2DESCRIPCIÓN Variantes de la proteína de fusión sensible al calcio tdTomato-aequorina La presente invención se refiere a proteínas derivadas de la proteína de fusión tdTomato-aequorina, que emite en la región roja del espectro cuando la aequorina une el ión calcio. Las proteínas de la invención son útiles para la cuantificación de calcio intracelular. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la Biomedicina. 5 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El calcio (Ca2+) es conocido por participar como segundo mensajero en el control de una gran variedad de procesos celulares en diferentes organismos. La aequorina (Aeq) es una fotoproteína sensible al Ca2+, un complejo formado por la proteína apoaequorina, el luminóforo coelenterazina (CLZ) y oxígeno molecular. Las técnicas de bioimagen para Ca2+ basadas en Aeq están bien establecidas. Esta fotoproteína emite luz azul cuando está en contacto con 10 Ca2+ libre, y presenta una alta relación señal-ruido. Sin embargo, su bajo rendimiento cuántico limita la resolución espacio-temporal en medidas de una sola célula y su uso en bioimagen in vivo. Entre todos los sensores de Ca2+ disponibles, Aeq es un reportero de elección en numerosas aplicaciones debido a su extraordinaria flexibilidad. Por ejemplo, las propiedades funcionales de Aeq han sido alteradas mediante la incorporación de diferentes análogos de CLZ. Además, estudios de mutagénesis han aportado variantes con diferente sensibilidad al Ca2+, desplazamiento 15 de la emisión, mejoría de la termoestabilidad de la proteína u otras características. Por otra parte, estos dos enfoques, mutaciones en apoaequorina más la elección de una CLZ sintética, se han combinado con éxito. La transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) consiste en el paso de la energía del estado excitado de una fotoproteína luminiscente (dador de energía, como Aeq), a un aceptor (como una proteína fluorescente, FP); de esta forma en lugar de la emisión de Aeq, se obtiene emisión del aceptor. Se ha utilizado 20 BRET como una estrategia para el desplazamiento de la emisión azul de Aeq y la generación de tonos alternativos, por ejemplo verde, amarillo y rojo (Bakayan A., et al. PLoS One 2011; 6: e19520). La primera proteína fluorescente roja (RFP) que se fusionó con Aeq como aceptor de BRET fue mRFP1, con un pico de emisión de 612 nm. Sin embargo, la transferencia de energía en estas fusiones fue muy limitada (Manjarres I. M., et al. Pflugers Arch 2008: 455: 961-970). Más recientemente hemos llevado a cabo un estudio comparativo de Aeq fusionada con diferentes 25 FPs, y se encontró que tdTomato, que presenta un máximo de emisión a 582 nm, fue un aceptor de energía adecuado. La quimera tdTomato-Aeq (tdTA) presentó el mayor porcentaje de cuentas por encima de 600 nm de todas las fusiones existentes, aunque la transferencia de energía no excedió el 50% (Bakayan A., et al. PLoS One 2011; 6: e19520), y tiene dos picos de emisión (a 470 nm y a 582nm), por lo que no es una proteína de fusión adecuada para estudios de Ca2+ en dos colores simultáneos (dos o más compartimentos, dos tipos celulares, etc). 30 Existen fusiones de GFP con Aeq (GA) con una emisión verde (pico de 509 nm) pero es importante encontrar un sensor de Ca2+ que emita en la región roja, y que, a diferencia de tdTA, no presente dos picos de emisión. La ventaja de obtener variantes de Aeq con emisión roja es que, por un lado, se facilita la adquisición de imágenes de doble canal en combinación con GA que es una variante verde (Manjarres I. M., et al. Pflugers Arch 2008: 455: 961-970), si se consigue el suficiente brillo y separación espectral entre la variante verde (GA) y la roja. Por otro lado, para el 35 seguimiento de Ca2+ en los tejidos profundos de mamíferos vivos, se necesita que emita en la llamada ventana óptica (de 600 a 900 nm), ya que la luz ultravioleta, azul y verde es considerablemente atenuada por los tejidos animales. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El presente trabajo está dirigido a la obtención de un sensor bioluminiscente de Ca2+ de color rojo, tomando tdTA 40 como punto de partida, mejorando la eficacia de la transferencia de energía, ajustando la afinidad del Ca2+ al nivel apropiado para la expresión de las quimeras en diferentes compartimentos celulares. Para este fin, se combinaron varios enfoques. Se mejoró la BRET al disminuir la distancia entre tdTomato y Aeq (comparado con tdTA). La variante resultante se denominó AD1. Posteriormente, se aplicó mutagénesis dirigida en la proteína apoaequorina, lo que ha resultado en un porcentaje de BRET máximo, el aumento de la estabilidad de las proteínas quiméricas, y 45 cambios en la sensibilidad al Ca2+. Finalmente, estas variantes se emparejaron con análogos de CLZ sintéticos y se ensayó su capacidad de informar de niveles de Ca2+ en dos compartimentos celulares de la misma célula (mediante protocolos de imagen en dos canales), la movilización de Ca2+ por la estimulación repetitiva con un agonista que actúa sobre un receptor de membrana, y el registro de la actividad espontánea del Ca2+ celular. Los autores de la presente invención han variado la configuración del enlace entre apoaequorina y tdTomato para 50 maximizar la transferencia de energía. Una combinación de deleciones cortas en el extremo C terminal de tdTomato, N terminal de apoaequorina y la eliminación completa del péptido conector en tdTA ha producido variantes como AD1 con BRET muy eficiente, donde se recogió más del 77% de la luz por encima de 575 nm, aunque esta manipulación provocó una disminución en el brillo de un 28%. Se obtuvieron otras mejoras mediante la combinación de AD1 con mutaciones puntuales en la secuencia de apoaequorina descritas en la literatura, como Y82F, que 55 provoca un desplazamiento hacia el rojo, y Q168R, que aumenta su termoestabilidad. Con ellas se obtuvo un resultado de hasta el 85% del total de la luz en la banda roja (variantes ADIF y ADIFQ). La bioluminiscencia celular se incrementó 7 veces por la mutación de termoestabilidad Q168R (variante ADNQ), lo
3que permitió la detección de cambios transitorios de Ca2+ con protocolos de adquisición rápida. Se logró la medición simultánea de Ca2+ citoplásmico y mitocondrial, mediante el emparejamiento apropiado de variantes de emisión verde y roja, junto con el ajuste de la sensibilidad al Ca2+ y la localización subcelular de las quimeras. Se obtuvieron imágenes de oscilaciones de Ca2+ espontáneas e inducidas por carbacol en células HEK individuales, con una combinación del biosensor rojo de una alta afinidad por Ca2+ y una CLZ sintética (CLZ-hcp). En conclusión, las 5 variantes de tdTA descritas en la presente invención mejoran BRET de Aeq a un emisor rojo hasta un valor máximo, lo que facilita poder tomar imágenes de Ca2+ en tejidos profundos de animales. La tdTomato en la se refiere a un dímero de DsRed que se obtiene a partir del organismo Discosoma sp. (Shaner N. C., et al. NatBiotechnol 2004; 22: 1567-1572) y cuya secuencia de ácido nucléico se refieren a la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos se refiere a la SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 1 es idéntica a la secuencia nucleotídica en 10 GenBank AY678269.1. La SEQ ID NO: 2 es idéntica a la secuencia de proteína AAV52169.1 en GenBank. La apoaequorina utilizada en la presente invención se refiere a una proteína que, combinada con el cofactor CLZ, emite luz en la zona azul del espectro visible, que se aísla del organismo Aequorea victoria y cuya secuencia de ácido nucléico se refiere a la SEQ ID NO: 3 y cuya secuencia de proteínas se refiere la SEQ ID NO: 4. También se puede referir a cualquiera de las variantes de apoaequorina descritas que guardan al menos un 70% de identidad, 15 por ejemplo Q7YTW8 (cuya secuencia nucleotídica en GenBank es AB103338.1), P02592, Q6J4T7, Q6J296, Q7YTX0, Q6J294, Q6J293, Q6J295, Q6J2A1, Q6J2A0, Q6J299, Q6J296, Q6J297, Q6J2A2, Q7YTW7, Q7YTW9 o P07164 que son obtenidas a partir de Aequorea victoria; o Q8WQY8, Q8WQY7 o Q6XDT9 que son obtenidas a partir de otras especies de Aequorea. Los códigos de las secuencias de proteína corresponden a la base de datos UniProtKB. 20 Por tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a una proteína de fusión fluorescente roja que comprende: a. una subunidad (a) que consiste en una proteína con al menos un 70%, preferiblemente al menos un 81%, más preferiblemente un 90%, aún más preferiblemente un 95% de identidad con la proteína SEQ ID NO: 2, o un fragmento de la misma, y 25 b. una subunidad (b) que consiste en una proteína fotoluminiscente sensible al calcio, con al menos un 70%, preferiblemente al menos un 81%, más preferiblemente un 90%, aún más preferiblemente un 95% de identidad con la proteína SEQ ID NO: 4 o un fragmento de la misma, donde la subunidad (b) está unida al extremo carboxilo-terminal de la subunidad (a) sin espaciador o mediante un polipéptido espaciador de hasta 19 aminoácidos, preferiblemente el polipéptido espaciador consiste en un 30 polipéptido de hasta 11 aminoácidos, más preferiblemente es de entre 2 y 11 aminoácidos. La fluorescencia es un tipo de luminiscencia que caracteriza a las sustancias que son capaces de absorber energía en forma de radiaciones electromagnéticas (luz de excitación) y luego emitir parte de esa energía en forma de radiación electromagnética de longitud de onda diferente (emisión fluorescente). Luminiscencia es todo proceso de emisión de luz cuyo origen no está condicionado por un aumento de temperatura. 35 Quimioluminiscencia es el fenómeno por el que en algunas reacciones químicas la energía liberada se emite en forma de luz. Se produce cuando, en una reacción química, los electrones saltan de las capas más altas de los átomos a las más bajas. Bioluminiscencia es la quimioluminiscencia que se produce por organismos vivos o células. Se entiende por “proteína fluorescente” aquella proteína que tras ser excitada con una determinada longitud de onda, emite luz de una longitud de onda mayor. Se entiende por “proteína fluorescente roja” aquella proteína que 40 tras ser excitada en una determinada longitud de onda emite luz en la zona roja del espectro visible. Se entiende por “proteína luminiscente” aquella proteína que emite luz a consecuencia de una reacción química, que puede ser enzimática o no. Se entiende por “fotoproteína” aquella proteína luminiscente cuya luz emitida es proporcional a la cantidad de proteína, y no a la cantidad de sustrato de una reacción enzimática. Algunas fotoproteínas (como Aeq u obelina) inician la emisión de luz al unir el ión calcio. 45 El término “identidad”, tal y como se utiliza en esta descripción, hace referencia a la proporción de aminoácidos idénticos entre dos secuencias de aminoácidos que se comparan. El tanto por ciento de identidad existente entre dos secuencias de aminoácidos puede ser identificado fácilmente por un experto en la materia, por ejemplo, con la ayuda de un programa informático apropiado para comparar secuencias. El término "fragmento", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a una porción de la proteína SEQ 50 ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4 capaz de emitir fluorescencia. El término “polipéptido espaciador” o “linker”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una secuencia de aminoácidos corta, preferiblemente, de hasta 19 aminoácidos de longitud situada entre la secuencia de aminoácidos de la subunidad (a) y la secuencia de aminoácidos de la subunidad (b). Cuando la unión es directa, es decir, sin espaciador, entre las subunidades (a) y (b) de la proteína de fusión de la 55
4invención, el aminoácido del extremo carboxilo-terminal de la subunidad (a) forma un enlace peptídico con el aminoácido del extremo amino-terminal de la subunidad (b), tal y como se representa en el siguiente esquema: Nt-(a)-Ct ~ Nt-(b)-Ct donde (a) representa a la subunidad (a), (b) representa a la subunidad (b), Nt representa el extremo amino-terminal de la subunidad correspondiente, Ct representa el extremo carboxilo-terminal de la subunidad correspondiente, y ~ 5 representa un enlace peptídico entre las diferentes unidades de la proteína de fusión de la invención. Cuando la unión entre las subunidades (a) y (b) de la proteína de fusión de la invención se realiza mediante un polipéptido espaciador, el aminoácido del extremo carboxilo-terminal de la subunidad (a) forma un enlace peptídico con el aminoácido del extremo amino-terminal del polipéptido espaciador (p) y el aminoácido del extremo carboxilo-terminal del polipéptido espaciador forma un enlace con el aminoácido del extremo amino-terminal de la subunidad 10 (b), tal y como se representa en el siguiente esquema: Nt-(a)-Ct ~ Nt-(p)-Ct ~ Nt-(b)-Ct donde (a) representa a la subunidad (a), (b) representa a la subunidad (b), (p) representa el polipéptido espaciador, Nt representa el extremo amino-terminal de la subunidad o del polipéptido espaciador correspondiente, Ct representa el extremo carboxilo-terminal de la subunidad o del polipéptido espaciador correspondiente, y ~ 15 representa un enlace peptídico entre las diferentes unidades de la proteína de fusión de la invención. En una realización preferida, la proteína de fusión tiene un pico de emisión de 582 nm. En una realización preferida, la subunidad (a) es la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma y/o la subunidad (b) es la SEQ ID NO: 4 o un fragmento de la misma. En una realización más preferida, la subunidad (a) de la proteína de fusión de la presente invención es la SEQ ID 20 NO: 2. Más preferiblemente la donde la subunidad (b) es la SEQ ID NO: 4. En una realización más preferida, la subunidad (a) de la proteína de fusión de la presente invención consiste en al menos los aminoácidos consecutivos 1 al 465, ambos inclusive de la proteína SEQ ID NO: 2. En otra realización preferida la subunidad (a) de la proteína de fusión de la presente invención consiste en al menos los aminoácidos consecutivos 1 al 468, ambos inclusive de la proteína SEQ ID NO: 2. 25 En otra realización preferida, la subunidad (b) de la proteína de fusión de la presente invención consiste en al menos los aminoácidos consecutivos 7 al 189 ambos inclusive de la proteína SEQ ID NO: 4. En otra realización preferida, la subunidad (b) de la proteína de fusión de la presente invención consiste en al menos los aminoácidos consecutivos 5 al 189 ambos inclusive de la proteína SEQ ID NO: 4. En otra realización preferida la subunidad (b) de la proteína de fusión de la presente invención consiste en los aminoácidos consecutivos 1 al 189 ambos inclusive 30 de la proteína SEQ ID NO: 4. El polipéptido espaciador se puede seleccionar, sin limitar a la lista que comprende SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO:42 ya la secuencia serina-glicina (SG). La proteína de fusión de la presente invención se puede seleccionar, sin limitarse a la lista que comprende SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28 y SEQ ID NO: 26. 35 En otra realización preferida, la subunidad (b) está unida al extremo carboxilo-terminal de la subunidad (a) sin espaciador y más preferiblemente la proteína de fusión es SEQ ID NO: 22. En otra realización preferida de la proteína de fusión de la presente invención, la subunidad (b) el aminoácido tirosina de la posición 82 es sustituido por un aminoácido fenilalanina y/o el aminoácido glutamina de la posición 168 es sustituido por un aminoácido arginina y/o el aminoácido asparragina de la posición 26 es sustituido por un 40 aminoácido ácido aspártico. La proteína de fusión de la presente invención se puede unir al cofactor CLZ. La apoaequorina necesita unirse a este cofactor y al oxígeno molecular para poder emitir luz (Head JF et al. Nature 2000. 405:372-376; Toma S et al. Protein Science 2005. 14:409-416. En la presente invención cuando se habla del término “reconstitución” para la Aeq, se refiere a que la apoaequorina se une al cofactor CLZ. 45 Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende la proteína de fusión del primer aspecto de la invención en combinación con el cofactor CLZ de fórmula general (I):
