ES2254043T3

ES2254043T3 - Proteinas fluorescentes y cromoproteínas de especies de hidrozoos que no son aequorea y métodos para su uso.

Info

Publication number: ES2254043T3
Application number: ES03779067T
Authority: ES
Inventors: Sergei Anatolievich Lukyanov; Dmitry Alexeevich Shagin; Yury Grigorievich Yanushevich
Original assignee: Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo " Evrogen"; ZAKRYTOE AKTSIONERNOE OBSCHESTVO EVROGEN
Current assignee: Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo " Evrogen"; ZAKRYTOE AKTSIONERNOE OBSCHESTVO EVROGEN
Priority date: 2002-11-12
Filing date: 2003-11-05
Publication date: 2011-10-24
Anticipated expiration: 2023-11-05
Also published as: JP2006506100A; WO2004044203A1; ES2254043T1; CA2505974A1; US7951923B2; EP2100958A1; ATE509946T1; US20070298412A1; DK1565559T3; AU2003285844A1; DE03779067T1; EP1565559A4; EP1565559A1; JP4644600B2; EP1565559B1

Abstract

Molécula aislada de ácido nucleico que codifica una proteína fluorescente o una cromoproteína, seleccionada del grupo que consta de: (a) un ácido nucleico que codifica una proteína que comprende la secuencia de aminoácido mostrada en los números de secuencia: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22; (b) un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida mostrada en los números de secuencia: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 ó 21; (c) un ácido nucleico que se hibrida, bajo condiciones severas, al ácido nucleico de (a) o (b) , descrito anteriormente; (d) un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácido de (a) , descrita anteriormente; (e) un ácido nucleico que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia nucleótida de (b) , descrita anteriormente; (f) un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene una sustitución, supresión o inserción de al menos un aminoácidoen la secuencia de aminoácido mostrada en los números de secuencia: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22; (g) un derivado o mimético del ácido nucleico de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) o (f) , descrito anteriormente; (h) un mutante del ácido nucleico de (a) , (b) , (c) , (d) o (e) , descrito anteriormente; (i) un ácido nucleico diferente del ácido nucleico de (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) o (h) , descrito anteriormente, debido a la degeneración del código genético; y (j) un fragmento del ácido nucleico de (a) o (b) , descrito anteriormente.

Description

Campo de la invención

La invención se refiere en general al campo de la biología y la química. Más en particular la invención se dirige a proteínas fluorescentes.

Antecedentes de la invención

El marcaje de una proteína, célula u organismo de interés tiene una función destacada en muchas aplicaciones bioquímicas, de biología molecular y de diagnóstico médico. Se ha desarrollado y usado en la técnica una variedad de marcadores diferentes, incluyendo radiomarcadores, cromomarcadores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, y similares, con diferentes propiedades y usos óptimos. Sin embargo, existe un interés continuo en el desarrollo de nuevos marcadores. Tiene un interés particular el desarrollo de nuevos marcadores proteínicos, incluyendo marcadores proteínicos fluorescentes.

La proteína fluorescente verde (GFP), sus mutantes y homólogos son ampliamente conocidos hoy en día debido a su uso intensivo como marcadores fluorescentes in vivo en ciencias biomédicas, discutido en detalle por Lippincott-Schwartz y Patterson en Science (2003) 300 (5616):87-91). La GFP de la hidromedusa Aequorea aequorea (sinónimo A. victoria), descubierta por Johnson y col. en J. Cell Comp. Physiol. (1962), 60:85-104, se encontró como parte del sistema bioluminiscente de la medusa, en la que la GFP tenía una función de emisor secundario transformando la luz azul de la fotoproteína aecuorina en luz verde. Después, se aislaron proteínas similares de varios celentéreos bioluminiscentes incluyendo la medusa hidroide Phialidium gregarium, pensamiento de mar Renilla (clase Anthozoa) y otros (véase Ward y col. en Photochem. Photobiol. (1982), 35: 803-808; Levine y col. en Comp. Biochem. Physiol. (1982), 72B: 77-85; Chalfie en Photochem. Photobiol. (1995), 62:651-656). Todas estas proteínas presentan fluorescencia verde (emisión a 497-509 nm) y funcionan como emisores secundarios en bioluminiscencia. Las proteínas fluorescentes también se aislaron de la especia Physalia y se determinó su secuencia de aminoácidos N-terminal (documento WO 03/017937).

El ADNc que codifica la GFP de A. victoria fue clonado por Prasher y col. (Gene (1992), 111(2):229- 33). Resultó que este gen puede ser expresado de forma heteróloga prácticamente en cualquier organismo, debido a la capacidad única de la GFP de formar un fluoróforo por si misma (Chalfie y col., Gene (1992), 111 (2):229-233). Este descubrimiento abre perspectivas amplias para usar la GFP en biología celular como un marcador fluorescente genéticamente codificado.

La GFP se aplicó en una amplia variedad de aplicaciones incluyendo el estudio de la expresión de genes y localización de proteínas (Chalfie y col., Science 263 (1994), 802-805, y Heim y col. en Proc. Nat. Acad. Sci. (1994),

91: 12501-12504), como herramienta para visualizar orgánulos subcelulares en células (Rizzuto y col., Curr. Biology (1995), 5: 635-642), para visualizar el transporte de proteínas a lo largo de la ruta secundaria (Kaether y Gerdes, FEBS Letters (1995), 369: 267-271).

Se ha llevado a cabo una gran cantidad de investigación para mejorar las propiedades de la GFP y producir reactivos de GFP útiles y optimizados para una variedad de propósitos de investigación. Se han desarrollado nuevas versiones de la GFP, tales como ADN de GFP “humanizado”, cuyo producto proteína tiene una síntesis mayor en células de mamífero (Haas, y col., Current Biology (1996), 6: 315-324; Yang, y col., Nucleic Acids Research (1996),

24: 4592-4593). Una de dichas proteínas humanizadas es la “proteína fluorescente verde potenciada” (EGFP). Otras mutaciones de la GFP han producido versiones que emiten luz azul, cian y verde-amarilla. Sin embargo, debido a la gran utilidad de la GFP, serían útiles en la técnica otras proteínas fluorescentes con propiedades similares o diferentes de la GFP. En particular, los beneficios de nuevas proteínas fluorescentes incluyen posibilidades de transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) basada en nuevos espectros y mejor idoneidad para una excitación más extensa. En 1999 se clonaron homólogos de la GFP de especies de Anthozoa no bioluminiscentes (Matz y col., Nature Biotechnol. (1999), 17: 969-973). Este descubrimiento demostró que estas proteínas no son un componente necesario de la maquinaria bioluminiscente. Las proteínas similares a GFP derivadas de Anthozoa presentaban una gran diversidad espectral incluyendo proteínas fluorescentes cian, verde, amarillo, rojo y cromoproteínas (CP) no fluorescentes azul-púrpura (Matz y col., Bioessays (2002), 24(10):953- 959).

El mayor inconveniente de las proteínas similares a la GFP derivadas de Anthozoa es la fuerte oligomerización que dificulta el uso de estas proteínas en muchas aplicaciones (Lauf y col., FEBS Lett. (2001), 498: 11-15; Campbell y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002), 99: 7877-7882; Mizuno y col., Biochemistry (2001), 40: 2502-2510). Por consiguiente, un objeto es proporcionar nuevas proteínas fluorescentes monómeras de diferentes colores así como los ADN que las codifican, que no tengan los inconvenientes de la GFP conocida.

Las especies de hidrozoos son una fuente potencial de dichas proteínas. Excepto la GFP de Aequorea victoria y homólogos de la GFP de otras especies de Aequorea, como los homólogos de la GFP muy próximos de Aequorea macrodactyla (número de acceso en GenBank AF435427-AF435433) y Aequorea coerulescens (Gurskaya y col., Biochem J. (2003), 373(Pt 2): 403-408), hasta la fecha no se han clonado otros genes que codifiquen proteínas fluorescentes de hidrozoos, aunque algunas de ellas se han caracterizado a nivel de proteína desde hace tiempo. La clonación y mutagénesis de proteínas fluorescentes de hidrozoos que no son Aequorea, es una forma posible de obtener nuevos marcadores fluorescentes con características mejoradas.

Otras técnicas anteriores importantes incluyen la de PRASHER D.C.: "Using GFP to see the light" Trends In Genetics, Elsevier, Amsterdam, NL, vol. 11, no. 8, 1995, páginas 320-323, XP004207387 ISSN: 0168-9525.

Resumen de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína fluorescente, seleccionada del grupo que consiste en:

(a): un ácido nucleico que codifica una proteína fluorescente que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; y

(b): un ácido nucleico que codifica una proteína fluorescente que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 90% a lo largo de la secuencia de la proteína entera respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Dicho ácido nucleico se puede aislar, sintetizar o estar presente en un medio no natural.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico de la presente invención se aísla de especies de hidrozoos que no son Aequorea que incluyen Phialidium sp., y dos medusas fluorescentes o medusas hidroides 1 y 2 (hidromedusas 1 y 2) del suborden Anthomedusae, o mutantes o derivados de las mismas.

Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislada codifica una proteína fluorescente que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 93% a lo largo de la secuencia de la proteína entera respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Preferiblemente, la proteína fluorescente que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 tiene un máximo de excitación a 525 nm y un máximo de emisión a 537 nm.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención, un casete de expresión que comprende:

(a): la molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención; y

(b): elementos reguladores para la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en la célula huésped deseada.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención, una célula que comprende la molécula de ácido nucleico, el vector o el casete de expresión de acuerdo con la presente invención, en la que la célula no es una célula madre embrionaria humana.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención, una línea celular estable que comprende la molécula de ácido nucleico, el vector o el casete de expresión de acuerdo con la presente invención, en la que la línea celular no es una línea de células madre embrionarias humanas.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención, una planta transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico, el vector o el casete de expresión de acuerdo con la presente invención.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención, un animal transgénico no humano que comprende la molécula de ácido nucleico, el vector o el casete de expresión de acuerdo con la presente invención.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención, un procedimiento para producir una proteína fluorescente, comprendiendo dicho procedimiento (a) proporcionar una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, operativamente unida a elementos reguladores de la expresión adecuados, (b) expresar la proteína fluorescente de dicha molécula de ácido nucleico, y (c) aislar la proteína sustancialmente exenta de otras proteínas.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención, una proteína fluorescente aislada seleccionada del grupo que consiste en:

(a): una proteína fluorescente que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; y

(b): una proteína fluorescente que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 90% a lo largo de la secuencia de la proteína entera respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

Preferiblemente, dicha proteína fluorescente tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 93% a lo largo de la secuencia de la proteína entera respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención, una proteína de fusión que comprende la proteína de acuerdo con la presente invención.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención, un anticuerpo que se une específicamente a la proteína de acuerdo con la presente invención.

También se proporciona de acuerdo con la presente invención, un kit que comprende el ácido nucleico, el vector, el casete de expresión, la proteína o la proteína de fusión de acuerdo con la presente invención.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de GFP, phiYFP, hydr1GFP y hm2CP. Los huecos introducidos se muestran mediante puntos. Los restos idénticos a los aminoácidos correspondientes en la GFP se representan mediante guiones.

La figura 2 ilustra los espectros de excitación (línea de trazos) y de emisión (línea continua) para phiYFP natural (A) y sus mutantes: phiYFP-Y1 (B), phiYFP-M0 (C), y phiYFP-M1 (D).

La figura 3 ilustra los espectros de excitación-emisión para las proteínas phiYFP-M1G1 (A) y phiYFP- M1C1 (B).

La figura 4 representa esbozos de la hidromedusa 1 (A) y la hidromedusa 2 (B) del suborden Anthomedusae.

La figura 5 ilustra los espectros de excitación-emisión para la hydr1GFP natural.

La figura 6 ilustra el espectro de absorción para la hm2CP natural.

La figura 7 ilustra los espectros de excitación-emisión para hm2CP natural

La figura 8 ilustra los espectros de excitación-emisión para el mutante fluorescente rojo S3-2 de hm2CP.

