のペリカム（pericam）の構築物を作製した。既報の通
り（Sawano, A.& Miyawaki, A. (2000) Nucleic Acids
Res. 28, e78）、リンカーの改変とcpEYFP（V68L/Q69
K）中の148および203位での部位特異的突然変異誘発を
実施することにより、フラッシュ（flash）ペリカム
（配列表の配列番号１）、レシオメトリック（ratiomet
ric）ペリカム（配列表の配列番号２）およびインバー
ス（inverse）ペリカム（配列表の配列番号３）を作製
した。ペリカム遺伝子の5'末端をPCRで改変して、HindI
II部位とその後にコザックコンセンサス配列（CCACCAT
G）を導入した。該ペリカムをコードするHindIII/EcoRI
断片を哺乳動物発現ベクターpcDNA3（Invitrogen）にサ
ブクローニングした。M13- EYFP（V68L/Q69K）（145-23
8）およびEYFP（V68L/Q69K）（1-144）-CaMをコードす
るcDNAをフラッシュペリカムcDNAから取得し、pcDNA3に
クローニングした。シトクロムcオキシダーゼのサブユ
ニットIVのN末端の12アミノ酸プレ配列をコードする配
列（Rizzuto,R., Simpson, A. W., Brini, M. & Pozza
n, T. (1992) Nature 358, 325-327）を用いて、レシオ
メトリックペリカムcDNAの5'末端を、また、核局在化シ
グナル：PKKKRKVEDAを用いてその3'末端をそれぞれ伸長
することにより、レシオメトリックペリカムmtおよびレ
シオメトリックペリカムnuを取得した。
【００５０】（Ａ−２）タンパク質発現およびin vitro
分光測定 既報の通り（Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., Mc
Caffery, J. M., Adams, J.A, Ikura, M. & Tsien, R.
Y. (1997) Nature 388, 882-887）、N末端にポリヒスチ
ジンタグを有する組換え蛍光タンパク質を大腸菌（JM10
9(DE3)）において発現させ、精製後、分光測定により解
析した。
分光測定 既報の通り（Miyawaki, A., Llopis, J., Heim, R., Mc
Caffery, J. M., Adams, J.A, Ikura, M. & Tsien, R.
Y. (1997) Nature 388, 882-887）、N末端にポリヒスチ
ジンタグを有する組換え蛍光タンパク質を大腸菌（JM10
9(DE3)）において発現させ、精製後、分光測定により解
析した。
【００５１】（Ａ−３）pHおよびCa2+滴定 既報の通り（Ormo, M., Cubitt, A.B., Kallio, K., Gr
oss, L. A., Tsien, R. Y. & Remington, S. J. (1996)
Science 273, 1392-1395）、ｐＨ４〜１２．５に調整
した一連の緩衝液を用いて、pH滴定を実施した。O,O’-
ビス（2-アミノエチル）エチレングリコール−N，N，
N’，N’−四酢酸（EGTA）、N-(2-ヒドロキシエチル)エ
チレンジアミン−N，N’，N’−三酢酸（EDTA-OH）また
はニトリロ三酢酸（NTA）を用いて調製したCa2+非含有
緩衝液およびCa2+飽和緩衝液で相互に希釈することによ
り、Ca2+滴定を実施した。
oss, L. A., Tsien, R. Y. & Remington, S. J. (1996)
Science 273, 1392-1395）、ｐＨ４〜１２．５に調整
した一連の緩衝液を用いて、pH滴定を実施した。O,O’-
ビス（2-アミノエチル）エチレングリコール−N，N，
N’，N’−四酢酸（EGTA）、N-(2-ヒドロキシエチル)エ
チレンジアミン−N，N’，N’−三酢酸（EDTA-OH）また
はニトリロ三酢酸（NTA）を用いて調製したCa2+非含有
緩衝液およびCa2+飽和緩衝液で相互に希釈することによ
り、Ca2+滴定を実施した。
【００５２】（Ａ−４）哺乳動物発現および画像化 Superfect（QIAGEN）を用いたcDNAトランスフェクショ
ンの２又は３日後に、MetaFluor/MetaMorph 4.0ソフト
ウエア（Universal Imaging）で制御されるMicroMax-13
00Y/HSインターラインCCDカメラ（Roper scientific In
c.）を用いて、オリンパスIX-70上にHBSS緩衝液中のHeL
a細胞を25℃で画像化した。フラッシュペリカム、イン
バースペリカムおよびスプリットペリカムによる単一波
長画像化には、475DF35励起フィルター、505DRLP二色性
ミラー、及び、HQ525/50発光フィルターを用いた。レシ
オメトリックペリカムによる二波長励起画像化には、フ
ィルターチェンジャー（ラムダ10-2、Sutter Instrumen
ts）により切換えられる２つの励起フィルター（480DF1
0および410DF10）、505DRLP-XR二色性ミラー、及び535D
F25発光フィルターを用いた。アルゴンイオンレーザー
（Omnichrome、MellesGriot）を用いたFluoview FV500
共焦点レーザー走査型顕微鏡（Olympus）を用いて、共
焦点画像を実現した。
ンの２又は３日後に、MetaFluor/MetaMorph 4.0ソフト
ウエア（Universal Imaging）で制御されるMicroMax-13
00Y/HSインターラインCCDカメラ（Roper scientific In
c.）を用いて、オリンパスIX-70上にHBSS緩衝液中のHeL
a細胞を25℃で画像化した。フラッシュペリカム、イン
バースペリカムおよびスプリットペリカムによる単一波
長画像化には、475DF35励起フィルター、505DRLP二色性
ミラー、及び、HQ525/50発光フィルターを用いた。レシ
オメトリックペリカムによる二波長励起画像化には、フ
ィルターチェンジャー（ラムダ10-2、Sutter Instrumen
ts）により切換えられる２つの励起フィルター（480DF1
0および410DF10）、505DRLP-XR二色性ミラー、及び535D
F25発光フィルターを用いた。アルゴンイオンレーザー
（Omnichrome、MellesGriot）を用いたFluoview FV500
共焦点レーザー走査型顕微鏡（Olympus）を用いて、共
焦点画像を実現した。
【００５３】（Ｂ）結果および考察 （Ｂ−１）Ca2+感受性サーキュラーパーミュテーション
化GFP変異体の構築 YFP変異体であるEYFP(V68L/Q69K)（Miyawaki, A., Grie
sbeck, O., Heim, R.& Tsien, R. Y. (1999) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 96, 2135-2140）にサーキュラーパ
ーミュテーションを施した。元のNおよびC末端を、ペン
タペプチドリンカーGGSGGを介して連結することによ
り、Y145およびN144を、それぞれ新しいNおよびC末端に
した（図１）。N末端に結合したヘキサヒスチジンタグ
（His6タグ）を用いて、サーキュラーパーミュテーショ
ン化YFP（cpEYFP(V68L/Q69K)）を大腸菌で発現させ、Hi
s6タグを用いて精製した。特に記載のない限り、精製し
たタンパク質の全てのスペクトルをpH7.4で測定した。c
pEYFP(V68L/Q69K)の吸光スペクトルは420nmに主要なピ
ークがあり、500nm付近で小さななだらかなピークを有
することを示した（図２Ａ）。これは、514nmに主ピー
クを有する元のEYFP(V68L/Q69K)（図２Ａ、Miyawaki,
A., Griesbeck, O., Heim, R. & Tsien, R. Y. (1999)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2135-2140）とは対照
的である。このブルーシフトは、発色団がcpEYFP(V68L/
Q69K)においてプロトン化していることを示唆してい
る。励起スペクトルは、WT-GFPの二峰性励起スペクトル
（Tsien, R. Y. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67, 509-
44）を暗示する417nmおよび506nmに２つのピークを有し
ていた（図２Ｂ）。420nm付近で吸光するcpEYFP(V68L/Q
69K)のプロトン化種は蛍光を発するのに対し、大部分の
YFPのプロトン化種は蛍光を発しない（Tsien, R. Y. (1
998) Annu. Rev. Biochem. 67, 509-44）。
化GFP変異体の構築 YFP変異体であるEYFP(V68L/Q69K)（Miyawaki, A., Grie
sbeck, O., Heim, R.& Tsien, R. Y. (1999) Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 96, 2135-2140）にサーキュラーパ
ーミュテーションを施した。元のNおよびC末端を、ペン
タペプチドリンカーGGSGGを介して連結することによ
り、Y145およびN144を、それぞれ新しいNおよびC末端に
した（図１）。N末端に結合したヘキサヒスチジンタグ
（His6タグ）を用いて、サーキュラーパーミュテーショ
ン化YFP（cpEYFP(V68L/Q69K)）を大腸菌で発現させ、Hi
s6タグを用いて精製した。特に記載のない限り、精製し
たタンパク質の全てのスペクトルをpH7.4で測定した。c
pEYFP(V68L/Q69K)の吸光スペクトルは420nmに主要なピ
ークがあり、500nm付近で小さななだらかなピークを有
することを示した（図２Ａ）。これは、514nmに主ピー
クを有する元のEYFP(V68L/Q69K)（図２Ａ、Miyawaki,
A., Griesbeck, O., Heim, R. & Tsien, R. Y. (1999)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2135-2140）とは対照
的である。このブルーシフトは、発色団がcpEYFP(V68L/
Q69K)においてプロトン化していることを示唆してい
る。励起スペクトルは、WT-GFPの二峰性励起スペクトル
（Tsien, R. Y. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67, 509-