5 donde: R1 es un grupo arilo, sustituido o sin sustituir y R2 se selecciona de entre un grupo arilo o un grupo cicloalquilo. El término “arilo” se refiere en la presente invención a una cadena carbocíclica aromática, que tiene de 6 a 12 átomos de carbono, pudiendo ser de anillo único ó múltiple, en este último caso con anillos separados y/o 5 condensados. Los grupos arilo son por ejemplo, pero sin limitarse a fenilo, naftilo, difenilo, indenilo, fenantrilo o antracilo. Los radicales arilo pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes. Preferiblemente R1 es un fenilo o naftilo, que puede estar o no sustituido, cuando está sustituido preferiblemente al menos por un grupo OH o halógeno, más preferiblemente el halógeno es F, más preferiblemente el grupo está en posición para. Preferiblemente R2 es un fenilo. 10 “Cicloalquilo" se refiere a un radical estable monocíclico o bicíclico de 3 a 10 miembros, que está saturado o parcialmente saturado, y que sólo consiste en átomos de carbono e hidrógeno, tal como ciclopentilo, ciclohexilo o adamantilo. Preferiblemente R2 es un ciclohexilo o ciclopentilo. El término “cofactor CLZ” puede referirse a los cofactores CLZ conocidos por el experto en la materia, como puede ser el caso de CLZ-nativo, CLZ-h, CLZ-f, CLZ-cp, CLZ-hcp o CLZ-n. 15 Otro aspecto de la presente invención se refiere a una secuencia nucleotídica que comprende la secuencia que codifica la proteína de fusión de la presente invención. La presente invención también se refiere a la construcción genética de RNA que comprende el RNA que se transcribe a partir de la secuencia de la invención. La secuencia nucleotídica puede estar comprendida en una construcción génica. Para generar construcciones génicas que comprendan la secuencia nucleotídica de la invención, se pueden utilizar las herramientas moleculares conocidas 20 por cualquier experto en la materia, entre ellas el clonaje y la utilización de enzimas de restricción. Esta construcción génica de la invención puede comprender el ácido nucleico de la invención, operativamente unido a, una secuencia reguladora de la expresión del ácido nucleico de la invención, constituyendo de este modo un cassette de expresión. “Unidos operativamente” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control “unida de forma operativa” al ácido 25 nucleico, está ligada al mismo de tal manera que se consigue la expresión de la secuencia codificadora del ácido nucleico. “Secuencia de control” se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que afectan la expresión de las secuencias a las que están ligadas. Dichas secuencias de control incluyen, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores, señales de iniciación, señales de terminación, intensificadores o silenciadores. Se pretende que el término “secuencias de 30 control” incluya, aquellos componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa. En una realización preferida, la construcción génica de la invención comprende el ácido nucleico de la invención unido operativamente a, al menos, una secuencia de control de la lista que comprende: a. un promotor, 35 b. una señal de inicio de la transcripción, c. una señal de terminación de la transcripción, d. una señal de poliadenilación, o
6e. un activador transcripcional. Como se usa aquí, el término “promotor” hace referencia a una región de ADN situada en posición 5’ con respecto al punto de inicio de la transcripción y que resulta necesaria o facilita dicha transcripción en una célula animal. Este término incluye, por ejemplo, pero sin limitarse, promotores constitutivos, promotores específicos de tipo celular o de tejido o promotores inducibles o reprimibles. 5 Las secuencias de control dependen del origen de la célula en la que se quiere expresar el ácido nucleico de la invención. En una realización particular, las secuencias de control de expresión unidas al ácido nucleico de la invención son funcionales en células y organismos procariotas, por ejemplo, pero sin limitarse, bacterias; mientras que en otra realización particular, dichas secuencias de control de expresión son funcionales en células y organismos eucariotas, por ejemplo, células de levadura o células animales. 10 El ácido nucleico de la invención o la construcción génica de la invención pueden ser introducidos al interior de una célula, denominada célula hospedadora, por ejemplo, pero sin limitarse, como ácido nucleico desnudo o mediante un vector. El término “vector de clonación”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una molécula de ADN en la que se puede integrar otro fragmento de ADN, sin que pierda la capacidad de autorreplicación. Ejemplos de 15 vectores de expresión son, pero sin limitarse, plásmidos, cósmidos, fagos de ADN o cromosomas artificiales de levadura. El término “vector de expresión”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un vector de clonaje adecuado para expresar un ácido nucleico que ha sido clonado en el mismo tras ser introducido en una célula, denominada célula hospedadora. Dicho ácido nucleico se encuentra, por lo general, unido operativamente a 20 secuencias de control. El término “célula hospedadora”, tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier organismo procariota o eucariota que es recipiente de un vector de expresión, de clonación o de cualquier otra molécula de ADN. En una realización preferida de la presente invención la secuencia nucleotídica se puede seleccionar de la lista que 25 comprende SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25. Otro aspecto de la presente invención se refiere a una célula que comprende una secuencia nucleotídica como las descritas anteriormente En adelante nos referiremos a éstas como a las “células de la invención”. La introducción de dichas construcciones génicas se puede realizar con los métodos conocidos en el estado de la técnica. La presente invención también se refiere a la célula que al comprender la proteína de la invención emite fluorescencia roja. 30 También se refiere esta invención, a la población celular que comprende la célula de la invención. Otro aspecto más de la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de la proteína de fusión de la presente invención que comprende cultivar la célula de la invención, descrita anteriormente, en condiciones que permiten la expresión de dichas proteínas, dicha expresión se produce en bacterias (por ejemplo en E. coli), levaduras, baculovirus, células de mamífero en cultivo o cualquier otro sistema de expresión de proteína 35 recombinante. Ejemplos no limitantes de células de mamífero son líneas celulares como HeLa o HEK, células musculares, astrocitos, neuronas, células epiteliales y endoteliales. En una realización preferida del procedimiento de la invención, además comprende aislar y/o purificar dichas proteínas obtenidas. Las técnicas de aislamiento o purificación que pueen utilizarse para las proteínas de la invención son las conocidas por el experto en la materia. Por este motivo, las proteínas de la invención pueden estar 40 unidas a secuencias de etiquetado (“tag sequences”), por ejemplo etiqueta de polihistidina. Otro aspecto de la presente invención, se refiere al uso de la proteína de fusión de la presente invención o de la composición que contiene dicha proteína, para la detección y/o cuantificación in vitro de la concentración de calcio en una célula, procariota o eucariota (por ejemplo, líneas celulares como HeLa o HEK), en un tejido o en un modelo animal. Preferiblemente el calcio que se detecta se localiza en el interior de una célula, por ejemplo pero sin limitarse 45 a la mitocondria, retículo endoplásmico o sarcoplásmico, núcleo, citoplasma, aparato de Golgi, vesículas secretoras, gránulos de secreción, o dominios subcelulares (como pueden ser subplasmalema o membrana plasmática, entre otras). En todos estos casos, se añaden secuencias de direccionamiento subcelular en el extremo amino (N) o carboxilo (C) terminal de las secuencias nucleotídicas que codifican para las proteínas de la invención. Un ejemplo de 50 direccionamiento subcelular es el direccionamiento a mitocondria por unión de una secuencia en el extremo amino-terminal. En la presente invención se muestran ejemplos, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 que se refieren a la secuencia nucleotídica y a la proteína respectivamente de mitoAD1 (AD1 con señal de localización mitocondrial) y SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 que se refieren a la secuencia nucleotídica y a la proteína respectivamente de mitoADNQ (ADNQ con señal de localización mitocondrial). 55
7Para la detección y/o cuantificación in vitro de la concentración de calcio, la proteína de fusión de la presente invención o la composición que la comprende se puede combinar con al menos una fotoproteína sensible a calcio, con emisión verde o azul. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para determinar la sensibilidad o afinidad de proteínas de fusión de la invención en una célula o tejido que comprende: 5 a. cultivar las células o el tejido; b. poner en contacto las células o el tejido con una proteína sensible al calcio; c. añadir a las células el cofactor CLZ, d. Estimular las células con un agonista de receptores de membrana para incrementar el calcio a un nivel fisiológico; 10 e. determinar la luminiscencia emitida por las células o tejido; f. estimular las células con un compuesto que sature las proteínas sensibles al calcio; g. determinar la luminiscencia emitida por las células o el tejido; h. Comparar el valor obtenido en el paso (e) con el valor obtenido en el paso (g), i. determinar la sensibilidad de la proteína sensible al calcio mediante la evaluación de la comparación del 15 paso (h). En adelante nos referiremos a éste como a “el método primero de la invención”. Ejemplos de agonistas de receptores de membrana podría ser un agonista muscarínico (como el carbacol) o histamina. Un ejemplo de compuesto que sature las proteínas sensibles al calcio podría ser la digitonina. La determinación de la luminiscencia se puede realizar mediante las técnicas conocidas por el experto en la materia, 20 como son utilización de unas cámaras contadoras de fotones, EM-CCD o un fotomultiplicador. Se entiende por nivel fisiológico de calcio el nivel alcanzado en el citoplasma tras el estímulo de una hormona o agonista de un receptor de membrana utilizado a concentraciones fisiológicas, que son aquellas halladas normalmente en el cuerpo. Se entiende por saturar proteínas sensibles al calcio la puesta en contacto de las mismas con concentraciones de 25 calcio capaces de liberar toda la luminiscencia, que es proporcional a la cantidad de esta proteína. Se utiliza un agente que permeabiliza la membrana celular, por ejemplo, digitonina, y pone en contacto el calcio extracelular con la proteína. La comparación en el paso (h) del método primero de la invención se puede realizar mediante la determinación de las cuentas emitidas (luminiscencia) y expresarlas como L/Lmax (cuentas dividido por la suma de las cuentas 30 totales). La comparación del valor L/Lmax con el agonista de receptores de membrana (como el carbacol) y la digitonina, permite estimar la sensibilidad del biosensor al calcio. La invención también se refiere a un método para el análisis óptico cuantitativo de la concentración intracelular de calcio (Ca2+). Este procedimiento se puede utilizar para determinar las propiedades farmacológicas de sustancias de prueba que actúen sobre receptores o enzimas implicados en la liberación de Ca2+ intracelular. Por ejemplo, el 35 ensayo es adecuado para encontrar ligandos (activadores o inhibidores) de receptores acoplados a proteínas G (GPCR), otros receptores de membrana acoplados a fosfolipasa C, moduladores de fosfolipasa C u otras enzimas implicadas en la liberación de Ca2+ intracelular, o receptores de inositol trifosfato o receptores de rianodina, que median la salida de Ca2+ de los depósitos intracelulares al citoplasma. El término “acoplado” significa una comunicación o interacción molecular entre el receptor y la proteína G, o entre ésta y una enzima como la 40 fosfolipasa C. Los receptores acoplados a proteínas C y enzimas forman parte de la transmisión de señales desde el exterior al interior de la célula. La presente invención también se refiere a un método de screening (cribado) de ligandos de receptores de membrana (en adelante el método segundo de la invención) que comprende: a. cultivar una célula o tejido que expresen un receptor de membrana acoplado a la liberación de Ca2+ intracelular; 45 b. poner en contacto una célula o tejido con la proteína de fusión del primer aspecto de la invención o con la secuencia nucleotídica que la comprende; c. añadir a las células el cofactor CLZ, d. estimular las células con una sustancia;
