KR20070121689A

KR20070121689A - 생발광이 강화된 포토프로테인 및 세포내 칼슘인디케이터로서의 이의 용도

Info

Publication number: KR20070121689A
Application number: KR1020077021664A
Authority: KR
Inventors: 나디아 마스트로이아니; 실비아 카이나르카; 사브리나 코라자
Original assignee: 악삼 에스피에이
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2006-03-09
Publication date: 2007-12-27
Also published as: RU2407750C2; CA2601029A1; EP1858921B1; DE602006005141D1; EP1858921A1; EP1700865A1; AU2006222182A1; IL185857A; CN101137667A; ES2321029T3; RU2007133797A; US20070259389A1; IL185857A0; WO2006094805A1; JP4962981B2; JP2008532504A; PT1858921E; DK1858921T3; ATE422504T1; US7981602B2

Abstract

본 발명은 클리틴의 돌연변이에 의해 얻은 강화된 생발광의 포토프로테인과 이들의 세포에 기초한 어세이 및 세포내 칼슘 인디케이터로서의 용도와 관련된다.

포토프로테인, 생발광, 칼슘 인디케이터

Description

생발광이 강화된 포토프로테인 및 세포내 칼슘 인디케이터로서의 이의 용도{PHTOPROTEIN WITH ENHANCED BIOLUMINESCENCE AND THEIR USE AS INTRACELLULAR CALCIUM INDICATORS}

본 발명은 생발광(bioluminescence)이 강화된 포토프로테인(photoproteins) 및 그 포토프로테인을 세포내 칼슘 인디케이터(intracellular calcium indicators)로 사용하는 방법을 제공한다. 포토프로테인은 클리틴(clytin) 코딩 서열의 돌연변이(mutagenesis)로 얻어지고, 강화된 생발광, 칼슘에 대한 높은 친화력(affinity) 및 오래 지속되는 광 방출(light emission)을 나타낸다. 이들은 전통적으로 세포 내 칼슘 농도의 변화를 측정하는 세포 기초(cell-based) 어세이, 특히 고생산 및 초고생산 기술(high and ultra-high-throughput technique)로 분자를 스크리닝하는 어세이에 사용된다.

생발광이란 다양한 화학발광 반응 시스템(chemiluminexcent reaction system)을 통해 생명체 또는 그들로부터 유도된 물질에 의해 가시광이 방출되는 현상이다. 생발광 반응은 세 가지 주요한 구성 성분; 루시페린(luciferin), 루시페라제(luciferase) 및 분자 산소(molecular oxygen)를 필요로 한다. 그러나 일부 반응 에서는 양이온(Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺) 및 보조 인자(ATP, NAD(P)H)를 포함한 다른 구성성분이 또한 필요할 수 있다. 루시페라제는 기질인 루시페린의 산화를 촉진하는 효소이고 불안정한 중간체를 생성한다. 빛은 불안정한 중간체가 분해되어 옥시루시페린(oxyluciferin)을 생성하면서 기저 상태가 될 때 방출된다. 적어도 7개의 종족(phyla)로부터 유래된 많은 종들이 코엘렌테라진(coelenterazine)으로 알려진 동일한 루시페린을 사용하고 있지만, 루시페린에 관계없는 유형도 많다. 몇몇 동물(예를 들어, 해파리(jellyfish))에서는, 루시페린/루시페라제 시스템이 칼슘 결합시 빛을 방출하는 안정된 포토프로테인의 형태에서 추출될 수 있다. 포토프로테인은 루시페라제와 루시페린의 안정되고 산화된 중간체라는 점에서 루시페라제와 다르다. 포토프로테인은 많은 해양 강장동물(coelenterate) 내에 존재하며, 이러한 생명체가 번식(breeding), 급식(feeding) 또는 방어를 포함하는 다양한 목적으로 빛을 방출할 수 있도록 한다(1). 많은 발광 생명체가 존재하지만, 오직 일곱 가지 포토프로테인, 이름하여 탈라시콜린(Thalassicolin)(2,3), 에쿼린(Aequorin)(4-6), 미트로크로민(Mitrocomin)(할리스토린(Halistaurin)이라고도 함)(7,8), 클리틴(Clytin)(피아리딘(Phialidin)이라고도 함)(8,9), 오벨린(Obelin(2,6,10,11)), 네미옵신( Mnemiopsin)(12,13) 및 베로빈(Berovin)(12,13)이 지금까지 분리되었다. 이들 단백질 모두는 아포프로테인(apoprotein), 이미다조피라진 발색단(imidazopyrazine chromophore)(코엘렌테라진), 및 산소의 복합체이다. 이들 구조는 특히 칼슘 결합 사이트(EP-핸드 구조)를 포함하는 부위에서 특히 잘 보존된 다. 아포포토프로테인(apophotoprotein)은 루시페린이 없는 단백질을 지시하는데 사용되는 반면, 포토프로테인이라는 용어는 생발광이 가능한 루시페린-결합 폴리펩티드를 말한다.

가장 잘 연구된 포토프로테인은 에쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria) (14)에서 추출된 에쿼린과 오벨리아 롱기시마(Obelia longissima)(15)에서 유래된 오벨린이다. 포토프로테인은 코엘렌테라진, 분자 산소, EDTA 및 2-머캡토에탄올(2-mercaptoethanol) 또는 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 배양함으로써, 아포프로테인으로부터 재생성될 수 있다. 코엘렌테라진은 포토프로테인인 에쿼린, 미트로크로민, 클리틴 및 오벨린에 의해 사용된 보통의 발광 기질이기 때문에, 광-방출 반응은 이들 네 가지 포토프로테인(16,17) 내에서 거의 동일하다.

클리틴 포토프로테인은 Inouye et al.(18)에 의해 1993년에 클로닝되었다. 지금까지 이 포토프로테인에 대해서는 많은 연구가 이루어지고 있지는 않다. 에쿼린, 미트로크로민, 클리틴 및 오벨린의 주된 구조는 정열되고 매우 강한 아미노산 서열 동질성을 보여준다. 클리틴⁺-결합 사이트는 매우 잘 보존되는 것으로 밝혀졌다(19). 히드로충의(hydrozoan) Ca² ⁺-결합 포토프로테인은 상대적으로 시스테인, 히스티딘, 트립토판, 프롤린 및 타이로신 잔기가 고농도라는 것에 의해 칼모듈린(calmodulin) 및 트로포닌(troponin) C와 같은 다른 Ca² ⁺-결합 단백질과는 다르다는 것이 밝혀졌다.

클리틴의 주된 구조의 분석은 198개의 아미노산 잔기(aa)를 포함하고 있으며, 포토 프로테인의 군에 속한다는 것을 보여준다.