Descripción detallada de la invención

Como se usa en el presente documento las expresiones “proteína fluorescente” o “fluoroproteína” significan una proteína que es fluorescente; p. ej., puede presentar fluorescencia baja, media o intensa tras la irradiación con luz de la longitud de onda de excitación adecuada. La fluorescencia característica de estas proteínas es la que procede de la interacción de dos o más restos de aminoácidos de la proteína, y no de un solo resto de aminoácido. Como tal, las proteínas fluorescentes de la presente invención no incluyen proteínas que presentan fluorescencia solo de restos que actúan por sí mismos como fluoróforos intrínsecos, es decir, triptófano, tirosina y fenilalanina.

Como se usa en el presente documento las expresiones “cromoproteína” o “proteína cromogénica” significan una proteína coloreada, que puede ser fluorescente, de fluorescencia baja o sin fluorescencia. Como se usa en el presente documento, las expresiones “cromoproteína” y “proteína fluorescente” no incluyen luciferasas, tales como la luciferasa de Renilla.

Como se usa en el presente documento, el término “GFP” se refiere a la proteína fluorescente verde de Aequorea victoria, incluyendo las versiones de la técnica anterior de la GFP diseñada para proporcionar fluorescencia mayor o fluorescencia en diferentes colores. La secuencia de la GFP natural la han descrito Prasher y col., Gene 111 (1992), 229-33).

Como se usa en el presente documento, el término “EGFP” se refiere a variantes mutantes de la GFP que tienen dos sustituciones de aminoácidos F64L y S65T (Heim y col., Nature 373 (1995), 663-664).

Como se usa en el presente documento, el término “aislado” significa una molécula o una célula que está en un entorno diferente del natural en el que se encuentra la molécula o la célula.

Como se usa en el presente documento, el término “fragmento” se entiende que comprende, p. ej., una molécula de ácido nucleico o proteína cortada y empalmada alternativamente, o truncada o escindida de otra forma.

Como se usa en el presente documento, el término “derivado” se refiere a un mutante, o un ARN editado, o una molécula de ácido nucleico químicamente modificada, o alterada de otra forma, o a un mutante o proteína químicamente modificada o alterada de otra forma.

Como se usa en el presente documento, el término “mutante” se refiere a la proteína descrita en la presente invención, a la que se añaden y/o sustituyen y/o eliminan y/o insertan uno o más aminoácidos en el extremo N y/o el extremo C, y/o dentro de las secuencias de aminoácidos nativas de las proteínas de la presente invención. Como se usa en el presente documento, el término “mutante” se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína mutante. Además, el término “mutante” se refiere a cualquier versión más corta o más larga de la proteína o ácido nucleico de la presente invención.

Como se usa en el presente documento, “homólogo u homología” son términos usados en la técnica para describir la relación de una secuencia de nucleótidos o peptídica con otra secuencia de nucleótidos o peptídica, que se determina por el grado de identidad y/o similitud entre dichas secuencias comparadas.

Como se ha resumido antes, la presente invención se dirige a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas fluorescentes y cromoproteínas y mutantes, variantes y derivados de las mismas, así como proteínas y péptidos codificados por estos ácidos nucleicos. Las moléculas de ácido nucleico y proteínas de interés se aíslan de especies de hidrozoos que no son Aequorea. Las proteínas de interés incluyen la proteína fluorescente amarilla, phiYFP de Phialidium sp., proteína fluorescente verde, hydr1GFP de la medusa hidroide 1 (hidromedusa 1) del suborden Anthomedusae, y cromoproteína púrpura, hm2CP de la medusa hidroide 2 (hidromedusa 2) del suborden Anthomedusae. También tienen interés las proteínas que son sustancialmente similares, o derivadas, u homólogas,

o mutantes de las proteínas específicas a las que se ha hecho referencia antes. También se proporcionan fragmentos de los ácidos nucleicos y los péptidos codificados por estos, así como anticuerpos específicos para las proteínas y péptidos de la invención. Además, se proporcionan células huésped, líneas celulares estables y organismos transgénicos que comprenden las moléculas de ácido nucleico a las que se ha hecho referencia antes. Las composiciones de la proteína y ácido nucleico objeto son útiles en una variedad de aplicaciones y procedimientos diferentes, en particular aplicaciones de marcaje de proteínas. Finalmente, se proporcionan kits para usar en dichos procedimientos y aplicaciones.

Moléculas de ácido nucleico

La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas fluorescentes/ cromoproteínas de especies de hidrozoos, distintas del género Aequorea, derivados, mutantes y homólogos de estas proteínas, así como fragmentos de las mismas. Una molécula de ácido nucleico como se usa en el presente documento, es una molécula de ADN, tal como moléculas de ADN genómico o moléculas de ADNc, o moléculas de ARN, tales como moléculas de ARNm. En particular, dichas moléculas de ácido nucleico son moléculas de ADNc que tienen un marco de lectura abierto que codifica una comoproteína/proteína fluorescente de hidrozoos de la invención o fragmento de la misma, que en condiciones adecuadas pueden ser expresadas como proteína o fragmento de proteína (péptido) fluorescente/cromoproteína, de acuerdo con la invención. La invención también abarca ácidos nucleicos que son homólogos, sustancialmente similares, idénticos, derivados, o miméticos de ácidos nucleicos que codifican proteínas o fragmentos de proteínas de la presente invención. Los ácidos nucleicos objeto están presentes en un entorno distinto de su entorno natural; p. ej., se aíslan, están presentes en cantidades enriquecidas, o están presentes o se expresan in vitro o en una célula u organismo celular distinto de su entorno natural.

Las moléculas de ácido nucleico específicas de interés son aquellas que codifican las siguientes cromo/fluoroproteínas de hidrozoos (y homólogos/derivados/mutantes de las mismas): proteína fluorescente amarilla, phiYFP de Phialidium sp., proteína fluorescente verde, hydr1GFP de la medusa hidroide 1 del suborden Anthomedusae, y cromoproteína púrpura, hm2CP de la medusa hidroide 2, del suborden Anthomedusae. Cada uno de estos tipos particulares de moléculas de ácido nucleico de interés se discute ahora individualmente con mayor detalle.

phiYFP

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas fluorescentes/cromoproteínas se pueden aislar de un organismo de la clase Hydrozoa, preferiblemente del orden Hydroida, más preferiblemente del suborden Leptomedusae, más preferiblemente de la familia Campanulariidae, e incluso más preferiblemente del género Phialidium. En la realización particularmente preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de Phialidium sp., codifica una proteína específica denominada PhiYFP. Los homólogos/mutantes/derivados de esta proteína tales como phiYFP-Y1, phiYFP-M1, phiYFP-M0, phiYFP-M1G1 (es decir, phiYFP-G1 o phiGFP1), y phiYFP-M1C1 (es decir, phiYFP-C1 o phiCFP1), descritos con más detalle a continuación en la parte experimental, también tienen un interés particular. La secuencia codificante de ADNc natural deducida para PhiYFP se representa en la SEQ ID NO: 01.

hydr1GFP

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas fluorescentes/cromoproteínas se pueden aislar de un organismo de la clase Hydrozoa, preferiblemente del orden Hydroida, más preferiblemente del suborden Anthomedusae. La proteína específica codificada por dicha molécula de ácido nucleico se denomina hydr1GFP (es decir anm1GFP1). Los homólogos/mutantes/derivados de esta proteína también tienen un interés particular. La secuencia codificante de ADNc natural deducida para hydr1GFP se representa en la SEQ ID NO: 11.

hm2CP

Las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas fluorescentes/cromoproteínas se pueden aislar de un organismo de la clase Hydrozoa, preferiblemente del orden Hydroida, más preferiblemente del suborden Anthomedusae. La proteína específica codificada por dicha molécula de ácido nucleico se denomina hm2CP (es decir, anm2CP). Los homólogos/mutantes/derivados de esta proteína, tales como el mutante fluorescente rojo S3-2 de hm2CP, descrito más adelante con más detalle en la parte experimental, también tienen un interés particular. La secuencia codificante de ADNc natural deducida para hm2CP se representa en la SEQ ID NO: 13.

También tienen interés los homólogos de las moléculas de ácido nucleico descritas antes. La fuente de ácidos nucleicos homólogos puede ser cualquier especie de planta o animal o la secuencia puede ser total o parcialmente sintética incluyendo miméticos del ácido nucleico. En algunas realizaciones, el ácido nucleico de la presente invención tiene una similitud de secuencia con los homólogos correspondientes a nivel de nucleótidos o aminoácidos, de al menos aproximadamente 40%, y preferiblemente aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,

o mayor, incluyendo 75%, 80%, 85%, 90% y 95% o mayor. Una secuencia de referencia normalmente será al menos de aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, más normalmente al menos de aproximadamente 80 nucleótidos de longitud, y se puede extender a la secuencia completa que se está comparando. La similitud de secuencia se calcula basándose en una secuencia de referencia. En la técnica se conocen los algoritmos para el análisis de secuencias, tales como BLAST, descrito por Altschul y col., J. Mol. Biol., 215, pág. 403-10 (1990) (por ejemplo, usando los ajustes por defecto, es decir los parámetros w=4 y T=17).

Los homólogos se identifican por cualquiera de una serie de procedimientos. Un fragmento de ADNc de la presente invención se puede usar como una sonda de hibridación frente a una genoteca de ADNc de un organismo objetivo usando condiciones de restricción baja. La sonda puede ser un fragmento grande, o uno o más cebadores degenerados cortos. Los ácidos nucleicos que tienen similitud de secuencia se detectan por hibridación en condiciones de restricción bajas, por ejemplo, a 50ºC y 6xSSC (cloruro sódico 0,9 M/citrato sódico 0,09 M) seguido de lavado a 55ºC en 1xSSC (cloruro sódico 1,15 M/citrato sódico 0,015 M). La identidad de secuencia se puede determinar por hibridación en condiciones de restricción alta, por ejemplo, a 50ºC o superior y 0,1xSSC (cloruro sódico 15 mM/citrato sódico 1,5 mM). Los ácidos nucleicos que tienen una región sustancialmente idéntica a las secuencias proporcionadas, p. ej., variantes alélicas, versiones genéticamente alteradas del ácido nucleico, etc., se unen a las secuencias proporcionadas en condiciones de hibridación de restricción alta. Usando sondas, en particular sondas marcadas de secuencias de ADN, se pueden aislar genes homólogos o relacionados.

También se proporcionan ácidos nucleicos que hibridan con los ácidos nucleicos descritos antes en condiciones restrictivas, preferiblemente en condiciones de restricción alta (es decir, complementos de los ácidos nucleicos descritos previamente). Un ejemplo de condiciones restrictivas es hibridación a 50ºC o superior 0,1xSSC (cloruro sódico 15 mM/citrato sódico 1,5 mM). Otro ejemplo de condiciones de hibridación de restricción alta es incubación durante la noche a 42ºC en una disolución de formamida al 50%, 5xSSC (NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5 x disolución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y ADN de esperma de salmón fraccionado y desnaturalizado 20 g/ml, seguido de lavado en 0,1xSSC a aproximadamente 65ºC. Se conocen otras condiciones de hibridación de restricción alta en la técnica y también se pueden usar para identificar ácidos nucleicos de la invención.

Se proporcionan los ácidos nucleicos que codifican variantes, mutantes o derivados de las proteínas de la invención. Los mutantes o derivados se pueden generar en un molde de ácido nucleico seleccionado de los ácidos nucleicos descritos antes, por modificación, eliminación o adición de uno o más nucleótidos en la secuencia molde, o una combinación de los mismos, para generar una variante del ácido nucleico molde. Las modificaciones, adiciones o eliminaciones se pueden introducir por cualquier procedimiento conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Gustin y col., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; y Colicelli y col., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pág. 15.3-15.108) incluyendo la PCR propensa a error, barajado, mutagénesis dirigida de oligonucleótido, PCR de ensamblaje, mutagénesis por PCR sexual, mutagénesis in vivo, mutagénesis de casete, mutagénesis de conjunto recursiva, mutagénesis de conjunto exponencial, mutagénesis dirigida, mutagénesis aleatoria, reensamblaje de genes, mutagénesis de saturación de sitios de genes (GSSM), reensamblaje de ligado sintético (SLR), o una combinación de las mismas. Estas modificaciones, adiciones o eliminaciones también se pueden introducir por un procedimiento que comprende recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificada por fosfotioato, mutagénesis de molde que contiene uracilo, mutagénesis de dúplex discontinuo, mutagénesis por reparación de apareamiento erróneo, mutagénesis de cepa huésped de reparación deficiente, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis por eliminación, mutagénesis por restricción-selección, mutagénesis por restricción-purificación, síntesis artificial de genes, mutagénesis de ensamblaje, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos y una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, las proteínas fluorescentes codificadas por ácidos nucleicos mutantes o derivados tienen las mismas propiedades fluorescentes que la proteína fluorescente natural. En otras realizaciones, los ácidos nucleicos mutantes o derivados codifican proteínas fluorescentes con propiedades espectrales alteradas, como se describe con más detalle para los mutantes phiYFPY1, phiYFP-M1, phiYFP-M1G1, phiYFP-M1C1, S3-2 del presente documento.