8e. estimular las células con un agonista conocido del receptor. f. determinar la emisión de la fotoproteína sensible al Ca2+ por las células o tejido; g. Cuantificar la luminiscencia emitida en respuesta a las sustancias de prueba, proporcional a la señal de Ca2+ intracelular. La presente invención también se refiere a un método de screening o cribado de moduladores de enzimas (en 5 adelante el método tercero de la invención) que comprende: a. cultivar una célula o tejido que expresen una enzima acoplada a la liberación de Ca2+ intracelular; b. poner en contacto una célula o tejido con la proteína de fusión del primer aspecto de la invención con la secuencia nucleotídica que la comprende; c. añadir a las células el cofactor CLZ, 10 d. estimular las células con una sustancia; e. Estimular las células o el tejido con un activador conocido de la enzima. f. determinar la emisión de la fotoproteína sensible al Ca2+ por las células o tejido; g. Cuantificar la luminiscencia emitida en respuesta a las sustancias de prueba, proporcional a la señal de Ca2+ intracelular. 15 Uso del método segundo y del método tercero de la invención para la identificación de un antagonista de un receptor o un inhibidor de un enzima acoplados a la liberación de Ca2+ intracelular. El uso del método segundo de la invención permite identificar este tipo de antagonista mediante la determinación de la disminución de la emisión de la fotoproteína sensible al Ca2+ por la presencia de la sustancia que se evalúa. El término “sustancia” se refiere a un compuesto del que se quiere determinar su actuación sobre receptores o 20 enzimas implicados en la liberación de Ca2+ intracelular. En los métodos segundo y tercero de la invención, la luminiscencia emitida por la sustancia es proporcional a la señal de Ca2+ intracelular. Preferiblemente, las células en el paso (a) tanto en el método segundo como en el tercero de la invención se sitúan en ausencia de luz. En el paso (f) la determinación de la emisión puede ser llevada a cabo por una cámara o fotomultiplicador apropiado según las técnicas conocidas por el experto en la materia. 25 En este método se miden las concentraciones intracelulares de Ca2+ con la ayuda de líneas celulares recombinantes que expresen una de las fotoproteínas sensibles al Ca2+ con emisión roja descritas anteriormente. Para establecer la línea celular, se transfecta la fotoproteína sensible al Ca2+ de forma transitoria o se selecciona la línea celular recombinante que exprese la fotoproteína. Además, estas líneas expresan de manera constitutiva un receptor o una enzima para los que se desea encontrar un activador o inhibidor farmacológico. Alternativamente, el receptor o 30 enzima se puede expresar en la línea celular mediante transfección. Los métodos segundo y tercero de la invención se pueden miniaturizar y automatizar para la selección de alto rendimiento (HTS) o ultra-alto rendimiento (uHTS) de activadores e inhibidores de estos receptores o enzimas. Dado que el acoplamiento entre receptor y el aumento de la señal de Ca2+ intracelular es rápido, el método proporciona una lectura óptica en segundos o minutos tras la adición de modulador de los citados receptores o enzimas. 35 Los compuestos de prueba son preferiblemente compuestos químicos que tienen un peso molecular generalmente de 100 a 1000. Estos compuestos incluyen péptidos, proteínas, sustancias naturales o sus extractos. Esta lista es sólo a modo de ejemplo. Un ejemplo de un receptor que puede usarse es el receptor muscarínico, que en ciertos tipos celulares causa aumentos del Ca2+ intracelular. En las figuras 3 y 9, en las que se utiliza el agonista muscarínico carbacol en células HEK (derivadas de riñón humano embrionario), se observa aumento de 40 luminiscencia causado por el incremento del Ca2+ intracelular. Otro receptor que señaliza a través de Ca2+ es el receptor de histamina tipo H2, como por ejemplo en las figuras 6 y 7 en células HeLa (derivadas de un cáncer cervical humano). Otro ejemplo es el receptor adrenérgico alfa-1 que, tras una activación, induce un aumento en la concentración intracelular de Ca2+. Estos receptores se denominan “receptores acoplados a proteínas G” (GPCR) y son proteínas integrales de membrana que transducen la acción de una hormona presente en el medio extracelular 45 al interior de la célula. Su acoplamiento a diversas proteínas G da como resultado liberación de Ca2+ de depósitos intracelulares, y un incremento en el Ca2+ citoplásmico y de algunos orgánulos celulares, como la mitocondria. Otro aspecto más de la presente invención ser refiere a un kit que comprende al menos una proteína de fusión descrita en la presente invención, una composición que contiene dicha proteína según se ha descrito anteriormente, o al menos una secuencia nucleotídica recombinante según se ha descrito anteriormente. 50
9Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso del kit descrito anteriormente, para la detección y/o cuantificación in vitro de niveles de calcio en una célula, en un tejido o en un modelo animal. Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleótidos. Los términos “péptido”, “oligopéptido”, “polipéptido” y “proteína” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren 5 a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. 10 Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIG. 1. Esquema de las diferentes configuraciones de enlace entre el extremo C terminal de tdTomato (residuos de aminoácidos en negrita a la izquierda) y el N terminal de apoaequorina (residuos en negrita a la derecha), a partir de 15 la fusión tdTA (secuencia de referencia). Los aminoácidos se designan por el código de una letra y las variantes se alinéan de acuerdo a su secuencia aminoacídica. El dipéptido central SG se conserva en la mayoría de las fusiones. Una línea horizontal sobre la secuencia de tdTA indica sitios mutagénicos importantes en la generación de las variantes (véase Materiales y Métodos). Dos variantes (a1 y b12) consisten en la inserción de secuencia adicional en el dipéptido SG de tdTA. 20 FIG. 2. Espectros de emisión bioluminiscente de cuatro sensores basados en Aeq representativos. Se obtuvo proteína híbrida a partir de lisados de células de mamífero en cultivo (ADiF) o a partir de cultivos de E. coli y purificación por columna de afinidad (CitA, tdTA, AD1). La Aeq se reconstituyó con CLZ-f. Los espectros se normalizaron de forma que la suma de los dos picos fuera igual a la unidad. En el cuadro se indica el valor del pico de emisión del dador (Aeq) y aceptor de BRET y la anchura a media altura (AMA, no aplicable a tdTA), todos ellos 25 expresados en nm. La línea discontinua vertical resalta la luz emitida por encima de 600 nm, importante para la detección de imágenes de calcio en animales. FIG. 3. Curso temporal de la bioluminiscencia en células HEK que expresan cada uno de los cinco sensores de Ca2+ indicados (experimentos representativos). La Aeq se reconstituyó con CLZ-f. Se inició la adquisición de imágenes (3s por imagen) y las células se estimularon con carbacol (50 μM). Al final de cada experimento se permeabilizó la 30 membrana celular con digitonina 30 μM para liberar las cuentas totales de Aeq. La intensidad de la emisión, convertida a L/Lmax, se representa en los ejes Y de la izquierda (la escala cambia según la variante), mientras que en los ejes Y de la derecha se muestra el porcentaje de Aeq restante en función del tiempo (la velocidad del consumo de Aeq). FIG. 4. Sensibilidad al Ca2+ de los diferentes sensores durante la respuesta fisiológica de células vivas. Células HEK 35 que expresaban cada proteína quimérica, e incubadas con CLZ-f, se expusieron a carbacol 50 μM y, al final de cada experimento, a digitonina 30 μM para obtener la luminiscencia total, como se indica en la Fig. 3. El valor de L/Lmax asignado a carbacol y digitonina en células individuales corresponde al pico de la primera respuesta de Ca2+ a estos estímulos y se muestra como su logaritmo decimal. El valor numérico a la derecha de los símbolos es el promedio de cada variante. Se muestran resultados de 3 a 6 experimentos en días diferentes para cada variante. 40 FIG. 5. Calibración de Ca2+ de las variantes CitA, tdTA y AD1 obtenida en proteína recombinante (expresada en E. coli) y purificada. Las muestras de proteína se incubaron con CLZ-nativa o CLZ-f para reconstituir la Aeq. Se muestra la relación entre la [Ca2+] obtenida mediante tampones de Ca2+ y L/Lmax (gráfico log-log). La intersección de la línea punteada vertical con el eje X corresponde a los valores promedio de L/Lmax obtenidos en la estimulación de células HEK con carbacol descrita en la Figura 4. 45 FIG. 6. Curso temporal de la bioluminiscencia en las mitocondrias (A, B), o citoplasma y núcleo (C, D) durante la estimulación de las células con histamina (experimentos representativos). Células HeLa que expresaban las variantes indicadas se preincubaron con CLZ-f para reconstituir la Aeq. Las imágenes de bioluminiscencia se registraron con una exposición de 2 segundos por cada imagen. Las células se estimularon primero con histamina 100 μMy más tarde con digitonina 30 μM, durante el tiempo indicado por barras horizontales debajo de “Histamina” 50 y “Digitonina”. No se utilizó ningún filtro de emisión. Se muestra la bioluminiscencia expresada como L/Lmax (eje Y izquierdo), junto con la correspondiente tasa de consumo de Aeq (eje derecho). Para cada sensor, se muestran imágenes de la fluorescencia (FL, tomadas justo antes de comenzar el experimento), y bioluminiscencia (BL, durante el pico de la respuesta de Ca2+). Las regiones de interés utilizadas para el análisis se indican por líneas discontinuas en la imagen de bioluminiscencia. La barra de la escala microscópica representa 30 m. 55 FIG. 7. Medición de Ca2+ citoplasmático y mitocondrial en las mismas células en experimentos de imagen en dos colores. Se muestran células HeLa que co-expresan GAQ (emisión fluorescente verde, expresión en citoplasma y
10núcleo, imagen superior izquierda) y mitoADNQ (emisión fluorescente roja, expresión en mitocondria, imagen superior derecha). Se reconstituyó la Aeq con CLZ-f. Las imágenes de bioluminiscencia se adquirieron con 2 s de exposición por canal, alternando los filtros de emisión de 535/52 nm (canal verde) y 570LP (canal rojo). Las células se expusieron a histamina 100 μM y más tarde a digitonina 30 μM para liberar las cuenta totales de Aeq. Se realizó una separación espectral de las señales antes de la conversión a L/Lmax. Se muestra la bioluminiscencia (L/Lmax, 5 eje Y izquierdo), junto con la correspondiente tasa de consumo de Aeq (eje Y derecho) para cada compartimento celular. Se muestran imágenes de bioluminiscencia durante el pico de la respuesta de Ca2+ de mitoADNQ (Mit, mitocondrias, imagen izquierda) y GAQ (Cyt, citoplasma/núcleo, imagen derecha) con las regiones de interés utilizadas para el análisis. La barra de la escala microcópica representa 20 μm. FIG. 8. Oscilaciones espontáneas de Ca2+ en células HEK individuales que expresan AD1 de forma transitoria. Las 10 células fueron preincubadas con CLZ-hcp durante 3 horas y el tiempo de integración fue de 4 s por cada imagen. En la parte inferior se muestra una imagen de fluorescencia (FL) seguida de tres imágenes de bioluminiscencia (BL) tomadas durante el nivel más alto de la señal de tres células representativas del campo microcópico (regiones de interés, ROI-1, 2 y 3). Los gráficos muestran el curso temporal de la intensidad de bioluminiscencia (en unidades relativas, RU) que corresponden a la actividad espontánea de Ca2+ de las células seleccionadas. La barra de la 15 escala microcópica representa 20 μm. ROI, región de interés. FIG. 9. Curso temporal de la bioluminiscencia en células HEK que expresan transitoriamente ADNQ, y preincubadas con CLZ-hcp (experimentos representativos). La adquisición de imágenes se realizó con 2 s (A) o 220 ms (B y C) de exposición por imagen. Las células se estimularon con carbacol (50 μM, A; o 10 μM, B y C), según se indica por barras horizontales. Al final de cada experimento se permeabilizó la membrana celular con digitonina 30 μM. No se 20 presenta todo el curso del tiempo para mayor claridad, se insertó una línea discontinua para indicar una interrupción. La intensidad de la emisión (L/Lmax) se representa en los ejes Y de la izquierda, mientras que en los ejes Y de la derecha se muestra el porcentaje de Aeq restante en función del tiempo. La barra de la escala microcópica en la imagen superior izquierda representa 20 μm. EJEMPLOS 25 MATERIALES Y MÉTODOS CONSTRUCCIÓN DE VARIANTES DERIVADAS DE tdTA CON ESPACIADORES DIFERENTES Y MUTAGÉNESIS PUNTUAL Las variantes con diferentes configuraciones de enlace entre tdTomato y apoaequorina se construyeron sobre la base de tdTA en el vector de expresión pcDNA3 (Invitrogen), desarrollado anteriormente (Bakayan A., et al. PLoS 30 One 2011; 6: e19520) (SEQ ID NO: 62: para la secuencia de nucleótidos de TdTA y SEQ ID NO: 63: para la secuencia de aminoácidos de TdTA). De N- a C-terminal, tdTA está formado por tdTomato, un péptido espaciador de 20 aminoácidos, y apoaequorina (Figura 1). Se introdujo un sitio único de restricción Kpn2I, que codifica para el dipéptido SG (notación de aminoácidos de una sola letra, subrayado en la Figura 1), entre el espaciador y apoaequorina. La extensión del espaciador entre tdTomato y apoaequorina, ya sea en tdTA o en ADiF, se llevó a 35 cabo mediante la inserción de un ADN de doble cadena en la secuencia del sitio de restricción Kpn2I. Los oligonucleótidos complementarios que codifican el espaciador se mezclaron en cantidades iguales y se incubaron a 65°C durante 10 minutos, la mezcla luego se dejó enfriar a temperatura ambiente. Dado que el espaciador contenía aminoácidos repetidos, se utilizaron diferentes codones para evitar la hibridación errónea. Los oligonucleótidos hibridados tenían extensiones solapantes como si hubieran sido tratados por Kpn2I (Tabla 1). Los plásmidos que 40 codifican tdTA o ADiF se trataron con Kpn2I y se ligaron con los oligonucleótidos hibridados respectivos (22aa-L, L-13aa y 6aa L-) para generar las variantes de espaciador largo b12, a1 y ADiFL. Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados para la construcción de variantes con enlazadores diferentes y para la inserción de mutaciones puntuales. La tabla se divide en sentido horizontal en tres secciones (líneas discontinuas). La primera detalla la composición de oligonucleótidos usados para construir las diferentes variantes de péptido enlazador. En la 45 sección siguiente se enumeran los oligonucleótidos mutagénicos utilizados para convertir los aminoácidos en la región de unión de tdTA por SG, o por un solo aminoácido D o L. Algunos cambios de aminoácidos requirieron dos rondas de mutagénesis; se indica primera o segunda ronda. La última sección muestra los oligonucleótidos mutagénicos utilizados para insertar mutaciones puntuales en apoaequorina o para eliminar un sitio de restricción HindIII, como paso intermedio en la clonación de las variantes de expresión mitocondrial. Todos los oligonucleótidos 50 mutagénicos llevan un grupo fosfato (P) en su extremo 5 'como modificación post-síntesis. La secuencia de ADN se detalla siempre en orientación 5´->3´. Corresponden a las SEQ ID 43 a SEQ ID: 61.