포토프로테인은 신호 전달(signal transduction) 및 유전자 발현(gene expression)과 관련된 세포내 일들을 모니터링하기 위한 리포터 유전자 기술(reporter gene technology)에서 널리 사용된다.

세포내 일들 및 그들의 조절의 연구는 민감하면서도, 조직을 해치지 않는 분석적 방법을 요한다. 포토프로테인 및 생발광의 일반적 사용은 형광(fluoresence) 시스템과 대조적으로 사실상 어떠한 배경도 가지지 않는다는 점에서, 탁월한 리포터(reporter) 시스템이다.

포토프로테인은 포유류 세포에서 발현되어, 다른 자극에 대한 반응으로 칼슘 변화를 모니터한다. 세포내 칼슘 농도는 포토프로테인을 발현시키고 광자를 방출하는 것을 감지하는 포유류 세포에 보조 인자(cofactor)인 코엘렌테라진을 첨가함으로써 측정될 수 있고, 이는 세포내 칼슘 농도의 지표가 된다. 포토프로테인 및 세포내 칼슘 농도를 조절하는데 관여하는 수용체 모두를 발현시키는 세포의 사용은 세포내 칼슘의 방출에 효과가 있는 화합물을 스크링하는데 유효한 시스템을 제공한다. 고 생산 스크리닝 어세이는 또한 리포터 시스템으로서 포토프로테인을 사용하도록 설계될 수 있다. 이 시스템의 높은 신호 대 잡음률(signal to noise ratio)와 민감도(sensitivity)는 작은 부피만으로도 어세이가 가능하도록 한다. 에쿼린은 이러한 스크리닝 어세이에 있어서, 가장 많이 사용되는 포토프로테인이다.

칼슘 플럭스 어세이(calcium flux assay)는 일반적으로 HTS 형식(format) 내에서 다수의 시료의 동시적 분석에 적합하고 CCD 카메라 검출기와 함께 발광 이미지 시 스템을 갖춘 광학적 스크리닝 기구를 사용하여 수행된다. 그러나, HTS에서 가장 많이 사용되는 도구는 FLIPR(Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, USA)인데, 이는 세포에 기초한 형광학적 분석을 위한 고 생산 광학적 스크리닝 도구로서 개발되었다. 이 기구는 광학적 검출 설비가 갖추어져, 세포의 단일층(cell-monolayer)에서 신호 분리를 가능하게 하고, 이에 의해 세포에 기초한 어세이를 위한 민감도를 강화시킨다. 이에 사용되는 소스로는 아르곤 레이져(Argon laser) 또는 크세논 램프(Xenon lamp)와 같은 광밴드 소스가 있다.

CCD에 비하면 낮은 민감도를 가지고 있으나, FLIPR 시스템의 가장 최근 버젼(FLIPR

및 FLIPR^TETRA)은 라이트-타이트 봉입체(light-tight enclosure), 극히 민감하고 빠른 카메라 및 동시적 온-라인 액체 분산 등을 구비하여 발광 어세이에 적합하도록 만들어졌다.

상기 설명된 기구인 FLIPR

, FLIPR³ 및 FLIPR^TETRA의 사용과 발광 어세이를 위해 일반적인 모든 기구가 민감도가 낮아도 사용될 수 있으려면, 강화된 광 방출을 하는 포토프로테인이 필요하다.

발명의 개시

본 발명의 일 실시예에 따르면,

a) 칼슘 및 코엘렌테라진과 결합할 수 있어서, 생발광을 생성하고,

b) 서열번호:1(클리틴)에 대하여 적어도 90%의, 바람직하게는 적어도 95%의, 보다 바람직하게는 적어도 98%의 동일성을 가지고,

c) 서열 번호:1(클리틴)에 서열 정렬되어, 하기의 단일 또는 다수의 대체물(잔기 부분은 서열 번호;1로 언급된다) 중 하나를 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단리된(isolated) 포토프로테인을 제공한다.

i) C₅₄→S;

ii) S₁₃₂→C;

iii) K₄₈→R, N₁₉₅→D;

iv) Q₆₈→R, A₉₀→V, T₁₈₄→I;

v) Y₈₂→F, K₁₁₀→N, F₁₂₅→L, S₁₄₉→R;

vi) G₁₄₂→C;

vii) I₅₃→V, S₁₄₉→R;

viii) N₁₈→D, I₄₀→V, K₅₆→R;

ix) Gly₅₈→Glu, Asp₆₉→Val, Ala₇₀→Cys, Lys₇₆→Arg, Lys₇₇→Gly, Ile₇₈→Cys, Asp₈₁→Glu, Val₈₆→Ile, Glu₈₇→Ala, Ala₉₀→Gln, Val₉₂→Leu, 및 Glu₉₇→Gln

바람직한 실시에에 따르면, 포토프로테인은 서열 번호:2,3,4,5,6,7,8,9,10로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 알려지거나 상업적으로 허용가능한 포토프로테인에 비교하여, 본 발명의 포토프로테인은 발전된 생발광 활성 및/또는 칼슘에 대한 높은 친화력 및/또는 오래 지속되는 광 방출을 나타낸다.

클리틴 서열은 원하는 포토프로테인 생발광 활성을 수행하는 지시된 잔기-치환물과 별도로, 포토프로테인의 생발광에 부정적인 영향을 미치지 않고, 특히 아미노산 잔기의 보존적 치환에 의해, 지시된 서열과 동일한 범위 내에서, 좀 더 변경될 수 있다. 게다가, 클리틴 서열은 그것의 포토프로테인의 활성을 변경하지 않고 작은 부분이 삭제될 수 있다.

더 나아가, 본 발명은 위에서 정의된 포토프로테인을 인코딩(encoding)하는 폴리뉴클레오티드를 개시한다. 바람직한 실시예로, 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19에 따른 포유류 코돈 용도를 위해 최적화된다. 가장 바람직한 실시예에서는, 핵산 분자가 미토콘드리아의 표적 서열에 융합된다(20, 21, 22).

또 다른 실시에에 따르면, 본 발명은 발현 벡터(expression vector)와 지시된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본 발명에 따른 포토프로테인을 발현시키는 숙주 세포는 칼슘 자극에 반응하여 강력한 생발광을 만드는데, 이는 자연의 포토프로테인, 특히 가장 많이 사용되는 것인 에쿼린에서 관측되는 것보다 강력하다.

또 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 본 발명에 따른 포토프로테인에 의해 세포내 칼슘 농도를 결정하기 위한 세포에 기초한 어세이(cell-based assay)를 제공한다.