Además, también se proporcionan las variantes degeneradas de los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de la presente invención. Las variantes degeneradas de ácidos nucleicos comprenden sustituciones de los codones del ácido nucleico por otros codones que codifican los mismos aminoácidos. En particular, las variantes degeneradas de los ácidos nucleicos se generan para aumentar su expresión en una célula huésped. En esta realización, los codones del ácido nucleico que no son preferidos o son menos preferidos en los genes en la célula huésped se sustituyen por los codones representados en exceso en secuencias codificantes en genes en la célula huésped, en la que dichos codones sustituidos codifican el mismo aminoácido. Las versiones humanizadas de los ácidos nucleicos de la presente invención tienen un interés particular. Como se usa en el presente documento, el término “humanizado” se refiere a cambios hechos en la secuencia de ácido nucleico para optimizar los codones para la expresión de la proteína en células de mamífero (humanas) (Yang y col., Nucleic Acids Research (1996) 24: 45924593). Véase también la patente de EE.UU. nº 5.795.737, que describe la humanización de proteínas.

El término “ADNc” como se usa en el presente documento, se pretende que incluya ácidos nucleicos que comparten la disposición de los elementos de la secuencia encontrados en la especie de ARNm madura nativa, en la que los elementos de la secuencia son exones y regiones no codificantes 5’ y 3’. Las especies de ARNm normalmente tienen exones contiguos, eliminándose los intrones intermedios, cuando están presentes, mediante corte y empalme de ARN nuclear, para crear un marco de lectura abierto continuo que codifica la proteína.

Una secuencia genómica de interés puede comprender el ácido nucleico presente entre el codón de inicio y el codón de parada, como se define en las secuencias listadas, incluyendo todos los intrones que normalmente están presentes en un cromosoma nativo. La secuencia genómica de interés puede incluir además regiones no traducidas 5’ y 3’ encontradas en el ARNm maduro, así como secuencias específicas reguladoras de la transcripción y traducción, tales como promotores, potenciadores, etc., incluyendo aproximadamente 1 kb, pero posiblemente más, de ADN genómico que flanquea en el extremo 5’ o 3’ de la región transcrita.

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden codificar toda o una parte de las proteínas objeto. Los fragmentos bicatenarios o monocatenarios se pueden obtener de la secuencia de ADN mediante síntesis química de oligonucleótidos de acuerdo con procedimientos convencionales, por digestión con enzimas de restricción, por amplificación por la PCR, etc. Para la mayor parte, los fragmentos de ADN serán de al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud, normalmente de al menos aproximadamente 18 nucleótidos de longitud o aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, y pueden ser de al menos aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, las presentes moléculas de ácido nucleico pueden ser de aproximadamente 100, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700 nucleótidos o más de longitud. Los presentes ácidos nucleicos pueden codificar fragmentos de las presentes proteínas o las proteínas enteras; p. ej. los presentes ácidos nucleicos pueden codificar polipéptidos de aproximadamente 25 aminoácidos, aproximadamente 50, aproximadamente 75, aproximadamente 100, aproximadamente 125, aproximadamente 150, aproximadamente 200 aminoácidos hasta la proteína de longitud completa.

Los presentes ácidos nucleicos se pueden aislar y obtener de forma sustancialmente purificada. La forma sustancialmente purificada significa que los ácidos nucleicos son al menos aproximadamente 50% puros, normalmente al menos aproximadamente 90% puros y habitualmente son “recombinantes”, es decir, flanqueados por uno o más nucleótidos con los que normalmente no están asociados en un cromosoma natural en su organismo huésped natural.

Los ácidos nucleicos de la presente invención, que tienen, p. ej. la secuencia de las SEQ ID NO: 01, 03, 05, 07, 09, 11, 13, 15, 17, 19 ó 21, los correspondientes ADNc, los genes de longitud completa y las construcciones, se pueden generar de forma sintética mediante una serie de protocolos diferentes conocidos para los expertos en la materia. Las construcciones de ácido nucleico adecuadas se purifican usando técnicas de ADN recombinante estándar como se describe, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, y de acuerdo con la normativa descrita, p. ej., en las Normas para la investigación del ADN recombinante del Instituto Nacional de la Salud (NIH), Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos (HHS).

También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican proteínas de fusión que comprenden una proteína de la presente invención, o fragmentos de la misma, que se discuten con más detalle a continuación.

También se proporciona un vector y otras construcciones de ácidos nucleicos que comprenden los presentes ácidos nucleicos. Los vectores adecuados incluyen vectores víricos y no víricos, plásmidos, cósmidos, fagos, etc., preferiblemente plásmidos, y se usan para la clonación, amplificación, expresión, transferencia etc. de la secuencia de ácido nucleico de la presente invención en el huésped adecuado. La elección del vector adecuado depende del experto en la materia, y hay muchos de dichos vectores disponibles en el comercio. Para preparar las construcciones, el ácido nucleico de longitud parcial o completa se inserta en un vector, típicamente mediante la unión con una ADN ligasa a un sitio escindido por una enzima de restricción en el vector. Alternativamente, la secuencia de nucleótidos deseada se puede insertar por recombinación homóloga in vivo, típicamente uniendo al vector regiones de homología en los flancos de la secuencia de nucleótidos deseada. Las regiones de homología se añaden por ligado de oligonucleótidos o por reacción en cadena de la polimerasa, usando cebadores que comprenden la región de homología y una parte de la secuencia de nucleótidos deseada, por ejemplo.

También se proporcionan casetes o sistemas de expresión usados, entre otros, para la producción de las presentes proteínas cromogénicas o fluorescentes o proteínas de fusión de las mismas, o para la replicación de las presentes moléculas de ácido nucleico. El casete de expresión puede existir como un elemento extracromosómico o puede estar integrado en el genoma de la célula como resultado de la introducción de dicho casete de expresión en la célula. Para la expresión, el producto génico codificado por el ácido nucleico de la invención se expresa en cualquier sistema de expresión conveniente, incluyendo, por ejemplo, sistemas bacterianos, de levadura, insecto, anfibio o mamífero. En el vector de expresión, un ácido nucleico objeto se une operativamente a una secuencia reguladora que puede incluir promotores, potenciadores, terminadores, operadores, represores e inductores. Los procedimientos para preparar casetes o sistemas de expresión capaces de expresar el producto deseado son conocidos para el experto en la materia.

Las líneas celulares que expresan establemente las proteínas de la presente invención, se pueden seleccionar por los procedimientos conocidos en la materia (p. ej., la cotransfección con un marcador seleccionable tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina, permite la identificación y el aislamiento de las células transfectadas que contienen el gen integrado en un genoma.

Los sistemas de expresión descritos antes se pueden usar en huéspedes procariotas o eucariotas. Se pueden usar células huésped tales como E. coli, B. subtilis, S. cerevisiae, células de insecto en combinación con vectores baculovirus, o células de un organismo superior tales como vertebrados, p. ej., células COS 7, HEK 293, CHO, oocitos de Xenopus, etc., para la producción de la proteína.

Cuando cualquiera de las células huésped a las que se ha hecho referencia antes, u otras células u organismos huésped adecuados, se usan para replicar y/o expresar los ácidos nucleicos de la invención, el ácido nucleico replicado resultante, proteína expresada o polipéptido está dentro del alcance de la invención como un producto de la célula u organismo huésped. El producto se puede recuperar por cualquier medio adecuado conocido en la técnica.

También tienen interés las secuencias promotoras de las secuencias genómicas de la presente invención, en las que la secuencia de la región que flanquea 5’ se puede usar para los elementos promotores, incluyendo sitios de unión del potenciador, que, por ejemplo, proporcionan la regulación de la expresión en células/tejidos en los que se expresan los genes de las presentes proteínas.

También se proporcionan fragmentos de ADN pequeños de los presentes ácidos nucleicos, que son útiles como cebadores para la PCR, sondas de cribado de hibridación, etc. Los fragmentos mayores de ADN son útiles para la producción del polipéptido codificado, como se ha descrito previamente. Sin embargo, para usar en reacciones de amplificación geométricas, tales como la PCR geométrica, se usará una pareja de fragmentos pequeños de ADN, es decir, cebadores. La composición exacta de las secuencias cebadoras no es crítica para la invención, pero en la mayoría de las aplicaciones, los cebadores hibridarán con la presente secuencia en condiciones restrictivas, como se conoce en la técnica. Es preferible elegir una pareja de cebadores que generarán un producto de amplificación de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 100 nucleótidos y pueden extenderse hasta la secuencia completa del ácido nucleico. Los algoritmos para la selección de las secuencias cebadoras son conocidos en general, y están disponibles en paquetes de software comercial. Los cebadores para la amplificación hibridan con las cadenas complementarias de ADN y cebarán una hacia la otra.

Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención también se pueden usar para identificar la expresión de un gen en una muestra biológica. La manera en la que se examina en las células la presencia de secuencias de nucleótidos particulares, tales como ADN o ARN genómicos, está bien establecida en la técnica. Brevemente, el ADN o ARN, se aíslan de una muestra celular. El ARNm se puede amplificar por RT-PCR, usando la transcriptasa inversa para formar una cadena de ADN complementaria, seguido de la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos para las presentes secuencias de ADN. Alternativamente, la muestra de ARNm se separa por electroforesis en gel, se transfiere a un soporte adecuado, p. ej., nitrocelulosa, nailon, etc., y después se hibrida con un fragmento del presente ADN como sonda. También se pueden usar otras técnicas, tales como ensayos de ligado de oligonucleótidos, hibridaciones in situ, e hibridación a sondas de ADN dispuestas en un chip sólido. La detección del ARNm que hibrida con la presente secuencia es indicativo de la expresión del gen en la muestra.

Los presentes ácidos nucleicos, incluyendo las regiones promotoras que flanquean y las regiones codificantes, se pueden mutar de varias formas conocidas en la técnica para generar cambios dirigidos en la resistencia del promotor

o para variar la secuencia de la proteína codificada o propiedades de la proteína codificada, incluyendo las propiedades fluorescentes de la proteína codificada.

En muchas realizaciones, los ácidos nucleicos encontrados en la especie Aequorea no están incluidos dentro del alcance de la invención. En algunas realizaciones, los homólogos de la GFP y los ácidos nucleicos que los codifican de Aequorea victoria, Aequorea macrodactyl, y Aequorea coerulscens, no están incluidos dentro del alcance de la presente invención.

Proteínas

La presente invención también proporciona cromoproteínas y proteínas fluorescentes de hidrozoos que no son de Aequorea y mutantes de las mismas incluyendo las proteínas de longitud completa, así como partes y fragmentos de las mismas. También se proporcionan variaciones de la proteína natural, en la que las variaciones son homólogas o sustancialmente similares a la proteína natural, y mutantes de las proteínas naturales, como se describe con más detalle a continuación.

En muchas realizaciones, las presentes proteínas tienen un máximo de absorbancia en el intervalo de aproximadamente 300 a 700, normalmente de aproximadamente 350 a 650 y lo más normalmente de aproximadamente 400 a 600 nm. Cuando las presentes proteínas son proteínas fluorescentes, por lo cual se entiende que se pueden excitar a una longitud de onda de la luz después de lo cual emitirán luz a otra longitud de onda, los espectros de excitación de las presentes proteínas habitualmente están en el intervalo de aproximadamente 300 a 700 nm. Las presentes proteínas en general tienen un coeficiente de extinción máximo que está en el intervalo de aproximadamente 25.000 a 150.000 y normalmente de aproximadamente 45.000 a 129.000. Las presentes proteínas habitualmente están en el intervalo de longitud de aproximadamente 150 a 300 aminoácidos y normalmente de aproximadamente 200 a 300 restos de aminoácido, y en general tienen un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 15 a 35 kDa, normalmente de aproximadamente 17,5 a 32,5 kDa.