11 Nombre y descripción Secuencia de ADN de oligonucleótidos 22aa-L-1, oligonucleótido sentido de un enlazador de 22 aminoacidos para generar el clon b12 5’-CCGGGGTGGCAGTGGAAGTGGTCAAAGTGGTTCCGGTAGTGGAGGCCAGAGTGGTAGTGGAAGTGGCCAATCC 22aa-L-2, oligonucleótido anti-sentido de un enlazador de 22 aminoacidos para generar el clon b12 5’- CCGGGGATTGGCCACTTCCACTACCACTCTGGCCTCCACTACCGGAACCACTTTGACCACTTCCACTGCCAC 13aa-L-1, oligonucleótido sentido de un enlazador de 13 aminoacidos para construir el clon a1 5’- CCGGGGTAGTGGAGGCCAGAGTGGTAGTGGAAGTGGCCAATCC 13aa-L-2, oligonucleótido anti-sentido de un enlazador de 13 aminoacidos para construir el clon a1 5’- CCGGGGATTGGCCACTTCCACTACCACTCTGGCCTCCACTACC 6aa-L-1, oligonucleótido sentido de un enlazador de 6 aminoacidos para generar el clon ADiFL 5’- CCGGCGGCAGCGGTAGCT 6aa-L-2, oligonucleótido anti-sentido de un enlazador de 6 aminoacidos para generar el clon ADiFL 5’- CCGGAGCTACCGCTGCCG YG-SG, oligonucleótido mutagénico sentido y fosforilado para generar clones A3, AW, AE, AD1, Alfa (P)5’- CTGTTCCTGTCCGGAATGGACGAGCTGTAC LF-SG-1, oligonucleótido mutagénico en sentido y fosforilado para construir clones B2 y BW (1ª ronda de mutagénesis) (P)5’- CCGCCACCACTTGGGCCTGTACGGCATGGACG LF-SG-2, oligonucleótido mutagénico sentido y fosforilado para construir clones B2 y BW (2ª ronda de mutagénesis) (P)5’- CCGCCACCACTCCGGACTGTACGGCATGGACG DN-SG-1, oligonucleótido mutagénico sentido y fosforilado para generar clones A3 y B2 (1ª ronda de mutagénesis) (P)5’- CTTACATCAGACTTCGCCAGACCAAGATGGATTGGACG DN-SG-2, oligonucleótido mutagénico sentido y fosforilado para generar clones A3 y B2 (2ª ronda de mutagénesis) (P)5’- TACATCAGACTTCTCCGGACCAAGATGGATTGGAC SD-SG, oligonucleótido mutagénico sentido y fosforilado para construir el clon AD1 (P)5’- GATCTGTCAAACTTACATCCGGATTCGACAACCCAAGATG
12SV-SG, oligonucleótido mutagénico sentido y fosforilado para construir el clon AE (P)5’- CAGTCCGGACTCAGATCCGGAAAACTTACATCAGACTTCG G-D, oligonucleótido mutagénico sentido y fosforilado para construir el clon Alfa (P)5’- CCACCTGTTCCTGTCCGACTTCGACAACCCAAGATGG F224L, oligonucleótido mutagénico sentido y fosforilado para generar el clon Alfa (P)5’- GAGGGCCGCCACCACCTGCTGCTGTCCGGATTCGACAAC N26D, oligonucleótido mutagénico sentido y fosforilado para generar el clon ADN y ADNQ (P)5’- GTTCAATTTCCTTGATGTCGACCACAATGGAAAAATCTCTCTTGACG Y82F, oligonucleótido mutagénico sentido y fosforilado para generar el clon ADiF y ADiFL (P)5'- GTGGAAACTGATTGGCCTGCATTTATTGAAGGATGGAAAAAATTG Q168R, oligonucleótido mutagénico sentido y fosforilado para generar el clon ADQ y ADNQ (P)5’- GATGTTGATGAGATGACAAGACGACATCTGGGATTTTGGTACACC HIII-out, oligonucleótido mutagénico sentido y fosforilado para la eliminación del 1er sitio HindIII en mitotdTA (P)5’- CTATAGGGAGACCCAAGCTAGGTACCGAGCTCG Las variantes de espaciador corto derivadas de tdTA (A3, B2, AW, BW, AE y AD1) se obtuvieron por mutagénesis dirigida, mediante la conversión de los pares de aminoácidos deseados (marcados por una línea encima de la secuencia de tdTA en la Figura 1) a un dipéptido SG flexible. Los codones que codifican SG contienen el sitio de restricción Kpn2I. Una vez se introdujeron estos dos codones en la secuencia de tdTomato y apoaequorina, se 5 hicieron los diferentes clones por digestión enzimática de los plásmidos con Kpn2I, eliminación de los fragmentos pequeños por la purificación del ADN plasmídico, y religación. Esto permitió la generación de clones en los cuales el extremo C-terminal de tdTomato se redujo hasta el residuo H465 o L468 de tdTomato, y clones cuya apoaequorina N-terminal se inició con el aminoácido K2, F7 o P10 (Figura 1). La construcción del vector de expresión bacteriano para CitA, tdTA y AD1 se logró mediante digestión doble (HindIII y XhoI) de sus genes correspondientes en pcDNA3 10 y subclonación en el plásmido pTriEx-4 (Novagen). El dipéptido espaciador SG de la variante AD1 se cambió a SD (residuos 5 y 6 de apoaequorina) por mutagénesis dirigida utilizando el oligonucleótido GD para formar la variante llamada Alfa. A su vez, se utilizó el oligonucleótido F224L para convertir la Phe 467 de tdTomato de AD1 en Leu, para generar la variante Beta (Figura 1). Las mutaciones puntuales N26D, Y82F y Q168R de apoaequorina [6,7,24] se introdujeron en la variante AD1 (Q168R en 15 GA para la variante GAQ) con el mismo método. Todos los oligonucleótidos (Tabla 4) se sintetizaron por Fisher Scientific. La construcción de mitoADNQ y mitoAD1 se derivó de mito-tdTA (donado amablemente por la Dra. María Teresa Alonso, IBGM, Valladolid). El péptido señal mitocondrial en mito-tdTA está flanqueado con dos sitios de restricción HindIII. Se eliminó el primero de ellos por mutagénesis dirigida utilizando el oligonucleótido HIII-out (Tabla 4). El clon 20 mutado fue digerido con HindIII/XhoI para liberar tdTA. ADNQ y AD1 fueron igualmente cortadas y se insertaron en lugar de tdTA para generar mitoADNQ y mitoAD1, respectivamente. Las enzimas de restricción utilizadas (Kpn2I, HindIII y XhoI) y la T4 ADN ligasa fueron de Fermentas y el kit de mutagénesis de sitios múltiples fue de Stratagene. La digestión con enzimas de restricción, ligación y mutagénesis de ADN fueron todos de acuerdo con los protocolos del fabricante. Todos los clones fueron verificados por secuenciación del ADN (Macrogen). 25 CULTIVO CÉLULAR, TRANSFECCIÓN Y RECONSTITUCIÓN DE AEQ Las células HEK-293 se cultivaron en medio mínimo esencial (MEM)-alfa (Lonza), complementado con 4 mM L-glutamina (Lonza). Las células HeLa se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Lonza) suplementado con 2 mM L-glutamina. Ambos medios fueron suplementados con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (Lonza). Las células se mantuvieron en una atmósfera humidificada, a 37°C y 30
13CO2 al 5%. Ambas líneas celulares se sembraron a una densidad de 6 x 105 células/cm2, y se transfectaron el día después de la siembra con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Antes de cada experimento, las células que expresan la construcción deseada se lavaron dos veces con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y la Aeq se reconstituyó con 3 µM de CLZ-nativa, CLZ-f, o CLZ-hcp (todas de Biotium), o con CLZ-h (Invitrogen). La incubación de células con CLZ se hizo en medio OptiMEM I (Gibco) 5 suplementado con FBS al 1% durante 2-3 horas a 37°C y CO2 al 5%, en la oscuridad. Para los experimentos de imagen de bioluminiscencia mitocondrial y de doble color, la Aeq se reconstituyó con 6 µM CLZ-f durante 3 horas a temperatura ambiente para minimizar el consumo de la Aeq mitocondrial durante la reconstitución. PREPARACIÓN DE LISADOS CELULARES PARA LA EVALUACIÓN ESPECTRAL DE LAS QUIMERAS Y WESTERN BLOT 10 Un día después de la transfección, las células HeLa (2-3 x 106 células) que expresan transitoriamente las diferentes quimeras se colocaron en hielo, se enjuagaron dos veces con un medio salino tamponado con fosfato (PBS) y se recogieron con un raspador de células. En las preparaciones destinadas a medidas espectrales, las células se centrifugaron a 500xg durante 5 minutos y luego se resuspendieron en un tampón de reconstitución frío (PBS con 10 mM de ditiotreitol (DTT), 5 mM de ácido etilenglicol tetraacético (EGTA) y 5 µM de CLZ-f). Las células suspendidas 15 se incubaron durante 3 horas a 4°C en la oscuridad para reconstituir la Aeq. Posteriormente, las células se lavaron una vez con PBS y se lisaron con un tampón hipoosmótico que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EGTA, 5 mM DTT, y un cóctel de inhibidores de proteasa (complete-Mini, libre de EDTA, Roche). Las membranas de las células se rompieron por dos ciclos de congelación-descongelación, seguido por paso a través de una aguja de calibre 25 (cuatro veces). Las muestras de lisado obtenidas se centrifugaron a 13,000xg durante 1 minuto. El 20 sobrenadante que contiene la Aeq activa se recuperó y se almacenó a -20°C para su uso posterior en la caracterización espectroscópica. WESTERN BLOT Las células HeLa transfectadas destinadas a Western blot se lisaron y se procesaron como se ha indicado anteriormente, pero sin la etapa de la reconstitución de Aeq. El contenido de proteína en el sobrenadante se estimó 25 por un ensayo de proteína BCA (Pierce Thermo Scientific). Las proteínas en la muestra (40 µg) se separaron por electroforesis en un gel de poliacrilamida de dodecilsulfato sodico (10%). Las bandas de proteínas se transfirieron a una membrana Hybond-P (Amersham Biosciences). Después de bloquear con BSA al 3%, las membranas se incubaron durante la noche a 4°C, ya sea con el anti-GFP de ratón (1:2000) (Covance) o anti-DsRed de ratón (1:500) (BD Pharmingen). Las membranas se lavaron y se incubaron con una inmunoglobulina-G de oveja anti-ratón, 30 conjugada a la peroxidasa de rábano (1:1000) (Santa Cruz) a temperatura ambiente durante 45 minutos. Se utilizó como sustrato de la peroxidasa la solución de quimioluminiscencia SuperSignal West Dura (Thermo Scientific Pierce) y la detección se llevó a cabo con el equipo FUJIFILM LAS-3000. Los experimentos se realizaron por lo menos dos veces para cada muestra. El estándar de peso molecular fue de BioRad (Precision Plus Protein Standard Dual Color). 35 EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN E. COLI Y PURIFICACIÓN La expresión de proteína recombinante etiquetada por poly-His (tdTA, AD1 y CitA) en E. coli se llevó a cabo utilizando el plásmido pTriEx-4 (Novagen). Sólo fueron introducidas pequeñas modificaciones en el protocolo detallado en Bakayan A., et al. PLoS One 2011; 6: e19520. Después de la sonicación, la eficiencia de extracción de proteínas se incrementó mediante el uso de cinco ciclos de congelación-descongelación. Los lisados celulares se 40 centrifugaron para eliminar los desechos celulares. Las proteínas etiquetadas por poly-His en el sobrenadante se purificaron en una columna de acuerdo con el protocolo del fabricante (Resina de Ni-NTA HisBind; Novagen). El intercambió del tampón fue mediante el uso de filtros de corte de peso molecular de 30 kDa (CitA) o 50 kDa (tdTA y AD1) (AmiconUltra MWCO 30K o 50K, Millipore). Un ml de la muestra de proteína purificada se concentró en 50 µl de volumen y se resuspendió en 1 ml del tampón deseado; este paso se repitió 3 a 4 veces. La cuantificación de 45 proteínas en las muestras purificadas se realizó en un espectrofotómetro Nanodrop midiendo la absorbancia a 280 nm, o a la longitud de onda correspondiente al pico del coeficiente de extinción de la FP en la quimera (516 nm para CitA, y 554 nm para tdTA y AD1). Las muestras puras se almacenaron a 4°C. Electroforesis en gel nativo La integridad de las proteínas purificadas se ensayó en un gel de poliacrilamida (6%) no desnaturalizante. El gel 50 nativo fue primero visualizado por fluorescencia. Las bandas que contienen Citrina se revelaron mediante la exposición del gel a 490 nm de luz monocromática, mientras que tdTomato fue excitado a 540 nm. Se colocaron filtros de emisión (de color amarillo para CitA; rojo para el tdTA y AD1) delante del objetivo de una cámara digital (Sony, DSC-S500). A continuación, el gel fue teñido con Coomassie para revelar todas las bandas de proteína (FUJIFILM LAS-3000). 55