44）を暗示する417nmおよび506nmに２つのピークを有し
ていた（図２Ｂ）。420nm付近で吸光するcpEYFP(V68L/Q
69K)のプロトン化種は蛍光を発するのに対し、大部分の
YFPのプロトン化種は蛍光を発しない（Tsien, R. Y. (1
998) Annu. Rev. Biochem. 67, 509-44）。
【００５４】最初の試みでは、CaMのC末端およびM13のN
末端を、cp EYFP(V68L/Q69K)のN末端およびC末端にそれ
ぞれ連結した。しかし、このキメラタンパク質は、Ca2+
に対して応答を示さなかった。次に、CaMおよびM13の位
置を交換した。すなわち、トリペプチドリンカーSAGを
介してM13のC末端に、また、GTGリンカーを介して、3番
目のCa2+結合ループ内に保存された二座配位子グルタメ
ートからグルタミンへのE104Q変異を含むCaM13のN末端
に、cpEYFP(V68L/Q69K)を融合した（図１）。CaMのN末
端とM13のC末端はそれらの複合体において50Å離れてい
るが（Ikura, M., Clore, G. M., Gronenborn A. M., Z
hu, G., Klee, C. B. & Bax, A.(1992)Science 256, 63
2-638）、キメラタンパク質は蛍光性でCa2+感受性を示
した。サーキュラーパーミュテーション化YFPおよびCaM
を有するタンパク質を「ペリカム(pericam)」と命名し
た。485nmで励起した場合、Ca2+結合ペリカムは、520nm
で発光ピークを示し、Ca2+を含まないペリカムよりも３
倍明るかった。これとは対照的に、cpEYFP(V68L/Q69K)
の吸光スペクトルおよび蛍光スペクトルはいずれもCa2+
に対して感受性がなかった。
末端を、cp EYFP(V68L/Q69K)のN末端およびC末端にそれ
ぞれ連結した。しかし、このキメラタンパク質は、Ca2+
に対して応答を示さなかった。次に、CaMおよびM13の位
置を交換した。すなわち、トリペプチドリンカーSAGを
介してM13のC末端に、また、GTGリンカーを介して、3番
目のCa2+結合ループ内に保存された二座配位子グルタメ
ートからグルタミンへのE104Q変異を含むCaM13のN末端
に、cpEYFP(V68L/Q69K)を融合した（図１）。CaMのN末
端とM13のC末端はそれらの複合体において50Å離れてい
るが（Ikura, M., Clore, G. M., Gronenborn A. M., Z
hu, G., Klee, C. B. & Bax, A.(1992)Science 256, 63
2-638）、キメラタンパク質は蛍光性でCa2+感受性を示
した。サーキュラーパーミュテーション化YFPおよびCaM
を有するタンパク質を「ペリカム(pericam)」と命名し
た。485nmで励起した場合、Ca2+結合ペリカムは、520nm
で発光ピークを示し、Ca2+を含まないペリカムよりも３
倍明るかった。これとは対照的に、cpEYFP(V68L/Q69K)
の吸光スペクトルおよび蛍光スペクトルはいずれもCa2+
に対して感受性がなかった。
【００５５】さらに大きなダイナミックレンジをもつペ
リカムを取得するために、プロトンネットワークに関与
する数個のアミノ酸を最適化した。Tyrの代わりにHis20
3への置換によってダイナミックレンジが有意に改善さ
れた。「フラッシュペリカム」と称するこの新しいペリ
カムは（図１）、Ca2+が存在する場合蛍光が８倍増加し
た（図３Ｄ）。37℃において改良したフォールディング
をもたらす２つの変異（V163AおよびS175G）を用いて、
フラッシュペリカムを細胞内Ca2+の単一波長指示薬とし
て作用するように設計した。Ca2+の不在下で、フラッシ
ュペリカムは、cpEYFP(V68L/Q69K)と類似した吸光スペ
クトルを示した（図３Ａ、破線）。Ca2+が飽和すると、
400nmピークが減少して490nmの吸光ピークが増大した
（図３Ａ、実線）。これは、Ca2+-CaMとM13ペプチドと
の会合により発色団のイオン化が起こり、その結果、pH
滴定曲線の左方シフトが起こったことを示している（図
３Ｇ）。pHが発色団をイオン化するのに十分なほど高い
場合には、Ca2+結合フラッシュペリカム（pH＝９）は、
Ca2+を含まない場合（pH＞10）の約２倍明るい。従っ
て、ｐＨ滴定性以外にも、CaMとM13との間の相互作用
は、発色団に直接的な立体作用を及ぼす可能性があり、
そのイオン化状態を変更したり、または面外変形を低減
して、無放射性緩和の増強を引き起こす可能性がある。
フラッシュペリカムとのCa2+結合によって量子収量が数
倍増加すると共に、490nmにおけるモル吸光係数が増加
したため（表１）、後者の可能性が高い。図３ＧのpH滴
定曲線から、Ca2+結合フラッシュペリカムが、アルカリ
抑制（alkali-quenched）された（pH＞10）ことが示さ
れ、不完全なβ-can構造の崩壊が示唆される。
リカムを取得するために、プロトンネットワークに関与
する数個のアミノ酸を最適化した。Tyrの代わりにHis20
3への置換によってダイナミックレンジが有意に改善さ
れた。「フラッシュペリカム」と称するこの新しいペリ
カムは（図１）、Ca2+が存在する場合蛍光が８倍増加し
た（図３Ｄ）。37℃において改良したフォールディング
をもたらす２つの変異（V163AおよびS175G）を用いて、
フラッシュペリカムを細胞内Ca2+の単一波長指示薬とし
て作用するように設計した。Ca2+の不在下で、フラッシ
ュペリカムは、cpEYFP(V68L/Q69K)と類似した吸光スペ
クトルを示した（図３Ａ、破線）。Ca2+が飽和すると、
400nmピークが減少して490nmの吸光ピークが増大した
（図３Ａ、実線）。これは、Ca2+-CaMとM13ペプチドと
の会合により発色団のイオン化が起こり、その結果、pH
滴定曲線の左方シフトが起こったことを示している（図
３Ｇ）。pHが発色団をイオン化するのに十分なほど高い
場合には、Ca2+結合フラッシュペリカム（pH＝９）は、
Ca2+を含まない場合（pH＞10）の約２倍明るい。従っ
て、ｐＨ滴定性以外にも、CaMとM13との間の相互作用
は、発色団に直接的な立体作用を及ぼす可能性があり、
そのイオン化状態を変更したり、または面外変形を低減
して、無放射性緩和の増強を引き起こす可能性がある。
フラッシュペリカムとのCa2+結合によって量子収量が数
倍増加すると共に、490nmにおけるモル吸光係数が増加
したため（表１）、後者の可能性が高い。図３ＧのpH滴
定曲線から、Ca2+結合フラッシュペリカムが、アルカリ
抑制（alkali-quenched）された（pH＞10）ことが示さ
れ、不完全なβ-can構造の崩壊が示唆される。
【００５６】
【表１】
【００５７】表１は、フラッシュペリカム、インバース
ペリカム、およびレシオメトリックペリカムのスペクト
ル特性を示す。 ａ：EYFP(V68L/Q69K)の一次配列からの置換は、置換さ
れるアミノ酸の一文字表記、配列中の位置、そして置換
の一文字表記として示す。 ｂ：λabsは、ナノメートル単位での吸光スペクトルの
ピークであり、括弧内のeは、103M-1cm-1でのモル吸光
係数である。 ｃ：λemは、ナノメートル単位での発光スペクトルのピ
ークであり、括弧内のΦは、蛍光量子収率である。 ｄ：Ca2+のKd値は、図３における適合曲線から推定し
た。括弧内のｎはヒル（Hill）係数である。 ｅ：これらの特性は、50 mM HEPES/KOH pH7.4で測定し
た。 ｆ：この値は、K'd値（見掛けのKd値）を示す。
ペリカム、およびレシオメトリックペリカムのスペクト
ル特性を示す。 ａ：EYFP(V68L/Q69K)の一次配列からの置換は、置換さ
れるアミノ酸の一文字表記、配列中の位置、そして置換
の一文字表記として示す。 ｂ：λabsは、ナノメートル単位での吸光スペクトルの
ピークであり、括弧内のeは、103M-1cm-1でのモル吸光
係数である。 ｃ：λemは、ナノメートル単位での発光スペクトルのピ
ークであり、括弧内のΦは、蛍光量子収率である。 ｄ：Ca2+のKd値は、図３における適合曲線から推定し
た。括弧内のｎはヒル（Hill）係数である。 ｅ：これらの特性は、50 mM HEPES/KOH pH7.4で測定し
た。 ｆ：この値は、K'd値（見掛けのKd値）を示す。
【００５８】ほとんどのYFPは、位置203にチロシンまた
はヒスチジンを有し、400nm付近で吸光する非蛍光性プ
ロトン化種を含む（Tsien, R. Y. (1998) Annu. Rev. B
iochem. 67, 509-44）。また、フラッシュペリカムを40
0nm付近で励起させた場合には、蛍光はほぼ検出不可能
だった。これに対し、YFPの位置203におけるフェニルア
ラニンは、プロトン化種を蛍光性にすることが示されて
いる。例えば、400nmでのPhe203を有するYFPの励起は、
455nmに主な発光ピークを発生させた（Dickson, R. M.,
Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. & Moerner, W. E. (199
7) Nature 388, 355-358）。二波長励起レシオメトリッ
クCa2+指示薬を目的として、フラッシュペリカムにPhe2
03を導入した。リンカーと数個のアミノ酸が、タンパク
質フォールディングとCa2+感受性の最適化に重要である
ことが判明した。多数の構築物を試験した後、H203F、H
148D、F46Lを導入し、CaMの前のグリシンを欠失させ、
元のN末端とC末端の間にあるGGSGGリンカーをVDGGSGGTG
で置換することにより、「レシオメトリックペリカム」
をフラッシュペリカムから誘導した（図１）。フラッシ
ュペリカムでみられたように、Ca2+結合は、レシオメト
リックペリカムにおける発色団のイオン化を促進してい
た。従って、レシオメトリックペリカムは、フラッシュ
ペリカムと同様の吸光スペクトルのCa2+依存性変化を示
し（図３Ｂ）、pH滴定曲線は、Ca2+により左方にシフト
した（図３Ｈ）。しかし、フラッシュペリカムとは対照
的に、レシオメトリックペリカムは、415nmおよび494nm
にピークをもつ二峰励起スペクトルを有しており（図３
Ｅ）、494 nmおよび415nm光で励起した場合に発光する
緑色蛍光（511〜517nm）の相対強度は、Ca2+飽和と、Ca
2+非含有形態とでは約10倍変化が見られた（図３Ｅ）。
励起比（494/415）から、見掛けの解離定数（K'd）が1.