En algunas realizaciones, las presentes proteínas son brillantes, donde por brillante se entiende que las cromoproteínas y proteínas fluorescentes se pueden detectar por procedimientos comunes (p. ej., selección visual, espectrofotometría, espectrofluorometría, microscopía fluorescente, por máquinas de FACS, etc.). El brillo de fluorescencia de proteínas fluorescentes particulares se determina por su rendimiento cuántico multiplicado por el coeficiente de extinción máximo. El brillo de una cromoproteína se puede expresar por su coeficiente de extinción máximo.

En algunas realizaciones, las presentes proteínas se pliegan rápidamente después de la expresión en la célula huésped. Por plegado rápido se entiende que las proteínas alcanzan su estructura terciara que da lugar a la cualidad de cromo o fluorescente en un periodo de tiempo corto. En estas realizaciones, las proteínas se pliegan en un periodo de tiempo que en general no supera aproximadamente 3 días, normalmente no supera aproximadamente 2 días y más normalmente no supera aproximadamente 1 día.

Las proteínas específicas de interés son cromoproteínas/proteínas fluorescentes (y homólogos, mutantes y derivados de las mismas) de una especie de hidrozoo que no es Aequorea: phiYFP de Phialidium sp., proteína fluorescente verde, hydr1GFP de la medusa hidroide 1 (hidromedusa 1) del suborden Anthomedusae, y cromoproteína púrpura, hm2CP de la medusa hidroide 2 (hidromedusa 2) del suborden Anthomedusae. Cada uno de estos tipos particulares de composiciones de polipéptidos de interés se discute ahora con mayor detalle de forma individual.

phiYFP (y derivados/mutantes de la misma)

Las proteínas de esta realización tienen un máximo de absorbancia en el intervalo de aproximadamente 350 a 550, normalmente de aproximadamente 450 a 550 y a menudo de aproximadamente 435 a 540 nm, p. ej., de 515 a 530 nm o de 480 a 490, mientras que el máximo de emisión habitualmente está en el intervalo de aproximadamente 400 nm a 650 nm y más normalmente de aproximadamente 450 a 600 nm, mientras que en muchas realizaciones los espectros de emisión están en el intervalo de aproximadamente 470 a 550 nm, p. ej., de 505 a 515 o de 520 a 530 nm, o de 530 a 540 nm. Las presentes proteínas habitualmente tienen una longitud en el intervalo de aproximadamente 200 a 250, normalmente de aproximadamente 210 a 240 restos de aminoácidos, y en general tienen un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 20 a 30, normalmente de aproximadamente 22,50 a 27,50 kDa. Tienen un interés particular en muchas realizaciones la phiYFP que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 02. También tienen interés los mutantes y derivados de esta secuencia, p. ej., phiYFP-Y1, phiYFP-M1, phiYFP-M0, phiYFP-M1G1 y phiYFP-M1C1, como en las SEQ ID NO: 04, 06, 08,18 y 20, respectivamente.

hydr1GFP (y derivados/mutantes de la misma)

En muchas realizaciones, las presentes proteínas objeto tienen un máximo de absorbancia en el intervalo de aproximadamente 400 a 600, y más normalmente de aproximadamente 450 a 550 y a menudo de aproximadamente 460 a 500 nm, p. ej., de 470 a 480 nm, mientras que los espectros de emisión de las presentes proteínas habitualmente están en el intervalo de aproximadamente 450 nm a 650 nm, normalmente de aproximadamente 460 a 600 y más normalmente de aproximadamente 480 a 550 nm, p. ej., de 480 a 500 nm, y a veces de 490 a 500 nm. Las presentes proteínas habitualmente tienen una longitud en el intervalo de aproximadamente 200 a 300 aminoácidos y normalmente de aproximadamente 220 a 290 restos de aminoácidos, y en general tienen un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 25 a 35 kDa, normalmente de aproximadamente 26,5 a 32,5 kDa. Tienen un interés particular en muchas realizaciones la proteína fluorescente hydr1GFP natural, que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 12, los mutantes y los derivados de la misma.

hm2CP (y mutantes de la misma)

En muchas realizaciones, las presentes proteínas tienen un máximo de absorbancia en el intervalo de aproximadamente 350 a 650, normalmente de aproximadamente 450 a 600 nm y más normalmente de aproximadamente 490 a 595 nm, p. ej., de 560 a 590 nm, mientras que los espectros de emisión de las presentes proteínas habitualmente están en el intervalo de aproximadamente 450 a 650, normalmente de aproximadamente 500 a 640 nm y más normalmente de aproximadamente de 580 a 620 nm, p. ej., de 590 a 620 nm. Las presentes proteínas habitualmente tienen una longitud en el intervalo de aproximadamente 210 a 240 restos de aminoácidos, y en general tienen un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 20 a 30 kDa, normalmente de aproximadamente 22,5 a 27,5 kDa. Tiene un interés particular en muchas realizaciones la proteína hm2CP (anm2CP), que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 14. También tienen interés los mutantes de esta secuencia, por ejemplo, la proteína fluorescente roja S3-2 y similares, como se proporciona, por ejemplo, en la SEQ ID NO: 16.

También se proporcionan los homólogos o las proteínas que varían en la secuencia respecto a las secuencias de aminoácidos específicas de la presente invención proporcionadas antes, es decir, las SEQ ID NO: 02, 04, 06, 08, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22. Por homólogo se entiende una proteína que tiene una identidad de la secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 55%, normalmente al menos aproximadamente 60% y más normalmente al menos aproximadamente 65% con respecto a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 02, 04, 06, 08, 10, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22 determinado usando el algoritmo de MegAlign, DNAstar clustal descrito por D.G. Higgins y P.M. Sharp, "Fast and Sensitive multiple Sequence Alignments on a Microcomputer," CABIOS, 5 pág. 151-3 (1989) (usando los parámetros ktuple 1, penalización por hueco 3, ventana 5 y diagonales guardadas 5). En muchas realizaciones, los homólogos de interés tienen una identidad de secuencia mucho mayor, p. ej., de 70%, 75%, 80%, 85%, 90% (p. ej., 92%, 93%, 94%) o mayor, p. ej., 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, en particular para la secuencia de aminoácidos que proporciona las regiones funcionales de la proteína.

También se proporcionan proteínas que son sustancialmente idénticas a la proteína natural, donde por sustancialmente idénticas se entiende que la proteína tiene una identidad de la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de la proteína natural que es al menos aproximadamente 60%, normalmente al menos aproximadamente 65% y más normalmente al menos aproximadamente 70%, donde en algunos casos la identidad puede ser mucho mayor, p. ej., 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o mayor.

También se proporcionan proteínas que son derivados o mutantes de las proteínas naturales descritas antes. Los mutantes y derivados pueden retener las propiedades biológicas de las proteínas naturales (p. ej., las que se encuentran de forma natural), o pueden tener propiedades biológicas que difieren de las proteínas naturales. La expresión “propiedad biológica” de las proteínas de la presente invención, se refiere, pero sin limitar, a propiedades espectrales, tales como el máximo de absorbancia, máximo de emisión, coeficiente de extinción máximo, brillo (p. ej., comparado con la proteína natural o con otra proteína de referencia tal como la proteína fluorescente verde (GFP) de A. victoria), y similares; propiedades bioquímicas, tales como la estabilidad in vivo y/o in vitro (p. ej., semivida); velocidad de maduración, tendencia a la agregación y tendencia a la oligomerización y otras propiedades similares. Las mutaciones incluyen cambios de un solo aminoácido, eliminaciones o inserciones de uno o más aminoácidos, truncados o extensiones N-terminales, truncados o extensiones C-terminales y similares.

Los mutantes y derivados se pueden generar usando técnicas estándar de biología molecular, como se describe con detalle en la sección anterior de “moléculas de ácidos nucleicos”. En el presente documento se describen varios mutantes. Con la guía proporcionada en los ejemplos y usando técnicas estándar, los expertos en la materia pueden generar fácilmente una amplia variedad de mutantes adicionales y ensayar si se ha alterado una propiedad biológica

(p. ej., bioquímica, espectral, etc.). Por ejemplo, la intensidad de la fluorescencia se puede medir usando un espectrofotómetro a diferentes longitudes de onda de excitación.

Los derivados también se pueden generar usando técnicas estándar e incluyen la edición de ARN, modificaciones químicas, modificaciones postraduccionales y postranscripcionales y similares. Por ejemplo, se pueden generar derivados mediante procedimientos tales como fosforilación alterada, o glicosilación o acetilación o lipidación, o por diferentes tipos de escisión de maduración y similares.

Aquellas proteínas de la presente invención que son proteínas naturales, están presentes en un entorno que no es natural, por ejemplo, están separadas de su entorno natural. Por ejemplo, se proporciona una proteína purificada, donde “purificada” significa que la proteína está presente en una mezcla que carece sustancialmente de proteínas no cromogénicas o fluorescentes de interés, donde “que carece sustancialmente” significa que menos de 90%, normalmente menos de 60% y más normalmente menos de 50% del contenido de la mezcla son proteínas no cromogénicas o fluorescentes o mutantes de las mismas. Las proteínas de la presente invención también pueden estar presentes en la forma aislada, por lo cual se entiende que la proteína carece sustancialmente de otras proteínas y otras moléculas biológicas naturales, tales como oligosacáridos, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, y similares, donde la expresión “que carece sustancialmente” en este caso significa que menos de 70%, normalmente menos de 60% y más normalmente menos de 50% de la composición que contiene la proteína aislada es alguna otra molécula biológica natural. En algunas realizaciones, las proteínas están presentes en forma sustancialmente purificada, donde “forma sustancialmente purificada” significa al menos 95%, normalmente al menos 97% y más normalmente al menos 99% puras.

También se proporcionan fragmentos de proteínas naturales así como de las proteínas mutantes y derivadas descritas antes. Los fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos que corresponden a dominios funcionales y similares, tienen un interés particular. Los fragmentos de interés son polipéptidos que habitualmente tienen al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, normalmente al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, preferiblemente al menos aproximadamente 75 ó 100 aminoácidos de longitud y pueden ser tan largos como de 300 aminoácidos de longitud o más largos, pero normalmente no excederán aproximadamente 250 aminoácidos de longitud, en los que el fragmento tendrá una región de aminoácidos que es idéntica a la presente proteína, de al menos aproximadamente 25 aminoácidos, y normalmente al menos aproximadamente 45 aminoácidos, y en muchas realizaciones de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, los presentes polipéptidos tienen aproximadamente 25 aminoácidos, aproximadamente 50, aproximadamente 75, aproximadamente 100, aproximadamente 125, aproximadamente 150, aproximadamente 200,

o aproximadamente 250 aminoácidos de longitud, hasta la longitud entera de la proteína. En algunas realizaciones, un fragmento de proteína retiene todas o sustancialmente todas las propiedades específicas de la proteína natural.

Las presentes proteínas y polipéptidos se pueden obtener de fuentes naturales o producir de forma sintética. Por ejemplo, las proteínas naturales se pueden obtener de fuentes biológicas que expresan las proteínas, p. ej., especie de hidrozoos, tales como las específicas listadas antes. Las presentes proteínas también se pueden obtener por medios sintéticos, p. ej. expresando una secuencia codificante de ácido nucleico recombinante, que codifica la proteína de interés en un huésped adecuado, como se ha descrito antes. Se puede usar cualquier procedimiento de purificación de proteínas conveniente, y las metodologías de purificación de proteínas adecuadas están descritas en Guide to Protein Purification, (Deuthser ed.) (Academic Press, 1990). Por ejemplo, se puede preparar un lisato a partir de la fuente original y purificar usando HPLC, cromatografía de exclusión, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad y similares.