14EVALUACIÓN DE LAS VARIANTES DE FUSIÓN IN VITRO Se intercambió el tampón de las muestras purificadas que contienen apoaequorina a 50 mM Tris-HCl y NaCl 150 mM (pH 7,5). La Aeq se reconstituyó in vitro mediante la adición de 5 μM CLZ-f o CLZ-nativa, DTT 10 mM y EGTA 5 mM, y se incubaron durante la noche a 4 ° C, en la oscuridad. Espectros de transferencia de energía resonante 5 Las medidas espectrales de las variantes de tdTA se realizaron en el laboratorio del Dr. Philippe Brûlet (CNRS, Gif-sur-Yvette, Francia). Una alícuota de cada variante de proteína recombinante purificada o lisado celular se pone en contacto con una solución de Ca2+ saturante (50 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7,5) en un tubo de PCR claro para inducir la emisión total de luz. Los fotones emitidos fueron recogidos por una fibra óptica hasta un espectrómetro (SPECIM) y capturados por una cámara EM-CCD (Andor Technologies). La calibración espectral se hizo con 10 punteros láser de 405 y 650 nm. Esta configuración permite el análisis espectral inmediato y sincrónico de la luminiscencia emitida a todas las longitudes de onda (sin barrido). Curvas de sensibilidad al Ca2+ Las muestras purificadas, reconstituidas con CLZ-f o CLZ-nativa, se lavaron y se intercambió el tampón a otro con cero Ca2+ (10 mM MOPS, 100 mM KCl, 10 mM K2EGTA, pH 7,2), asegurando una mínima contaminación con Ca2+. 15 En este punto las muestras pueden ser almacenadas a 4°C en la oscuridad. Justo antes del experimento, la concentración de K2EGTA en las muestras de proteína se diluyó a 1 mM en una solución de 10 mM MOPS (pH 7,2), 100 mM KCl. Una alícuota de 10 μl de muestra de proteína (rango de concentración de 30 a 50 ng/μl) se colocó en un tubo de luminómetro (Sirius, Berthold Detection Systems) y se mezcló con 400 μl de una solución que contiene la concentración deseada de Ca2+ libre. Las soluciones tamponadas con EGTA de mayor o menor concentración de 20 Ca2+ libre fueron de Molecular Probes, Invitrogen. Esta concentración se calculó considerando el EGTA presente en la muestra de proteína, la Kd de CaEGTA, el pH y la temperatura. La emisión de luminiscencia se midió durante 20 s (ruido basal) antes de la inyección de la solución con Ca2+ libre conocido. Se continuó la adquisición hasta que se obtuvo una señal estable o con decaimiento. En este punto, se inyectó un volumen de 500 μl de una solución saturante de Ca2+ (MOPS 10 mM, 50 mM CaCl2, pH 7,2) y la integración de la luz continuó hasta que se había 25 consumido toda la Aeq y la intensidad de la luz alcanzó el nivel basal. La intensidad de luminiscencia (L) a diferentes [Ca2+] se tomó como el valor de pico de la respuesta en el caso de la señal con decaimiento, o como el valor estable, en caso de emisión estable. El máximo de luminiscencia (Lmax) se midió mediante la integración de todas las cuentas restantes desde ese momento (valor L) hasta el final del experimento. Los valores de Kd se extrajeron a partir de una relación de ajuste dosis-respuesta sigmoidal (de pendiente variable) utilizando el software GraphPad 30 Prism4. Capacidad luminiscente in vitro Se intercambió el tampón de las muestras purificadas y reconstituidas (ClZ-f) a 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl y 5 mM EGTA (pH 7,5), para eliminar el DTT y especialmente cualquier resto de CLZ. Las alícuotas de las muestras de proteína pura (CitA, tdTA, y AD1) con igual cantidad de proteína (40 ng) se mezclaron con 500 μl de una solución 35 saturante de Ca2+ (50 mM Tris-HCl, 50 mM CaCl2, pH 7,5). La capacidad luminiscente de la variante de FP-Aeq se midió mediante la integración de toda la luz emitida durante el experimento con un luminómetro (Sirius, Berthold Detection Systems). Obtención de imágenes de microscopía La preparación de los cultivos de células y la instalación de microscopía utilizados en este estudio se presentaron en 40 detalle en nuestro trabajo anterior (Bakayan A., et al. PLoS One 2011; 6: e19520). En resumen, las imágenes de fluorescencia de células HEK o HeLa que expresan las variantes de Aeq fusionadas con GFP o tdTomato fueron tomadas usando dos canales, verde y rojo. Las imágenes de fluorescencia de las células cargadas con el indicador sintético de Ca2+ Fluo3 (Molecular Probes) se realizaron con una excitación a 500 nm y el cubo de filtros Brightline Filtercube HC-YFP (Semrock). Éste está compuesto de los filtros HC500/24 nm (excitación), dicroico de 520 nm, y 45 HC542/27 nm (emisión) (longitud de onda central/ancho de banda). La adquisición de imágenes y la velocidad de fotogramas se especifican en los resultados. Las células se montan en una cámara de microscopía y se superfunden con soluciones de carbacol (Sigma), histamina (Sigma) y digitonina (Sigma) en HBSS, como se indica en las figuras. Las imágenes de bioluminiscencia se tomaron en la oscuridad. La emisión de luz de las células fue recogida por un objetivo, pasó a través de filtros de emisión definidos (o sin filtro, según se indique) previamente montados en una 50 rueda de filtros, y fue capturada por una cámara EM-CCD (Hamamatsu) (Bakayan A., et al. PLoS One 2011; 6: e19520).
15Imagen en dos canales de emisión El registro de imágenes de bioluminiscencia de doble color del Ca2+ citoplásmico y mitocondrial se realizó de forma secuencial mediante el uso de dos canales de emisión, verde (filtro de paso de banda de 535/52 nm) y rojo (filtro 570LP), colocados entre un objetivo de inmersión en aceite 63x y la cámara EM-CCD. Las señales de bioluminiscencia se adquirieron durante 2 s por canal, con un intervalo de tiempo total de 4,1 s por fotograma (para 5 los dos canales). La cámara se fijó en el modo de imagen de fotón-2, máxima ganancia y binning 4x4 (128x128 píxeles por campo microscópico). Se realizó una corrección de la emisión espectral de GAQ y mitoADNQ a los canales no deseados (rojo y verde, respectivamente) con Microsoft Excel, utilizando el porcentaje de la contribución de cada una de estas variantes (expresada aisladamente) a estos canales. CARACTERIZACIÓN DE LAS VARIANTES DE FUSIÓN EN CÉLULAS VIVAS INDIVIDUALES 10 Medición de la transferencia de energía utilizando el método de cuatro canales La evaluación de la transferencia de energía de las diferentes variantes se llevó a cabo en células HeLa (o células HEK donde se indica) individuales, utilizando el método de cuatro canales. Una descripción detallada de este enfoque, junto con su validación cuantitativa, fue presentada previamente en (Bakayan A., et al. PLoS One 2011; 6: e19520). En resumen, las señales de la bioluminiscencia fueron registradas, de forma secuencial, a través de cuatro 15 filtros de paso de banda en una rueda de filtros: 481/34, 535/52, 595/40 y 640/50 nm (longitud de onda central/ancho de banda). Se cuantificó el porcentaje de la contribución de la luz emitida de cada variante a través de estos canales en células individuales. Todos los recuentos fueron corregidos por la señal ruido basal, normalizados por el ancho de banda y transmitancia de cada filtro, y por la sensibilidad espectral de la cámara EM-CCD. Evaluación de la sensibilidad de las variantes a Ca2+ en células individuales 20 Células HEK que expresan transitoriamente diferentes variantes de FP-Aeq (24 horas después de la transfección) se incubaron con CLZ-nativa,-f o - hcp para la reconstitución de la Aeq, como se describió anteriormente. Posteriormente, las células se lavaron dos veces y se mantuvieron en HBSS para la captura de imágenes. Se perfundió una solución de carbacol (50 μM) como se indica en Figura 3. Al final de cada experimento, se calculó Lmax al permeabilizar las células con digitonina 30 μM para permitir la entrada de Ca2+ extracelular y, por lo tanto, la 25 obtención de la emisión de luz de la Aeq restante. La estimulación de las células HEK con carbacol eleva los niveles de Ca2+ citoplásmico a un valor relativamente reproducible (0,9-1 μM), en particular en el primer pico de Ca2+. La comparación del valor de L/Lmax en este pico y después de la saturación de la sonda (perfusión de digitonina) proporciona una estimación de la su sensibilidad al Ca2+ en células vivas. RESULTADOS 30 Generación de nuevas variantes derivadas de tdTA con emisión roja El péptido de 20 residuos fue sustituido por el dipéptido SG (en las variantes A3, B2, AW, BW, AE, AD1) o fue eliminado por completo (variante Alfa) (FIG. 1). En cambio, las variantes B12 y A1 fueron construidas con inserciones de 22 y 13 residuos de aminoácidos, respectivamente. La variante ADiFL tiene un enlazador 6 aminoácidos más largo que AD1 y se describirá más adelante. La secuencia YGMDELYK en el extremo de 35 tdTomato, que se añadió originalmente para mejorar la estabilidad y facilitar la clonación de fusiones C terminales (Shaner N. C., et al. NatBiotechnol 2004; 22: 1567-1572), fue eliminada (Figura 1). Las variantes B2 y BW son como A3 y AW, respectivamente, pero carecen del tripéptido LFL en el extremo C terminal de tdTomato. Hay que señalar que la FP roja tdTomato tiene dos copias de Tomato enlazadas para que sea un dímero en tándem. Los cambios descritos se realizaron sólo en la secuencia del segundo Tomato. También se ensayaron deleciones en el extremo N 40 de la secuencia de apoaequorina (código P02592). Las combinaciones de las deleciones descritas se muestran en la Figura 1, las cuales fueron comprobadas mediante su secuencia de ADN y posteriormente caracterizadas. Las construcciones de la Figura 1 en un vector de expresión de mamíferos se expresaron en células HeLa para examinar la viabilidad celular y la fluorescencia roja de la fracción tdTomato por microscopía. El clon de partida tdTA (SEQ ID NO: 63) y las variantes b12(SEQ ID NO:6 ), a1 (SEQ ID NO: 8), A3(SEQ ID NO: 10), B2(SEQ ID NO: 12), 45 AW(SEQ ID NO: 14), BW(SEQ ID NO:16 ), AE(SEQ ID NO: 18, AD1(SEQ ID NO: 20), Alfa(SEQ ID NO: 22), Beta(SEQ ID NO: 24) y ADiFL(SEQ ID NO: 26) mostraron tinción citoplásmica difusa en células vivas transfectadas con los plásmidos de expresión. Por otra parte, se observaron agregados fluorescentes con las variantes B2 y AE. Esta última mostró baja tasa de supervivencia de las células que la expresan, lo que es una señal de su citotoxicidad. En cuanto a la bioluminiscencia, todas las variantes, excepto A3 y B2, emitieron luz cuando se añadió 50 digitonina a las células para elevar los niveles de Ca2+ citoplasmáticos. La eliminación del tripéptido FDN en el extremo N-terminal de apoaequorina (en las variantes A3 y B2) fue perjudicial y abolió por completo la bioluminiscencia. Así, al menos en el contexto de estas fusiones con tdTomato, el tripéptido FDN (o parte de éste) es esencial para la luminiscencia de Aeq. La integridad de la proteína quimérica AD1 fue verificada por Western blot de extractos citosólicos de células HeLa 55 transfectadas con la misma. Se observó una banda inmunorreactiva única de la masa molecular esperada frente a anticuerpos anti-DsRed (la proteína precursora de tdTomato).
