ES2321029T3 - Fotoproteinas con bioluminiscencia potenciada y su uso como indicadores de calcio intracelulares. - Google Patents
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Abstract
La fotoproteína aislada que contiene una secuencia de aminoácidos que: a) es capaz de unir celenterazina y calcio, produciendo bioluminiscencia; y b) es idéntica en al menos el 90% a SEC ID N.º: 1 (clitina); y c) en alineamiento de secuencia con SEC ID N.º: 1 (clitina), presenta una de las siguientes sustituciones individual o múltiple (las posiciones de los residuos se refieren a SEC ID N.º: 1): i) C 54-S; ii) S132-C; iii) K48-R, N195-D; iv) Q 68-R, A 90-V, T 184-I; v) Y82-F, K110-N, F125-L; S149-R; vi) G 142-C; vii) I53-V, S149-R; viii N18-D, I40-V, K56-R ix) Gly 58 - Glu, Asp 69 - Val, Ala 70 - Cys, Lys 76 - Arg, Lys 77 - Gly, Ile 78 - Cys, Asp 81 - Glu, Val 86 - Ile, Glu 87 - Ala, Ala 90 - Gln, Val 92 - Leu, y Glu 97 - Gln.
Description
Fotoproteínas con bioluminiscencia potenciada y
su uso como indicadores de calcio intracelulares.
La presente invención se refiere a fotoproteínas
con bioluminiscencia potenciada y a su uso como indicadores de
calcio intracelulares. Las fotoproteínas se obtienen mediante
mutagénesis de la secuencia codificante de clitina y muestran
bioluminiscencia potenciada, alta afinidad por calcio y emisión de
luz a largo plazo. Se usan convenientemente en ensayos basados en
células para determinar variaciones de concentración intracelular
de calcio, particularmente en ensayos para el rastreo de moléculas
con técnicas de rendimiento ultraelevado.
La bioluminiscencia es el fenómeno mediante el
que se emite luz visible por organismos vivos o por una sustancia
derivada de ellos a través de una diversidad de sistemas de reacción
quimioluminiscentes. Las reacciones de bioluminiscencia requieren
tres componentes principales: una luciferina, una luciferasa y
oxígeno molecular. Sin embargo, pueden requerirse también otros
componentes en algunas reacciones, incluyendo cationes (Ca^{++} y
Mg^{++}) y cofactores (ATP, NAD(P)H). Las
luciferasas son enzimas que catalizan la oxidación de un sustrato,
luciferina, y producen un intermedio inestable. La luz se emite
cuando el intermedio inestable se descompone a su estado basal,
generando oxiluciferina. Hay muchos tipos no relacionados diferentes
de luciferina, aunque muchas especies de al menos 7 filos usan la
misma luciferina, conocida como celenterazina. En algunos animales
(por ejemplo, la medusa) el sistema luciferina/luciferasa se puede
extraer en la forma de una "fotoproteína" estable que emite
luz tras unión de calcio. Las fotoproteínas se diferencian de las
luciferasas en que son complejos intermedios oxigenados
estabilizados de luciferasa y luciferina. Las fotoproteínas están
presentes en muchos celentarados marinos y permiten a estos
organismos emitir luz para una diversidad de propósitos incluyendo
reproducción, alimentación y defensa (1). Hay muchos organismos
luminiscentes, pero sólo se han aislado siete fotoproteínas, a
saber Thalassicolina (2, 3), Aecuorina (4-6),
Mitrocomina (sinónimo de Halistaurina) (7, 8), Clitina (sinónimo de
Fialidina) (8, 9), Obelina (2, 6, 10, 11), Mnemiopsina (12, 13) y
Berovina (12, 13) hasta ahora. Todas estas proteínas son complejos
formados por una apoproteína, un cromóforo de imidazopirazina
(celenterazina) y oxígeno. Sus estructuras están altamente
conservadas, especialmente en la región que contiene los tres
sitios de unión a calcio (EF-estructuras de mano).
El término "fotoproteína" identifica el polipéptido unido a
luciferina, que es capaz de luminiscencia, mientras que
"apoproteína" se usa para indicar la proteína sin
luciferina.
Las fotoproteínas más estudiadas son Acuorina,
aislada de Aquorea victoria (14) y Obelina, aislada de
Obelia longissima (15). La fotoproteína se puede regenerar a
partir de la apoproteína mediante incubación con celenterazina,
oxígeno molecular, EDTA y 2-mercaptoetanol o
ditiotreitol. Dado que la celenterazina es el sustrato luminiscente
común usado por las fotoproteínas aecuorina, mitrocomina, clitina y
obelina, la reacción que emite luz es probablemente la misma en
estas cuatro fotoproteínas (16, 17).
La fotoproteína clitina se clonó en 1993 por
Inouye y col. (18). Hasta la fecha no se ha hecho mucho trabajo
sobre esta fotoproteína. Las estructuras primarias de acuorina,
mitrocomina, clitina y obelina se alinearon y mostraron identidades
de secuencia de aminoácidos muy fuertes. Se encontró que los sitios
de unión a Ca^{2+} de clitina están altamente conservados (19).
Se ha encontrado que las fotoproteínas de unión a Ca^{2+} de
hidrozoos difieren de otras proteínas de unión a Ca^{2+} tales
como calmodulina y troponina C por un contenido relativamente alto
de resíduos de cisteína, histidina, triptófano, prolina y
tirosina.
El análisis de la estructura primaria de clitina
mostró que contiene 198 residuos de aminoácídos (aa) y pertenece a
la familia de las fotoproteínas.
Las fotoproteínas se usan ampliamente en
tecnología de genes comunicadores para controlar los eventos
celulares asociados con transducción de señales y expresión de
genes.
El estudio de eventos celulares y su regulación
requiere procedimientos sensibles, analíticos no invasivos. Las
fotoproteínas y en general el uso de bioluminiscencia son sistemas
comunicadores excelentes ya que no tienen virtualmente ningún
antecedente en contraste con sistemas de fluorescencia.
Las fotoproteínas se expresan en células de
mamíferos para controlar cambios de calcio en respuesta a diferentes
estímulos. Las concentraciones de calcio intracelular se pueden
medir añadiendo el cofactor celenterazina a células de mamífero que
expresen la fotoproteína y detectando la emisión de fotones, que es
indicadora de concentración de calcio intracelular. El uso de
células que expresan tanto una fotoproteína como un receptor
implicado en la modulación de concentración de calcio intracelular
proporciona un sistema válido para el rastreo de compuestos por sus
efectos en la liberación de calcio intracelular. Los ensayos de alto
rendimiento se pueden diseñar usando una fotoproteína como sistema
comunicador. La sensibilidad del sistema así como su señal alta
para la tasa de ruido permite el uso de volúmenes de ensayo
pequeños. Aecuorina es hasta ahora la fotoproteína más usada para
estos ensayos de rastreo.