También se proporcionan proteínas de fusión que comprenden una proteína de la presente invención, o fragmentos de la misma, fusionada, por ejemplo, con una secuencia de degradación, una secuencia de localización subcelular

(p. ej., señal de localización nuclear, señal de localización peroxisomal, secuencia de localización del aparato de Golgi, secuencia de localización mitocondrial, etc.), un péptido señal, o cualquier proteína o polipéptido de interés. Las proteínas de fusión pueden comprender por ejemplo, una fluoro/cromoproteína del polipéptido de la presente invención y un segundo polipéptido (“la pareja de fusión”) fusionado en el marco con el extremo N y/o el extremo C del fluoro/cromopolipéptido. Las parejas de fusión incluyen, pero sin limitar, polipéptidos que se pueden unir a anticuerpos específicos para la pareja de fusión (p. ej., marcadores epitópicos), anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos, polipéptidos que proporcionan una función catalítica o inducen una respuesta celular, ligandos o receptores o miméticos de los mismos, y similares. En dichas proteínas de fusión, la pareja de fusión en general no está asociada de forma natural con la parte de fluoro/cromoproteína de la proteína de fusión, y típicamente no es una fluoro/cromoproteína de hidrozoo de la presente invención o un derivado/fragmento de la misma, es decir no se encuentra en la especie de hidrozoos.

También se proporcionan anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas fluorescentes o cromoproteínas de la presente invención. Se pueden producir anticuerpos adecuados usando las técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales se pueden obtener como se describe en (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) y los anticuerpos monoclonales se puede obtener como se describe en (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice: Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology; 3ª edición, (1996) Academic Press). Los anticuerpos quiméricos incluyendo anticuerpos humanizados así como los anticuerpos monocatenarios y fragmentos de anticuerpo tales como Fv, F(ab’)2 y Fab también tiene interés.

Transgénicos

Los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden usar para generar organismos transgénicos o modificaciones de genes específicas del sitio en líneas celulares. Las células transgénicas de la presente invención incluyen uno o más ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, presentes como un transgén. Para los propósitos de la invención, se puede usar cualquier célula huésped adecuada incluyendo células huésped procariotas (p. ej. Escherichia coli, Streptomyces sp., Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, etc.) o eucariotas. El organismo transgénico de la presente invención puede ser un organismo procariota o eucariota incluyendo bacterias, cianobacterias, hongos, plantas y animales, en los que una o más de las células del organismo contienen el ácido nucleico heterólogo de la presente invención introducido mediante la intervención humana, tal como por técnicas transgénicas bien conocidas en la materia.

El ácido nucleico aislado de la presente invención se puede introducir en el huésped mediante procedimientos conocidos en la materia, por ejemplo mediante infección, transfección, transformación o transconjugación. Las técnicas para transferir las moléculas de ácido nucleico (es decir, ADN) a dichos organismos son conocidas y se proporcionan en referencias tales como Sambrook y col. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª Ed., (2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).

En una realización, el organismo transgénico puede ser un organismo procariota. Los procedimientos para la transformación de huéspedes procariotas están bien documentados en la materia (por ejemplo véase, Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, y Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology (1995) John Wiley & Sons, Inc).

En otra realización, el organismo transgénico puede ser un hongo, por ejemplo una levadura. La levadura se usa ampliamente como vehículo para la expresión de genes heterólogos (por ejemplo, véase, Goodey y col., Yeast biotechnology, D.R. Berry y col, eds, (1987) Allen and Unwin, Londres, pág 401-429) y King y col., Molecular and Cell Biology of Yeasts, E.F. Walton y G.T. Yarronton, eds, Blackie, Glasgow (1989) pág 107-133). Están disponibles varios tipos de vectores de levaduras, incluyendo vectores integradores, que requieren la recombinación con el genoma del huésped para su mantenimiento, y que replican vectores plasmídicos de forma autónoma.

Otro organismo huésped es un animal. Los animales transgénicos se pueden obtener por técnicas transgénicas bien conocidas en la materia y proporcionadas en referencia tales como Pinkert, Transgenic Animal Technology: a Laboratoiy Handbook, 2ª edición (2203) San Diego: Academic Press; Gersenstein y Vintersten, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3ª ed., (2002) Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory; Blau y col., Laboratory Animal Medicine, 2ª Ed., (2002) Fox J.G., Anderson L.C., Loew F.M., Quimby F.W. (Eds), American Medical Association, American Psychological Association; Gene Targeting: A Practical Approach, de Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2ª edición (2000). Por ejemplo, los animales transgénicos se pueden obtener mediante recombinación homóloga, en la que el locus endógeno es alterado. Alternativamente, se integra aleatoriamente una construcción de ácido nucleico en el genoma. Los vectores para la integración estable incluyen plásmidos, retrovirus y otros virus animales, YAC, y similares.

El ácido nucleico se pueden introducir en la célula directa o indirectamente, por introducción en un precursor de la célula, mediante manipulación genética intencionada, tal como por microinyección o por infección con un virus recombinante o con un vector vírico recombinante y similares. La expresión manipulación genética no incluye la fecundación cruzada clásica, o fertilización in vitro, sino que se dirige a la introducción de una molécula de ácido nucleico recombinante. Esta molécula de ácido nucleico se puede integrar en un cromosoma o puede ser ADN con replicación extracromosómica.

Las construcciones de ADN para la recombinación homóloga comprenderán al menos una parte de un ácido nucleico de la presente invención, en la que el gen tiene la o las modificaciones genéticas deseadas, que incluyen regiones de homología del locus objetivo. No es necesario que las construcciones de ADN para la integración aleatoria incluyan regiones de homología para mediar la recombinación. Se pueden incluir de forma conveniente marcadores para la selección positiva y negativa. Los procedimientos para generar células que tienen modificaciones de genes objetivo mediante recombinación homóloga son conocidos en la materia. Para las diferentes técnicas de transfección de células de mamífero, véase Keown y col., Meth. Enzymol. (1990) 185:527

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Para las células madre embrionarias (ES) se puede usar una línea de células ES, o se pueden obtener células embrionarias recientes de un huésped tal como un ratón, rata, cobayo, etc. Dichas células se cultivan en una capa cebadora de fibroblastos adecuada o se cultivan en presencia de factor inhibidor de leucemia (LIF). Las células embrionarias o ES transformadas se pueden usar para producir animales transgénicos usando la técnica adecuada descrita en la materia.

Los animales transgénicos pueden ser cualesquiera animales no humanos incluyendo mamíferos no humanos (p. ej., ratón, rata), un ave o un anfibio, etc., y se pueden usar en estudios funcionales, cribado de fármacos y similares.

Los ejemplos representativos del uso de animales transgénicos incluyen los descritos a continuación. También se pueden producir plantas transgénicas. Los procedimientos para preparar células de plantas transgénicas y plantas se describen en las patentes de EE.UU. nº 5.767.367; 5.750.870; 5.739.409; 5.689.049; 5.689.045; 5.674.731; 5.656.466; 5.633.155; 5.629.470; 5.595.896; 5.576.198; 5.538.879; 5.484.956. Los procedimientos para producir plantas transgénicas también se revisan en Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea and Leegood, John Wiley & Sons) (1993) pág. 275-295 y en Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey and Barz), (2002) pág. 719.

Por ejemplo, se pueden usar explantes embriogénicos que comprenden células somáticas para preparar el huésped transgénico. Después de recoger las células o el tejido, el ADN exógeno de interés se introduce en las células de la planta, estando disponibles una variedad de técnicas diferentes para dicha introducción. Para protoplastos aislados, surge la posibilidad de la introducción mediante protocolos de transferencia de genes mediada por ADN, incluyendo la incubación de los protoplastos con ADN desnudo, tal como plásmidos que comprenden la secuencia codificante exógena de interés en presencia de cationes polivalentes (por ejemplo, PEG o PLO); o electroporación de protoplastos en presencia de ADN desnudo que comprende la secuencia exógena de interés. Después se seleccionan los protoplastos que han absorbido satisfactoriamente el ADN exógeno, se desarrollan en un callo, y finalmente en una planta transgénica mediante el contacto con las cantidades y proporciones adecuadas de factores de estimulación tales como auxinas y citoquinas.

Se pueden usar otros procedimientos adecuados para producir plantas, tales como el procedimiento de “pistola génica” o transformación mediada por Agrobacterium, disponibles para los expertos en la materia.

Procedimientos de uso

Las proteínas fluorescentes de la presente invención (así como otros componentes de la presente invención descritos antes) tienen utilidad en una variedad de aplicaciones diferentes. Por ejemplo, se pueden usar en los procedimientos para el marcaje, análisis o detección de una molécula biológica, célula u orgánulo celular. Los usos representativos de cada uno de estos tipos de proteínas se describirán a continuación, donde los usos descritos en el presente documento son simplemente ilustrativos y no se pretende de ninguna forma que limiten el uso de las proteínas de la presente invención a aquellos descritos.

En una realización preferida relacionada con el procedimiento de marcaje de una molécula biológica, célula u orgánulo celular, las presentes proteínas tienen uso como marcadores in vivo (o moléculas indicadoras) en ensayos de células y de biología molecular. Los ensayos de interés incluyen, pero sin limitar, los ensayos para la expresión de genes, localización y colocalización de proteínas, interacciones proteína–proteína, interacciones proteína–ácido nucleico, interacciones ácido nucleico–ácido nucleico, localización e interacciones de células y orgánulos celulares, etc. Las proteínas fluorescentes de la presente invención son útiles como marcadores biomoleculares o marcadores de orgánulos celulares en células vivas y fijadas; como marcadores en la fusión de células u orgánulos, como marcadores de integridad de células u orgánulos, como marcadores de transfección (p. ej., como marcadores para la selección de células transfectadas que contienen un vector de expresión que codifica al menos una proteína fluorescente de la invención), como sondas en tiempo real que trabajan en concentraciones cercanas a la fisiológica, etc.

Además, las presentes proteínas se pueden usar en el procedimiento para analizar una molécula biológica. Por ejemplo, son útiles para identificar y/o medir la expresión de una proteína o polipéptido de interés en material biológico. Este procedimiento comprende: i) introducir en una célula una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína fluorescente de acuerdo con la presente invención, en el que dicha molécula de ácido nucleico se une operativamente a y bajo el control de una secuencia de control de la expresión que modera la expresión de dicha proteína o polipéptido de interés; ii) la expresión de dicho ácido nucleico en condiciones adecuadas; y iii) detectar la emisión de fluorescencia de la proteína fluorescente como medio de medición de la expresión de la proteína de interés.

En particular, las presentes proteínas son útiles para identificar y/o medir la expresión y/o para la localización de una proteína o polipéptido de interés en material biológico. Este procedimiento comprende: i) introducir en una célula una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína fluorescente de acuerdo con la presente invención, en el que dicha molécula de ácido nucleico se fusiona con la secuencia que codifica la proteína o polipéptido de interés, y se une operativamente a y bajo el control de una secuencia de control de la expresión que modera la expresión de dicha proteína o polipéptido de interés; ii) cultivar la célula en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de interés; y iii) detectar la emisión de fluorescencia de la proteína fluorescente como medio de medición de la expresión/localización de la proteína de interés.

Las aplicaciones de interés incluyen el uso de las presentes proteínas en procedimientos de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). En estos procedimientos, las presentes proteínas sirven como donadores y/o aceptores en combinación con una segunda proteína fluorescente o colorante, por ejemplo otra proteína fluorescente de la presente invención, o una proteína fluorescente como describen Matz y col., Nature Biotechnology 17:969-973 (1999); una proteína fluorescente verde de Aequorea victoria o un mutante fluorescente de la misma, por ejemplo, como se describe en las patentes de EE.UU. 6.066.476; 6.020.192; 5.985.577; 5.976.796; 5.968.750; 5.968.738; 5.958.713; 5.919.445; 5.874.304; otros colorantes fluorescentes tales como cumarina y sus derivados, 7-amino-4-metilcumarina y aminocumarina; colorantes BODIPY; Cascade Blue; o fluoresceína y sus derivados, tales como isotiocianato de fluoresceína y verde Oregón; colorantes de rodamina tales como rojo Texas, tetrametilrodamina, eosinas y eritrosinas; colorantes de cianina tales como Cy3 y Cy5; quelatos macrocíclicos de iones de lantánidos, tales como colorantes Quantum; y colorantes quimioluminiscentes tales como luciferasa, incluyendo los descritos en las patentes de EE.UU. nº 5.843.746; 5.700.673; 5.674.713; 5.618.722; 5.418.155; 5.330.906; 5.229.285; 5.221.623; 5.182.202.