16Efecto del enlace entre tdTA y apoaequorina sobre la transferencia de energía Se caracterizaron las variantes descritas en la Figura 1 por la eficiencia BRET. Las células HeLa fueron transfectadas con las quimeras y se incubaron con CLZ-f para la reconstitución de Aeq. La incubación con el cofactor CLZ es esencial para la formación de Aeq capaz de emitir fotones en respuesta a la unión del Ca2+. Esta CLZ ofrece una buena combinación, al presentar emisión ligeramente desplazada hacia el rojo, y una intensidad 5 relativa y tiempo de regeneración moderados. La bioluminiscencia se inició en las células mediante la adición de digitonina, que hace permeable la membrana celular al Ca2+ extracelular, y se alternaron filtros de emisión centrados en 481, 535, 595 y 640 nm de forma secuencial cada 2 s. Anteriormente hemos demostrado que este enfoque de cuatro filtros permite la caracterización espectral de las proteínas quiméricas en células vivas de mamífero (Bakayan A., et al. PLoS One 2011; 6: e19520). 10 La Tabla 2 muestra el porcentaje de la luz emitida que pasa a través de estos filtros. Se incluyen en la Tabla 2 la Aeq, y las fusiones previamente caracterizadas, GA (fusión GFP-Aeq) y tdTA (Bakayan A., et al. PLoS One 2011; 6: e19520) para poder compararlas con las variantes nuevas objeto de esta invención. Mientras que Aeq emite más luz en el filtro de 481 nm, GA presentó un pico de emisión a 535 nm, lo que indica BRET muy fuerte entre Aeq y GFP. El punto de partida de todas las variantes, tdTA, muestra dos picos, uno a 481 nm (luz emitida directamente por Aeq) y 15 otro a 595 nm (por transferencia de energía a tdTomato). De la luminiscencia total de tdTA a través de estos cuatro filtros, el 58% correspondió a los de 481 y 535 nm (filtros azul y verde, B+G) y el 42% a 595 y 640 nm (filtros naranja y rojo, O+R) (véase las dos columnas de la derecha de la Tabla 2). Los espectros completos de CitA y tdTA también se obtuvieron en muestras de proteína purificada (FIG. 2). La variante AW, que consiste en la eliminación del péptido YGMDELYK en el extremo C terminal de tdTomato más 20 la sustitución del enlazador presente en tdTA por el dipéptido SG (Figura 1), dio lugar a una transferencia de energía mayor que tdTA (51% del recuento en B+G y 49% en O+R). Sin embargo, un mayor acortamiento de la secuencia de tdTomato fue perjudicial para BRET, ya que la variante BW, con la deleción añadida del tripéptido LFL, mostró sólo el 26% del recuento en los canales O+R. Manteniendo constante la supresión presente en la variante AW, se examinó el efecto de acortar el extremo N de apoaequorina por cuatro (variante AE) o nueve residuos (variante 25 AD1). En AE, no se observó ningún cambio espectral en comparación con AW. Por el contrario, AD1 dio lugar a un marcado desplazamiento hacia el rojo: el 23% de la luz pasó a través de los filtros B+G y el 77% se recogió en los filtros O+R. Un espectro completo de AD1 se obtuvo también en proteína recombinante (Figura 2). Tabla 2: Caracterización de BRET en las diferentes variantes, según la distribución de la bioluminiscencia en cuatro filtros de emisión. El perfil de emisión de Aeq, GA, y tdTA se representa junto a ocho variantes del péptido de enlace 30 (Figura 1). Se determinó el porcentaje de cuentas en cuatro canales para cada variante expresada en células HeLa individuales durante la respuesta de Ca2+ tras su permeabilización con digitonina. Los filtros de emisión fueron: 481/34, 535/52, 595/40 y 640/50 nm (longitud de onda central/ancho de banda) (véase Bakayan A., et al. PLoS One 2011; 6: e19520). Las cuentas en cada canal se normalizaron por el ancho de banda del filtro, por su transmitancia, y por la sensibilidad de la cámara EM-CCD y se dividieron por la suma de las cuentas en los cuatro canales. Se 35 muestra el promedio de 8 a 38 células ± la desviación standard. Las dos columnas de la derecha muestran la suma del % de emisión en los canales 481 y 535 nm (B+G), y 595 y 640 nm (O+R).
17 Contribución de la señal de bioluminiscencia (% del total) en cada filtro de emisión Par de BRET 481 nm (B) 535 nm (G) 595 nm (O) 640 nm (R) B+G O+R Aeq 60.2 ± 2.1 29.2 ± 1.3 7.2 ± 1.9 3.4 ± 1.0 89.4 10.6 GA 16.2 ± 4.1 72.3 ± 2.5 9.4 ± 4.0 2.1 ± 1.1 88.5 11.5 tdTA 38.1 ± 2.5 20.0 ± 2.1 28.6 ± 2.6 13.3 ± 1.5 58.1 41.9 b12 44.6 ± 4.1 22.4 ± 2.2 22.3 ± 3.6 10.7 ± 2.7 67.0 33.0 a1 41.3 ± 5.1 21.1 ± 3.6 25.7 ± 4.0 11.9 ± 3.0 62.4 37.6 AW 33.0 ± 3.2 18.3 ± 1.6 32.3 ± 2.9 16.4 ± 1.6 51.3 48.7 BW 48.6 ± 3.5 25.8 ± 1.7 17.4 ± 3.0 8.2 ± 1.5 74.4 25.6 AE 33.3 ± 2.2 19.0 ± 1.6 32.2 ± 1.4 15.5 ± 1.9 52.3 47.7 Alfa 26.0 ± 2.6 9.0 ± 1.2 45.7 ± 2.1 19.3 ± 1.8 35.0 65.0 Beta 13.8 ± 3.6 11.7 ± 1.7 50.0 ± 1.0 24.5 ± 3.6 25.5 74.5 AD1 12.6 ± 2.4 10.0 ± 1.6 50.8 ± 3.2 26.6 ± 1.3 22.6 77.4 B, azul; G, verde; O, naranja; y R, rojo. Se construyeron también otras quimeras: la variante denominada Alfa se llevó a cabo para convertir el dipéptido conector SG de la variante AD1 en la secuencia SD presente en el N-terminal de apoaequorina, mientras que en la variante Beta se convierte la secuencia LFL del extremo C terminal de Tomato en LLL. Ambas variantes, que son 5 exactamente de la misma longitud que AD1, resultaron en un alto porcentaje de BRET y un desplazamiento hacia el rojo, en comparación con tdTA, pero no fue mejor que en AD1. Hemos probado también a aumentar la longitud del péptido conector presente en tdTA (variantes a1 y b12, Figura 1). En ambos casos, hubo una cierta pérdida de BRET en comparación con tdTA (Tabla 2). Mejora de las propiedades de la variante AD1 mediante mutagénesis dirigida 10 Aplicamos una mutación puntual Tyr 82 a Phe (Y82F) en la secuencia de apoaequorina en tdTA y en las variantes de la Figura 1. El resultado fue una mejoría en BRET por el aumento del solapamiento entre los espectros de emisión de Aeq y de absorción de tdTomato, un mecanismo que es independiente de la optimización del péptido conector descrito anteriormente. En la Tabla 3 se muestra que la mutación puntual Y82F en tdTA (tdTAF) resultó en un 49% de la emisión en los 15 canales O+R (un aumento del 7%), en células HeLa transfectadas con la quimera e incubadas con CLZ-f. La misma mutación Y82F aumentó un 10% la luminiscencia en los canales O+R en la variante AW (AWF) y un 5% en la variante AD1 (ADIF). Esta última fue la variante con el mayor corrimiento al rojo descubierta hasta ahora (con un 82% de la emisión en los canales O+R). Así, la Phe 82 en la secuencia de apoaequorina de ADIF, desplazando el espectro de emisión de Aeq hacia el rojo, aumentó la transferencia de energía a tdTomato hasta casi un valor 20 máximo. Por otra parte, la variante ADiFL, que es idéntica a ADIF (AD1 más Y82F), pero con el hexapéptido SGGSGG añadido al conector (Figura 1), presentó muchas menos cuentas en los canales O+R (66%). Tabla 3. Caracterización de BRET en las variantes con mutaciones puntuales, según la distribución de la bioluminiscencia en cuatro filtros de emisión. Los datos se obtuvieron como se indica en la Tabla 2. *Los clones cuyo nombre incluye F, N y Q designan las mutaciones Y82F, N26D y Q168R en apoaequorina, respectivamente. Cabe 25 señalar que ADiFL contiene una inserción adicional en el enlace entre tdTomato y apoaequorina, además de la mutación Y82F (Figura 1). Las fusiones GA, tdTA, AW y AD1 de la Tabla 2 se incluyen para facilitar la comparación con sus formas mutadas. Se muestra el promedio de 13 a 38 células ± la desviación standard. Las dos columnas de la derecha muestran la suma del % de emisión en los canales 481 y 535 nm (B+G), y 595 y 640 nm (O+R). 30
18 Contribución de la señal de bioluminiscencia (% del total) en cada filtro de emisión Análogo CLZ Par de BRET 481 nm (B) 535 nm (G) 595 nm (O) 640 nm (R) B+G O+R -f GA 16.2 ± 4.1 72.3 ± 2.5 9.4 ± 4.0 2.1 ± 1.1 88.5 11.5 GAQ* 17.7 ± 3.0 71.0 ± 3.2 9.2 ± 2.9 2.1 ± 0.8 88.7 11.3 tdTA 38.1 ± 2.5 20.0 ± 2.1 28.6 ± 2.6 13.3 ± 1.5 58.1 41.9 tdTAF* 25.0 ± 3.2 26.0 ± 2.8 33.0 ± 4.0 16.0 ± 2.2 51.0 49.0 AW 33.0 ± 3.1 18.3 ± 2.5 32.3 ± 2.0 16.4 ± 1.6 51.3 48.7 AWF* 20.8 ± 3.5 20.5 ± 2.1 39.1 ± 4.1 19.6 ± 2.0 41.3 58.7 AD1 12.6 ± 3.2 10.0 ± 2.1 50.8 ± 2.8 26.6 ± 2.0 22.6 77.4 ADiF* 7.6 ± 1.1 10.4 ± 1.3 54.0 ± 1.4 28.0 ± 1.1 18.0 82.0 ADiFL* 15.3 ± 2.4 18.7 ± 2.8 43.9 ± 3.0 22.1 ± 2.2 34.0 66.0 ADN* 10.5 ± 2.3 9.1 ± 0.9 52.6 ± 2.1 27.8 ± 0.8 19.6 80.4 ADQ* 16.1 ± 2.0 11.0 ± 1.0 48.1 ± 2.6 24.8 ± 1.1 27.1 72.9 ADNQ* 13.1 ± 0.9 9.7 ± 0.5 51.5 ± 1.1 25.7 ± 0.6 22.8 77.2 -hcp tdTA 52.0 ± 2.7 16.8 ± 0.9 20.8 ± 2.1 10.4 ± 1.2 68.8 31.2 AWF* 29.9 ± 3.9 19.1 ± 2.5 33.5 ± 4.0 17.5 ± 2.4 49.0 51.0 AD1 18.0 ± 3.9 9.6 ± 1.5 47.6 ± 3.5 24.8 ± 1.7 27.6 72.4 ADiF* 16.5 ± 2.1 10.9 ± 1.0 45.7 ± 1.1 26.9 ± 1.3 27.4 72.6 ADN* 15.0 ± 1.9 7.3 ± 1.0 50.3 ± 1.6 27.4 ± 1.3 22.3 77.7 ADQ* 20.4 ± 1.7 10.8 ± 0.7 45.2 ± 0.8 23.6 ± 0.9 31.2 68.8 ADNQ* 17.0 ± 2.8 8.7 ± 0.8 47.4 ± 1.5 26.9 ± 2.1 25.7 74.3 B, azul; G, verde; O, naranja; y R, rojo. Lambolez y colaboradores han descrito un conjunto de mutaciones de apoaequorina obtenidas por un procedimiento de evolución in vitro y selección funcional (Tsuzuki K.,et al. J Biol Chem 2005; 280: 34324-34331). Los llamados mutantes "brillantes" aumentaron la bioluminiscencia en cuando se expresaron en bacterias, aunque el rendimiento 5 de fotones se mantuvo sin cambios en los ensayos libres de células. Así, la mejora debe surgir de que la proteína expresada en bacterias tenga una mayor estabilidad o esté a mayor concentración. El mutante Q168R, localizado en una posición justo al lado de H169, un residuo de unión a la CLZ, mostró un aumento de la vida media de Aeq en las células, una termoestabilidad excepcional y disminuyó ligeramente su afinidad al Ca2+ (EC50 6,8 M). Por el contrario, el mutante N26D, situado en la primera mano EF (motivo de unión al Ca2+), no afectó la vida media de la 10 proteína, aunque forma parte del grupo de mutaciones “brillantes”. Estas mutaciones se introdujeron en AD1 en un intento de mejorar la expresión celular de la quimera. El efecto de estas mutaciones en el perfil espectral se muestra en la Tabla 2. La mutación N26D en AD1 (variante denominada ADN) mejoró ligeramente BRET (80,4% de la luz en canales O+R). Sin embargo, la introducción de Q168R (variante ADQ) disminuyó la emisión en los canales O+R en un 4,5%. La combinación de ambas mutaciones (variante 15 llamada ADNQ) resultó en un espectro de emisión prácticamente igual a AD1. El efecto de estas mutaciones en la sensibilidad al Ca2+ y otras propiedades se describirá más adelante. Sensibilidad al Ca2+ de las variantes en células vivas in vitro Después de la identificación de variantes con un marcado desplazamiento hacia el rojo, obtenidas por el ajuste de la