바람직한 실시예에서, 세포내 칼슘 농도의 변화는,

a) 서열 번호: 2 내지 10, 이들의 변형(variants) 또는 조각(fragment)의 포토프로테인을 발현시키는 세포를 제공하고;

b) 코엘렌테라진(coelenterazine)을 세포에 적재하고(loading);

c) 세포내 저장소로부터 칼슘 유입(influx) 또는 칼슘 방출(release)을 자극시키는 약제(agent)를 세포에 접촉시키고;

d) 포토프로테인의 생발광(bioluminescence)을 검출하는 것에 의해 결정된다.

어세이는 바람직하게는 고생산 또는 초고생산 적용(ultra high throughput application)을 위한 CCD 카메라 검출기가 있는 발광 이미지 시스템(luminescence imaging system), 또는 플루오로메트릭 이미징 플레이트 리더(Fluorometric Imaging Plate Reader)(FLIPR

)과 같은 다수의-시료 분석에 적합한 광학적 스크리닝 도구 또는 기구를 사용한 고생산 형태에서 수행된다. 이들 양 시스템과 함께 본 발명의 포토프로테인은 자동화된 세포 기능 어세이에서 보통 사용되는 알려진 포토프로테인에 비교하여 강한 신호를 생성한다.

바람직한 실시예에서, 포토프로테인을 발현시키는 세포와 세포내 칼슘 동원(mobilization)에 관련된 수용체(receptor)가 수용체 조정(modulation)에 미치는 그들의 영향에 대해서 후보군 분자를 테스트하는데 사용된다. 전형적으로 세포들은 관심이 있는 수용체 또는 채널이 내생적으로 존재하지 않는 경우에도, 서열을 인코딩하는 포토프로테인을 포함하는 발현 벡터로 형질전환(transfected)된다. 포지티브 클론은 선택되고 적절한 배지(medium)에서 플레이트되어, 배양된 세포는 코엘렌테라진과 함께 적재되고, 어세이는 시험 분자 또는 자극을 첨가함에 의해 시작된다. 생성된 발광은 적절한 검출 시스템(CCD 카메라 또는 루미노미터(luminometer))에 의해 읽혀진다. 어세이는 또한 멀티-웰 플레이트 리딩이 갖춰진 자동화된 기계, 특히 FLIPR

안에서 수행될 수 있다. 이러한 경우, 포토프로테인-발현 세포는 마이크로플레이트 웰 안에 플레이트되어, 시험 분자/자극의 첨가 후에 신호 기록(signal recording)과 동시에 읽혀진다.

포토프로테인-기초의 리포터 시스템과 함께 갖춰진 고 생산 스크리닝 어세이는 발전된 민감도(sensitivity)와 신호대 잡음률을 나타낸다. 본 발명의 포토프로테인을 발현시키는 세포는 칼슘 자극에 반응하여, 강력한 생발광을 생성하고, 이는 일반적으로 자연의 포토프로테인에서 관찰되는 것보다 더 강력하다.

또 다른 실시예에서, 본 발명은 안정되거나 유발가능한(inducible) 프로모터(promoter) 및 어세이를 실행하기에 적합한 시약(reagent)의 제어 하에서 본 발명의 포토프로테인을 발현시키는 세포의 제조를 포함하는 어세이 키트(assay kit)를 제공한다.

게다가, 본 발명의 포토프로테인은 세포내 칼슘 이온 농도 및/또는 세포내 칼슘 이온의 유입(influx)/유출(outflow)의 측정에 기초한 진단 방법 내에서 세포내 칼슘 인디케이터로 사용될 수 있다.

본 발명은 다음 실험 부분에서 좀 더 상세히 기술될 것이다.

물질 및 방법

시약

제한 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs)으로부터 구입하였고, 공급자의 지시사항에 따라 사용했다. 리게이션 인디펜던트 클로닝(Ligation Independent Cloning)(LIC) 키트는 노바젠(Novagen)(Nottingham, UK)에서 구입했다. 생체외 전사(transcription)과 해독(transslation)을 위해서, 프로메가(Promega)(Madison, WI)의 키트와 커플링된 TNT 퀵을 사용했다. PCR을 위한 시약으로, E.coli 균주(strains)의 적격 세포(competent cell)인 XL-1블루(XL-1Blue) 및 BL21-골드(DE3)는 프림(Primm)(Milan)으로부터 구입했다. 코엘렌테라진은 파마 테크. 인터내셔널사(Fairfield, NJ)로부터 구입했다. 다른 모든 화학물질은 기준 소스로부터 구입했고, 시약의 등급이거나 그 이상이었다.

1. 랜덤하게 돌연변이된 라이브러리의 생성 및 스크리닝( Generation of a Randomly Mutagenized Library and Screening)

1.1 포유류 세포내에서의 발현을 위한 포토프로테인 최적화( GENEART GmbH , Regensburg, Germany)

야생형(wild-type) 클리틴 유전자의 코돈을 고도로 발현된 포유류 유전자의 코돈 바이어스(codon bias)에 사용하는 것은 적합하다. 매우 높거나(> 80%) 매우 낮은(< 30%) GC 함량 부분은 가능하면 피해져왔다. 효과적인 해독(translation) 개시를 위해 코작-콘센서스 서열(Kozak-consensus sequence)을 출발 코돈의 상류( upstream)에 도입하였다. 두 개의 정지코돈(STOP codon)을 효과적인 종결을 위해 첨가하였다.

1.2 랜덤 돌연변이

진모르프 Ⅱ 랜덤 뮤타제너시스 키트(GeneMorph Ⅱ Random Mutagenesis kit) (Stratagene)를 다음 공급자의 지시사항에 따라 사용하였다. 표적 DNA의 두 개의 다른 시작 양, 0.1 ng 및 0.01 ng을 고도의 돌연변이률(mutation rate)을 달성하는데 사용하였다.

PCR 프라이머는 적절하게 설계되어, Ek/LIC 클로닝 키트(Novagen) 에 설명된 서열에 대응하는 5' LIC 신장(extension)(in italics)을 포함한다.

윗부분: GATGACGACGACAAG-ATGGCCGACACCGCCAG (서열 번호: 20)

아래 부분: GAGGAGAAGCCCGGT-TTATCAAGGACACGAAGT (서열 번호: 21)

증폭(amplification) 프로토콜을 퍼킨 엘머 2400 열순환 반응기(Perkin Elmer 2400 thermocycler)에서 수행하였다.