Los ensayos de flujo de calcio se llevan a cabo
comúnmente en formato HTS utilizando aparatos de rastreo ópticos
adecuados para el análisis simultáneo de un número alto de muestras
y equipados con un sistema de formación de imágenes de
luminiscencia con un detector de Cámara CCD. Sin embargo, uno de los
instrumentos más usados en HTS es FLIPR® (Lector de Placa de
Formación de Imágenes Fluorométrico, Molecular Devices Corporation,
Sunnyvale, CA, EE.UU.) que se desarrolló como herramienta de
rastreo óptica de alto rendimiento para ensayos fluorescentes
basados en células. El aparato se equipó con un dispositivo de
detección óptico que permite el aislamiento de señales en una
monocapa celular, potenciando por lo tanto sensibilidad para ensayos
basados en células. La fuente de excitación puede ser bien un láser
de argón o bien una fuente de banda ancha como una lámpara de
xenón.
Con un recinto hermético a la luz, una cámara
extremadamente sensible y rápida, y administración de líquido en
línea simultánea auténtica, las versiones más recientes del sistema
de FLIPR® (FLIPR^{3} y FLIPR^{TETRA}) se han fabricado
adecuadas también para ensayos de luminiscencia, incluso si la
sensibilidad es baja comparada con los equipamientos basados en
cámaras CCD.
Para el uso de los instrumentos anteriormente
descritos FLIPR®, FLIPR^{3} y FLIPR^{TETRA} y en general para
todos los instrumentos con una sensibilidad baja para ensayos de
luminiscencia, es altamente deseable una fotoproteína con emisión
de luz potenciada.
De acuerdo con un primer aspecto, la invención
proporciona una fotoproteína aislada que contiene una secuencia de
aminoácidos que:
- a)
- es capaz de unir celenterazina y calcio, produciendo bioluminiscencia;
- b)
- tiene una identidad de al menos el 90%, preferiblemente de al menos el 95%, más preferiblemente de al menos el 98% con SEC ID N.º: 1 (clitina);
- c)
- en alineamiento de secuencia con SEC ID N.º: 1 (clitina), presenta una de las siguientes sustituciones simples o múltiples (las posiciones de residuos se refieren a SEC ID N.º: 1):
- i)
- C_{54} \rightarrow S;
- ii)
- S_{132} \rightarrow C;
- iii)
- K_{48} \rightarrow R, N_{195} \rightarrow D;
- iv)
- Q_{68} \rightarrow R, A_{90} \rightarrow V, T_{184} \rightarrow I;
- v)
- Y_{82} \rightarrow F, K_{110} \rightarrow N, F_{125} \rightarrow L; S_{149} \rightarrow R;
- vi)
- G_{142} \rightarrow C;
- vii)
- I_{53} \rightarrow V, S_{149} \rightarrow R;
- viii)
- N_{18} \rightarrow D, I_{40} \rightarrow V, K_{56} \rightarrow R
- ix)
- Gly_{58} \rightarrow Glu, Asp_{69} \rightarrow Val, Ala_{70} \rightarrow Cys, Lys_{76} \rightarrow Arg, Lys_{77} \rightarrow Gly, Ile_{78} \rightarrow Cys, Asp_{81} \rightarrow Glu, Val_{86} \rightarrow Ile, Glu_{87} \rightarrow Ala, Ala_{90} \rightarrow Gln, Val_{92} \rightarrow Leu, y Glu_{97} \rightarrow Gln.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, la fotoproteína
contiene una secuencia de aminoácidos que se selecciona del grupo
de SEC ID N.º^{s}: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10. Comparadas con
fotoproteínas conocidas o comercialmente disponibles, las
fotoproteínas de la invención muestran actividad de bioluminiscencia
incrementada, y/o afinidad más alta por calcio y/o emisión de luz
de duración más larga.
Aparte de las sustituciones de residuo
indicadas, que confieren la actividad de bioluminiscencia de la
fotoproteína deseada, la secuencia de clitina se puede modificar
adicionalmente sin afectar negativamente la actividad de
bioluminiscencia de las fotoproteínas, especialmente mediante
sustituciones conservadoras de residuos aminoacídicos, dentro de
los límites de identidad de secuencia indicados. Además, la
secuencia de clitina se puede delecionar de partes pequeñas, sin
alterar su actividad de fotoproteína.
En un aspecto adicional, la invención se refiere
a un polinucleótido que codifica una fotoproteína como se define
anteriormente. En una realización preferida, las secuencias de
polinucleótidos están optimizadas para uso del codón de mamíferos
de acuerdo con las SEC ID N.º^{s}: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19. En una realización preferida adicional, las moléculas de ácidos
nucleicos están condensadas con secuencias diana mitocondriales
(20, 21, 22).
De acuerdo con un aspecto adicional, la
invención proporciona vectores de expresión y células huésped que
contienen los polinucleótidos indicados. Las células huésped que
expresan una fotoproteína de acuerdo con la invención producen una
bioluminiscencia intensa en respuesta a la estimulación por calcio,
que es mucho más alta que aquella observada con fotoproteínas
naturales, en particular con la más usada, acueorina.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona un ensayo basado en células para determinar
concentración de calcio intracelular por medio de una fotoproteína
de acuerdo con la invención.
En una realización preferida, los cambios en
calcio intracelular se determinan mediante:
- a)
- proporcionar una célula que expresa una fotoproteína de SEC ID N.º: 2-10, variantes o fragmentos de la misma;
- b)
- cargar las células con celenterazina;
- c)
- poner en contacto las células con un agente que estimula flujo de entrada de calcio o liberación de calcio desde reservorios intracelulares;
- d)
- detectar la bioluminiscencia de las fotoproteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo se lleva preferiblemente a cabo en un
formato de alto rendimiento utilizando una herramienta de rastreo
óptico o un aparato adecuado para análisis de muestras múltiples, o
con el Lector de Placa de Imagen Fluorométrico (FLIPR®). Con ambos
de estos sistemas, las fotoproteínas de la invención producen la
señal más alta comparadas con las fotoproteínas conocidas usadas
comúnmente en ensayos funcionales de células automatizados.