7μMおよびHill定数が1.1の、単相性Ca2+依存性が示さ
れた（図３Ｋ）。
はヒスチジンを有し、400nm付近で吸光する非蛍光性プ
ロトン化種を含む（Tsien, R. Y. (1998) Annu. Rev. B
iochem. 67, 509-44）。また、フラッシュペリカムを40
0nm付近で励起させた場合には、蛍光はほぼ検出不可能
だった。これに対し、YFPの位置203におけるフェニルア
ラニンは、プロトン化種を蛍光性にすることが示されて
いる。例えば、400nmでのPhe203を有するYFPの励起は、
455nmに主な発光ピークを発生させた（Dickson, R. M.,
Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. & Moerner, W. E. (199
7) Nature 388, 355-358）。二波長励起レシオメトリッ
クCa2+指示薬を目的として、フラッシュペリカムにPhe2
03を導入した。リンカーと数個のアミノ酸が、タンパク
質フォールディングとCa2+感受性の最適化に重要である
ことが判明した。多数の構築物を試験した後、H203F、H
148D、F46Lを導入し、CaMの前のグリシンを欠失させ、
元のN末端とC末端の間にあるGGSGGリンカーをVDGGSGGTG
で置換することにより、「レシオメトリックペリカム」
をフラッシュペリカムから誘導した（図１）。フラッシ
ュペリカムでみられたように、Ca2+結合は、レシオメト
リックペリカムにおける発色団のイオン化を促進してい
た。従って、レシオメトリックペリカムは、フラッシュ
ペリカムと同様の吸光スペクトルのCa2+依存性変化を示
し（図３Ｂ）、pH滴定曲線は、Ca2+により左方にシフト
した（図３Ｈ）。しかし、フラッシュペリカムとは対照
的に、レシオメトリックペリカムは、415nmおよび494nm
にピークをもつ二峰励起スペクトルを有しており（図３
Ｅ）、494 nmおよび415nm光で励起した場合に発光する
緑色蛍光（511〜517nm）の相対強度は、Ca2+飽和と、Ca
2+非含有形態とでは約10倍変化が見られた（図３Ｅ）。
励起比（494/415）から、見掛けの解離定数（K'd）が1.
7μMおよびHill定数が1.1の、単相性Ca2+依存性が示さ
れた（図３Ｋ）。
【００５９】レシオメトリックペリカムを準ランダム突
然変異誘発に供した結果、D148Tの置換を有する興味深
いタンパク質をみいだした（図１）。フラッシュペリカ
ムとは対照的に、500nmで励起した場合に発光する緑色
蛍光（513〜515nm）は、Ca2+により15％まで減少した
（図３Ｆ）。このタンパク質を「インバースペリカム」
と命名した。インバースペリカムへのCa2+の結合が発色
団のプロトン化を促進した可能性があったが、下記の結
果からそうではないことが判明した。pH7.4において、C
a2+イオンだけが、吸光スペクトルのピークを503nmから
490nmにブルーシフトさせ、400nm付近の小さな丘状曲線
は未変化であった（図３Ｃ）。すなわち、Ca2+結合は発
色団のプロトン化状態に影響を与えなかった。また、Ca
2+結合インバースペリカムおよびCa2+非含有インバース
ペリカムの両方を同様にpH滴定したが、イオン化状態
（pH＞８）では、Ca2+非含有タンパク質は、Ca2+結合形
態より７倍明るかった（図３Ｉ）。実際、量子収率は、
Ca2+結合により30％減少した（表１）。これらの結果
は、蛍光強度の変化は、発色団に対するCa2+関連の構造
変化の直接的作用によるものと説明できることを示唆し
ている。
然変異誘発に供した結果、D148Tの置換を有する興味深
いタンパク質をみいだした（図１）。フラッシュペリカ
ムとは対照的に、500nmで励起した場合に発光する緑色
蛍光（513〜515nm）は、Ca2+により15％まで減少した
（図３Ｆ）。このタンパク質を「インバースペリカム」
と命名した。インバースペリカムへのCa2+の結合が発色
団のプロトン化を促進した可能性があったが、下記の結
果からそうではないことが判明した。pH7.4において、C
a2+イオンだけが、吸光スペクトルのピークを503nmから
490nmにブルーシフトさせ、400nm付近の小さな丘状曲線
は未変化であった（図３Ｃ）。すなわち、Ca2+結合は発
色団のプロトン化状態に影響を与えなかった。また、Ca
2+結合インバースペリカムおよびCa2+非含有インバース
ペリカムの両方を同様にpH滴定したが、イオン化状態
（pH＞８）では、Ca2+非含有タンパク質は、Ca2+結合形
態より７倍明るかった（図３Ｉ）。実際、量子収率は、
Ca2+結合により30％減少した（表１）。これらの結果
は、蛍光強度の変化は、発色団に対するCa2+関連の構造
変化の直接的作用によるものと説明できることを示唆し
ている。
【００６０】（Ｂ−２）ペリカムを発現するHeLa細胞に
おける［Ca2+］i画像化：各ペリカムをHeLa細胞にトラ
ンスフェクトした場合、蛍光はサイトゾルコンパートメ
ントおよび核コンパートメント全体に均質に分布する
が、核孔を通過することのできる44kDaのタンパク質で
あると予想されることから、核からは排除されない（例
えば、図５Ａを参照）。従って、ペリカムは、細胞内遊
離Ca2+濃度（［Ca2+］i）を追跡することができる。図
４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、フラッシュペリカム、レシオ
メトリックペリカムおよびインバースペリカムをそれぞ
れ発現するHeLa細胞における、受容体刺激型［Ca2+］i
振動を示す。各々の場合において、応答は、大きな棘状
波で始まり、正弦波となった後、一時的な棘状波に変わ
り、なだらかに振動数が低下した。
おける［Ca2+］i画像化：各ペリカムをHeLa細胞にトラ
ンスフェクトした場合、蛍光はサイトゾルコンパートメ
ントおよび核コンパートメント全体に均質に分布する
が、核孔を通過することのできる44kDaのタンパク質で
あると予想されることから、核からは排除されない（例
えば、図５Ａを参照）。従って、ペリカムは、細胞内遊
離Ca2+濃度（［Ca2+］i）を追跡することができる。図
４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、フラッシュペリカム、レシオ
メトリックペリカムおよびインバースペリカムをそれぞ
れ発現するHeLa細胞における、受容体刺激型［Ca2+］i
振動を示す。各々の場合において、応答は、大きな棘状
波で始まり、正弦波となった後、一時的な棘状波に変わ
り、なだらかに振動数が低下した。
【００６１】単一波長指示薬（フラッシュペリカムおよ
びインバースペリカム）と比較して、レシオメトリック
ペリカムは、定量的Ca2+画像化を可能にし、これによ
り、指示薬濃度および細胞の厚み又は運動により生じる
アーティファクトを相殺することができる。Ca2+イオノ
ホアの存在下で、高濃度（5mM）の細胞外Ca2+の適用、
次いで、BAPTA-AMおよびEGTAの適用により、in situ較
正用の最大比および最小比（それぞれ、Rmaxおよび
Rmin）が得られた（図４Ｂの上部）。最初の棘状波の振
幅は約３μMであったが、続く棘状波の振幅は、１μMを
下回った。相対的に弱いCa2+親和性のために、一般の二
波長励起レシオメトリックCa2+指示薬であるfura-2と比
較して、より正確な棘状波振幅の定量化が可能になる。
びインバースペリカム）と比較して、レシオメトリック
ペリカムは、定量的Ca2+画像化を可能にし、これによ
り、指示薬濃度および細胞の厚み又は運動により生じる
アーティファクトを相殺することができる。Ca2+イオノ
ホアの存在下で、高濃度（5mM）の細胞外Ca2+の適用、
次いで、BAPTA-AMおよびEGTAの適用により、in situ較
正用の最大比および最小比（それぞれ、Rmaxおよび
Rmin）が得られた（図４Ｂの上部）。最初の棘状波の振
幅は約３μMであったが、続く棘状波の振幅は、１μMを
下回った。相対的に弱いCa2+親和性のために、一般の二
波長励起レシオメトリックCa2+指示薬であるfura-2と比
較して、より正確な棘状波振幅の定量化が可能になる。
【００６２】インバースペリカムの時間経過（図４Ｃ）
は、フラッシュペリカムの対称画像であると考えられる
（図４Ａ）。しかし、インバースペリカムは、比較的に
より持続した［Ca2+］iの増加を示した（図４Ｃ）。こ
れは、インバースペリカムが、フラッシュペリカムより
Ca2+に対する親和力が高く、そのKd値はそれぞれ0.2μM
および0.7μMであった（図3Jおよび3L）という知見と一
致する。インバースペリカムの利点の一つは、Ca2+非含
有形態が、pH7.4において高いモル吸光係数および量子
収率を有することであり（表１）、これらは、enhansed
GFPにほぼ匹敵する（Tsien, R. Y. (1998) Annu. Rev.
Biochem. 67, 509-44）。従って、Ca 2+により減光する
異常な特性にもかかわらず、インバースペリカムの使用
により、十分なＳ／Ｎ比で、Ca2+画像化が可能になる。
は、フラッシュペリカムの対称画像であると考えられる
（図４Ａ）。しかし、インバースペリカムは、比較的に
より持続した［Ca2+］iの増加を示した（図４Ｃ）。こ
れは、インバースペリカムが、フラッシュペリカムより
Ca2+に対する親和力が高く、そのKd値はそれぞれ0.2μM
および0.7μMであった（図3Jおよび3L）という知見と一
致する。インバースペリカムの利点の一つは、Ca2+非含
有形態が、pH7.4において高いモル吸光係数および量子
収率を有することであり（表１）、これらは、enhansed
GFPにほぼ匹敵する（Tsien, R. Y. (1998) Annu. Rev.