다음 단계로 1 회(time):

전PCR(pre PCR) 94℃에서 2'

다음 단계로 30 회:

변성(denaturation) 94℃에서 30"

어닐링(annealing) 56℃에서 30"

연장(elongation) 72℃에서 40"

다음 단계로 1회:

연장 72℃에서 10'

특정 PCR 산물의 예상되는 길이: 630 bp

얻어진 DNA의 양을 정량적으로 결정하기 위하여, 증폭 산물을 마니아티스(Maniatis et al)에 의해 개시된 다음의 기준 절차(procedure)에 따라 흐르는 버퍼 1×TAE 내의 1%의 아가로스 겔 위에서 전기영동(electrophoresis)에 의해 분석하였다. 시료를 DNA 분자량 마커(DNA molecular weight marker)(MWXVI, Roche)와 비교하였다.

1.3 Ek / LIC 클로닝

노바젠 리게이션 인디펜던트 클로닝(The Novagen Ligation Independent Cloning) (LIC) 키트를 제한 효소 절단(digestion) 또는 접합(ligation) 반응 필요없이 PCR 산물의 방향성 있는 클로닝을 얻기 위하여 공급자의 지시사항에 따라 사용하였다. 엔테로키나제 절단 사이트(enterokinase cleavage site)의 하류에서 표적 단백질을 발현시키도록 설계된, pET-30 Ek/LIC 벡터를 선택하였다.

1.4 형질 전환(Transformation)

단백질 발현이 잘되게 하기 위하여, E.coli B의 유도체로, BL21 적격 세포의 발전된 균주(strain)인 BL21-골드(DE3) 세포 (Stratagene)를 선택하였다. 균주의 유전자형(genotype)은 E. coli B F^- ompT hsdS (r_B ^- m_B ^-) dcm⁺Tet^r galλ(DE3) endA Hte이다. 이 균주는 정제되는 동안 단백질을 변성시킬 수 있는 lon 및 ompT 프로테아제(proteases)를 가지고 있지 않다. Hte 표현형(phenotype)은 형질전환 효능(pUC18 DNA > 1x10⁸ cfu/μg)을 증가시킨다. 게다가, 엔도뉴클레아제 I를 인코딩하는 endA 유전자는 불활성화되어 있다(플라스미드 DNA의 변성이 없다).

적격 세포를 형질 전환의 고 효율성으로 얻기 위해 우리는 이콜라이 펄서 형질전환 매뉴얼(E. coli Pulser Transformation apparatus manual)(BioRad)에 개시된 BL21-골드(DE3) 세포의 제조 및 전자적 형질 전환(electro-transforming)을 위한 기준 프로토콜을 따랐다.

pUC18 DNA 및 pET DNA 벡터를 사용해서 형질전환 효율성(efficiency)를 시험할 수 있었고, 얻어진 효율성은 다음과 같다.

pUC18 DNA의 1x10¹⁰ cfu/μg

pET DNA의 1x10⁸ cfu/μg

이들 고도의 전자적격(electrocompetent) 세포를 사용하여 우리들은 랜덤하게 변형된 클리틴 포토프로테인을 발현시키는 약 84,000 콜로니의 라이브러리를 얻을 수 있었다.

1.5 플레이팅 , 유도(induction) 및 하전( charging )

형질전환된 세포를 LB 아가 플레이트에 플레이트시키고, 37℃에서 밤새 성장시켰다. 밤새 콜로니가 성장한 후에 10 mM IPTG와 5 mM의 EDTA를 첨가시켜 유도하였으며, 37℃에서 4시간 동안 배양시켰다. 콜로니는 10 μM 코엘렌테라진 용액과 함께 하전시키고 4℃ 암소에서 밤새 배양했다.

1.6 CCD 카메라 측정

생발광을 처음 측정으로부터 0 시간, 3 분 후 및 5 분 후 시간마다 30"의 고정된 시간 간격으로 신호를 측정함으로써 분석하였다.

1.7 콜로니 선택(picking) 및 재-시험( re - testing )

가장 잘 만들어진 콜로니를 선택하여 LB 액체 배지 1ml에서 성장시켰고, 이전에 설명한 것과 동일한 실험 조건을 사용하여 재시험하였다.

2. 생체 외 전사 및 해독

포토프로테인의 해독을 공급자의 일반적 지시사항에 따라 토끼의 망상적혈구 셀-프리 시스템(rabbit reticulocyte cell-free system)(TNT Quick coupled kit, Promega) 내에서 수행하였다. DNA 500 ng을 생체 외 전사/해독 반응 혼합물 각각에 사용하였다. 반응 부피(10μl)는 TNT T7 퀵 마스터 믹스(Quick Master Mix) 8 μl, DNA 1.6 μl, 메티오닌 버퍼(Methionine buffer) 0.2μl 및 코엘렌테라진(0.5 mM) 0.2 μl를 포함한다. 해독 혼합물의 각 시료 5 μl씩에, 칼슘 용액을 주입(injection)하고 애센트 루미노스칸(Ascent Luminoskan (Labsystems))을 사용하여 광 방출을 테스트하였다.

3. 재조합 프로테인 생산( Recombinant protein production )

재조합 프로테인의 생산을 위해서 우리는 자연 조건 하에서, 작은 범위의 프로테인 정제 프로토콜을 따랐다. 구조 내의 N-터미널 His 태그(N-terminal His tag)의 존재로 인해, 공급자의 프로토콜에 따라 Ni-NTA 스핀 칼럼(Ni-NTA Spin Columns (Qiagen))에서 발현된 단백질을 정제하였다.

4. 칼슘 농도 커브(Calcium concentration curve )

다른 칼슘 농도에서 포토프로테인의 반응을 측정하기 위해, 재조합 프로테인의 0.05 ng/웰(well) (96 MTP)을 4 ℃에서 밤새 10μM의 코엘렌테라진과 함께 하전시켰다.

배양 후에, CaCl₂의 다른 농도를 주입하고, 방출된 광을 애센트 루미노스칸을 사용하여 10초의 전체 시간에, 20 ms의 노출 시간(integration time)으로 측정하였다.

5. 포유류 세포에서의 돌연변이 포토프로테인의 발현

시약

제한 효소를 뉴 잉글랜드 바이오랩(Beverly, MA)에서 구입하여, 공급자의 지시에 따라 사용했다. 래피드 DNA 접합 키트(Rapid DNA ligation kit) 및 퓨진(Fugene) 형질전환(transfection) 시약을 로슈(Basel, CH)사로부터 구입했다. 코엘렌테라진은 파마 테크. 인터내셔널사(Fairfield, NJ)로부터 구입했다. 다른 모든 화학물질은 기준 소스로부터 구입했고, 시약 등급이거나 그 이상이었다.

클로닝 절차(Cloning procedure)

가장 유망한 돌연변이 포토프로테인 클론을 포유류 세포 내에서 그들의 발현을 시험하기 위해 서브클론하였다.