19distancia dador-aceptor (Tabla 2) y la mejora de su solapamiento espectral y estabilidad (Tabla 3), se caracterizó la sensibilidad al Ca2+ de las variantes más prometedoras. En el primer enfoque, se obtuvo una medida de esta sensibilidad en células HEK transfectadas con las quimeras. En segundo lugar, se obtuvo proteína recombinante de variantes seleccionadas y se midió la sensibilidad al Ca2+ in vitro con tampones de Ca2+. Para las mediciones del primer enfoque, hemos desarrollado un método (método primero de la invención): para 5 determinar la sensibilidad y la afinidad de proteínas sensibles al calcio, células que expresaban cada quimera fueron estimuladas con carbacol, un agonista de receptores muscarínicos, seguido por la saturación de la sonda con Ca2+ (incubación con digitonina 30 μM) . Los sensores de alta afinidad por Ca2+ muestran L/Lmax elevada con carbacol, próxima al valor obtenido por digitonina. Y los sensores de baja afinidad tienen valor L/Lmax pequeño con carbacol (Figura 3). Los resultados correlacionan muy bien con la medida de la sensibilidad al Ca2+ in vitro (segundo 10 enfoque). Los niveles de Ca2+ citosólico se elevan a un valor cercano a 0,9 μM con carbacol en células Hek en cultivo (en base a calibraciones realizadas con indicadores fluorescentes de Ca2+ de síntesis) y alcanzan valores de saturación del biosensor por la incubación con digitonina, que hace permeable la membrana plasmática al Ca2+. Para cada célula sujeta a estos dos estímulos se calculó el cociente L/Lmax (la luz emitida en cada punto del curso temporal dividida 15 por la luminiscencia total restante en el experimento). L/Lmax es directamente proporcional a la concentración de Ca2+. La Figura 4 muestra L/Lmax (escala logarítmica) para las diferentes variantes utilizando CLZ-f en la reconstitución de Aeq. Las variantes CitA (descrita en Bakayan A., et al. PLoS One 2011; 6: e19520; que se trata de una fusión citrina-Aeq) y GA mostraron la mayor sensibilidad al Ca2+ (valores grandes de L/Lmax durante el primer transitorio de Ca2+ por estimulación con carbacol, en comparación con el pico hallado al añadir digitonina). En 20 cambio, tdTA mostró una sensibilidad intermedia, y que fue similar a la de las variantes AW, AD1, AWF, ADIF y ADN. Se obtuvieron diferencias similares entre estas quimeras cuando se usó CLZ-nativa en la reconstitución (sólo se ensayaron CitA, GA, tdTA, AW y AD1). Por lo tanto, las variantes de tdTA obtenidas por el acortamiento y ajuste del péptido conector entre apoaequorina y tdTomato (AW, AD1), o mediante la introducción de las mutaciones puntuales Y82F y N26D en apoaequorina (AWF, ADIF y ADN), tienen una sensibilidad al Ca2+ virtualmente idéntica. 25 En cambio, las variantes de tdTA que incluyen la mutación Q168R en apoaequorina (ADQ y ADNQ) presentaron una disminución de L/Lmax, de acuerdo con su menor afinidad por el Ca2+ demostrada anteriormente en Aeq sola (Tricoire L., et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: 9500-9505). La sensibilidad al Ca2+ también se midió in vitro en las variantes CitA, tdTA y AD1 en muestras de proteína recombinante producida en bacteria, purificada por columna de afinidad, y reconstituida con CLZ-nativa o CLZ-f 30 (Figura 5). CitA presentó al menos un orden de magnitud mayor afinidad que tdTA y AD1. Estas últimas mostraron curvas muy similares a excepción de una desviación alrededor de log [Ca2+]= -7 (100 nM Ca2+). Los resultados obtenidos in vitro para las variantes seleccionadas coinciden con las mediciones de sensibilidad realizadas en células vivas (párrafo anterior). De hecho, asumiendo que la estimulación fisiológica con carbacol aumenta el Ca2+ citoplásmico a un valor cercano a 1 μM, los valores de L/Lmax obtenidos en células (Figura 4) son muy similares a 35 los obtenidos con proteína recombinante (Figura 5), y la diferencia en L/Lmax entre CitA y las variantes derivadas de tdTA se conservó. La Figura 5 también muestra una mayor sensibilidad al Ca2+ (L/Lmax mayor), de cada variante reconstituida con CLZ-f en comparación a CLZ-nativa. Por último, la Tabla 4 resume las constantes de disociación para las variantes principales, calculadas de la Figura 5 (y obtenidos de la literatura para Aeq y GA), y los valores L/Lmax obtenidos en la Figura 4 y de datos no mostrados para CLZ-hcp y CLZ-nativa. 40 Tabla 4. Constantes de disociación (Kd) y valores de L/Lmax de sensores basados en Aeq. Las Kd de los diferentes sensores de Ca2+ se obtuvieron de forma experimental en este estudio o de la literatura (Aeq y GA). Los valores de L/Lmax corresponden al primer pico de Ca2+ en respuesta a la estimulación por carbacol. Estos valores L/Lmax reflejan la sensibilidad de los sensores a una concentración aproximada de 1 μM Ca2+ (Figuras 3 y 4). 45
20Tabla 4. Kd (nM) L/Lmax (pico de Ca2+ con carbacol) Sensor CLZ-nativa CLZ-f CLZ-nativa CLZ-f CLZ-hcp Aeq 1,220 [42] 510 [4] 0.00057 - - GA 630 [26] - 0.005 0.047 - CitA 417 260 0.023 0.17 - tdTA 1,260 730 0.00074 0.004 0.039 AD1 1,500 870 0.00071 0.0034 0.054 ADNQ - - - 0.0005 0.006 Kd, constante de disociación Bioluminiscencia relativa de las variantes expresadas en células de mamífero Células HeLa que expresan diferentes fusiones FP-Aeq se reconstituyeron con CLZ-f, se incubaron con digitonina, y se integraron las cuentas totales emitidas en cada célula durante el curso temporal (promedio de 8-30 células para 5 las distintas variantes). Se obtuvo mayor luminiscencia total en las células que expresaban tdTA (1,02 unidades relativas de luminiscencia) que en aquellas con CitA o GA (0,26 y 0,36, respectivamente). La bioluminiscencia por célula fue mayor en las variantes AW, AWF, AD1, ADIF y ADN (0,63, 0,82, 0,50, 0,42 y 0,75, respectivamente, en las mismas unidades), pero todavía fue inferior a tdTA. Sin embargo, las variantes de AD1 que incorporan la mutación Q168R sola (ADQ), o en combinación con N26D (ADNQ) mostraron un marcado aumento de actividad 10 respecto a AD1 (una luminiscencia total de 1,89 y 3,47 unidades relativas por célula, respectivamente). Este resultado está de acuerdo con la estabilidad conferida a Aeq sola por estas mutaciones (Tsuzuki K., et al. J Biol Chem 2005; 280: 34324-34331). Además, las variantes ADQ y ADNQ mostraron un mayor porcentaje de células fluorescentes después de la transfección transitoria del gen que tdTA o AD1. Por lo tanto, es probable que la mutación Q168R o la combinación N26D/Q168R aumenten la cantidad y/o estabilidad de estas proteínas quiméricas 15 de Aeq en las células, produciendo más fluorescencia y bioluminiscencia total. Por otra parte, ya se había demostrado que GA (fusión GFP-Aeq) emite más bioluminiscencia que Aeq sola en células de mamífero. GFP parece provocar una estabilización de Aeq en la fusión GA y este efecto se potencia en la variante ADNQ: las células que expresan ADNQ emiten casi diez veces más bioluminiscencia por célula que las que expresan GA (3,47/0,36 = 9,7). 20 Capacidad luminiscente El término "capacidad luminiscente" se refiere a la luz total que puede ser emitida por una muestra luminiscente relativa a la cantidad de proteína presente en ella. Para algunas quimeras seleccionadas, la capacidad de luminiscencia se evaluó en muestras de proteína recombinante después de purificación por afinidad, comparando la luz total emitida con Ca2+ saturante con la misma cantidad de cada proteína. La integridad de las proteínas se 25 comprobó por fluorescencia en un gel nativo. Se verificó la fluorescencia verde (CitA) y roja (tdTA, AD1) de las bandas y no se observó degradación de las muestras en geles teñidos con Coomassie (datos no mostrados). Tomando tdTA como referencia, CitA mostró una capacidad luminiscente del 91% de tdTA, y AD1 del 72% de tdTA, todo ello referido a la misma cantidad de proteína recombinante. Por lo tanto, es muy probable que la mayor parte de la diferencia de luminiscencia celular de CitA, GA, tdTA y las variantes de tdTA descritas en el párrafo anterior se 30 deban a cambios en la cantidad y/o la estabilidad de las proteínas quiméricas en células de mamífero, más que a su capacidad luminiscente intrínseca. MEDICIÓN DE Ca2+ CITOPLÁSMICO Y MITOCONDRIAL A NIVEL DE CÉLULAS INDIVIDUALES EN EXPERIMENTOS DE IMAGEN EN DOS COLORES Elección de variantes Aeq verde y roja para su expresión en el citoplasma y matriz mitocondrial 35 En general se acepta que las señales de Ca2+ globales en el citoplasma pueden ser influenciadas por la captación de Ca2+ mitocondrial, que da forma a los cambios transitorios de Ca2+ reduciendo tanto su amplitud como la velocidad de propagación de las ondas. El registro de imágenes de bioluminiscencia en dos canales para monitorizar niveles de Ca2+ al mismo tiempo en dos orgánulos celulares, por ejemplo, citoplasma y mitocondrias, es una herramienta útil para la comprensión de la relación de los flujos de Ca2+ entre estos compartimentos (Manjarres I. M., 40 et al. Pflugers Arch 2008: 455: 961-970).
21Para poder registrar imágenes de Ca2+ en el citoplasma y las mitocondrias al mismo tiempo con sondas genéticamente codificadas, éstas deben emitir luz en bandas distintas del espectro. Las variantes de tdTA aquí descritas mejoran sustancialmente la separación espectral con las variantes de emisión verde como GA. En segundo lugar, su afinidad debe ajustarse a los niveles de Ca2+ esperados en cada compartimento celular en reposo y durante la estimulación. Para ello es importante tanto la elección de la variante de apoaequorina (FIG 4 y 5) como 5 la CLZ sintética utilizada. Además, es obligado usar la misma CLZ para reconstituir Aeq en todos los compartimentos celulares, puesto que no se puede dirigir su difusión a un compartimento en particular. Como hemos descrito, en la variante AD1, CLZ-f proporcionaba la mayor transferencia de energía entre Aeq y tdTomato (77% de la luz en canales O+R), y por lo tanto una separación espectral de GA razonable (Tabla 2). Modificamos la secuencia de AD1 para que fuera importada a la matriz mitocondrial (mitoAD1) (véase Material y 10 Métodos). Sin embargo, mitoAD1 reconstituida con CLZ-f descargó rápidamente gran parte de la luminiscencia con el nivel de Ca2+ mitocondrial alcanzado durante la estimulación de las células HeLa con histamina (Figura 6A, consumo de Aeq). Por lo tanto, elegimos para su uso en mitocondrias la variante ADNQ, que presenta el mismo perfil espectral de AD1 (Tabla 3), un alto nivel de expresión y actividad luminiscente, pero con una reducción de la sensibilidad al Ca2+ (Figura 4). La expresión en células HeLa de mitoADNQ (véase construcción en Materiales y 15 Métodos) mostró la localización mitocondrial de la quimera, con un marcaje fluorescente intenso en comparación con el citoplasma (Figura 6B y 7). La tasa de consumo de la luminiscencia de mitoADNQ fue moderada (Figura 6B). En cuanto a la variante complementaria a mitoADNQ para ser utilizada en el citoplasma, elegimos GA. Sin embargo, GA combinada con CLZ-f resultó en una afinidad al Ca2+ muy alta y una rápida tasa de luminiscencia, más del 50% fue consumida después de la primera respuesta de Ca2+ (Figura 6C). La introducción de la mutación puntual Q168R 20 en GA fue suficiente para disminuir su sensibilidad al Ca2+ alrededor de 9 veces, y disminuir la tasa de consumo de Aeq (Figura 6D). La variante resultante se denominó GAQ, y no se observó ningún cambio en su espectro luminiscente en comparación con GA (Tabla 3). Medidas de Ca2+ citoplásmico y mitocondrial en la misma célula con las variantes seleccionadas Antes de realizar los experimentos de imagen en dos colores simultáneos, se midió la emisión de las sondas GAQ y 25 mitoADNQ separadamente en los canales verde (filtro de paso de banda de 535/52 nm) y rojo (filtro de paso largo de 570 nm). Se transfectaron células HeLa por separado con las quimeras y se estimularon con histamina. La contribución espectral de cada quimera se calculó como las cuentas de la respuesta de Ca2+ en cada canal dividido por la suma de cuentas en ambos canales. El canal verde (535/52 nm) registró el 81% de las cuentas de GAQ, y el canal rojo recogió el 85% de las cuentas de mitoADNQ. Este porcentaje puede ser mejorado optimizando estos 30 filtros de emisión. A continuación se co-transfectaron células HeLa con GAQ y mitoADNQ para obtener imágenes de Ca2+ en el citoplasma y las mitocondrias de las mismas células. La mayoría de ellas mostraron co-expresión de niveles adecuados de GAQ en el citoplasma/núcleo, y mitoADNQ en las mitocondrias; se muestra un experimento representativo en la Figura 7. La aplicación de histamina 100 µM indujo un aumento de Ca2+ que comenzó primero 35 en el citoplasma/núcleo (GAQ, canal verde) y fue seguido por un pico de Ca2+ mitocondrial (mitoADNQ, canal rojo) (Figura 7). USO DE CLZ-hcp PARA REGISTRAR ACTIVIDAD DE Ca2+ ESPONTÁNEA O PARA ADQUIRIR IMÁGENES DE Ca2+ A ALTA FRECUENCIA Actividad espontánea de Ca2+ en células HEK individuales 40 La Aeq cambia su espectro y tasa de emisión, la sensibilidad hacia el Ca2+ y la cinética de la reacción (ascenso y decaimiento de la bioluminiscencia) dependiendo de la CLZ, nativa o sintética, utilizada en la reconstitución (Shimomura O., et al. Cell Calcium 1993; 14: 373-378). Por lo tanto, el tipo de CLZ añade flexibilidad a las variantes tdTA descritas, y cada CLZ puede ser óptima para una aplicación específica, por ejemplo, el seguimiento de la actividad espontánea de Ca2+. De las distintas CLZ sintéticas, se ha mostrado que Aeq/CLZ-hcp proporciona la 45 mayor tasa de emisión (190 veces más cuantos/s que la CLZ-nativa a pCa 7) y la cinética más rápida (constante de tiempo de ascenso, 2,4 ms, y de decaimiento, 150-300 ms) (Shimomura O., et al. Cell Calcium 1993; 14: 373-378). Sin embargo, la CLZ-hcp causó un corrimiento al azul de 29 nm en comparación con CLZ-f (pico a 444 nm frente a 473 nm, respectivamente), que dio lugar a una transferencia de energía ligeramente inferior en la variante AD1 (Tabla 3). En cuanto a la sensibilidad al Ca2+ en las células que expresan AD1, CLZ-hcp produjo valores de L/Lmax 50 (0,0546) 16 veces más altos que CLZ-f (L/Lmax = 0,0033, Figura 4) durante los cambios transitorios de Ca2+ estimulados por carbacol. Este resultado está de acuerdo con el valor publicado de 11 veces mayor intensidad relativa de Aeq/CLZ-hcp en comparación con CLZ-f a pCa 7. La mayor sensibilidad de AD1/CLZ-hcp al Ca2+ podría permitirnos el registro de imágenes durante oscilaciones espontáneas de Ca2+ en células. Para ello, se incubaron células HEK que expresan AD1 con CLZ-hcp como se 55 indica en Materiales y Métodos. Posteriormente, las células se lavaron y se incubaron en medio de cultivo MEM-alfa sin rojo fenol. Con el fin de mantener las células viables por varias horas, se tomaron las imágenes de bioluminiscencia en un microscopio colocado en una cámara con humedad controlada a 37°C y 5% de CO2. Se