En una realización preferida, las células que
expresan una fotoproteína y un receptor implicadas en movilización
de calcio intracelular se usan para someter a prueba las moléculas
candidatas por sus efectos en modulación de receptor. Típicamente,
las células se transfectaron con un vector de expresión que contiene
una fotoproteína que codifica secuencia y cuando no están
endógenamente presentes, un receptor o canal de interés. Los clones
positivos se seleccionan y plaquean en un medio adecuado, las
células cultivadas se cargan con el sustrato de celenterazina y el
ensayo se comienza añadiendo la molécula o estímulo de prueba. La
luminiscencia producida se lee mediante un sistema de detección
adecuado (cámara CCD o luminómetro). El ensayo puede también hacerse
funcionar en un aparato automático equipado con lector de placas
multipocillo, en particular el sistema FLIPR®. En este caso, las
células que expresan fotoproteína se plaquean en pocillos de
microplaca, que, después de adición de la molécula de
prueba/estímulo, se leen simultáneamente con registro de señal.
Los ensayos de rastreo de alto rendimiento
montados con un sistema indicador basado en fotoproteínas muestran
sensibilidad mejorada y razón señal frente a ruido mejorada. Las
células que expresan una fotoproteína de la invención producen una
bioluminiscencia intensa en respuesta a estimulación de calcio, que
es generalmente más alta que aquella observada con fotoproteínas
naturales.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona un kit de ensayo que contiene una preparación de células
que expresan una fotoproteína de la invención bajo el control de un
promotor estable o inducible, y reactivos adecuados para hacer
funcionar el ensayo.
Además, las fotoproteínas de la invención se
pueden usar como indicadores de calcio intracelular en
procedimientos de diagnóstico basados en la medida de la
concentración de iones de calcio celular y/o en flujo de entrada de
ión calcio celular/flujo de salida de ión calcio celular.
La invención se describirá en más detalle en la
siguiente sección experimental.
Las enzimas de restricción se compraron a New
England Biolabs y se usaron de acuerdo con las instrucciones del
suministrador. El kit de Clonación Independiente de Ligazón (LIC)
era de Novagen (Nottingham, Reino Unido). Para Transcripción y
Traducción in vitro se usó el kit acoplado TNT Quick de
Promega (Madison, WI). Reactivos para PCR, y células competentes de
cepas de E. coli XL-1blue y
BL21-Gold(DE3), fueron de Stratagene (la
Jolla, CA). Los oligonucleótidos se compraron de Primm (Milán). La
celenterazina era de Pharma Tech. Internacional Inc. (Fairfiled,
NJ). Todos los otros productos químicos eran de fuentes estándar y
fueron de calidad de reactivo o mejor.
El uso del codón del gen de clitina de tipo
natural se adaptó a la predisposición del codón de genes de mamífero
altamente expresados. Además se han evitado regiones de contenido
en GC muy alto (>80%) o muy bajo (<30%) donde ha sido
posible.
\newpage
Para iniciación de traducción eficiente la
secuencia consenso de Kozak se introdujo corriente arriba del codón
inicial. Se añadieron dos codones de parada para asegurar
terminación eficiente.
El kit de Mutagénesis Aleatoria GeneMorph II
(Stratagene) se usó siguiendo las instrucciones del suministrador.
Se usaron dos cantidades iniciales diferentes de ADN diana para
lograr una velocidad de mutación alta, 0,1 ng y
0,01 ng.
0,01 ng.
Los cebadores de PCR se diseñaron apropiadamente
para contener extensiones 5' LIC (en letras cursivas) que
corresponden a secuencias descritas en el Kit de Clonación Ek/LIC
(Novagen).
| Superior: | GATGACGACGACAAG-ATGGCCGACACCGCCAG | (SEC ID N.º: 20) |
| Inferior: | GAGGAGAAGCCCGGT-TTATCAAGGACACGAAGT | (SEC ID N.º: 21) |
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolo de amplificación llevada a cabo en el
termociclador de Perkin Elmer 2400:
1 vez la etapa siguiente:
- pre PCR
- 2' a 94ºC
\vskip1.000000\baselineskip
30 veces las etapas siguientes:
- desnaturalización
- 30'' a 94ºC
- reasociación
- 30'' a 56ºC
- elongación
- 40'' a 72ºC
\vskip1.000000\baselineskip
1 vez la etapa siguiente:
- elongación
- 10' a 72ºC
\vskip1.000000\baselineskip
- Longitud esperada de producto específico de PCR:
- 630 pb.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar cuantitativamente la cantidad de
ADN obtenido, los productos de amplificación se analizaron mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1% en tampón de funcionamiento
1xTAE tras procedimiento estándar, como se describe por Maniatis y
col. Las muestras se compararon con un marcador de peso molecular de
ADN (MWXVI, Roche).
El kit de Clonación Independiente de Ligazón de
Novagen (LIC) se usó siguiendo las instrucciones del suministrador
con el fin de obtener clonación direccional de los productos de PCR
sin la necesidad de digestión de enzimas de restricción o de
reacciones de ligazón. Se eligió el vector pET-30
Ek/LIC, manipulado para expresar la proteína diana inmediatamente
cadena abajo de un sitio de escisión de enteroquinasa.
Para expresión de proteínas buena los inventores
eligieron células BL21-Gold(DE3)
(Stratagene), un derivado de E. coli B, una cepa mejorada de
células competentes BL21. El genotipo de la cepa es: E. coli
B F^{-} ompT hsdS (r_{B}^{-}m_{b}^{-})
dcm^{+} Tet^{r} gal \lambda(DE3) endA Hte. Esta cepa
carece tanto de la proteasa Ion como de la proteasa
ompT, que pueden degradar proteínas durante purificación. El
fenotipo Hte incrementa la eficiencia de transformación (>1 x
10^{8} ufc/\mug de ADN de pUC18). Además el gen endA,
que codifica endonucleasa I está inactivado (sin ninguna degradación
del ADN plasmídico).
Con el fin de obtener células competentes con
una alta eficiencia de transformación, los inventores siguieron el
protocolo estándar para preparar y electrotransformar células
BL21-Gold(DE3) descritas en el manual de
aparato de Transformación por Emisor de Pulsos de E. coli
(BioRad).
\newpage
La eficiencia de transformación se probó usando
el ADN de pUC18 y los vectores de ADN de pET y las eficiencias
obtenidas fueron:
- \bullet 1 x 10^{10} ufc/\mug de ADN de pUC18
- \bullet 1 x 10^{8} ufc/\mug de ADN de pET.