플라스미드 2 μl을 PCR 분석에서 주형(template)으로 사용하였다. 덧붙여, 네거티브 콘트롤(negative control)이 주형 없이 수행되었다.

표준 PCR 절차는 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)에 의해 알려졌다. PCR 프로토콜은 다음과 같다.

프라이머(Primers):

상부(upper) 프라이머: TCGTTGGGATCCGCCACCATGGCCGACACCGCC (서열 번호: 22)

하부(lower) 프라이머: GGGCCCTCTAGATTATCAAGGCACGAA (서열 번호: 23)

PCR 반응 혼합:

2 μl 주형

5 μl 10 x Pfx 버퍼 (GIBCO-LifeTechnologies)

1.5 μl 10 mM dNTPs

1 μl 50 mM MgSO₄ (GIBCO-LifeTechnologies)

2.5 μl 상부 프라이머 (10 μM)

2.5 μl 하부 프라이머 (10 μM)

2.5 U 백금 Pfx (GIBCO-LifeTechnologies)

35 μl H₂O

아래 부분: GAGGAGAAGCCCGGT-TTATCAAGGACACGAAGT (서열 번호: 21)

증폭(amplification) 프로토콜이 퍼킨 엘머 2400 열순환 반응기에서 수행되었다.

다음 단계로 1 회(time):

전 PCR(pre PCR) 94℃에서 2'

다음 단계로 25 회:

변성(denaturation) 94℃에서 15"

어닐링(annealing) 56℃에서 30"

연장(elongation) 68℃에서 40"

다음 단계로 1회:

연장 68℃에서 10'

특정 PCR 산물의 예상되는 길이: 630 bp

증폭 산물은 마니아티스(Maniatis et al)에 의해 개시된 다음의 기준 절차(procedure)에 따라 흐르는 버퍼 1×TAE 내의 1 %의 아가로스 겔 위에서 전기영동(electrophoresis)에 의해 분석되었다.

PCR 산물은 퀴아젠(Qiagen) 컬럼을 사용하여 겔 정제되었고, BamHI 및 XbaI 제한 효소에 의해 절단되었다.

pcDNA3neo -/ mitoMutated - 클리틴 구조( construction )

인-하우스 변경된 pcDNA 3 벡터(in-house modified pcDNA3 vector)가 사람의 시토크롬 c 옥시다제(20,21,22)의 서브유닛 Ⅷ로부터 미토콘드리아의 표적 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함하도록 제조되어, 최적화된 포토프로테인 유전자의 코돈-사용의 5'-말단 프레임에서 사용될 수 있게 되었다. 상기 언급한 PCR로 얻어진 증폭 산물은 포유류 세포 라인에서 발현을 위한 네오마이신 내성 유전자(Neomycin resistance gene)가 부족한 변경된 pcDNA3 벡터로 클로닝되었다.

미토콘드리아의 타겟팅을 위한 신호 서열은:

5’―ATGTCCGTCCTGACGCCGCTGCTGCTGCGGGGCTTGACAGGCTCGGCCCGGCGGCTCCCAGTGCCGCGCGCCAAGATCCATTCGTTGGGATCCGCCACC―3’(서열 번호: 24).

pcDNA3neo -/ cytoMutated - 클리틴 구조

돌연변이된 클리틴 유전자를 BamHI와 XbaI 제한 효소에 의한 절단에 의해 pcrScript/hMutated-클리틴 벡터로부터 얻었다. pcDNA3neo-는 BamHI와 XbaI 제한 효소로 절단되어, 정제되었다.

돌연변이된 클리틴 유전자는 pcDNA3neo- 벡터에 접합되어, pcDNA3neo-CYTO-hMutated-클리틴을 얻었다.

생성된 양 구조는 전장 디데옥시 시퀀싱(full-length dideoxy sequencing)에 의하여 입증되었다.

세포 컬쳐 (Cell culture)

컬쳐 배지( culture medium ), 씨딩 ( seeding ) 및 배양( incubation ) : 글루타맥스(Glutamax)(GIBCO cod. 31331-028)와 함께 DMEM/F12, 10% FBS, 1% Pen./Strep. (Invitrogen cod.15140-122), 25 mM 헤프스 버퍼액(Hepes Buffer Solution)(GIBCO cod. 15630-056), 1.0 mM 소디움 피루베이트(Sodium Pyruvate)(GIBCO cod. 11360-039), 1.5 g/L 소디움 바이카르보네이트(Sodium Bicarbonate) (GIBCO cod. 25080-060).

전컬쳐 조건( Preculture conditions ): 세포는 70 내지 80% 합류되었을 때 실험을 위해 씨드되었다.

세포 컬쳐 조건( Cell culture conditions ): 일주일에 두번씩 쪼갠다: 3.0x10⁵ 셀(cells)/플라스크(flask) T75 (회복: 8x10⁶ 셀).

클론 선택 과정( Clone Selection Process ):

CHO-K1는 pcDNA3Neo^-/MITO-hMutated-클리틴 또는 pcDNA3Neo^-/CYTO-hMutated-클리틴과 형질전환되었다.

형질 전환 48시간 후에, 형질 전환된 세포는 완전한(complete) DMEM 내 10x96 w/p에 플레이트되었다.

합류점에서 10x96 w/p이 10 화이트 플레이트 내에서 복제되었다. 측정하기 3시간 반 전에, 배지는 티로드(tyrode)(2 mM Ca² ⁺ 및 코엘렌테라진 10 μM) 50 μl/웰로 대체되었다.

포지티브 클론이 선택되어 측정되었다.

첫번째 선택은 TRITON X-100으로 세포 용해된 것이었다. CCD 카메라 조건: 낮은 감도, 노출 시간(integration time) 1초. 해독(reading) 시간 5초.

5개의 클론이 3x96 w/p 내에서 각각 희석되도록 선택되었다.

합류에서 15x96 w/p이 15 화이트 플레이트 내에서 복제되었다. 측정하기 3시간 반 전에, 배지는 티로드(tyrode)(2 mM Ca² ⁺ 및 코엘렌테라진 10 μM) 50 μl/웰로 대체되었다.

두번째로, 키네틱스(kinetics)를 모니터링할 10 μM 의 ATP를 선택하여 사용하였고, 세포는 TRITON X-100로 용해시켰다. CCD 카메라 조건: 낮은 감도, TRITON X-100으로 30초간 처리한 후 ATP를 측정하기 위해 노출 시간 1초, 해독 시간 30초.

선택된 가장 우수한 클론의 4가지 제한적으로 희석하였고, 10x96 w/p으로 웰 당 0.3 셀을 형성하였다.