Biochem. 67, 509-44）。従って、Ca 2+により減光する
異常な特性にもかかわらず、インバースペリカムの使用
により、十分なＳ／Ｎ比で、Ca2+画像化が可能になる。
【００６３】ペリカムの開発過程では、哺乳動物細胞に
おける37℃でのフォールディング効率も重要な因子であ
った。インバースペリカムおよびレシオメトリックペリ
カムが、温度とは無関係に効率的にフォールデングする
ことができるのに対し、フラッシュペリカムは、28〜30
℃で良好に生成される。
おける37℃でのフォールディング効率も重要な因子であ
った。インバースペリカムおよびレシオメトリックペリ
カムが、温度とは無関係に効率的にフォールデングする
ことができるのに対し、フラッシュペリカムは、28〜30
℃で良好に生成される。
【００６４】（Ｂ−３）タンパク質ヘテロ二量体化のモ
ニター：サーキュラーパーミュテーション化GFP変異体
が分子間会合を検出できるかどうかは興味深い。この可
能性を調べるために、EYFP(V68L/Q69K)の元のN末端とC
末端との間のリンカーにおいてフラッシュペリカムを分
割した（図１）。２つのタンパク質（「スプリットペリ
カム」）を、HeLa細胞中で共発現させた。GFPの発色団
は、トリペプチド65〜67から成るが、その形成には完全
なβ-can構造（Tsien, R. Y. (1998) Annu. Rev. Bioch
em. 67, 509-44）が必要である。従って、２つのペプチ
ド鎖が［Ca2+］iの基底レベルでどれくらい効率的に会
合するか、また、成熟発色団がどの程度形成されるかは
明らかではない。これにも拘わらず、スプリットペリカ
ムは、CaMとM13ペプチドとの間の可逆的会合をモニター
することができた。時間経過プロフィールは、ATPもし
くはヒスタミンにより引き起こされる［Ca2+］i振動を
生じた（図４Ｄ）。しかし、スプリットペリカムは確実
なCa2+指示薬として使用することはできなかった。CaM
およびM13ペプチドは分離しているため、これらは細胞
中の未標識CaMおよびCaM結合タンパク質と交差反応して
いた。in vitro実験から、フラッシュペリカムにおいて
融合したCaMとM13は互いに優先的に相互作用することが
示された。
ニター：サーキュラーパーミュテーション化GFP変異体
が分子間会合を検出できるかどうかは興味深い。この可
能性を調べるために、EYFP(V68L/Q69K)の元のN末端とC
末端との間のリンカーにおいてフラッシュペリカムを分
割した（図１）。２つのタンパク質（「スプリットペリ
カム」）を、HeLa細胞中で共発現させた。GFPの発色団
は、トリペプチド65〜67から成るが、その形成には完全
なβ-can構造（Tsien, R. Y. (1998) Annu. Rev. Bioch
em. 67, 509-44）が必要である。従って、２つのペプチ
ド鎖が［Ca2+］iの基底レベルでどれくらい効率的に会
合するか、また、成熟発色団がどの程度形成されるかは
明らかではない。これにも拘わらず、スプリットペリカ
ムは、CaMとM13ペプチドとの間の可逆的会合をモニター
することができた。時間経過プロフィールは、ATPもし
くはヒスタミンにより引き起こされる［Ca2+］i振動を
生じた（図４Ｄ）。しかし、スプリットペリカムは確実
なCa2+指示薬として使用することはできなかった。CaM
およびM13ペプチドは分離しているため、これらは細胞
中の未標識CaMおよびCaM結合タンパク質と交差反応して
いた。in vitro実験から、フラッシュペリカムにおいて
融合したCaMとM13は互いに優先的に相互作用することが
示された。
【００６５】（Ｂ−４）Ca2+イオンに対する核膜の透過
性：サイトゾルのCa2+濃度（［Ca2+］c）とは無関係
に、核内Ca2+濃度（［Ca2+］n）が調節されるかどうか
は不明である（Malviya, A. N. & Rogue, P. J. (1998)
Cell 92, 17-23）。合成蛍光キレート剤を用いて、［Ca
2+］nおよび［Ca2+］cの比較測定が実施されている。し
かし、サイトゾルシグナルには、キレート剤がコンパー
トメント化される小胞体等の細胞内小器官からのシグナ
ルが混入していることが多い（Brown, G.R., Kohler, M
& Berggren, P. O. (1997) Biochem. J. 325, 771-77
8）。Ca2+感受性発光タンパク質であるエクオリンは、
核およびサイトゾル中に特異的に局在化しているが（Ba
dminton, M. N., Campbell, A. K.& Rembold, C. M. (1
996) J. Biol. Chem. 271, 31210-31214；及びBrini,
M.,Murgia, M., Pasti, L., Picard, D., Pozzan, T. &
Rizzuto, R. (1993) EMBOJ. 12, 4813-4819）、個々の
細胞における［Ca2+］nおよび［Ca2+］cを画像化するの
は難しいことが判明した。Ca2+波の伝播を検定するため
に、HeLa細胞をフラッシュペリカムcDNAを用いてトラン
スフェクトした後、アルゴンイオンレーザーを備えた高
速共焦点線走査型顕微鏡を用いてシグナルを観測した。
図５Ａは、フラッシュペリカムを発現する細胞の光断面
画像を示す。ここで、フラッシュペリカムは、前述した
通り同じタンパク質濃度で、サイトゾルおよび核全体に
常に分布していた。従って、フラッシュペリカムを使用
して、Ca2+緩衝作用の相違とは無関係に、２つのCa2+濃
度を比較することができた。ヒスタミンにより刺激さ
れ、線走査により検出されるCa2+伝播の典型的なパター
ンを図５Ｂに示す。Ca2+波は、図５Ａに示した線に沿っ
て移動した。図５Ｃは、１μMのヒスタミン浸漬後の［C
a2+］nおよび［Ca2+］cの、時間経過による測定を示
す。［Ca2+］nと［Ca2 +］cとの間に、時間経過によるプ
ロフィールに明白な相違はみられなかった。ビデオ−速
度走査型２光子励起蛍光顕微鏡（Fan, G. Y., Fujisak
i, H., Miyawaki, A., Tsay, R. K., Tsien, R.Y. & El
lisman, M. H. (1999) Biophys. J. 76,2412-2420）
と、蛍光Ca2+指示薬であるカメレオン（cameleon）（Mi
yawaki, A.,Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M.,
Adams, J.A, Ikura, M. & Tsien,R. Y. (1997) Nature
388, 882-887）を用いて行った実験からも、同様の結
果が得られた。
性：サイトゾルのCa2+濃度（［Ca2+］c）とは無関係
に、核内Ca2+濃度（［Ca2+］n）が調節されるかどうか
は不明である（Malviya, A. N. & Rogue, P. J. (1998)
Cell 92, 17-23）。合成蛍光キレート剤を用いて、［Ca
2+］nおよび［Ca2+］cの比較測定が実施されている。し
かし、サイトゾルシグナルには、キレート剤がコンパー
トメント化される小胞体等の細胞内小器官からのシグナ
ルが混入していることが多い（Brown, G.R., Kohler, M
& Berggren, P. O. (1997) Biochem. J. 325, 771-77
8）。Ca2+感受性発光タンパク質であるエクオリンは、
核およびサイトゾル中に特異的に局在化しているが（Ba
dminton, M. N., Campbell, A. K.& Rembold, C. M. (1
996) J. Biol. Chem. 271, 31210-31214；及びBrini,
M.,Murgia, M., Pasti, L., Picard, D., Pozzan, T. &
Rizzuto, R. (1993) EMBOJ. 12, 4813-4819）、個々の
細胞における［Ca2+］nおよび［Ca2+］cを画像化するの
は難しいことが判明した。Ca2+波の伝播を検定するため
に、HeLa細胞をフラッシュペリカムcDNAを用いてトラン
スフェクトした後、アルゴンイオンレーザーを備えた高
速共焦点線走査型顕微鏡を用いてシグナルを観測した。
図５Ａは、フラッシュペリカムを発現する細胞の光断面
画像を示す。ここで、フラッシュペリカムは、前述した
通り同じタンパク質濃度で、サイトゾルおよび核全体に
常に分布していた。従って、フラッシュペリカムを使用
して、Ca2+緩衝作用の相違とは無関係に、２つのCa2+濃
度を比較することができた。ヒスタミンにより刺激さ
れ、線走査により検出されるCa2+伝播の典型的なパター
ンを図５Ｂに示す。Ca2+波は、図５Ａに示した線に沿っ
て移動した。図５Ｃは、１μMのヒスタミン浸漬後の［C
a2+］nおよび［Ca2+］cの、時間経過による測定を示
す。［Ca2+］nと［Ca2 +］cとの間に、時間経過によるプ
ロフィールに明白な相違はみられなかった。ビデオ−速
度走査型２光子励起蛍光顕微鏡（Fan, G. Y., Fujisak
i, H., Miyawaki, A., Tsay, R. K., Tsien, R.Y. & El
lisman, M. H. (1999) Biophys. J. 76,2412-2420）
と、蛍光Ca2+指示薬であるカメレオン（cameleon）（Mi
yawaki, A.,Llopis, J., Heim, R., McCaffery, J. M.,
Adams, J.A, Ikura, M. & Tsien,R. Y. (1997) Nature
388, 882-887）を用いて行った実験からも、同様の結
果が得られた。
【００６６】（Ｂ−５）ミトコンドリアにおける遊離Ca
2+動態力学：ミトコンドリアは、細胞のCa2+シグナリン
グにおける活性な関与因子である。ミトコンドリアは、
細胞内貯蔵物からのCa2+の侵入または放出により生じる
高濃度のCa2+のサイトゾルミクロドメインからCa2+を分
離させる。［Ca2+］cの増加がどのようにしてミトコン
ドリアに中継されるかを調べることは興味深いが、無傷
の単細胞での［Ca2+］cおよび［Ca2+］m（ミトコンドリ
アにおける遊離Ca2+濃度）の同時測定の成功はごく少数
の例しかない（Ricken, S., Leipziger, J., Greger,
R. & Nitschke, R. (1998) J. Biol. Chem. 273, 34961
-34969）。合成蛍光キレート剤を示差的にターゲッティ
ングするのは困難である。従って、測定には、パッチク
ランプ法を使用している。例えば、ミトコンドリア中の
透過性カチオンrhod-2アセトキシメチルエステルの蓄積
後、デキストランと結合した他のCa2+染料を全細胞透析
によりローディングしたが（Babcock, D., Herrington,
J., Goodwin, P. C., Park, Y. B. & Hille, B. (199
7) J. Cell Biol. 136, 833-844）、ミトコンドリアは
天然サイトゾルには浸漬しなかった。これに対し、エク
オリンは容易にターゲッティングされるが（Rutter, G.