Usando estas células altamente
electrocompetentes los inventores fueron capaces de obtener una
biblioteca de aproximadamente 84.000 colonias que expresan la
fotoproteína clitina mutada aleatoriamente.
Las células transformadas se sembraron en placas
de agar LB y se cultivaron durante toda una noche a 37ºC. Después
de cultivar la colonia durante toda una noche, se obtuvo la
inducción añadiendo IPTG 10 mM y EDTA 5 mM, e incubando durante 4
horas a 37ºC. Las colonias se cargaron con solución de celenterazina
10 \mug y se incubaron durante toda una noche a 4ºC en la
ausencia de luz.
La bioluminiscencia se sometió a ensayo mediante
la detección de la señal durante un periodo de tiempo fijado de
30'' a tiempo 0, después de 3 y después de 5 minutos a partir de la
primera medida.
Las mejores colonias se recogieron y cultivaron
en 1 ml de medio líquido LB y se volvieron a someter a prueba
usando las mismas condiciones experimentales descritas
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
La traducción de las fotoproteínas se llevó a
cabo en el sistema libre de células de reticulocito de conejo (kit
acoplado a TNT Quick, Promega), siguiendo las instrucciones
generales del suministrador. Se usaron 500 ng de ADN para cada
mezcla de reacción de transcripción/traducción in vitro. El
volumen de reacción (10 \mul) incluyó 8 \mul de Mezcla TNT T7
Quick Master, 1,6 \mul de ADN, 0,2 \mul del tampón de metionina
y 0,2 \mul de celenterazina (0,5 mM). Para este fin, se probaron 5
\mul de cada muestra de la mezcla de traducción para emisión de
luz mediante la inyección de solución de calcio y midiendo en el
Ascent Luminoskan (Labsystems).
\vskip1.000000\baselineskip
Para la producción de la proteína recombinante
los inventores siguieron un protocolo de purificación de proteína a
pequeña escala bajo condiciones nativas. Debido a la presencia de la
marca de His N-terminal en las construcciones de
los inventores, los inventores decidieron purificar las proteínas
expresadas en Columnas de Giro Ni-NTA (Qiagen)
siguiendo el protocolo de los suministradores.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de evaluar la respuesta de la
fotoproteína a diferentes concentraciones de calcio, se cargaron
0,05 ng/pocillo (MTP de 96) de la proteína recombinante con
celenterazina 10 \muM durante toda una noche a 4ºC.
Después de la incubación, se inyectaron
concentraciones diferentes de CaCl_{2} y la luz liberada se midió
en el Ascent Luminoskan con un tiempo de integración de 20 ms para
un tiempo total de 10 segundos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las enzimas de restricción se compraron a New
England Biolabs (Beverly, MA) y se usaron de acuerdo con las
instrucciones del suministrador. Se compraron el kit de ligazón de
ADN y el reactivo de transfección de Fugene a Roche (Basel, CH). La
celenterazina era de Pharma Tech. Internacional Inc. (Fairfield,
NJ). Todos los otros productos químicos eran de fuentes estándar y
eran de calidad de reactivo o mejor.
Los clones de fotoproteína del mutante más
prometedor se subclonaron para someter a prueba su expresión en
células de mamífero.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Se usaron 2 \mul de plásmido como molde en
análisis de PCR. Además se llevó a cabo un control negativo sin
ningún molde.
El procedimiento estándar de PCR fue como se
indica por Perkin Elmer. El protocolo de PCR fue como sigue:
| Cebadores: | ||
| Cebador superior: | TCGTTGGGATCCGCCACCATGGCCGACACCGCC | (SEC ID N.º: 22) |
| Cebador inferior: | GGGCCCTCTAGATTATCAAGGCACGAA | (SEC ID N.º: 23) |
| Mezcla de reacción de PCR: |
- 2 \mul
- molde
- 5 \mul
- 10 x Tampón de Pfx (GIBCO-Life Technologies)
- 1,5 \mul
- dNTP 10 mM
- 1 \mul
- MgSO_{4} 50 mM (GIBCO-Life Technologies)
- 2,5 \mul
- cebador superior (10 \muM)
- 2,5 \mul
- cebador inferior (10 \muM)
- 2,5 U
- Pfx de Platino (GIBCO-Life Technologies)
- 35 \mul
- H_{2}O
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolo de amplificación llevado a cabo en
termociclador de Perkin Elmer 2400:
1 vez la etapa siguiente:
- Pre PCR
- 2' a 94ºC
\vskip1.000000\baselineskip
25 veces las siguientes etapas:
- desnaturalización
- 15'' a 94ºC
- reasociación
- 30'' a 56ºC
- elongación
- 40'' a 68ºC
\vskip1.000000\baselineskip
1 vez la etapa siguiente:
- elongación
- 10' a 68ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Longitud esperada de producto de PCR específico:
630 pares de bases.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de amplificación se analizaron
mediante electroforesis en gel de azarosa al 1% en tampón de
funcionamiento 1 x TAE tras el procedimiento estándar, como se
describe por Maniatis y col.
El producto de PCR fue el purificado usando
columnas de Quiagen y se digirió con enzimas de restricción Bam HI
y XbaI.
Se ha preparado un vector pcADN3 modificado
(Invitrogen) en el laboratorio de los inventores (Invitrogen)
conteniendo la secuencia que codifica el péptido que marca como
objetivo la mitocondria a partir de la subunidad VIII de la
citocromo c oxidasa (20, 21, 22) de forma que podría usarse en fase
en el extremo 5' del gen de la fotoproteína optimizada en uso de
codones. El producto de amplificación obtenido de la PCR
anteriormente mencionada se ha clonado en este vector pcADN3
modificado que carece del gen de resistencia a Neomicina para
expresión en líneas celulares de mamíferos.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para el marcado como objetivo de la mitocondria
la secuencia señal es:
El gen de clitina mutada se obtiene a partir del
vector pcrScript/hmutado-clitina mediante digestión
con BamHI y XBaI. El pcADN3neo- se digiere con las enzimas de
restricción BamHI y XBaI, y se purifica.
El gen de clitina mutada se liga después dentro
del vector pcADN3neo- para obtener
pcADN3neo-CYTO-hMutada-clitina.
Ambas construcciones obtenidas se verificaron
mediante secuenciación de longitud total dideoxi.
Medio de cultivo, sembrado e incubación:
DMEM/F12 con Glutamax (código de GIBCO 31331-028),
FBS al 10%, Penicilina/Estreptomicina (código de Invitrogen
15140-122) al 1%, Solución Tampón de Hepes (código
de GIBCO 15630-056) 25 mM, piruvato de sodio
(código de GIBCO 11360-039) 1,0 mM, bicarbonato de
sodio (código de GIBCO 25080-060) 1,5 g/l.