마지막 클론을 ATP 0.25 μM, 코엘렌테라진 5 μM과 함께 네번째 LD후에 선택하였다.

어세이의 완전한 최적화를 가장 우수한 반응 클론 상에서 수행하였다.

CCD 카메라 측정 파라미터:

CHO 세포는 384MTP (500, 750, 1,000, 1,500 셀/웰) 내에서, 상기 언급한 것으로 보충되었던 성장 배지 내에서 다른 세포 밀도로 씨딩하였고 플레이팅 후 24 시간, 48 시간 경과 후에 CCD 카메라로 측정하였다. 실험 성장 배지를 제거하기에 앞서, 세포를 코엘렌테라진을 첨가시킨 티로드 버퍼에 적재하였다. 발광을 CCD카메라로 아고니스트(agonist)의 첨가 후에 측정하였다(30초, 키네틱스).

플루오로메트릭 이미징 플레이트 리더( Fluorometric Imaging Plate r ader)(FLIPR

) 측정

발광 측정을 위한 어세이 표준 프로토콜을 위한 FLIPR ³ 의 세팅

384 화이트 월 클리어 바텀 플레이트

실험 24시간 전 셀 플레이팅

배지 제거

25μl/웰의 코엘렌테라진을 첨가한 티로드의 첨가

37℃에서 4시간 동안 배양

FLIPR³에서 실행한 실험: 티로드 버퍼(25 μl/웰)에 화합물 (2X) 주입.

모든 파라미터 수치는 다음을 제외하고는 기계 디폴트 수치(instrumentation default values)이다.

전 어세이 단계( Pre - assay steps ):

1) 카레라 구성(configuration):

노출 길이(exposure lenth)= 0.7

카메라 게인(Camera gain) = 200

2) 서열 파라미터(Sequence parameters):

디스펜스 384 웰 헤드(head)

높이 = 30 μl

속도 = 25 μl/sec

발광 측정을 위한 어세이 표준 프로토콜을 위한 FLIPR ^TETRA 의 세팅.

384 화이트 월 클리어 바텀 플레이트

실험 24시간 전 셀 플레이팅

배지 제거

25μl/웰의 코엘렌테라진을 첨가한 티로드의 첨가

37 ℃에서 4시간 동안 배양

FLIPR ^TETRA 에서 실행한 실험: 티로드 버퍼(25 μl/웰)에 화합물 (2X) 주입.

셋 업 해독 모드 (Set up read mode ):

1) 카메라 구성:

카메라 게인 = 200

노출 시간 = 0.50

2) 서열 파라미터:

디스펜스 384 웰 헤드(head)

높이 = 30 μl

속도 = 25 μl/sec

참고 화합물:

ATP (시그마, A-7699)는 물에 100mM의 농도로 용해시켰고, 일정 부분(aliquots)은 -20 ℃에서 저장하였다. 사용하는 용액은 티로드 버퍼 내에서 제조하였다.

티로드 버퍼 조성물: NaCl 130 mM, KCl 5 mM, CaCl₂ 2 mM, MgCl₂ 1 mM, NaHC0₃ 5 mM e HEPES 20 mM, pH 7.4.

IMETIT (시그마, I-135)

도 1은 세 가지 칼슘 농도의 돌연 변이 콜로니의 재 테스트 결과를 나타낸다.

도 2는 생체 외 전사 및 해독. 5 pM의 칼슘 주입에서 광 방출 측정을 나타낸다.

도 3은 생체 외 전사 및 해독. 1 mM의 칼슘 주입에서 광 방출 측정을 나타낸다.

도 4는 재조합 포토프로테인에 1 mM 칼슘 주입을 한 경우 광 방출 측정의 키네틱스를 나타낸다.

도 5는 재조합 포토프로테인 25N03b의 칼슘 용량-반응 곡선을 나타낸다.

도 6은 재조합 포토프로테인에 1 mM의 칼슘 주입을 한 경우의 광 밀도 피크를 나타낸다.

도 7은 CHOK1/mito25N03b 셀 라인의 CCD 카메라로 측정한 10 μM ATP 반응의 키네틱스를 나타낸다.

도 8은 CHOK1/mito25N03b 셀라인의 ATP 용량(dose)-반응 곡선을 나타낸다.

도 9는 씨딩 후 24 시간 후에 CCD 카메라 테스팅 500 셀/웰에서 얻은 CHOK1/mito12mutCly 셀라인의 ATP 용량(dose)-반응 키네틱스를 나타낸다.

도 10은 다른 코엘렌테라진 농도 및 배양 시간의 다른 수의 셀/웰을 가진 CCD 카메라에서 얻은 CHOK1/mito12mutCly 셀라인의 ATP 용량-반응 곡선을 나타낸다.

도 11은 다른 수의 셀/웰을 가진 CCD 카메라에서 얻은 CHOK1/mito12mutCly 셀라인의 ATP 용량-반응 곡선을 나타낸다.

도 12는 다른 수의 셀/웰을 가진 CCD 카메라에서 얻은 CHOK1/mito12mutCly/H3 셀라인의 IMETIT 용량-반응 곡선을 나타낸다.

도 13은 FLIPR³에서 얻은 CHOK1/mito12mutCly/H3 셀라인의 IMETIT 용량-반응 곡선을 나타낸다.

도 14는 루미박스(Lumibox) CCD 카메라, 웰당 500개의 셀, 씨딩 후 24시간 후에 테스트 된, A3 아고니스트 (IB MECA)와 함께 CHOK1/mito25N03b-A3 셀라인의 용량-반응 곡선을 나타낸다. 5 μM 코엘렌테라진. 카메라 감도 5, 60초 측정.

도 15는 CyBi 루막스(Lumax) HT CCD 카메라, 웰당 2500개의 셀, 씨딩 후 24 시간 후에 테스트 된, A3 아고니스트 (IB MECA)와 함께 CHOK1/mito25N03b-A3 셀라인의 용량-반응 곡선을 나타낸다. 5 μM CTZ. 카메라 감도 HV 10 아날로그, 60초 측정.

도 16은 FLIPR^TETRA에서, 웰당 2500개의 셀, 씨딩 후 24시간 후에 테스트 된, A3 아고니스트 (IB MECA)와 함께 CHOK1/mito25N03b-A3 셀라인의 용량-반응 곡선을 나타낸다. 10μM 코엘렌테라진 노출 시간 2초, 게인 240.