22muestra un experimento representativo (de tres) en la Figura 8. Varias células en el mismo campo microscópico mostraron una actividad espontánea de los niveles de Ca2+ citosólico, que se prolongó durante cinco horas. Durante ese tiempo, muchas células se movieron fuera del campo de registro, lo que impidió la conversión de las cuentas en L/Lmax. Registro de imágenes de Ca2+ a alta frecuencia en células HEK 5 Como ya se mencionó, una de las características más atractivas de CLZ-hcp es su cinética rápida. Por otra parte, la variante ADNQ mostró una baja afinidad al Ca2+ (Figura 4) y aproximadamente 7 veces más luminiscencia en células HeLa transfectadas que AD1. La combinación de ADNQ con CLZ-hcp podría permitir la rápida adquisición de imágenes durante cambios transitorios de Ca2+ por su alta tasa de emisión y, al mismo tiempo, permitir la estimulación repetitiva de las células con agonistas en experimentos de larga duración. Células HEK que expresan 10 ADNQ se incubaron con CLZ-hcp, se inició la adquisición de una imagen cada 2s, y las células se estimularon con 50 M carbacol, se lavaron y se estimularon de nuevo (Figura 9A). Se observó señal luminiscente correspondiente a oscilaciones de Ca2+ repetitivas. El tiempo de duración promedio de las oscilaciones fue de 6 s. Después de una hora de adquisición de imágenes, se había consumido menos del 10% de la Aeq total (Figura 9A). En células HEK transfectadas con ADNQ e incubadas con CLZ-hcp, se tomaron imágenes a una velocidad de 15 adquisición más rápida (220 ms/imagen), y se estimularon con carbacol 10 M (Figura 9B). En algunos experimentos, las células HEK respondieron con una cinética aún más nítida a este estímulo, con una duración de los picos de Ca2+ de 2s (Figura 9B, panel inferior). Por lo tanto, la combinación ADNQ/CLZ-hcp permitió monitorizar oscilaciones de Ca2+ citoplásmico con una buena relación señal-ruído, y con el consumo de menos del 10% de la Aeq total disponible, lo que permite el registro de imágenes durante períodos prolongados de tiempo. 20 Conclusiones Anteriormente se identificó tdTomato como el mejor aceptor de BRET de Aeq entre las diversas RFPs evaluadas. Para mejorar la eficiencia de BRET en tdTA, se han ensayado cambios en varios factores, como el grado de solapamiento espectral, la orientación y la distancia entre los cromóforos dador/aceptor. CAMBIO DEL PÉPTIDO DE ENLACE Y DELECIONES EN tdTOMATO Y APOAEQUORINA. En primer lugar, 25 acortamos y alargamos el enlazador entre tdTomato y apoaequorina presente en tdTA y estudiamos su efecto sobre BRET. En general, el acortamiento mejoró la transferencia de energía. Además, la introducción de deleciones tanto en el extremo C terminal de tdTomato como N de apoaequorina proporcionaron mejoras incrementales en BRET y un corrimiento al rojo de la emisión. Así, un empaquetamiento más compacto de dador y aceptor favorece BRET, presumiblemente a través de una disminución de la distancia y/o una orientación más favorable de los cromóforos, 30 hasta un límite máximo obtenido en la variante AD1. Deleciones adicionales no mejoraron BRET (variante BW) o suprimieron la bioluminiscencia por completo (en A3 y B2), mientras que algunas deleciones intermedias, como en la variante AE, produjeron quimeras inestables con tendencia a la agregación y la toxicidad. En conclusión, encontramos que el péptido enlazador y las deleciones presentes en AD1 son óptimas, con una eficiencia estimada de BRET del 75% (Tabla 2, Figura 2). 35 MUTACIONES PARA OBTENER UN CORRIMIENTO AL ROJO DE AEQ. Una forma adicional de ajustar las propiedades de Aeq es el uso de mutagénesis aleatoria o dirigida. Se ha demostrado que algunas mutaciones afectan al pico de máxima emisión, por ejemplo, Y82F en Aeq desplaza su emisión 29 nm hacia el rojo (Stepanyuk G. A., et al. FEBS Lett 2005; 579: 1008-1014). La introducción de esta mutación en la variante ADiF resultó en un corrimiento al rojo del pico de Aeq (Figura 2) y, por tanto, aumentó el grado de superposición espectral con 40 tdTomato, y la eficiencia de BRET (Tabla 3). MUTACIONES EN AEQ QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA PROTEINA y LA SENSIBILIDAD AL Ca2+. La tasa de emisión de una variante también depende de la Aeq total disponible a nivel celular. Se sabe que la Aeq silvestre tiene una vida media corta en células eucariotas, especialmente en el citosol. Algunas mutaciones, tales como Q168R, aumentan la termoestabilidad y probablemente extienden la vida media de la Aeq (Tsuzuki K., et al. J 45 Biol Chem 2005; 280: 34324-34331). En efecto, hemos observado una mayor actividad bioluminiscente de las variantes que incluyen la mutación Q168R en células HeLa. Además, esta mutación también disminuye la afinidad por el Ca2+ (Figura 4, ADQ y ADNQ) (Tricoire L., et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: 9500-9505). Así, a diferencia de AD1, las variantes ADQ y ADNQ en combinación con CLZ-f resultaron en una menor sensibilidad al Ca2+ (Figura 4 y Tabla 4). Esta afinidad disminuída puede contribuir a la Aeq total disponible en las células después 50 de la reconstitución con CLZ, al afectar al consumo de Aeq durante ese paso. Esto puede estar relacionado con la luminiscencia total observada en las células: ADNQ>tdTA>CitA, que se correlaciona inversamente con su afinidad por el Ca2+ (Tabla 4). DIFERENCIA ENTRE LAS VARIANTES SOBRE AFINIDAD. Las fusiones CitA y GA reconstituidas con CLZ-nativa mostraron mayor sensibilidad hacia el Ca2+ que tdTA y AD1 (Figura 5; Tabla 4). Además, también se ha mostrado en 55 la literatura que GA presenta una afinidad más alta que Aeq sola. Se sabe que Aeq, en presencia de Ca2+, interactúa con la GFP silvestre (la forma natural presente en Aeq), cambiando el tamaño relativo de sus dos picos de excitación. Es probable que en las FPs derivadas de GFP (como citrina) se conserve esta propiedad, lo que
23explicaría la alta eficiencia de BRET (Figura 2) y alta sensibilidad al Ca2+ de CitA (Figura 5). AD1 tiene una afinidad al Ca2+ ligeramente menor que tdTA (Tabla 4). Por debajo de 150 nM, la curva de titulación de Ca2+ de AD1/CLZ-nativa se aplana (Figura 5), lo que podría deberse a la deleción de apoaequorina N-terminal, que puede afectar a la coordinación entre las tres manos EF, especialmente la primera (Tricoire L., et al. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103: 9500-9505). 5 VENTAJAS DE LA RECONSTITUCIÓN CON CLZ Y SUS EFECTOS SOBRE EL ESPECTRO DE EMISIÓN Y AFINIDAD. El paso de la reconstitución Aeq con su cofactor CLZ, aunque requiere tiempo, también ofrece ventajas, ya que permite ajustar algunas de las propiedades de Aeq. De los diversos análogos, CLZ-f proporciona el pico de emisión de mayor longitud de onda (473 nm), en comparación con CLZ-h (464 nm) y CLZ-hcp (444 nm). Así, por ejemplo, AD1 combinada con CLZ-f mostró la mayor transferencia de energía de las tres CLZ (Tabla 3; no se 10 muestra CLZ-h). También facilitó los experimentos de imagen por su tasa de emisión moderada (Figura 3) (Shimomura O., et al. Cell Calcium 1993; 14: 373-378). Por último, en los ensayos de sensibilidad al Ca2+ se refleja la afinidad intermedia de CLZ-f en comparación con -nativa o -hcp (Figura 4 y tabla 4) (Shimomura O., et al. Cell Calcium 1993; 14: 373-378). SENSIBILIDAD AL Ca2+ Y TASA DE CONSUMO DE AEQ, VENTAJAS DE LA CLZ-hcp. Las tasas de emisión y 15 consumo de un sensor basado en Aeq son proporcionales a su sensibilidad al Ca2+. A pesar de que una tasa de emisión alta facilita la adquisición de imágenes de luminiscencia, puede limitar su observación a largo plazo (véase el rápido consumo de GA y CitA en la Figura 3). Del mismo modo, un sensor de baja afinidad con menor tasa de emisión hace más difícil tomar imágenes de Ca2+ (por ejemplo, ADNQ en la Figura 3). Por lo tanto, un sensor con una afinidad, emisión (cuantos/s), y tasa de consumo moderados proporcionaría el equilibrio necesario. 20 Por tanto, el siguiente objetivo fue aumentar los cuantos/s de ADNQ sin afectar mucho la estabilidad de la proteína mejorada. Demostramos que la combinación de ADNQ con CLZ-hcp, que muestra una cinética de reacción rápida, fue adecuada para registrar la dinámica de Ca2+ a velocidades de captura relativamente altas (Figura 9). Por otro lado, CLZ-hcp junto con AD1 resultó en una variante de emisión roja de alta afinidad (Tabla 4). Esta combinación permitió visualizar la movilización espontánea de Ca2+ de células HEK con una buena relación señal/ruído en 25 experimentos de larga duración (Figura 8). MEDIDAS DE IMAGEN DE Ca2+ CITOPLÁSMICO Y MITOCONDRIAL EN LA MISMA CÉLULA. Dos principales desafíos están presentes en el seguimiento de Ca2+ con Aeq en un orgánulo celular como la mitocondria: la cantidad total de proteína que puede ser expresada y los niveles de Ca2+. La cantidad de proteína exógena que se puede acumular en las mitocondrias es bastante limitada en comparación con la expresión citosólica o nuclear. Además, el 30 Ca2+ en las mitocondrias puede alcanzar el rango micromolar y por lo tanto se debe ajustar la afinidad de la sonda específica a los niveles de Ca2+ que ocurren durante la estimulación. En consecuencia, la variante ADNQ/CLZ-f, con una actividad luminiscente alta y una afinidad baja, fue la combinación seleccionada. Se espera que la concentración de Ca2+ mitocondrial alcance 10 µM o más. Las calibraciones con mitoAD1 dieron valores de 40 µM (Figura 5 y 6A). Como sonda citoplásmica complementaria de ADNQ mitocondrial, se construyó la variante verde GAQ que, 35 combinada con CLZ-f, presenta menor afinidad al Ca2+ que GA (Figura 6C-D). Esto es especialmente importante, ya que la uniportador mitocondrial tiene una Kd en el rango 2-4 µM. Además de utilizar un sensor con moderada sensibilidad al Ca2+, otra manera de minimizar la interferencia potencial de la sonda con la captación de Ca2+ mitocondrial (Manjarres I. M., et al. Pflugers Arch 2008: 455: 961-970), sería dirigir su expresión al núcleo. En conclusión, AD1 es un nuevo sensor de Ca2+ con bioluminiscencia roja, que cuando se combina con análogos de 40 CLZ y mutaciones puntuales adecuadas, permite generar variantes con propiedades ajustadas para distintas necesidades. Éstas podrán ser utilizadas en el futuro en otras aplicaciones además de los ejemplos presentados aquí. Además, al ser el sensor basado en Aeq con la mayor emisión por encima de 600 nm, tiene un gran potencial para permitir registrar imágenes de Ca2+ en tejidos profundos de organismos vivos. 45