Condiciones de precultivo: las células se
sembraron para experimentos cuando son confluyentes al
70-80%.
Condiciones de cultivo celular: dividir
dos veces a la semana: 3,0 x 10^{5} células/matraz T75
(recuperación: 8 x 10^{6} células).
Proceso de Selección Clonal:
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
- \bullet
-
\vtcortauna
\vskip1.000000\baselineskip
Parámetros de Medida de Cámara CCD:
Se sembraron células CHO a diferentes densidades
celulares en MTP de 384 (500, 750, 1000, 1500 células/pocillo) en
medios de crecimiento suplementados como anteriormente y se midieron
con una cámara de CCD 24 horas y 48 horas después de sembrar en
placas. Antes de los experimentos el medio de crecimiento se retira
y las células se cargan con tampón de Tyrode más celenterazina a
37ºC durante 3 horas. La luminiscencia se controla finalmente
mediante cámara CCD después de la adición del agonista (cinética de
30 segundos).
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- 384 placas de fondo transparente de paredes blancas
- \bullet
- sembrar en placas células 24 horas antes del experimento
- \bullet
- retirada de medio
- \bullet
- adición de 25 \mul de Tyrode más celenterazina/pocillo
- \bullet
- incubación 4 horas a 37ºC
- \bullet
- los experimentos funcionan a FLIPR^{3}: inyección de compuesto (2X) en tampón de Tyrode (25 \mul/pocillo).
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los valores de parámetros son los valores
de experimentación por defecto, excepto para lo siguiente:
1) Configuración de la cámara:
- Duración de exposición = 0,7
- Aumento de cámara = 200
\vskip1.000000\baselineskip
2) Parámetros de secuencia:
- Administrar con cabezal de 384 pocillos
- Altura = 30 \mul
- Velocidad = 25 \mul/segundo.
\vskip1.000000\baselineskip
- \bullet
- 384 placas de fondo transparente de paredes blancas
- \bullet
- sembrar en placas células 24 horas antes del experimento
- \bullet
- retirada de medio
- \bullet
- adición de 25 \mul de Tyrode más celenterazina/pocillo
- \bullet
- incubación 4 horas a 37ºC
- \bullet
- los experimentos funcionan a FLIPR^{TETRA}: inyección de compuesto (2X) en tampón de Tyrode (25 \mul/ pocillo).
\newpage
Todos los valores de parámetros son los valores
de experimentación por defecto, excepto para lo siguiente:
1) Configuración de la cámara:
- Aumento de cámara = 200
- Tiempo de exposición = 0,50
\vskip1.000000\baselineskip
2) Parámetros de secuencia:
- Altura = 30 \mul
- Velocidad = 25 \mul/segundo.
\vskip1.000000\baselineskip
ATP (Sigma, A-7699) se
disolvió en H_{2}O a una concentración de 100 mM y se almacenó en
alícuotas a -20ºC. La solución de trabajo se preparó recientemente
en tampón de Tyrode.
Composición de Tampón de Tyrode: NaCl 130
mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 2 mM, MgCl_{2} 1 mM, NaHCO_{3} 5 mM y
HEPES 20 mM, pH 7,4.
IMETIT (Sigma,
I-135).
Fig. 1: re-sometimiento a prueba
de colonias mutantes con tres concentraciones de calcio.
Fig. 2: Transcripción y Traducción In
vitro. Medida de emisión de luz hasta inyección de calcio 5
pM.
Fig. 3: Transcripción y Traducción In
vitro. Medida de emisión de luz hasta inyección de calcio 1
mM.
Fig. 4: cinéticas de la medida de emisión de luz
hasta inyección de calcio 1 mM para las fotoproteínas
recombinantes.
Fig. 5: curva de respuesta a dosis de calcio de
la fotoproteína recombinante 25N03b.
Fig. 6: intensidad lumínica de pico de
fotoproteínas recombinantes hasta inyección de calcio 1 mM.
Fig. 7: cinéticas de respuesta de ATP 10 \muM
en la cámara CCD para la línea celular CHOK1/mito25N03b.
Fig. 8: curva de respuesta a dosis de ATP de la
línea celular CHOK1/mito25N03b.
Fig. 9: cinética de respuesta a dosis de ATP de
la línea celular CHOK1/mito12mutCly obtenida en la cámara CCD
probando 500 células/pocillo 24 horas después de sembrar.
Fig. 10: curva de respuesta a dosis de ATP de la
línea celular CHOK1/mito12mutCly obtenida en la cámara CCD con
diferente número de células/pocillo, diferentes concentraciones de
celenterazinas, y tiempo de incubación.
Fig. 11: curva de respuesta a dosis de ATP de la
línea celular CHOK1/cito12mutCly obtenida en la cámara CCD con
diferente número de células/pocillo.
Fig. 12: curva de respuesta a dosis de IMETIT de
la línea celular CHOK1/mito12mutCly/H3 obtenida en la cámara CCD
con diferente número de células/pocillo
Fig. 13: curva de respuesta a dosis de IMETIT de
la línea celular CHOK1/mito12mutCly/H3 obtenida en FLIPR^{3}.
Fig. 14: curva de respuesta a dosis de la línea
celular CHOK1/mito25N03b-A3 con agonista de A3 (IB
MECA), probada en la cámara CCD Lumibox, 500 células por pocillo,
24 horas después de sembrar. Celenterazina 5 \muM. Sensibilidad
de la cámara 5, medida de 60 segundos.
Fig. 15: curva de respuesta a dosis de la línea
celular CHOK1/mito25N03b-A3 con agonista de A3 (IB
MECA), probada en la cámara CCD CyBi Lumax HT, 2500 células por
pocillo, 24 horas después de sembrar, CTZ 5 \muM. Sensibilidad de
la cámara equivalente a HV 10, medida de 60 segundos.
Fig. 16: curva de respuesta a dosis de la línea
celular CHOK1/mito25N03b-A3 con agonista de A3 (IB
MECA), probada en el FLIPR^{TETRA}, 2500 células por pocillo, 24
horas después de sembrar. Tiempo de exposición a celenterazina 10
\muM 2 segundos, aumento 240.