A. Burnett, P., Rizzuto, R., Brini, M., Murgia,
M., Pozzan, T., Tavare, J. M. & Denton, R.M. (199
6) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5489-5494）、セ
レンテラジン（coelenterazine）の組込みを必要とし、
Ca2+により不可逆的に消費される。しかも、そのルミネ
センスが生成する光子は１分子当たり１個に満たないた
め、画像化が困難である。
2+動態力学：ミトコンドリアは、細胞のCa2+シグナリン
グにおける活性な関与因子である。ミトコンドリアは、
細胞内貯蔵物からのCa2+の侵入または放出により生じる
高濃度のCa2+のサイトゾルミクロドメインからCa2+を分
離させる。［Ca2+］cの増加がどのようにしてミトコン
ドリアに中継されるかを調べることは興味深いが、無傷
の単細胞での［Ca2+］cおよび［Ca2+］m（ミトコンドリ
アにおける遊離Ca2+濃度）の同時測定の成功はごく少数
の例しかない（Ricken, S., Leipziger, J., Greger,
R. & Nitschke, R. (1998) J. Biol. Chem. 273, 34961
-34969）。合成蛍光キレート剤を示差的にターゲッティ
ングするのは困難である。従って、測定には、パッチク
ランプ法を使用している。例えば、ミトコンドリア中の
透過性カチオンrhod-2アセトキシメチルエステルの蓄積
後、デキストランと結合した他のCa2+染料を全細胞透析
によりローディングしたが（Babcock, D., Herrington,
J., Goodwin, P. C., Park, Y. B. & Hille, B. (199
7) J. Cell Biol. 136, 833-844）、ミトコンドリアは
天然サイトゾルには浸漬しなかった。これに対し、エク
オリンは容易にターゲッティングされるが（Rutter, G.
A. Burnett, P., Rizzuto, R., Brini, M., Murgia,
M., Pozzan, T., Tavare, J. M. & Denton, R.M. (199
6) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 5489-5494）、セ
レンテラジン（coelenterazine）の組込みを必要とし、
Ca2+により不可逆的に消費される。しかも、そのルミネ
センスが生成する光子は１分子当たり１個に満たないた
め、画像化が困難である。
【００６７】本実施例では、HeLa細胞において、ミトコ
ンドリアおよび核にターゲッティングしたレシオメトリ
ックペリカムを用いて、それぞれ［Ca2+］mおよび［Ca
2+］nを測定した。HeLa細胞内でCa2+シグナルがサイト
ゾルから核へと自由に通過するという知見に基づき、ミ
トコンドリア外Ca2+シグナルとして、［Ca2+］nを測定
した。これによって、空間的に十分離れたミトコンドリ
ア内およびミトコンドリア外のCa2+シグナルの同時観測
を実施することが可能になる。図６Ａは、１μMヒスタ
ミンによる灌流から０、５、１０および６５秒後のHeLa
細胞の４つのスナップショットを示す。０秒画像に表示
した２つのスポットで測定された励起比（480/410）は
重なっている（図６Ｂ）。［Ca2+］nの持続的増加が起
こったが、これには、一過性かつ同調した［Ca2+］m増
加が伴った。しかし、［Ca2+］mのピークは、既報の通
り（Ricken, S., Leipziger, J., Greger, R. & Nitsch
ke, R. (1998) J. Biol. Chem. 273, 34961-34969）、
［Ca2+］nより５〜10秒遅延した。ホールセルパッチ法
で［Ca2+］mと［Ca2+］nとを比較した以前の実験では、
［Ca 2+］m低下の遅延が報告されているが、本実施例で
は、［Ca2+］mの回復はかなり速く、無傷細胞を用いた
別の実験結果と一致した（Ricken, S., Leipziger, J.,
Greger, R. & Nitschke, R. (1998) J. Biol. Chem. 27
3, 34961-34969）。従って、ミトコンドリアからのCa2+
流出は、全細胞透析で消失するサイトゾル因子により調
節される可能性がある。また、図６Ａから、65秒画像の
矢印が示すように、下降期の間、一部のミトコンドリア
が他より多くのCa2+を一過性に取込んだことがわかる。
［Ca2+］mの局所的増加は、繰り返し観測された。ミト
コンドリアにターゲッティングされたレシオメトリック
ペリカムだけを含む２つのHeLa細胞（図６Ｃ）では、高
［Ca2+］mを示す単一のミトコンドリアがはっきりと画
像化された（矢印で示す）。［Ca2+］m上昇はそれぞれ
約10秒間持続した。個々の細胞におけるミトコンドリア
集団のこのような異なる挙動は、エクオリンを用いた
［Ca2+］mの細胞小器官画像化により明らかにされた（M
ontero, M. Alonso, M. T., Carnicero, E., Cuchillo-
Ibanez, I., Albinos, A., Garcia, A. G., Garcia-San
cho, J. & Alvarez, J. (2000) Nat. Cell Biol. 2, 57
-61）。
ンドリアおよび核にターゲッティングしたレシオメトリ
ックペリカムを用いて、それぞれ［Ca2+］mおよび［Ca
2+］nを測定した。HeLa細胞内でCa2+シグナルがサイト
ゾルから核へと自由に通過するという知見に基づき、ミ
トコンドリア外Ca2+シグナルとして、［Ca2+］nを測定
した。これによって、空間的に十分離れたミトコンドリ
ア内およびミトコンドリア外のCa2+シグナルの同時観測
を実施することが可能になる。図６Ａは、１μMヒスタ
ミンによる灌流から０、５、１０および６５秒後のHeLa
細胞の４つのスナップショットを示す。０秒画像に表示
した２つのスポットで測定された励起比（480/410）は
重なっている（図６Ｂ）。［Ca2+］nの持続的増加が起
こったが、これには、一過性かつ同調した［Ca2+］m増
加が伴った。しかし、［Ca2+］mのピークは、既報の通
り（Ricken, S., Leipziger, J., Greger, R. & Nitsch
ke, R. (1998) J. Biol. Chem. 273, 34961-34969）、
［Ca2+］nより５〜10秒遅延した。ホールセルパッチ法
で［Ca2+］mと［Ca2+］nとを比較した以前の実験では、
［Ca 2+］m低下の遅延が報告されているが、本実施例で
は、［Ca2+］mの回復はかなり速く、無傷細胞を用いた
別の実験結果と一致した（Ricken, S., Leipziger, J.,
Greger, R. & Nitschke, R. (1998) J. Biol. Chem. 27
3, 34961-34969）。従って、ミトコンドリアからのCa2+
流出は、全細胞透析で消失するサイトゾル因子により調
節される可能性がある。また、図６Ａから、65秒画像の
矢印が示すように、下降期の間、一部のミトコンドリア
が他より多くのCa2+を一過性に取込んだことがわかる。
［Ca2+］mの局所的増加は、繰り返し観測された。ミト
コンドリアにターゲッティングされたレシオメトリック
ペリカムだけを含む２つのHeLa細胞（図６Ｃ）では、高
［Ca2+］mを示す単一のミトコンドリアがはっきりと画
像化された（矢印で示す）。［Ca2+］m上昇はそれぞれ
約10秒間持続した。個々の細胞におけるミトコンドリア
集団のこのような異なる挙動は、エクオリンを用いた
［Ca2+］mの細胞小器官画像化により明らかにされた（M
ontero, M. Alonso, M. T., Carnicero, E., Cuchillo-
Ibanez, I., Albinos, A., Garcia, A. G., Garcia-San
cho, J. & Alvarez, J. (2000) Nat. Cell Biol. 2, 57
-61）。
【００６８】（Ｂ−６）ペリカムと他の遺伝子をコード
化可能なCa2+指示薬の比較：２種の遺伝子的にコード化
可能な蛍光Ca2+指示薬が既に報告されている。すなわ
ち、カメレオン（Miyawaki, A., Llopis, J., Heim,
R., McCaffery, J. M.,Adams, J.A, Ikura, M. & Tsie
n, R. Y. (1997) Nature 388, 882-887）およびカムガ
ルー（camgaroo）（Baird, G. S., Zacharias, D.A. &
Tsien, R. Y. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,
11241-11246）である。カメレオンは、色が異なる２種
のGFP変異体を使用してFRETを用いる二波長測光型レシ
オメトリックCa2+指示薬である。カメレオンと比較し
て、レシオメトリックペリカムは、Ca 2+に対してより大
きな応答を示す。HeLa細胞内部のレシオメトリックペリ
カムのRminに対するRmaxの10倍比は、in vitroで得られ
た励起比（494/415）の変化と一貫しており、改良した
黄色カメレオン（Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim,
R. & Tsien, R. Y. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 96, 2135-2140）のRm ax / Rminの２倍比よりはるかに
大きい。レシオメトリックペリカムは、比較的高いモル
吸光係数および量子収率、及び37℃での効率的フォール
ディング能力を示すことから、このレシオメトリックペ
リカムも十分なシグナル／ノイズ比を保証する。本実施
例では、ミトコンドリアにターゲッティングするレシオ
メトリックペリカムにより、単一のミトコンドリア中の
［Ca2+］mをモニターすることができた。
化可能なCa2+指示薬の比較：２種の遺伝子的にコード化
可能な蛍光Ca2+指示薬が既に報告されている。すなわ
ち、カメレオン（Miyawaki, A., Llopis, J., Heim,
R., McCaffery, J. M.,Adams, J.A, Ikura, M. & Tsie
n, R. Y. (1997) Nature 388, 882-887）およびカムガ
ルー（camgaroo）（Baird, G. S., Zacharias, D.A. &
Tsien, R. Y. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,
11241-11246）である。カメレオンは、色が異なる２種
のGFP変異体を使用してFRETを用いる二波長測光型レシ
オメトリックCa2+指示薬である。カメレオンと比較し
て、レシオメトリックペリカムは、Ca 2+に対してより大
きな応答を示す。HeLa細胞内部のレシオメトリックペリ
カムのRminに対するRmaxの10倍比は、in vitroで得られ
た励起比（494/415）の変化と一貫しており、改良した
黄色カメレオン（Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim,
R. & Tsien, R. Y. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 96, 2135-2140）のRm ax / Rminの２倍比よりはるかに
大きい。レシオメトリックペリカムは、比較的高いモル
吸光係数および量子収率、及び37℃での効率的フォール
ディング能力を示すことから、このレシオメトリックペ
リカムも十分なシグナル／ノイズ比を保証する。本実施
例では、ミトコンドリアにターゲッティングするレシオ
メトリックペリカムにより、単一のミトコンドリア中の
［Ca2+］mをモニターすることができた。
【００６９】カムガルーは、中央部位にカルモジュリン
の挿入を有するCa2+感受性EYFPであり、フラッシュペリ
カム同様に、Ca2+の飽和時に７倍明るくなる。しかし、
そのCa2+に対する親和力が低い（Kd＝７μM）ために、
カムガルーは、２〜３μMまでのヒスタミン誘導型［Ca
2+］I棘状波を十分に検出することができない。これと
は対照的に、フラッシュペリカムは、Ca2+に対して十分
に高い親和力（Kd＝0.7μM）を有することから、［C
a2+］iの生理学的変化を感知することができる。
の挿入を有するCa2+感受性EYFPであり、フラッシュペリ
カム同様に、Ca2+の飽和時に７倍明るくなる。しかし、
そのCa2+に対する親和力が低い（Kd＝７μM）ために、
カムガルーは、２〜３μMまでのヒスタミン誘導型［Ca
2+］I棘状波を十分に検出することができない。これと
は対照的に、フラッシュペリカムは、Ca2+に対して十分
に高い親和力（Kd＝0.7μM）を有することから、［C
a2+］iの生理学的変化を感知することができる。
【００７０】本実施例により、発色団近傍のアミノ酸に
精妙な変異を導入するだけで、ペリカムのCa2+依存性挙
動を著しく改変できることが判明した。ほとんどの場
合、ペリカムはランダムに突然変異させたが、合理的な
突然変異もいくつかあった。一例は、残基203における
チロシンのフェニルアラニンへの置換（Y203F）によ
り、レシオメトリックペリカムを作製したことである。
３つのペリカムに関する結晶学的実験により、異なる挙
動を有するペリカム、もしくはその他cpGFPに基づくバ
イオセンサーを設計する上でさらに多くの情報が得られ
るかもしれない。GFPのプロトンネットワークについて
の理解をさらに深めることにより、cpGFPは、FRET技術
を補う潜在的に有力な手段となる可能性がある。
精妙な変異を導入するだけで、ペリカムのCa2+依存性挙
動を著しく改変できることが判明した。ほとんどの場
合、ペリカムはランダムに突然変異させたが、合理的な
突然変異もいくつかあった。一例は、残基203における
チロシンのフェニルアラニンへの置換（Y203F）によ
り、レシオメトリックペリカムを作製したことである。
３つのペリカムに関する結晶学的実験により、異なる挙
動を有するペリカム、もしくはその他cpGFPに基づくバ
イオセンサーを設計する上でさらに多くの情報が得られ
るかもしれない。GFPのプロトンネットワークについて
の理解をさらに深めることにより、cpGFPは、FRET技術
を補う潜在的に有力な手段となる可能性がある。
【００７１】
【発明の効果】本発明により、カルシウムイオンに感受
性のある新規な蛍光タンパク質、特に３７℃においてカ
ルシウムイオン濃度を定量化するための指示薬として使
用できる蛍光タンパク質を提供することが可能になっ
た。
性のある新規な蛍光タンパク質、特に３７℃においてカ
ルシウムイオン濃度を定量化するための指示薬として使
用できる蛍光タンパク質を提供することが可能になっ
た。
【００７２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> Fluorescent proteins <130> A11060MA <160> 5