Los ejemplos específicos en los que se pueden usar ensayos de FRET usando las presentes proteínas fluorescentes incluyen, pero sin limitar, la detección de interacciones de proteína–proteína, tales como un sistema de dos híbridos de mamífero, dimerización de factores de transcripción, multimerización de proteínas de membrana, formación de complejos de multiproteínas; como un biosensor para una serie de sucesos diferentes en los que un péptido o proteína se une covalentemente a una combinación fluorescente de FRET que incluye las presentes proteínas fluorescentes, y el péptido o proteína de unión es, por ejemplo, un sustrato específico de proteasa para la escisión mediada por caspasa, un péptido que experimenta cambio conformacional tras recibir una señal que aumenta o disminuye la FRET, tal como un dominio regulador PKA (cAMP-sensor), un sitio de fosforilación (por ejemplo, en el que hay un sitio de fosforilación en el péptido o el péptido tiene especificidad de unión al dominio fosforilado/desfoforilado de otra proteína), o el péptido tiene un dominio de unión de Ca2+. Además, las aplicaciones de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia o FRET en las que son útiles las proteínas de la presente invención incluyen, pero sin limitar, las descritas en las patentes de EE.UU. nº 6.008.373; 5.998.146; 5.981.200; 5.945.526; 5.945.283; 5.911.952; 5.869.255; 5.866.336; 5.863.727; 5.728.528; 5.707.804; 5.688.648;

5.439.797.

Las proteínas fluorescentes de la presente invención son útiles en un procedimiento para detectar los efectos de una sustancia de ensayo en la regulación de la expresión y/o traslocación de una o más proteínas de interés en una célula. Alternativamente, son útiles en un procedimiento para detectar la expresión de una proteína de interés y la actividad simultánea de una secuencia de control de la expresión en respuesta a una sustancia de ensayo. Las proteínas fluorescentes también son útiles en un procedimiento para comparar la actividad de dos o más secuencias de control de la expresión en una célula en respuesta a una sustancia de ensayo. Dichos procedimientos se pueden llevar a cabo en presencia y en ausencia de una sustancia de ensayo cuyo efecto se va a medir en el procedimiento.

Las proteínas fluorescentes de la presente invención también son útiles en aplicaciones que implican el cribado automático de matrices de células que expresan grupos indicadores fluorescentes usando la generación de imágenes por microscopio y análisis electrónico. El cribado se puede usar para descubrir fármacos y, en el campo de la genómica funcional en la que las presentes proteínas se usan como marcadores de células enteras, para detectar cambios en la reorganización y migración multicelular, por ejemplo en la formación de túbulos multicelulares (formación de vasos sanguíneos) por células endoteliales, migración de células a través del sistema Fluoroblok Insert (Becton Dickinson Co.), curación de heridas o crecimiento de neuritas. El cribado también se puede usar cuando las proteínas de la presente invención se usan como marcadores fusionados con péptidos (como secuencias de localización) o proteínas que detectan cambios en la localización intracelular como una indicador para la actividad celular, por ejemplo en la transducción de señales, tal como la traslocación de quinasa y factores de transcripción tras estímulos. Los ejemplos incluyen la proteína quinasa C, proteína quinasa A, factor de transcripción NFkB, y NFAT; proteínas del ciclo celular, tales como ciclina A, ciclina B1 y ciclina E; escisión por proteasa con el posterior movimiento del sustrato escindido; fosfolípidos, con marcadores para estructuras intracelulares tales como el retículo endoplásmico, aparato de Golgi, mitocondria, peroxisomas, núcleos, nucléolos, membrana plasmática, histonas, endosomas, lisosomas o microtúbulos.

Las proteínas de la presente invención también se pueden usar en el cribado de alto contenido para detectar la colocalización de otras proteínas de fusión fluorescentes con marcadores de localización como indicadores de movimientos de las proteínas/péptidos fluorescentes intracelulares o como marcadores solos. Los ejemplos de aplicaciones que implican el cribado automático de matrices de células, en las que las presentes proteínas fluorescentes son útiles incluyen las de la patente de EE.UU. 5.989.835; así como de los documentos WO 0017624; WO 00/26408; WO 00/17643; y WO 00/03246.

Las proteínas fluorescentes de la presente invención también son útiles en los ensayos de cribado de alto rendimiento. Las presentes proteínas fluorescentes son proteínas estables con semividas de más de 24 horas. También se proporcionan versiones desestabilizadas de las presentes proteínas fluorescentes con menores semividas, que se pueden usar como indicadores de la transcripción para el descubrimiento de fármacos. Por ejemplo, una proteína de acuerdo con la presente invención se puede fusionar con una secuencia señal proteolítica putativa derivada de una proteína con una semivida más corta, tal como una secuencia PEST del gen de la ornitina descarboxilasa de ratón, una caja de destrucción de ciclina B1 de ratón o ubiquitina, etc. Para una descripción de las proteínas y vectores desestabilizados que se pueden usar para producir los mismos, véase p. ej., la patente de EE.UU. nº 6.130.313. Los promotores de las rutas de transcripción de señales se pueden detectar usando versiones desestabilizadas de las presentes proteínas fluorescentes para el cribado de fármacos, tales como, por ejemplo, API, NFAT, NFkB, Smad, STAT, p53, E2F, Rb, myc, CRE, ER, GR y TRE, y similares.

Las presentes proteínas se pueden usar como detectores de mensajero secundarios mediante fusión de las presentes proteínas con dominios específicos tales como el dominio de unión de Ca PKCgamma, dominio de unión de DAG PKCgamma, dominio SH2 o dominio SH3, etc.

Las formas secretadas de las presentes proteínas, que a su vez se pueden usar en una variedad de aplicaciones diferentes, se pueden preparar mediante la fusión de las secuencias guía secretadas con las presentes proteínas.

Las presentes proteínas también son útiles en las aplicaciones de separación de células activadas por fluorescencia (FACS). En dichas aplicaciones, la presente proteína fluorescente se usa como marcador para marcar una población de células y la población resultante de células marcadas después se separa con un dispositivo de separación de células activadas por fluorescencia, como se conoce en la materia. Los procedimientos de FACS se describen en las patentes de EE.UU. nº 5.968.738 y 5.804.387.

Las presentes proteínas también son útiles como marcadores in vivo en animales transgénicos. Por ejemplo, la expresión de la presente proteína puede estar dirigida por promotores específicos de tejido, en los que dichos procedimientos son útiles en la investigación para la terapia génica, tal como el ensayo de la eficacia de la expresión transgénica, entre otras aplicaciones. Una aplicación representativa de las proteínas fluorescentes en animales transgénicos que ilustra dichas aplicaciones se encuentra en el documento WO 00/02997.

Las aplicaciones adicionales de las proteínas de la presente invención incluyen el uso como marcadores después de inyección en células o animales, y en la calibración para la medición cuantitativa; como marcadores o indicadores en dispositivos biosensores de oxígeno para el seguimiento de la viabilidad celular; como marcadores o etiquetas para animales, mascotas, juguetes, alimentos y similares.

Las presentes proteínas fluorescentes también son útiles en ensayos de escisión por proteasa. Por ejemplo, los ensayos de fluorescencia inactivada por escisión se pueden desarrollar usando las presentes proteínas, en los que las presentes proteínas están diseñadas para incluir una secuencia de escisión específica de proteasa sin destruir el carácter fluorescente de la proteína. Tras la escisión de la proteína fluorescente por una proteasa activada, la fluorescencia disminuiría rápidamente debido a la destrucción del cromóforo funcional. Alternativamente, la fluorescencia activada por escisión se puede desarrollar usando las proteínas de la presente invención, en la que las proteínas están diseñadas para contener una secuencia espaciadora adicional próxima/dentro del cromóforo. Esta variante tiene una actividad fluorescente significativamente menor, porque partes del cromóforo funcional están divididas por el espaciador. El espaciador está enmarcado entre dos sitios idénticos de escisión específicos de proteasa. Tras la escisión mediante la proteasa activada, el espaciador sería cortado y la dos “subunidades” residuales de la proteína fluorescente serían capaces de volver a unirse para generar una proteína fluorescente funcional. Ambas aplicaciones anteriores se podrían desarrollar en ensayos para una variedad de tipos diferentes de proteasas, tales como caspasas y otras.

Las presentes proteínas también se pueden usar en ensayos para determinar la composición de fosfolípidos en membranas biológicas. Por ejemplo, las proteínas de fusión de las presentes proteínas (o cualquier clase de modificación covalente o no covalente de las presentes proteínas) que permiten la unión a fosfolípidos específicos para localizar/visualizar patrones de distribución de fosfolípidos en membranas biológicas, mientras que permiten la colocalización de proteínas de membrana en grupos de fosfolípidos específicos, se pueden realizar con las proteínas presentes. Por ejemplo, el dominio PH de GRP1 tiene una alta afinidad por el trifosfato de fosfatidil-inositol (PIP3), pero no por el PIP2. Como tal, se puede construir una proteína de fusión entre el dominio PH de GRP1 y las presentes proteínas, para marcar específicamente zonas ricas en PIP3 en membranas biológicas.

Las presentes proteínas fluorescentes también son útiles como biosensores en células procariotas y eucariotas, tal como un indicador de iones Ca2+, un indicador de pH, un indicador de fosforilación; o como un indicador de otros iones tales como magnesio, sodio, potasio, cloruro y haluros. Los procedimientos para usar las proteínas fluorescentes como biosensores también incluyen los descritos en las patentes de EE.UU. nº 5.972.638; 5.824.485 y

5.650.135 (así como las referencias citadas en las mismas).

Los anticuerpos de la presente invención, descritos antes, también son útiles en una serie de aplicaciones, incluyendo la diferenciación de las presentes proteínas de otras proteínas fluorescentes.

Kits

La presente invención también proporciona kits para usar en la práctica de una o más de las aplicaciones descritas antes. En realizaciones preferidas, los kits se pueden usar para el marcaje de una molécula biológica. Los kits típicamente incluyen la proteína de la invención como tal, o un ácido nucleico que codifica la misma, preferiblemente con los elementos para la expresión de las presentes proteínas, por ejemplo, una construcción tal como un vector que comprende un ácido nucleico que codifica la presente proteína. La invención también abarca medios para producir dichos componentes del kit. Dichos medios pueden incluir el ADNc de medusa de hidrozoos y una pareja de cebadores oligonucleótidos para producir el ácido nucleico de la presente invención, p. ej., por PCR, o dichos medios pueden incluir una serie de fragmentos de ácido nucleico, que cuando se ligan pueden producir el ácido nucleico que codifica la proteína fluorescente de la presente invención, etc. Los componentes del kit están típicamente presentes en un medio de conservación adecuado, tal como una disolución tamponada, típicamente en un envase adecuado. También pueden estar presentes en los kits anticuerpos específicos para la proteína proporcionada. En algunas realizaciones, el kit comprende una pluralidad de vectores diferentes, que codifica cada uno la presente proteína, en el que los vectores están diseñados para la expresión en diferentes entornos y/o en diferentes condiciones, por ejemplo, la expresión constitutiva en la que el vector incluye un promotor fuerte para la expresión en células de mamíferos o un vector sin promotor con un sitio de clonación múltiple para la inserción a medida de un promotor y expresión adaptada, etc.

Además de los componentes anteriores, los presentes kits incluirán además instrucciones para la práctica de los presentes procedimientos. Estas instrucciones pueden estar presentes en dichos kits en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no como limitación.