La Biblioteca mutante Aleatoria se obtuvo usando
el kit de Mutagénesis Aleatoria GeneMorph II (Stratagene). Con el
fin de lograr una tasa de mutaciones alta se usaron dos cantidades
iniciales diferentes de ADN objetivo: 0,1 ng y 0,01 ng. Se pusieron
a prueba un total de 83305 colonias bacterianas en su actividad
luminiscente. De éstas, 1089 fueron positivas y por tanto tuvieron
características bioluminiscentes. Las mejores colonias se
recogieron, para un total de 289 colonias, y de estas, 16 resultaron
mejores después de un re-sometimiento a prueba.
Finalmente se eligieron y analizaron 9 colonias.
La figura 1 muestra los resultados obtenidos en
una curva de respuesta a dosis de CaCl_{2} de prueba de tres
puntos con los 8 mutantes.
Se mezclaron directamente 5 \mul de la mezcla
de traducción con 95 \mul de solución de PBS en una placa de 96
pocillos que se montó dentro del Luminómetro (Berthold). Para
activar emisión de luz de fotoproteínas, se inyectó una solución de
CaCl_{2} 5 pM dentro del pocillo y la luminiscencia se registró
durante 10 segundos.
Los resultados de la transcripción y la
traducción in vitro del ADN de los 8 mutantes se muestran en
la figura 2.
Se llevó a cabo un experimento de transcripción
y traducción in vitro nuevo con el mutante que mejor
responde, 25N03b (secuencia ID n.º: 16), y con la fotoproteína
aecuorina (figura 3) con el fin de tener una comparación de la
emisión de luz hasta la inyección de la solución de CaCl_{2} 1
mM.
Las fotoproteínas recombinantes correspondientes
a algunos mutantes se produjeron bajo condiciones nativas siguiendo
un protocolo de purificación a pequeña escala. La emisión de luz se
midió hasta que se muestran inyección de calcio 1 mM y las
cinéticas correspondientes en la figura 4.
La fotoproteína mutante recombinante,
correspondiente al clon 25N03b, se caracterizó mejor con una curva
de respuesta a dosis de calcio completa, que se puede ver en fig.
5.
En otro experimento, la fotoproteína 25N03b
recombinante se comparó con acueorina recombinante. La emisión de
luz registrada hasta inyección de CaCl_{2} 1 mM fue
sorprendentemente más alta en el caso del mutante 25N03b como se
muestra en la figura 6.
4.1 El clon que expresa CHOmito25N03b
(CHOK1/mito25N03b) se ha obtenido mediante transfección de células
CHO-K1 (Materiales y Procedimientos). 48 horas
después de la transfección las células se tripsinizaron y sembraron
en placas dentro de MTP (Placas de Microvaloración) de 10 x 96 en
MEM completo. A confluencia, las MTP de 10 x 96 se duplicaron
usando MATRIX (Hudson, NH, EE.UU.) en MTP blancas de 10 x 96. 3
horas antes de la medida se reemplazó el medio con 50
\mul/pocillo de tampón de Tyrode Ca^{2+} 2 mM y celenterazina 10
\muM. Los clones se seleccionaron en base a su respuesta
funcional (señal luminiscente) a ATP, que se conoce que estimula el
receptor de P2Y endógeno de CHO y que eleva la concentración de
Ca^{2+} citoplásmica. Al final de cada experimento las células se
lisaron mediante perfusión de una solución que contiene Tritón
X-10. La fotoproteína activa se reconstituyó
incubando las células con celenterazina 10 \muM diluida en tampón
de Tyrode que contiene Ca^{2+} 2 mM, en la oscuridad, a 37ºC, en
una atmósfera de CO_{2} al 5% durante 3 horas. Para la medida de
la emisión de luz, las células se lisaron en presencia de calcio y
se registró la luminiscencia emitida. El número de fotones emitidos
durante los primeros 30 segundos se integró mediante una cámara CCD
y se visualizó en la pantalla. Las células transfectadas con un
plásmido vacío o no transfectadas no incrementaron la emisión de
protones. Para detectar cambios en concentraciones de calcio, se
inyectó ATP 10 \muM y se determinaron las cinéticas de la
respuesta. La curva obtenida se muestra en la figura 7.
El clon final se sembró en placas de 384
pocillos y se sometió a prueba con concentraciones incrementantes
de ATP como se muestra en la curva de respuesta a dosis en la figura
8.
La línea celular CHOK1/mito25N03b se transfectó
también con un receptor acoplado a proteínas G, el receptor de
Adenosina A3, y con una proteína G\alpha quimérica, con el fin de
cambiar la señal a la ruta PLC/IP. Se generó una línea celular
estable (a partir de ahora referida aquí como clon
CHOK1/mito25N03b/A3).
\newpage
Tras estimulación con su agonista, el receptor
A3 induce un incremento en concentración de calcio intracelular que
se mide mediante la luminiscencia de mito25N03b.
Los clones finales de las líneas celulares de
CHO que expresan mito25N03b y el receptor de Adenosina A3 humano se
cultivaron a confluencia del 80-95% en matraces de
cultivo de tejidos y se recogieron mediante tripsinización. Las
células se administraron a diferentes densidades celulares en placas
de 384 pocillos en medio de crecimiento (DMEM/F12 conteniendo Suero
Bovino Fetal al 10%) y se incubaron durante 24 horas y 48 horas a
37ºC en un incubador humidificado a CO_{2} al 5%. En el día del
experimento, el medio de cultivo se eliminó y, para experimentos
luminosos, las células se cargaron con celenterazina 5 \muM
durante 3 horas, a 37ºC, CO_{2} al 5%. La respuesta de calcio se
estimuló mediante adición de diferentes concentraciones de ATP a
cada pocillo. Las cinéticas de luminiscencia ultrarrápida se
siguieron usando una cámara CCD, que inyecta reactivos y registra
emisión lumínica a partir de cada pocillo individual.
Los agonistas y antagonistas se diluyeron en
tampón de Tyrode a diferentes concentraciones. Aproximadamente 25
\mul de estas soluciones se inyectaron separadamente dentro de
cada pocillo y la respuesta se midió con la instrumentación de
cámara CCD. La luz emitida se registró inmediatamente a diferentes
intervalos de tiempo. Los resultados mostrados en la figura 14 se
refieren al agonista específico de A3, IB-MECA. Los
mismos experimentos se llevaron a cabo en otra instrumentación de
cámara CCD, los resultados se muestran en la figura 15.
4.2 Las células CHOK1 se transfectaron
establemente con el mutante 12mutCly (SEC ID N.º: 19) clonado en
pcADN3neomito, para obtener la línea celular CHOK1/mito12mutCly
(Materiales y Procedimientos).