【００７３】 <210> 1 <211> 1278 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Recombinant DNA <400> 1 atg aag agg cgc tgg aag aaa aac ttc att gcc gtc agc gct gcc aac 48 Met Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn 1 5 10 15 cgg ttc aag aag atc tcc agc tcc ggg gca ctg ggg tct gca ggc tac 96 Arg Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu Gly Ser Ala Gly Tyr 20 25 30 aac agc cac aac gtc tat atc atg gcc gac aag cag aag aac ggc atc 144 Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile 35 40 45 aag gcc aac ttc aag atc cgc cac aac atc gag gac ggc ggc gtg cag 192 Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln 50 55 60 ctc gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc ccc gtg 240 Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val 65 70 75 80 ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg agc cac cag tcc gcc ctg agc aaa 288 Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser His Gln Ser Ala Leu Ser Lys 85 90 95 gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc gtg acc 336 Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr 100 105 110 gcc gcc ggg atc act ctc ggc atg gac gag ctg tac aag ggt ggc agc 384 Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Ser 115 120 125 ggt ggc atg gtg agc aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc 432 Gly Gly Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro 130 135 140 atc ctg gtc gag ctg gac ggc gac gta aac ggc cac aag ttc agc gtg 480 Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val 145 150 155 160 tcc ggc gag ggc gag ggc gat gcc acc tac ggc aag ctg acc ctg aag 528 Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys 165 170 175 ttc atc tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc ctc gtg 576 Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val 180 185 190 acc acc ttc ggc tac ggc ctg aag tgc ttc gcc cgc tac ccc gac cac 624 Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His 195 200 205 atg aag cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa ggc tac gtc 672 Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val 210 215 220 cag gag cgc acc atc ttc ttc aag gac gac ggc aac tac aag acc cgc 720 Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg 225 230 235 240 gcc gag gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc atc gag ctg 768 Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu 245 250 255 aag ggc atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg cac aag ctg 816 Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu 260 265 270 gag tac aac ggt acc ggg gac caa ctg aca gaa gag cag att gca gag 864 Glu Tyr Asn Gly Thr Gly Asp Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ala Glu 275 280 285 ttc aaa gaa gcc ttc tca tta ttc gac aag gat ggg gac ggc acc atc 912 Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly Thr Ile 290 295 300 acc aca aag gaa ctt ggc acc gtt atg agg tcg ctt gga caa aac cca 960 Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Val Met Arg Ser Leu Gly Gln Asn Pro 305 310 315 320 acg gaa gca gaa ttg cag gat atg atc aat gaa gtc gat gct gat ggc 1008 Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala Asp Gly 325 330 335 aat gga acg att tac ttt cct gaa ttt ctt act atg atg gct aga aaa 1056 Asn Gly Thr Ile Tyr Phe Pro Glu Phe Leu Thr Met Met Ala Arg Lys 340 345 350 atg aag gac aca gac agc gaa gag gaa atc cga gaa gca ttc cgt gtt 1104 Met Lys Asp Thr Asp Ser Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe Arg Val 355 360 365 ttt gac aag gat ggg aac ggc tac atc agc gct gct cag tta cgt cac 1152 Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Gln Leu Arg His 370 375 380 gtc atg aca aac ctc ggg gag aag tta aca gat gaa gaa gtt gat gaa 1200 Val Met Thr Asn Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val Asp Glu 385 390 395 400 atg ata agg gaa gca gat atc gat ggt gat ggc caa gta aac tat gaa 1248 Met Ile Arg Glu Ala Asp Ile Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn Tyr Glu 405 410 415 gag ttt gta caa atg atg aca gca aag taa 1278 Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala Lys 420 425
【００７４】 <210> 2 <211> 1284 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Recombinant DNA <400> 2 atg aag agg cgc tgg aag aaa aac ttc att gcc gtc agc gct gcc aac 48 Met Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn 1 5 10 15 cgg ttc aag aag atc tcc agc tcc ggg gca ctg ggg tct gca ggc tac 96 Arg Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu Gly Ser Ala Gly Tyr 20 25 30 aac agc gac aac gtc tat atc atg gcc gac aag cag aag aac ggc atc 144 Asn Ser Asp Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile 35 40 45 aag gcc aac ttc aag atc cgc cac aac atc gag gac ggc ggc gtg cag 192 Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln 50 55 60 ctc gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc ccc gtg 240 Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val 65 70 75 80 ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg agc ttc cag tcc gcc ctg agc aaa 288 Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Ser Ala Leu Ser Lys 85 90 95 gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc gtg acc 336 Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr 100 105 110 gcc gcc ggg atc act ctc ggc atg gac gag ctg tac aag gtc gac ggt 384 Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Val Asp Gly 115 120 125 ggc agc ggt ggc acc ggt gtg agc aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg 432 Gly Ser Gly Gly Thr Gly Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly 130 135 140 gtg gtg ccc atc ctg gtc gag ctg gac ggc gac gta aac ggc cac aag 480 Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys 145 150 155 160 ttc agc gtg tcc ggc gag ggc gag ggc gat gcc acc tac ggc aag ctg 528 Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu 165 170 175 acc ctg aag ctc atc tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc 576 Thr Leu Lys Leu Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro 180 185 190 acc ctc gtg acc acc ttc ggc tac ggc ctg aag tgc ttc gcc cgc tac 624 Thr Leu Val Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe Ala Arg Tyr 195 200 205 ccc gac cac atg aag cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa 672 Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu 210 215 220 ggc tac gtc cag gag cgc acc atc ttc ttc aag gac gac ggc aac tac 720 Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr 225 230 235 240 aag acc cgc gcc gag gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc 768 Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg 245 250 255 atc gag ctg aag ggc atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg 816 Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly 260 265 270 cac aag ctg gag tac aac ggt acc gac caa ctg aca gaa gag cag att 864 His Lys Leu Glu Tyr Asn Gly Thr Asp Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile 275 280 285 gca gag ttc aaa gaa gcc ttc tca tta ttc gac aag gat ggg gac ggc 912 Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly 290 295 300 acc atc acc aca aag gaa ctt ggc acc gtt atg agg tcg ctt gga caa 960 Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Val Met Arg Ser Leu Gly Gln 305 310 315 320 aac cca acg gaa gca gaa ttg cag gat atg atc aat gaa gtc gat gct 1008 Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala 325 330 335 gat ggc aat gga Acg att tac ttt cct gaa ttt ctt act atg atg gct 1056 Asp Gly Asn Gly Thr Ile Tyr Phe Pro Glu Phe Leu Thr Met Met Ala 340 345 350 aga aaa atg aag gac aca gac agc gaa gag gaa atc cga gaa gca ttc 1104 Arg Lys Met Lys Asp Thr Asp Ser Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe 355 360 365 cgt gtt ttt gac aag gat ggg aac ggc tac atc agc gct gct cag tta 1152 Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Gln Leu 370 375 380 cgt cac gtc atg aca aac ctc ggg gag aag tta aca gat gaa gaa gtt 1200 Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val 385 390 395 400 gat gaa atg ata agg gaa gca gat atc gat ggt gat ggc caa gta aac 1248 Asp Glu Met Ile Arg Glu Ala Asp Ile Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn 405 410 415 tat gaa gag ttt gta caa atg atg aca gca aag taa 1284 Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala Lys 420 425
【００７５】 <210> 3 <211> 1284 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Recombinant DNA <400> 3 atg aag agg cgc tgg aag aaa aac ttc att gcc gtc agc gct gcc aac 48 Met Lys Arg Arg Trp Lys Lys Asn Phe Ile Ala Val Ser Ala Ala Asn 1 5 10 15 cgg ttc aag aag atc tcc agc tcc ggg gca ctg ggg tct gca ggc tac 96 Arg Phe Lys Lys Ile Ser Ser Ser Gly Ala Leu Gly Ser Ala Gly Tyr 20 25 30 aac agc gac aac gtc tat atc atg gcc gac aag cag aag aac ggc atc 144 Asn Ser Asp Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile 35 40 45 aag gcc aac ttc aag atc cgc cac aac atc gag gac ggc ggc gtg cag 192 Lys Ala Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Gly Val Gln 50 55 60 ctc gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc atc ggc gac ggc ccc gtg 240 Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val 65 70 75 80 ctg ctg ccc gac aac cac tac ctg agc ttc cag tcc gcc ctg agc aaa 288 Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Phe Gln Ser Ala Leu Ser Lys 85 90 95 gac ccc aac gag aag cgc gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc gtg acc 336 Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr 100 105 110 gcc gcc ggg atc act ctc ggc atg gac gag ctg tac aag gtc gac ggt 384 Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Val Asp Gly 115 120 125 ggc agc ggt ggc acc ggt gtg agc aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg 432 Gly Ser Gly Gly Thr Gly Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly 130 135 140 gtg gtg ccc atc ctg gtc gag ctg gac ggc gac gta aac ggc cac aag 480 Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys 145 150 155 160 ttc agc gtg tcc ggc gag ggc gag ggc gat gcc acc tac ggc aag ctg 528 Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu 165 170 175 acc ctg aag ctc atc tgc acc acc ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc 576 Thr Leu Lys Leu Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro 180 185 190 acc ctc gtg acc acc ttc ggc tac ggc ctg aag tgc ttc gcc cgc tac 624 Thr Leu Val Thr Thr Phe Gly Tyr Gly Leu Lys Cys Phe Ala Arg Tyr 195 200 205 ccc gac cac atg aag cag cac gac ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa 672 Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu 210 215 220 ggc tac gtc cag gag cgc acc atc ttc ttc aag gac gac ggc aac tac 720 Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr 225 230 235 240 aag acc cgc gcc gag gtg aag ttc gag ggc gac acc ctg gtg aac cgc 768 Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg 245 250 255 atc gag ctg aag ggc atc gac ttc aag gag gac ggc aac atc ctg ggg 816 Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly 260 265 270 cac aag ctg gag tac aac ggt acc gac caa ctg aca gaa gag cag att 864 His Lys Leu Glu Tyr Asn Gly Thr Asp Gln Leu Thr Glu Glu Gln Ile 275 280 285 gca gag ttc aaa gaa gcc ttc tca tta ttc gac aag gat ggg gac ggc 912 Ala Glu Phe Lys Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp Lys Asp Gly Asp Gly 290 295 300 acc atc acc aca aag gaa ctt ggc acc gtt atg agg tcg ctt gga caa 960 Thr Ile Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Val Met Arg Ser Leu Gly Gln 305 310 315 320 aac cca acg gaa gca gaa ttg cag gat atg atc aat gaa gtc gat gct 1008 Asn Pro Thr Glu Ala Glu Leu Gln Asp Met Ile Asn Glu Val Asp Ala 325 330 335 gat ggc aat gga acg att tac ttt cct gaa ttt ctt act atg atg gct 1056 Asp Gly Asn Gly Thr Ile Tyr Phe Pro Glu Phe Leu Thr Met Met Ala 340 345 350 aga aaa atg aag gac aca gac agc gaa gag gaa atc cga gaa gca ttc 1104 Arg Lys Met Lys Asp Thr Asp Ser Glu Glu Glu Ile Arg Glu Ala Phe 355 360 365 cgt gtt ttt gac aag gat ggg aac ggc tac atc agc gct gct cag tta 1152 Arg Val Phe Asp Lys Asp Gly Asn Gly Tyr Ile Ser Ala Ala Gln Leu 370 375 380 cgt cac gtc atg aca aac ctc ggg gag aag tta aca gat gaa gaa gtt 1200 Arg His Val Met Thr Asn Leu Gly Glu Lys Leu Thr Asp Glu Glu Val 385 390 395 400 gat gaa atg ata agg gaa gca gat atc gat ggt gat ggc caa gta aac 1248 Asp Glu Met Ile Arg Glu Ala Asp Ile Asp Gly Asp Gly Gln Val Asn 405 410 415 tat gaa gag ttt gta caa atg atg aca gca aag taa 1284 Tyr Glu Glu Phe Val Gln Met Met Thr Ala Lys 420 425
【００７６】 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: linker peptide <400> 4 Gly Gly Ser Gly Gly 1 5
【００７７】 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: linker peptide <400> 5 Val Asp Gly Gly Ser Gly Gly Thr Gly 1 5
【図１】図１は、細菌および哺乳動物細胞における発現
用ペリカムの構造および配列を示す。リンカーおよびア
ミノ酸置換の配列を、バーの上下にそれぞれ示す。His6
は、ポリヒスチジンタグを；kzは、コザックコンセンサ
ス配列を；nlsは核局在化シグナルを；coxIVは、シトク
ロムcオキシダーゼサブユニットIVターゲッティングシ
グナル（Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M. & P
ozzan, T. (1992)Nature 358, 325-327）をそれぞれ示
す。
用ペリカムの構造および配列を示す。リンカーおよびア
ミノ酸置換の配列を、バーの上下にそれぞれ示す。His6
は、ポリヒスチジンタグを；kzは、コザックコンセンサ
ス配列を；nlsは核局在化シグナルを；coxIVは、シトク
ロムcオキシダーゼサブユニットIVターゲッティングシ
グナル（Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M. & P
ozzan, T. (1992)Nature 358, 325-327）をそれぞれ示
す。
【図２】図２の（Ａ）は、EYFP(V68L/Q69K)（破線）お
よびcpEYFP(V68L/Q69K)（実線）の吸光スペクトルを示
し、図２の（Ｂ）は530nm発光および485nm励起でそれぞ
れ記録したcpEYFP(V68L/Q69K)の蛍光励起（ex）および
発光（em）スペクトルを示す。ここで、スペクトルはす
べて、最大値1.0に正規化した。
よびcpEYFP(V68L/Q69K)（実線）の吸光スペクトルを示
し、図２の（Ｂ）は530nm発光および485nm励起でそれぞ
れ記録したcpEYFP(V68L/Q69K)の蛍光励起（ex）および
発光（em）スペクトルを示す。ここで、スペクトルはす
べて、最大値1.0に正規化した。
【図３】図３は、フラッシュペリカム（Ａ、Ｄ、Ｇおよ
びＪ）、レシオメトリックペリカム（Ｂ、Ｅ、Ｈおよび
Ｋ）、ならびにインバースペリカム（Ｃ、Ｆ、Ｉおよび
Ｌ）ののin vitro特性を示す。図３では、ペリカムの吸
光スペクトル（Ａ〜Ｃ）、ならびに、蛍光励起および発
光スペクトル（Ｄ〜Ｆ）、514nm発光ピーク（Ｇ）、516
nm発光ピーク（Ｉ）、ならびに、495/510の励起比にお
ける正規化振幅のpH依存性（Ｈ）を示す。（Ａ）〜
（Ｉ）では、スペクトルおよびデータ点は、Ca 2+イオン
の存在下（実線）および不在下（破線）で得られた。
（Ｊ）〜（Ｌ）は、ペリカムのCa2+滴定曲線を示す。FI
は蛍光強度を指す。
びＪ）、レシオメトリックペリカム（Ｂ、Ｅ、Ｈおよび
Ｋ）、ならびにインバースペリカム（Ｃ、Ｆ、Ｉおよび
Ｌ）ののin vitro特性を示す。図３では、ペリカムの吸
光スペクトル（Ａ〜Ｃ）、ならびに、蛍光励起および発
光スペクトル（Ｄ〜Ｆ）、514nm発光ピーク（Ｇ）、516
nm発光ピーク（Ｉ）、ならびに、495/510の励起比にお
ける正規化振幅のpH依存性（Ｈ）を示す。（Ａ）〜
（Ｉ）では、スペクトルおよびデータ点は、Ca 2+イオン
の存在下（実線）および不在下（破線）で得られた。
（Ｊ）〜（Ｌ）は、ペリカムのCa2+滴定曲線を示す。FI
は蛍光強度を指す。
【図４】図４は、フラッシュペリカム（Ａ）、レシオメ
トリックペリカム（Ｂ）、インバースペリカム（Ｃ）お
よびスプリットペリカム（Ｄ）を発現するHeLa細胞にお