Ejemplos

Ejemplo 1

Clonación, secuenciación y producción de la proteína recombinante phiYFP

La fluorescencia amarilla brillante se detectó usando un microscopio de fluorescencia en la hidromedusa Phialidium sp. (Cnidaria; Hydrozoa; Hydroida; Leptomedusae; Campanulariidae). Para encontrar la proteína responsable de la fluorescencia en esta medusa, se eligió una estrategia basada en el cribado de una genoteca de ADNc de expresión en E. coli. Las muestras de ADNc amplificadas se prepararon usando un kit de amplificación de ADNc SMART (Clontech) y se clonaron en el vector PCR-Script (Stratagene). Se seleccionaron de forma visual aproximadamente 105 clones recombinantes usando un estereomicroscopio fluorescente. Se encontraron 2 clones fluorescentes que codificaban las mismas proteínas fluorescentes amarillas y se denominaron phiYFP. Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos para phiYFP se muestran en las SEQ ID NO: 01, 02 y 23. La comparación de phiYFP con la GFP de A. victoria se muestra en la figura 1. Parece que phiYFP es más similar a la GFP (identidad de 50%) que las proteínas fluorescentes derivadas de coral.

Para facilitar la purificación de la proteína, la región codificante del gen de phiYFP se clonó en un vector de expresión pQE30 (Qiagen), de modo que la proteína recombinante contenía un marcador de 6 histidinas en el extremo N. Después de la expresión en E. coli, la proteína phiYFP se purificó mediante una resina de afinidad con metales TALON (Clontech) Los espectros de excitación-emisión para phiYFP tenían máximos a 525 y 537 nm (figura 2A), respectivamente. A diferencia con la GFP de A. victoria natural, la nueva proteína tenía solo un máximo de absorción-excitación, correspondiente probablemente a un estado del cromóforo desprotonado.

Ejemplo 2

Mutagénesis de phiYFP

El ácido nucleico que codifica la secuencia de phiYFP se preparó como se ha descrito antes en el ejemplo 1. Los autores de la invención han modificado la proteína natural codificada por mutagénesis aleatoria. La mutagénesis aleatoria de phiYFP dio como resultado la generación de un mutante más brillante denominado phiYFP-Y1 con espectros de excitación–emisión ligeramente alterados. Este mutante contenía 3 sustituciones de aminoácidos, específicamente S2P, E174G, I201M (SEQ ID NO: 03, 04, y 24). phiYFP-Y1 presentaba un brillo de 1,5 a 2 veces mayor que la phiYFP en una comparación visual lado a lado de colonias de E. coli que expresan estas proteínas fluorescentes. Además, phiYFP-Y1 demostró un espectro de emisión ligeramente desplazado al rojo que tenía un máximo a 542 nm (véase la figura 2B).

Se encontró que tanto la proteína phiYFP como phiYFP-Y1 eran dímeras. Se demostró por electroforesis en gel de proteínas de muestras de proteínas no calentadas (véase Baird y col., véase antes, 2000). En estas condiciones estas FP migraban como una banda fluorescente amarilla a aproximadamente 50 kDa. Los ensayos de filtración en gel proporcionaron un estado dímero de phiYFP y phiYFP-Y1. Las muestras de proteínas purificadas (1 mg/ml) se cargaron en una columna Sephadex-100 (0,7 x 60 cm) y se eluyeron con una disolución de tampón de fosfato 50 mM (pH 7,0) y NaCl 100 mM. Se usaron como referencias de monómero, dímero y tetrámero EGFP, HcRed1 y DsRed2 (Clontech), respectivamente.

Se usó la mutagénesis dirigida para crear una variante monómera de phiYFP-Y1. Se introdujeron 6 sustituciones de aminoácidos, específicamente V103N, M166R, Y198N, T202S, T206K, V221K. En total, este mutante phiYFP-M0 llevaba 9 sustituciones: S2P, V103N, M166R, E174G, Y198N, I201M, T202S, T206K, V221K (SEQ ID NO: 05, 06, y 25). phiYFP-M0 demostró un plegado de proteína lento y brillo bajo cuando se expresó en E. coli. Sus espectros de excitación-emisión estaban desplazados al azul comparado con el mutante parental (máximo a 517 y 529 nm, respectivamente; figura 2C). phiYFP-M0 era una proteína monómera de acuerdo con los ensayos de filtración en gel. Para mejorar phiYFP-M0 los autores de la invención aplicaron la mutagénesis aleatoria. Se usó el kit de mutagénesis aleatoria Diversity PCR Random Mutagenesis (CLONTECH), en condiciones óptimas para 5-6 mutaciones por 1000 pb. Las colonias de E. coli que expresaban las proteínas mutantes se cribaron de forma visual con un estereomicroscopio fluorescente SZX-12 (Olympus). El clon más brillante con espectros aparentemente desplazados al rojo (comparados con la phiYFP-M0 parental) se caracterizó mejor. Este mutante denominado phiYFP-M1 contenía las siguientes sustituciones de aminoácidos: E88D, V103N, M166C, E174G, 1201M, T202S, T206K, V221K (SEQ ID NO: 07, 08 y 26). Los espectros de excitación-emisión para esta proteína tenían máximos a 524 y 539 nm, respectivamente, de forma similar a los de phiYFP natural (Figura 2D). phiYFP-M1 purificada tenía un coeficiente de extinción molar de 130.000 M-1cm.1 y un rendimiento cuántico de fluorescencia de 0,40. Para la determinación del coeficiente de extinción molar, los autores de la invención se basaron en la evaluación de la concentración de cromóforo maduro. La proteína se desnaturalizó con álcali con un volumen igual de NaOH 2 M. En estas condiciones, el cromóforo similar a la GFP absorbe a 446 nm y su coeficiente de extinción molar es 44.000 M-1cm-1 (Ward, W.W. “Properties of the coelentrate green-fluorescent protein”, en Bioluminescence and Chemiluminescence. Academic Press (1981), 235-242). Se midieron los espectros de absorción para la phiYFP-M1 nativa y desnaturalizada con álcali. El coeficiente de extinción molar de la proteína en estado nativo se calculó basándose en la absorción de la proteína desnaturalizada. Para la determinación del rendimiento cuántico, la fluorescencia de phiYFP-M1 se comparó con la EGFP que absorbe igual (rendimiento cuántico 0,60 (Patterson y col., J. Cell. Sci. (2001), 114: 837-838)). phiYFP-M1 era una proteína monómera de acuerdo con los ensayos de filtración en gel.

Para potenciar la expresión en células de mamíferos, los autores de la invención sintetizaron la versión “humanizada” de phiYFP-M1 usando codones optimizados para mamíferos (SEQ ID NO: 09, 10 y 27). La versión "humanizada" de phi YFP-M1 se sometió a mutagénesis dirigida y aleatoria para obtener las versiones de emisión de luz verde y cian de la proteína. Se obtuvieron las proteínas fluorescentes mutantes con fluorescencia verde y cian. El mutante verde de la phiYFP-M1 humanizada, denominado phiYFP- M1G1, contenía las siguientes sustituciones de aminoácidos (comparado con phiYFP-M1): T65S, L148Q, Y203T, K231T, T232A (SEQ ID NO: 17, 18 y 31). El mutante cian de la phiYFP-M1 humanizada, denominado phiYFP-M1C1, contenía las siguientes sustituciones de aminoácidos (comparado con phiYFP-M1): L6Q, T65S, Y66W, N124K, C147Y, L148Q, Y203T, V224L (SEQ ID NO: 19, 20 y 32). Los espectros de excitación-emisión para esta proteínas se muestran en las figura 3A, B.

Ejemplo 3

Clonación, secuenciación y producción de la proteína recombinante hydr1GFP

La fluorescencia verde brillante se detectó usando un microscopio de fluorescencia en una hidromedusa 1 (aproximadamente 1 mm de longitud, figura 4) del suborden Anthomedusae (Cnidaria, Hydrozoa, Anthomedusae). Para buscar el gen responsable de la fluorescencia en esta medusa, se implementó una estrategia basada en el cribado de una genoteca de ADNc de expresión en E. coli. Las muestras de ADNc amplificadas se prepararon usando un kit de amplificación de ADNc SMART (Clontech) y se clonaron en el vector PCR-Script (Stratagene). Se seleccionaron de forma visual aproximadamente 105 clones recombinantes usando un estereomicroscopio fluorescente. Se identificaron 3 clones fluorescentes que codifica cada uno la misma proteína fluorescente verde que se denominó hydr1GFP. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para esta proteína se muestran en las SEQ ID NO: 11, 12 y 28. Se muestra una comparación de hydr1GFP con la GFP de A. victoria en la figura 1. Parece que hydr1GFP es más parecida a la GFP (identidad de 37%) que las proteínas fluorescentes de corales.

Para facilitar la purificación de la proteína, la región codificante de hydr1GFP se clonó en un vector de expresión pQE30 (Qiagen), de modo que la proteína recombinante contenía un marcador de 6 histidinas en el extremo N. Después de la expresión en E. coli, la proteína hydr1GFP se purificó mediante una resina de afinidad con metales TALON (Clontech) Los espectros de excitación-emisión para hydr1GFP mostraban máximos a 474 nm y 494 nm (figura 5). A diferencia con la GFP de A. victoria natural, la nueva proteína hydr1GFP tenía solo un máximo de absorción-excitación, que puede corresponder a un estado del cromóforo desprotonado.

Ejemplo 4

Clonación, secuenciación y producción de la proteína recombinante hm2CP

La fluorescencia verde brillante se detectó en una hidromedusa 2 pequeña del suborden Anthomedusae (Cnidaria, Hydrozoa, Anthomedusae) usando un microscopio de fluorescencia. Para buscar la FP de esta medusa, los autores de la invención escogieron una estrategia basada en el cribado de una genoteca de ADNc de expresión en E. coli. Las muestras de ADNc amplificadas se prepararon usando un kit de amplificación de ADNc SMART (Clontech) y se clonaron en el vector PCR-Script (Stratagene). Se seleccionaron de forma visual aproximadamente 105 clones recombinantes usando un estereomicroscopio fluorescente o a simple vista. De forma inesperada, los autores de la invención no observaron clones fluorescentes. En su lugar, se identificó la CP no fluorescente púrpura (hm2CP). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos para esta proteína se muestran en las SEQ ID NO: 13, 14 y 29. Se muestra una comparación de hm2CP con la GFP en la figura 1. Parece que hm2CP es relativamente distante a la GFP homóloga (identidad tan baja como 24%).

Para facilitar la purificación de la proteína, la región codificante de hm2CP se clonó en un vector de expresión pQE30 (Qiagen), de modo que la proteína recombinante contenía un marcador de 6 histidinas en el extremo N. Después de la expresión en E. coli, la proteína hm2CP se purificó mediante una resina de afinidad con metales TALON (Clontech) El espectro de absorción para hm2CP purificada tenía un solo máximo a 568 nm (figura 6). Se pudo detectar una fluorescencia roja muy débil (máximos de excitación a 569 y 597 nm, respectivamente) de hm2CP (figura 7).

Ejemplo 5

Mutagénesis de hm2CP

La secuencia codificante de ácido nucleico de hm2CP se preparó como se ha descrito antes en el ejemplo 4. Para generar los mutantes fluorescentes de hm2CP los autores de la invención usaron la mutagénesis aleatoria. Se usó el kit de mutagénesis aleatoria Diversity PCR Random Mutagenesis (Clontech) para la mutagénesis aleatoria de hm2CP, en condiciones óptimas para 5-6 mutaciones por 1000 pb. Las colonias de E. coli que expresaban las proteínas mutantes se seleccionaron de forma visual con un estereomicroscopio fluorescente SZX-12 (Olympus). Las variantes más brillantes se seleccionaron y se sometieron a otro ciclo de mutagénesis aleatoria. En total 4 ciclos de mutagénesis dieron como resultado un mutante fluorescente rojo brillante y que maduraba rápido, denominado S3-2. Comparado con la cromoproteína parental, S3-2 llevaba 13 sustituciones de aminoácidos, específicamente D24G, I30V, K73R, T91S, I118V, K136R, T145N, S154P, C161A, Y162F, L181M, V199T, I201T (SEQ ID NO: 15, 16 y 30). Los espectros de excitación y emisión para este mutante tenían máximos a 585 y 611 nm, respectivamente (Figura 8). La proteína fluorescente roja S3-2 tenía una naturaleza monómera como se puso de manifiesto por los datos de filtración en gel. Para potenciar la expresión en células de mamíferos, los autores de la invención sintetizaron la versión “humanizada” de S3-2 usando codones optimizados para mamíferos (SEQ ID NO: 21, 22 y 33).