El clon final se seleccionó sobre la base de la
respuesta funcional (señal luminiscente) a ATP, que se conoce que
estimula el receptor P2Y endógeno de CHO y que eleva la
concentración de Ca^{2+} citoplásmica. Al final de cada
experimento, las células se lisaron mediante perfusión de una
solución que contiene Tritón X-100. La fotoproteína
activa se reconstituyó incubando las células con celenterazina 2,5 o
5 \muM diluidas en tampón de Tyrode que contiene Ca^{2+} 2 mM,
en la oscuridad, a 37ºC, en una atmósfera de CO_{2} al 5% durante
3 horas. Para medida de emisión de luz, las células se lisaron en
presencia de calcio y se registró la luminiscencia emitida. El
número de fotones emitidos durante los primeros 30 segundos se
integró mediante un luminómetro basado en cámara CCD y se visualizó
en la pantalla. Las células transfectadas con un plásmido vacío o
no transfectadas no incrementaron emisión de fotones. Se sembró
cantidad diferente de células en MTP de 384. Después de 24 horas
para detectar cambios en concentraciones de calcio, se inyectaron
diferentes concentraciones de ATP y se determinaron las cinéticas
de la respuesta. Ejemplos de cinéticas obtenidas sembrando 500
células/pocillo 24 horas antes de la prueba se muestran en
figura 9.
figura 9.
La emisión de luz alta y la sensibilidad a
Ca^{2+} alta observadas en la línea celular CHOK1 mito12mutCly
permitieron el uso de un número inferior de células y de una
concentración menor de celenterazina incluso durante menos tiempo
en comparación con las condiciones de ensayos celulares basados en
fotoproteína estándar.
Ejemplos de curvas de respuesta a dosis de ATP
obtenidas sembrando 100 a 600 células/pocillo 24 horas antes de la
prueba e incubando las células con celenterazina 2,5 y 5 \muM
diluida en tampón de Tyrode que contiene Ca^{2+} 2 mM, en la
oscuridad, a 37ºC, en una atmósfera de CO_{2} al 5% durante 2 y 3
horas se muestran en las figuras 10a y 10b.
La línea celular CHOK1 cito12mutCly se obtuvo
mediante transfección de células CHO-k1 (Materiales
y Procedimientos).
El clon final se seleccionó sobre la base de la
respuesta funcional (señal luminiscente) a ATP, que se conoce que
estimula el receptor endógeno de CHO P2Y y que eleva la
concentración de Ca^{2+} citoplásmica. Al final de cada
experimento, las células se lisaron mediante perfusión de una
solución que contiene Tritón X-100. La fotoproteína
activa se reconstituyó incubando las células con celenterazina 2,5 o
5 \muM diluida en tampón de Tyrode que contiene Ca^{2+} 2 mM,
en la oscuridad, a 37ºC, en una atmósfera de CO_{2} al 5% durante
3 horas. Para medida de emisión de luz, las células se lisaron en
presencia de calcio y se registró la luminiscencia emitida. El
número de fotones emitidos durante los primeros 30 segundos se
integró mediante un luminómetro basado en cámara CCD y se visualizó
en la pantalla. Las células transfectadas con un plásmido vacío o no
transfectadas no incrementaron emisión de fotones. Se sembró
cantidad diferente de células en MTP de 384. Después de 24 y 48
horas para detectar cambios en concentraciones de calcio, se
inyectaron diferentes concentraciones de ATP y se determinaron las
cinéticas de las respuestas. Las curvas de respuesta a dosis de ATP
obtenidas sembrando 50, 1000 y 2000 células/pocillo 24 horas antes
de la prueba e incubando las células con celenterazina 2,5 y 5
\muM diluida en tampón de Tyrode que contiene Ca^{2+} 2 mM, en
la oscuridad, a 37ºC, en una atmósfera de CO_{2} al 5% durante 2
y 3 horas se muestran en la figura 11.
La línea celular CHOK1 mito12mutCly se
transfectó con un receptor acoplado a proteína G, el receptor de
histamina-3, y con una proteína G\alpha
quimérica, con el fin de cambiar la señal a la ruta PLC/IP. Se
generó una línea celular estable (a partir de ahora referida aquí
como línea CHOK1/mito12mutCly/H3) (Materiales y Procedimientos).
Tras estimulación con su agonista (IMETIT), el
receptor de H3 induce un incremento en concentración de calcio
intracelular que se mide mediante luminiscencia de mito12mutCly.
\newpage
Las curvas de respuesta a dosis de IMETIT
obtenidas sembrando 250, 500, 750 y 1000 células/pocillo 24 horas
antes de la prueba e incubando las células con celenterazina 5
\muM diluida en tampón de Tyrode que contiene Ca^{2+} 2 mM, en
la oscuridad, a 37ºC, en una atmósfera de CO_{2} al 5% durante 3
horas se muestran en figura 12.
Las CHOK1/mito25N03b/A3 y las
CHOK1/mito12mutCly/H3 se ponen a prueba en FIPR midiendo la señal de
luminiscencia inducida mediante la activación del receptor
transfectado.
La luminiscencia medida con la instrumentación
de FLIPR se comunica como Unidades de Cambio de Luminiscencia en la
figura 13, en la que se comunican los resultados obtenidos midiendo
la liberación de luz inducida por estimulación con IMETIT en
CHOK1/mito12mutCly/H3. Se sembraron 5000 células/pocillo en MTP de
384 24 horas antes del experimento. El medio se reemplazó y
sustituyó con 25 \mul de celenterazina concentrada 2X (10 \muM)
se diluyó en tampón de Tyrode que contiene Ca^{2+} 2 mM, en la
oscuridad, durante 3 horas a 37ºC, en una atmósfera de CO_{2} al
5%. Se inyectó el compuesto IMETIT (2X) a diferentes concentraciones
en células (25 \mul/células).
En figura 16 la luminiscencia medida con la
instrumentación FLIPR^{TETRA} se comunica como RLU (Unidades de
Luz Relativa), en las que se comunican los resultados obtenidos
midiendo la luz liberada inducida por estimulación de
IB-MECA en CHOK1/mito25N03b/A3. Se sembraron 2500
células/pocillo en MTP de 384 24 horas antes del experimento. El
medio se reemplazó y se sustituyó con 25 \mul de celenterazina
concentrada 2X (10 \muM) diluida en tampón de Tyrode conteniendo
Ca^{2+} 2 mM, en la oscuridad, durante 3 horas a 37ºC, en una
atmósfera de CO_{2} al 5%. Se inyectó compuesto
IB-MECA (2X) a concentraciones diferentes en células
(25 \mul/pocillo).