1. 랜덤하게 돌연변이된 라이브러리의 생성 및 스크리닝

랜덤 뮤턴트 라이브러리(Random mutant Library)를 진모르프 Ⅱ 랜덤 뮤타제너시스 키트(Stratagene)을 사용하여 얻었다. 높은 돌연변이 비율을 달성하기 위하여, 표적 DNA를 두 가지 다른 양으로 사용하였다: 0.1 ng 및 0.01 ng. 전체 83305 박테리아 콜로니를 발광 활성 테스트에 사용하였다. 이들 중 1089 개가 포지티브였고, 생발광 특성을 가졌다.

가장 우수한 289개의 콜로니가 선택되었고, 이들 중 16 개는 재-테스트를 거쳐 가장 우수한 것으로 밝혀졌다. 마지막으로 9개의 콜로니를 선택하여 분석하였다.

도 1은 8 개의 돌연 변이로부터 얻은 세 가지 테스트-포인트 CaCl₂ 용량-반응 곡선을 나타낸다.

2. 포토프로테인 어세이

해독 혼합물 5μl을 96 웰 플레이트에서 PBS 용액 95 μl와 직접적으로 혼합시켜 루미노미트(Berthold)에 장착시켰다. 포토프로테인 광 방출을 증폭시키기 위해,5 pM CaCl₂ 용액을 웰에 주입시키고, 10초 간격으로 발광을 기록했다.

8 개의 뮤턴트의 DNA 생체외 전사 및 해독의 결과는 도 2에 나타내었다.

1 mM CaCl₂ 용액을 주입한 경우의 광 방출을 비교하기 위해, 새로운 생체 내 전사 및 해독 실험을 가장 훌륭한 반응 뮤턴트인 25N03b(서열 번호 n °16)와 에쿼린 포토프로테인(도 3)에서 수행했다.

3. 재조합 포토프로테인 및 칼슘 농도 커브

몇몇 뮤턴트에 대응한 재조합 포토프로테인을 제조를 위해, 우리는 자연 조건 하에서 작은 범위의 정제 프로토콜을 따랐다. 광 방출을 1 mM의 칼슘 주입에서 측정하였고, 이에 대응하는 키네틱스는 도 4에 나타냈다.

재조합 뮤턴트 포토프로테인은 클론 25N03b에 대응하는 것으로, 도 5에서 보듯이 완전한 칼슘 용량-반응 커브로 보다 잘 특징지워진다.

다른 실험에서 재조합 포토프로테인 25N03b과 재조합 에쿼린을 비교하였다. 1mM의 CaCl₂ 주입에서 기록된 광 방출은 놀랍게도 도 6에서 보듯이 25N03b 뮤턴트의 경우에 높게 나타났다.

4. 셀에 기초한 기능적 어세이( Cell - based functional assays )

4.1 CHOmito25N03b-발현 클론(CHOK1/mito25N03b)은 CHO-K1 셀의 형질 전환에 의해 얻어진다.(Materials and Methods).

형질 전환 48시간 후에, 세포들을 트립신으로 처리하고, MEM 배지가 담긴 10x96 MTP(Microtiter Plates)에 플레이팅하였다. 합류에서, 10x96 w/p을 10x96 화이트 MTP 내에서MATRIX(Hudson, NH, USA)를 사용하여 복제하였다. 측정 3 시간 전에 배지를 2 mM의 Ca² ⁺를 포함하는 티로드 버퍼 50 μl/웰과 10 μM 코엘렌테라진으로 대체하였다. 클론을 그들의 ATP에 대한 기능적 반응(발광 신호), 즉 CHO 내인성(endogenous) 수용체 P2Y를 자극시키고, 세포질 Ca² ⁺ 농도를 증가시키는 것으로 알려져 있는 기능적 반응에 기초하여 선택하였다. 이는 각 실험의 끝에 세포를 Triton X-100을 포함하는 용액의 관류(perfusion)에 의해 분해하였다. 활성화된 포토프로테인을 2 mM의 Ca² ⁺를 포함하는 티로드 버퍼 내에서 희석된 10 μM 코엘렌테라진으로 암소에서 37 ℃, 5 %의 CO₂ 대기압에서 3시간 동안 세포를 배양함으로써 재구성하였다. 광 방출 측정을 위해, 세포를 칼슘의 존재하에서 분해하였으며, 방출된 발광은 기록되었다. 처음 30초 동안 방출된 광자(photon)의 수는 CCD 카메라로 통합되어 스크린에 가시화되었다. 빈 플라스미드로 형질전환되거나 그렇지 않은 세포는 광자-방출을 증가시키지 않았다. 칼슘 농도 변화를 검출하기 위하여 10 μM ATP가 주입되었고, 반응의 키네틱스가 결정되었다. 얻어진 커브는 도 7에 나타낸다.

마지막 클론을 384 w/p 에 씨딩하였고, 도 8의 용량-반응 곡선에서 나타낸 바와 같이 ATP 농도를 증가시키면서 테스트하였다.

PLC/IP 경로의 신호를 변환시키기 위해 CHOK1/mito25N03b 셀라인을 G-단백질과 결합하는 수용체, 아데노신 A3 수용체 및 키메릭 Gα단백질로 형질전환시켰다. 안정한 셀라인을 형성하였다(이하에서는, CHOK1/mito25N03b /A3 클론으로 지칭한다.).

아고니스트의 반응에서와 같이 A3 수용체는 mito25N03b 발광에서 측정되는 세포내 칼슘 농도를 증가시킨다.

mito25N03b을 발현시키는 CHO 셀라인의 최종 클론과 사람의 아데노신 A3 수용체는 조직 배양 플라스크에서 80 내지 95% 합류점으로 성장하고, 트립신처리(trypsinization)으로 거두어들인다. 세포를 성장 배지(10% 소혈청(Foetal Bovine Serum)을 포함하는 DMEM/F12)에서 384 w/p로 다른 세포 밀도에서 디스펜스하고, 5% CO₂에서 습기가 있는 인큐베이터 내에서 37 ℃로 24 시간과 48 시간 동안 배양하였다. 실험 도중에 배양 배지를 제거하고, 발광 실험을 위해 세포는 5% CO₂ _,37 ℃로 3시간 동안 5 μM 코엘렌테라진에 적재하였다. 다른 농도의 ATP를 각각의 웰에 첨가함으로써 칼슘 반응을 자극시켰다. 번쩍이는 발광의 키네틱스를 CCD 카메라를 사용하여 뒤따라 측정하였으며, 시약을 주입하고 각각의 단일 웰로부터의 광방출을 기록했다.

아고니스트와 안타고니스트는 다른 농도에서 티로드 버퍼 내에서 희석하였다. 이들 용액 약 25μl는 분리하여 각각의 웰로 주입하였고, 각 반응은 CCD 카메라 기구로 측정하였다. 방출된 빛은 즉각적으로 각기 다른 시간 간격에서 기록하였다. 도 14에서 보여준 기록은 A3 특정 아고니스트, IB-MECA에 관한 것이다. 동일한 실험을 다른 CCD 카메라 기구에서도 수행하였고, 그 결과를 도 15에 나타낸다.