ける、受容体刺激により誘導される［Ca2+］i一過性事
象および振動を示す。サンプリング間隔は３〜５秒であ
る。（Ｂ）上部、480nm対410nmの励起比。右側の縦座標
は、矢印線と矢先がそれぞれ示すRmaxおよびRminを用い
て、μM単位で［Ca2+］iを較正する。下部、480nm励起
（黒い線、左側の目盛）および410nm励起（灰色の線、
右側の目盛）。
トリックペリカム（Ｂ）、インバースペリカム（Ｃ）お
よびスプリットペリカム（Ｄ）を発現するHeLa細胞にお
ける、受容体刺激により誘導される［Ca2+］i一過性事
象および振動を示す。サンプリング間隔は３〜５秒であ
る。（Ｂ）上部、480nm対410nmの励起比。右側の縦座標
は、矢印線と矢先がそれぞれ示すRmaxおよびRminを用い
て、μM単位で［Ca2+］iを較正する。下部、480nm励起
（黒い線、左側の目盛）および410nm励起（灰色の線、
右側の目盛）。
【図５】図５の（Ａ）は、フラッシュペリカムを発現す
るHeLa細胞の共焦点画像を示し、図５の（Ｂ）は、ヒス
タミン誘発Ca2+伝播の（Ａ）における縦線に沿った線走
査画像を示し、図５の（Ｃ）は、サイトゾルおよび核に
おけるCa2+シグナルの時間経過を示す。それらの領域
は、（Ｂ）の右側に示す。目盛棒は10μm。
るHeLa細胞の共焦点画像を示し、図５の（Ｂ）は、ヒス
タミン誘発Ca2+伝播の（Ａ）における縦線に沿った線走
査画像を示し、図５の（Ｃ）は、サイトゾルおよび核に
おけるCa2+シグナルの時間経過を示す。それらの領域
は、（Ｂ）の右側に示す。目盛棒は10μm。
【図６】図６の（Ａ）は、レシオメトリックペリカムnu
およびmtを発現した４つのHeLa細胞の一連の擬似着色画
像を示す。左上から右下に向かって、１μMのヒスタミ
ン適用から、０、５、10、および65秒後を示す。一番左
の細胞にみられる小円および大円は、それぞれ［Ca2+］
nおよび［Ca2+］m測定の目的とする領域である。これら
の時間経過は、（Ａ）の４つの画像を取得した時点の表
示と共に、（Ｂ）に示す。図６の（Ｃ）は、レシオメト
リックペリカムmtを発現する２つのHeLa細胞の一連の擬
似着色画像を示す。矢印は、一過性に高［Ca2+］mを示
すミトコンドリアの小集団を示す。目盛棒、10μm。
およびmtを発現した４つのHeLa細胞の一連の擬似着色画
像を示す。左上から右下に向かって、１μMのヒスタミ
ン適用から、０、５、10、および65秒後を示す。一番左
の細胞にみられる小円および大円は、それぞれ［Ca2+］
nおよび［Ca2+］m測定の目的とする領域である。これら
の時間経過は、（Ａ）の４つの画像を取得した時点の表
示と共に、（Ｂ）に示す。図６の（Ｃ）は、レシオメト
リックペリカムmtを発現する２つのHeLa細胞の一連の擬
似着色画像を示す。矢印は、一過性に高［Ca2+］mを示
すミトコンドリアの小集団を示す。目盛棒、10μm。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/52 Ｃ Ｇ０１Ｎ 21/78 33/84 Ｚ 33/52 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/84 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB41 BB51 CB01 DB07 FA19 FA29 FB02 GC15 2G054 CA10 CE02 EA03 GA03 GA04 4B024 AA11 BA80 CA07 EA04 HA01 4B063 QA01 QA18 QQ01 QQ89 QR48 QR58 QS32 QS36 QX02 4B065 AB01 BA02 CA24 CA46 4H045 AA10 BA41 EA50 FA74
Claims (21)
- 【請求項１】 Ｎ末端からＣ末端方向に以下のアミノ酸
配列（１）〜（３）を順番に有する蛍光タンパク質にお
いて、当該蛍光タンパク質にカルシウム結合タンパク質
とその標的ペプチドとを融合して得られる融合蛍光タン
パク質がＣａ 2+イオンの量に依存した蛍光を発すること
ができることを特徴とする、蛍光タンパク質。 （１）緑色蛍光タンパク質又はその変異体、黄色蛍光タ
ンパク質またはその変異体、シアン蛍光タンパク質また
はその変異体、赤色蛍光タンパク質またはその変異体、
及び青色蛍光タンパク質またはその変異体から成る群か
ら選択される蛍光タンパク質のＮ末端からｎ番目のアミ
ノ酸からＣ末端までのアミノ酸配列（ただし、ｎは１４
０から１５０までの整数を示す）； （２）２〜２０個のアミノ酸配列から成るリンカー配
列；及び （３）上記（１）に記載した蛍光タンパク質のＮ末端の
1番目からｎ−１番目のアミノ酸配列： - 【請求項２】 融合蛍光タンパク質がＣａ2+イオンの存
在下においてその量に依存して異なる強度の蛍光を発す
ることができる、請求項１に記載の蛍光タンパク質。 - 【請求項３】 融合蛍光タンパク質がＣａ2+イオンの存
在下においてその量に依存して異なる波長の励起を示
す、請求項１に記載の蛍光タンパク質。 - 【請求項４】 リンカー配列のアミノ酸配列がGly-Gly-
Ser-Gly-Gly又はVal-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Thr-Gly
である、請求項１から３の何れか１項に記載の蛍光タン
パク質。 - 【請求項５】 以下の何れかの蛍光タンパク質。 （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７５番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７５番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７５番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質： （Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７８番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質：又は （Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質、又
は配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目から
２７８番目までのアミノ酸において１から数個のアミノ
酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を
有し、配列番号３に記載のアミノ酸配列のうち３２番目
から２７８番目までのアミノ酸を有するタンパク質と同
等以上の蛍光特性を有するタンパク質： - 【請求項６】 Ｎ末端からＣ末端方向に以下のアミノ酸
配列（１）〜（５）を順番に有する融合蛍光タンパク質
において、Ｃａ2+イオンの量に依存した蛍光を発するこ
とができることを特徴とする、融合蛍光タンパク質。 （１）カルシウム結合タンパク質の標的ペプチドのアミ
ノ酸配列； （２）緑色蛍光タンパク質又はその変異体、黄色蛍光タ
ンパク質またはその変異体、シアン蛍光タンパク質また
はその変異体、赤色蛍光タンパク質またはその変異体、
及び青色蛍光タンパク質またはその変異体から成る群か
ら選択される蛍光タンパク質のＮ末端からｎ番目のアミ
ノ酸からＣ末端までのアミノ酸配列（ただし、ｎは１４
０から１５０までの整数を示す）； （３）２〜２０個のアミノ酸配列から成るリンカー配
列；及び （４）上記（２）に記載した蛍光タンパク質のＮ末端の
1番目からｎ−１番目のアミノ酸配列： （５）カルシウム結合タンパク質のアミノ酸配列： - 【請求項７】 Ｃａ2+イオンの存在下においてその量に
依存して異なる強度の蛍光を発することができる、請求
項６に記載の融合蛍光タンパク質。 - 【請求項８】 Ｃａ2+イオンの存在下においてその量に
依存して異なる波長の励起を示す、請求項６に記載の融
合蛍光タンパク質。 - 【請求項９】 リンカー配列のアミノ酸配列がGly-Gly-
Ser-Gly-Gly又はVal-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Thr-Gly
である、請求項６から８の何れか１項に記載の融合蛍光
タンパク質。 - 【請求項１０】 カルシウム結合タンパク質が、カルモ
ジュリン、トロポニンＣ、カルシニューリンＢ、ミオシ
ン軽鎖、レコベリン、Ｓ−モジュリン、ビシニン、ＶＩ
ＬＩＰ、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フレクエニ
ン、カルトラクチン、カルパイン・ラージ・サブユニッ
ト、Ｓ１００プロテイン、パルバルブミン、カルビンジ
ンＤ9K、カルビンジンＤ28K及びカルレチニンから成る
群から選ばれるタンパク質である、請求項６から９の何
れか１項に記載の融合蛍光タンパク質。 - 【請求項１１】 以下の何れかの融合蛍光タンパク質。 （Ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号１に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質： （Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号２に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号２に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質：又は （Ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質、又は配列番号３に記載のアミノ酸配列において１
から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有す
るアミノ酸配列を有し、配列番号３に記載のアミノ酸配
列を有するタンパク質と同等以上の蛍光特性を有するタ
ンパク質： - 【請求項１２】 請求項６から１１の何れかに記載の融
合蛍光タンパク質から成るカルシウムイオン指示薬。 - 【請求項１３】 請求項６から１１の何れかに記載の融
合蛍光タンパク質を用いて細胞内のカルシウムイオンの
濃度又は分布を測定する方法。 - 【請求項１４】 請求項１から５の何れかに記載の蛍光
タンパク質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項１５】 以下の何れかのＤＮＡ。 （Ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち９４番目から
８２５番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号１に記載のアミノ酸配列のうち９４番目から８２５番
目までの塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置
換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号１
に記載の塩基配列のうち９４番目から８２５番目までの
塩基配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等
以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮ
Ａ； （Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列のうち９４番目から
８３４番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号２に記載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目ま
での塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及
び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号２に記
載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目までの塩基
配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等以上
の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；又
は （Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列のうち９４番目から
８３４番目までの塩基配列を有するＤＮＡ、又は配列番
号３に記載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目ま
での塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及
び／又は付加を有する塩基配列を有し、配列番号２に記
載の塩基配列のうち９４番目から８３４番目までの塩基
配列を有するＤＮＡがコードするタンパク質と同等以上
の蛍光特性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ； - 【請求項１６】 請求項６から１１の何れかに記載の融
合蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項１７】 以下の何れかのＤＮＡ。 （Ａ）配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号１に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号１に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ； （Ｂ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号２に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ；又は （Ｃ）配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、又
は配列番号３に記載の塩基配列において１から数個の塩
基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有
し、配列番号３に記載の塩基配列がコードするタンパク
質と同等以上の蛍光特性を有するタンパク質をコードす
るＤＮＡ； - 【請求項１８】 請求項１４から１７の何れかに記載の
ＤＮＡを有する組み換えベクター。 - 【請求項１９】 請求項１４から１７の何れかに記載の
ＤＮＡ又は請求項１１８に記載の組み換えベクターを有
する形質転換体。 - 【請求項２０】 請求項１９に記載の形質転換体を用い
て、該形質転換体中のカルシウムイオン濃度又は分布を
当該形質転換体が発する蛍光を指標にして測定する方
法。 - 【請求項２１】 請求項１から５の何れかに記載の蛍光
タンパク質、請求項６から１１の何れかに記載の融合蛍
光タンパク質、請求項１２に記載のカルシウムイオン指
示薬、請求項１４から１７の何れかに記載のＤＮＡ、請
求項１８に記載の組み換えベクター、請求項１９に記載
の形質転換体から選択される少なくとも1種以上を含む
ことを特徴とする、カルシウムイオンを測定するための
キット。
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