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potenciada y ensayos usando las mismas
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 198
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Clytia gregaria
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<400> 1
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<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 198
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<212> PRT
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<213> Desconocida
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<220>
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<223> Mutante de clitina: mutClyK1
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 198
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<212> PRT
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<213> Desconocida
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de clitina: mutClyK4
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 198
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<212> PRT
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<213> Desconocida
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de clitina: mutante 1F10
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 198
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<212> PRT
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<213> Desconocida
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<220>
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<223> Mutante de clitina: mutante 1H7
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 198
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<212> PRT
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<213> Desconocida
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<220>
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<223> Mutante de clitina: mutante 1C12
\newpage
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<400> 6
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<212> PRT
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<213> Desconocida
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<220>
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<223> Mutante de clitina: mutante
25N03b
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<212> PRT
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<213> Desconocida
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<220>
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<223> Mutante de clitina: mutante 3C12
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<210> 9
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<212> PRT
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<213> Desconocida
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<220>
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<223> Mutante de clitina: mutante 6H22
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 198
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<212> PRT
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<213> Desconocida
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<220>
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<223> Mutante de clitina: 12mutCly
\newpage
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<400> 10
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<210> 11
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<212> ADN
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<213> Desconocida
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<223> Mutante de clitina: mutClyK1_dna
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<210> 12
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<211> 600
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<212> ADN
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<213> Desconocida
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de clitina: mutClyK4_dna
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<400> 12
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<210> 13
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<211> 600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocida
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de clitina: 1F10
mutant_dna
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<400> 13
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<210> 14
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<211> 600
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocida
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Mutante de clitina: 1H7
mutant_dna
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<400> 14
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<210> 15
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<211> 600
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<212> ADN
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<213> Desconocida
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de clitina: 1C12
mutant_dna
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<400> 15
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<210> 16
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<211> 600
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocida
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de clitina: 25N03b
mutant_dna
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<210> 17
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<211> 600
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocida
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de clitina: 3C12
mutant_dna
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<211> 600
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocida
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de clitina: 6H22
mutant_dna
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<400> 18
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<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 597
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocida
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Mutante de clitina: 12mutCly_dna
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocida
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sintético
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<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatgacgacg acaagatggc cgacaccgcc ag
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocida
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sintético
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<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaggagaagc ccggtttatc aaggacacga agt
\hfill33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocida
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sintético
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgttgggat ccgccaccat ggccgacacc gcc
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocida
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sintético
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggccctcta gattatcaag gcacgaa
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (17)
1. La fotoproteína aislada que contiene una
secuencia de aminoácidos que:
a) es capaz de unir celenterazina y calcio,
produciendo bioluminiscencia; y
b) es idéntica en al menos el 90% a SEC ID N.º:
1 (clitina); y
c) en alineamiento de secuencia con SEC ID N.º:
1 (clitina), presenta una de las siguientes sustituciones
individual o múltiple (las posiciones de los residuos se refieren a
SEC ID N.º: 1):
- i)
- C_{54}\rightarrowS;
- ii)
- S_{132}\rightarrowC;
- iii)
- K_{48}\rightarrowR, N_{195}\rightarrowD;
- iv)
- Q_{68}\rightarrowR, A_{90}\rightarrowV, T_{184}\rightarrowI;
- v)
- Y_{82}\rightarrowF, K_{110}\rightarrowN, F_{125}\rightarrowL; S_{149}\rightarrowR;
- vi)
- G_{142}\rightarrowC;
- vii)
- I_{53}\rightarrowV, S_{149}\rightarrowR;
- viii
- N_{18}\rightarrowD, I_{40}\rightarrowV, K_{56}\rightarrowR
- ix)
- Gly_{58} \rightarrow Glu, Asp_{69} \rightarrow Val, Ala_{70} \rightarrow Cys, Lys_{76} \rightarrow Arg, Lys_{77} \rightarrow Gly, Ile_{78} \rightarrow Cys, Asp_{81} \rightarrow Glu, Val_{86} \rightarrow Ile, Glu_{87} \rightarrow Ala, Ala_{90} \rightarrow Gln, Val_{92} \rightarrow Leu, y Glu_{97} \rightarrow Gln.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La fotoproteína de la reivindicación 1 que
contiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 95% a
la SEC ID N.º: 1.
3. La fotoproteína de la reivindicación 2 que
contiene una secuencia de aminoácidos idéntica en al menos el 98% a
la SEC ID N.º: 1.
4. La fotoproteína de la reivindicación 3 que
contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo
constituido por SEC ID N.º: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10.
5. Una fotoproteína de acuerdo con las
reivindicaciones 1-4, en la que dicha secuencia de
aminoácidos está condensada con una secuencia objetivo
mitocondrial.
6. Un polinucleótido aislado que codifica una
fotoproteína de acuerdo con las reivindicaciones
1-5.
7. El polinucleótido de la reivindicación 6 que
tiene la secuencia de SEC ID N.º: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19.
8. Un vector de expresión que contiene un
polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
6-7.
9. Una célula huésped procariota o eucariota que
contiene el vector de la reivindicación 8.
10. Una célula huésped de mamífero de acuerdo
con la reivindicación 9.
11. Un procedimiento in vitro para
detectar cambios en la concentración de calcio intracelular que
comprende:
- a)
- proporcionar una célula que expresa una fotoproteína de acuerdo con las reivindicaciones 1-5;
- b)
- poner en contacto la célula con un agente que estimula el flujo de entrada de calcio o la liberación de calcio desde reservorios intracelulares;
- c)
- detectar la bioluminiscencia de la fotoproteína.
12. Un procedimiento de rastrear compuestos que
modulan la concentración de calcio intracelular, que comprende:
- a)
- proporcionar una célula que expresa una fotoproteína de acuerdo con las reivindicaciones 1-5;
- b)
- poner en contacto la célula con el compuesto candidato;
- c)
- detectar la bioluminiscencia de la fotoproteína.
13. Un procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 11 ó 12, que se lleva a cabo en un formato de alto
rendimiento.
14. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13, que se lleva a cabo con un aparato de rastreo
óptico de alto rendimiento adecuado para análisis de
multi-muestras.
15. El uso de una fotoproteína de acuerdo con
las reivindicaciones 1-5 como indicador de calcio
intracelular.
16. El uso de una fotoproteína de acuerdo con la
reivindicación 15 en un ensayo de alto rendimiento basado en
células.
17. El uso de una fotoproteína de acuerdo con
las reivindicaciones 1-5 para la preparación de una
composición diagnóstica.
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