Ejemplo 6

Preparación de anticuerpo policlonal

Las regiones codificantes de los ácidos nucleicos de la proteína fluorescente roja S3-2 y proteína fluorescente amarilla phiYFP-M1 preparadas como se ha descrito antes en los ejemplos 2 y 5, respectivamente, se clonaron en el vector de expresión pQE30 (Qiagen), de modo que las proteínas recombinantes contenían el marcador de 6 histidinas en su extremo N. Después de expresión en E. coli, hm2CP se purificó mediante resina de afinidad con metales TALON (Clontech) en condiciones desnaturalizantes. Se inmunizaron conejos y se administraron refuerzos 4 veces en intervalos mensuales con el polipéptido DSN recombinante emulsionado en adyuvante completo de Freund. Diez u 11 días después de cada refuerzo, se recogió sangre de los animales. Se ensayó la proteína recombinante en antisuero policlonal por ELISA y por inmunotransferencia.

Ejemplo 7

Marcaje de células de mamífero usando las proteínas phiYFP y S3-2

Para el marcaje fluorescente de célula eucariotas, las versiones humanizadas de las proteínas phiYFP-M1 y S3-2 preparadas como se ha descrito antes en los ejemplos 2 y 5, respectivamente, se clonaron en el vector pEGFP-C1 (CLONTECH) entre los sitios de restricción AgeI y BglII (en lugar de la región codificante de EGFP). Se usaron las siguiente líneas celulares: células epiteliales de riñón humanas 293T, fibroblastos embrionarios de ratón 3T3, fibroblastos subcutáneos murinos L929, células epiteliales de riñón de mono verde africano Vero y fibroblastos de riñón de mono verde africano COS1. Las células se transfectaron usando el reactivo Lipofectamine (Invitrogen) y se ensayaron 20 h después de transfección. Se usó un microscopio de fluorescencia CK40 Olympus equipado con una cámara con CCD (DP-50, Olympus) para la generación de imágenes celulares. La expresión de phiYFP-M1 o S3-2 en diferentes líneas celulares produjo señales rojas o amarillo brillantes sin agregación. La fluorescencia era claramente detectable 24 horas después de la transfección. No se observó toxicidad celular.

Ejemplo 8

Análisis de marcaje de proteínas y localización de proteínas usando las proteínas phiYFP y S3-2

Las versiones humanizadas de las proteínas phiYFP-M1 y S3-2 preparadas como se ha descrito antes en los ejemplos 2 y 5, respectivamente, se fusionaron con beta-actina citoplasmática humana. La transfección de células epiteliales de riñón humanas 293T con plásmidos que expresan construcciones marcadas fusionadas con phiYFPM1 o S3-2 produjo fluorescencia brillante que puso de manifiesto un patrón que se correspondía mucho con el observado para las fusiones con EGPF.

La versión humanizada de phiYFP-M1 se fusionó además con tubulina alfa y proteína nucleolar, fibrilarina humanas.

Las células epiteliales de riñón humanas 293T transfectadas con plásmidos que expresan construcciones marcadas fusionadas con phiYFP-M1 produjeron fluorescencia brillante con un patrón característico para las correspondientes parejas de fusión.

Ejemplo 9

Marcaje de mitocondrias usando phiYFP

La secuencia codificante de la versión de phiYFP-M1 humanizada preparada como se ha descrito antes en el ejemplo 2 se fusionó con la secuencia de localización mitocondrial (MTS) de la subunidad VIII de la citocromo c oxidasa humana. La transfección de células epiteliales de riñón humanas 293T con plásmidos que expresan la construcción fusionada phiYFP-M1-MTS produjo la translocación eficaz de la proteína a la mitocondria de las células huésped. La fluorescencia era claramente detectable 24 h después de transfección.

Ejemplo 10

Marcaje del aparato de Golgi usando phiYFP

La secuencia codificante de la versión de phiYFP-M1 humanizada preparada como se ha descrito antes en el ejemplo 2 se fusionó con una secuencia que codifica los 81 aminoácidos N-terminales de la beta-1,4galactosiltransferasa humana (GT; Watzele y Berger (1990) Nucleic Acids. Res. 18:7174). Esta región de la beta-1, 4-GT humana contiene el péptido señal de anclaje en la membrana que dirige la proteína de fusión a la región transmedial del aparato de Golgi (Llopis et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95: 6803-6808; Yamaguchi & Fukuda J. Biol. Chem. (1995)270: 12170-12176; Gleeson y col. Glycoconjugate J. (1994) 11: 381-394). La transfección de células epiteliales de riñón humanas 293T con plásmidos que expresan la construcción marcada fusionada con phiYFP-M1 produjo el marcaje fluorescente de la región trans-medial del aparato de Golgi en las células.

Ejemplo 11

Marcaje de peroxisomas usando phiYFP

La secuencia codificante de la versión de phiYFP-M1 humanizada preparada como se ha descrito antes en el ejemplo 2 se fusionó con una señal de localización peroxisomal 1 (PTS1). La secuencia de PTS1 codifica el tripéptido SKL, que dirige la proteína de fusión a la matriz de los peroxisomas (Gould y col., J. Biol. Chem. (1989)

108: 1657-1664; Gould y col., EMBO J. (1990) 9: 85-90; Monosov y col. J. Histo. Cytochem. (1996) 44: 581-589). La transfección de células epiteliales de riñón humanas 293T con plásmidos que expresan la construcción marcada fusionada con phiYFP-M1 produjo el marcaje fluorescente de los peroxisomas.

Ejemplo 12

Marcaje de núcleo usando phiYFP

La secuencia codificante de la versión de phiYFP-M1 humanizada preparada como se ha descrito antes en el ejemplo 2 se fusionó con 3 copias de la señal de localización nuclear (NLS) del virus de simio 40 fusionado con antígeno T largo en su extremo C (Kalderon y col., Cell (1984) 39: 499- 509; Lanford y col. Cell (1986) 46: 575-582). La transfección de células epiteliales de riñón humanas 293T con plásmidos que expresaban la construcción marcada fusionada con phiYFP-M1, produjo el marcaje fluorescente de los núcleos.

La cita de cualquiera de las publicaciones es para proporcionar contexto y comprensión de la presente invención y no debe considerarse como una admisión de que alguna de dichas publicaciones es técnica anterior.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> LUKYANOV, Sergei Anatolievich SHAGIN, Dmitry Alexeevich YANUSHEVICH, Yury Grigorievich

<120> PROTEÍNAS FLUORESCENTES Y CROMOPROTEÍNAS DE ESPECIES DE HIDROZOOS QUE NO SON AEQUOREA Y PROCEDIMIENTOS PARA USARLAS

<130> XXX

<160> 22

<170> Patentln versión 3.1

<210> 1

<211> 784

<212> ADN

<213> Phialidium sp.

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 234

<212>: PRT 5 <213> Phialidium sp.

<400> 2

<210> 3

<211> 705

<212>: ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> mutante phiYFP-M1 de phiYFP

<400> 3

<210> 4

<211> 234

<212>: PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> mutante phiYFP-Y1 de phiYFP

<400> 4

<210> 5

<211> 705

<212>: ADN 5 <213> Secuencia artificial

imagen1

<220>

<223> mutante phiYFP-M0 de phiYFP

<400> 5

imagen1

10 <210> 6

<211> 234

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> mutante phiYFP-M0 de phiYFP

<400> 6

imagen1

<210> 7

<211> 705

<212>: ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> mutante phiYFP-M1 de phiYFP

<400> 7

<210> 8

<211> 234

<212>: PRT 5 <213> Secuencia artificial

imagen1

<220>

<223> mutante phiYFP-M1 de phiYFP

<400> 8

imagen2

<210> 9

<211> 705

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> versión humanizada de phiYFP-M1 5 <400> 9

imagen1

<210> 10

<211> 234

<212>: PRT 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> versión humanizada de phiYFP-M1

<400> 10

<210> 17

<211> 705

<212>: ADN 5 <213> Secuencia artificial

imagen1

<210>: 11

<211>: 1047

<212>: ADN

<213> 5: hidromedusa 1 del suborden Anthomedusae

<400>: 11

imagen1

<210>: 12

<211>: 262

<212>: PRT

<213> 5: hidromedusa 1 del suborden Anthomedusae

<400>: 12

imagen1

<210>: 13

<211>: 1089

<212>: ADN

<213> 5: hidromedusa 2 del suborden Anthomedusae

<400>: 13

imagen1

<210>: 14

<211>: 232

<212>10: PRT

<213>: hidromedusa 2 del suborden Anthomedusae

<400>: 14

imagen1

<210>: 15

<211>: 699

<212>: ADN

<213> 5: Secuencia artificial

<220>

<223>: mutante S3-2 de hm2CP

<400>: 15

imagen1

<210>: 16

<211>: 232

<212>: PRT

<213> 5: Secuencia artificial

<220>

<223>: mutante S3-2 de hm2CP

<400>: 16

imagen1

<220>

<223> mutante phiYFP-M1G1, derivado de la versión humanizada de phiYFP-M1

<400> 17

imagen1

10 <210> 18

<211> 234

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 15 <223> mutante phiYFP-M1G1, derivado de la versión humanizada de phiYFP-M1

<400> 18

imagen1

<210> 19

<211> 705

<212>: ADN 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> mutante phiYFP-M1C1, derivado de la versión humanizada de phiYFP-M1

<400> 19

<210> 20

<211> 234

<212>: PRT 5 <213> Secuencia artificial

imagen1

<220>

<223> mutante phiYFP-M1C1, derivado de la versión humanizada de phiYFP-M1

<400> 20

imagen1

<210>: 21

<211>: 699

<212>: ADN

<213> 5: Secuencia artificial

<220>

<223>: versión humanizada del mutante S3-2

<400>: 21

imagen1

<210>10: 22

<211>: 232

<212>: PRT

<213>: Secuencia artificial

<220>

<223>15: mutante S3-2 humanizado

<400>: 22

imagen1

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína fluorescente, seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

un ácido nucleico que codifica una proteína fluorescente que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; y

(b)

un ácido nucleico que codifica una proteína fluorescente que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 90% a lo largo de la secuencia de la proteína entera respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
2.

Una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico codifica una proteína fluorescente que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 93% a lo largo de la secuencia de la proteína entera respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
3.

Una molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que la proteína fluorescente que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 tiene un máximo de excitación a 525 nm y un máximo de emisión a 537 nm.
4.

Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5.

Un casete de expresión que comprende:

(a)

la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3; y

(b)

elementos reguladores para la expresión de dicha molécula de ácido nucleico en la célula huésped deseada.
6.

Una célula que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el vector de acuerdo con la reivindicación 4, o el casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la célula no es una célula madre embrionaria humana.
7.

Una línea celular estable que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el vector de acuerdo con la reivindicación 4, o el casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la línea celular no es una línea de células madre embrionarias humanas.
8.

Una planta transgénica que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el vector de acuerdo con la reivindicación 4, o el casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 5.
9.

Un animal transgénico no humano que comprende la molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el vector de acuerdo con la reivindicación 4, o el casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 5.
10.

Un procedimiento para producir una proteína fluorescente, comprendiendo dicho procedimiento (a) proporcionar una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, operativamente unida a elementos reguladores de la expresión adecuados, (b) expresar la proteína fluorescente de dicha molécula de ácido nucleico, y (c) aislar la proteína sustancialmente exenta de otras proteínas.
11.

Una proteína fluorescente aislada seleccionada del grupo que consiste en:

(a)

una proteína fluorescente que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2; y

(b)

una proteína fluorescente que tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 90% a lo largo de la secuencia de la proteína entera respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
12.

Una proteína fluorescente aislada de acuerdo con la reivindicación 11, en la que dicha proteína fluorescente tiene una identidad de secuencia de al menos aproximadamente 93% a lo largo de la secuencia de la proteína entera respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.
13.

Una proteína fluorescente aislada de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, en la que la proteína fluorescente que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 tiene un máximo de excitación a 525 nm y un máximo de emisión a 537 nm.
14.

Una proteína de fusión que comprende la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
15.

Un anticuerpo que se une específicamente a la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13.
16.

Un kit que comprende el ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el vector de acuerdo con la reivindicación 4, el casete de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, la proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, o la proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 14.

11-13.