4.2 CHOK1 셀은 pcDNA3neo-mito 내에서 클론된 뮤턴트 12mutCly(서열 번호: 19)와 안정적으로 형질전환되어 셀라인 CHOK1/mito12mutCly을 얻었다 (Materials and Methods).

마지막 클론을 ATP에 대한 기능적 반응(발광 신호), 즉, CHO 내인성(endogenous) 수용체 P2Y를 자극시키고, 세포질 Ca² ⁺ 농도를 증가시키는 것으로 알려져 있는 기능적 반응에 기초하여 선택하였다. 각 실험의 끝에 세포를 Triton X-100을 포함하 는 용액의 관류(perfusion)에 의해 분해하였다. 2 mM의 Ca² ⁺를 포함하는 티로드 버퍼 내에서 희석된 2.5 또는 5μM 코엘렌테라진으로 처리하고 암소에서 37℃, 5%의 CO₂ 대기압에서 3시간 동안 세포를 배양함으로써 활성화된 포토프로테인을 재구성하였다. 광 방출 측정을 위해, 세포를 칼슘의 존재하에서 분해하였으며, 방출된 발광을 기록하였다. 처음 30초 동안 방출된 광자(photon)의 수는 CCD 카메라로 통합되어 스크린에 가시화되었다. 빈 플라스미드로 형질전환되거나 그렇지 않은 세포는 광자-방출을 증가시키지 않았다. 세포의 다른 양을 384 MTP에 씨딩하였다. 24시간 후에 칼슘 농도를 검출하기 위해서 다른 ATP 농도를 주입하였고, 반응의 키네틱스를 측정하였다. 테스트 24 시간 전에 500 셀/웰 씨딩하여 얻은 키네틱스의 실시예를 도9 에 나타낸다.

기준 포토프로테인에 기초한 셀 어세이 조건과 비교하여, CHOK 1 mito12mutCly 셀라인에서 관찰된 높은 광방출과 Ca² ⁺에 대한 감도로 적은 수의 셀 및 낮은 농도의 코엘렌테라진의 사용이 적은 시간 동안에도 가능해진다.

600 셀/웰에 테스트하기 24 시간 전에 100을 씨딩하고 2 mM의 Ca² ⁺를 포함하는 티로드 버퍼 내에서 희석된 2.5 또는 5 μM 코엘렌테라진으로 암소에서 37 ℃, 5%의 CO₂ 대기압에서 2 및 3시간 동안 세포를 배양함으로써 얻은 ATP 용량-반응 커브의 실시예가 도 10a 및 도 10b에 나타나있다.

CHOK1 cyto12mutCly 셀라인은 CHO-K1 셀의 형질전환에 의해 얻어진다 (Materials and Methods).

마지막 클론을 ATP에 대한 기능적 반응(발광 신호), 즉, CHO 내인성(endogenous) 수용체 P2Y를 자극시키고, 세포질 Ca² ⁺ 농도를 증가시키는 것으로 알려져 있는 기능적 반응에 기초하여 선택하였다. 각 실험의 끝에 세포를 Triton X-100을 포함하는 용액의 관류(perfusion)에 의해 분해하였다. 2 mM의 Ca² ⁺를 포함하는 티로드 버퍼 내에서 희석된 2.5 또는 5 μM 코엘렌테라진으로 처리하고, 암소에서 37 ℃, 5 %의 CO₂ 대기압에서 3시간 동안 세포를 배양함으로써 활성화된 포토프로테인을 재구성하였다. 광 방출 측정을 위해, 세포를 칼슘의 존재하에서 분해하였으며, 방출된 발광을 기록하였다. 처음 30초 동안 방출된 광자(photon)의 수를 CCD 카메라로 통합하여 스크린에 가시화하였다. 빈 플라스미드로 형질전환되거나 그렇지 않은 세포는 광자-방출을 증가시키지 않았다. 세포의 다른 양을 384 MTP에 씨딩하였다. 24시간 후에 칼슘 농도를 검출하기 위해서 다른 ATP 농도를 주입하고, 반응의 키네틱스를 측정하였다. 테스트 24 시간 전에 500, 1000 및 2000 셀/웰 씨딩하고, 2 mM의 Ca² ⁺를 포함하는 티로드 버퍼 내에서 희석된 2.5 또는 5 μM 코엘렌테라진으로 처리하고 암소에서 37 ℃, 5 %의 CO₂ 대기압에서 2 및 3시간 동안 세포를 배양함으로써 얻은 ATP 용량-반응 곡선을 도 11에 나타내었다.

PLC/IP 경로의 신호를 변환시키기 위해 CHOK1/mito12mutCly 셀라인은 G-단백질과 결합하는 수용체, 히스타민-3 수용체 및 키메릭 Gα단백질로 형질전환시켰다. 안정 한 셀라인이 형성되었다(이하에서는, CHOK1/mito12mutCly/H3 셀 라인으로 지칭한다.).

아고니스트의 자극에서(IMETT), H3 수용체는 mito12mutCly 발광에서 측정되는 세포내 칼슘 농도를 증가시킨다.

테스트하기 24 시간 전에 250, 500, 750 및 1000 셀/웰을 씨딩하고, 2 mM의 Ca²⁺를 포함하는 티로드 버퍼 내에서 희석된 5 μM 코엘렌테라진으로 처리하고, 암소에서 37 ℃, 5 %의 CO₂ 대기압에서 3시간 동안 세포를 배양함으로써 얻은 IMETIT 용량-반응 커브는 도 12에 나타낸다.

5. FLIPR 에서 세포에 기초한 어세이

CHOK1/mito25N03b/A3와 CHOK1/mito12mutCly/H3는 FLIPR에서, 형질전환된 수용체의 활성에 의해 개시된 발광 신호를 측정하여 테스트하였다.

FLIPR 기구로 측정된 발광은 도 13에서 발광 변화 유닛으로 보고되어 있고, 여기에는 CHOK1/mito12mutCly/H3에 가하여진 IMETIT 자극에 의해 유도된 빛 방출을 측정함에 의해 얻어진 결과가 보고되어 있다. 5000 셀/웰은 실험 24시간 전에 385 MTP에 씨딩되었다. 배지를 바꾸고 2 mM의 Ca² ⁺를 포함하는 티로드 버퍼 내에서 희석된 세포 2X 농도의 코엘렌테라진(10 μM) 25μl으로 처리하고 암소에서 37 ℃, 5 %의 CO₂ 대기에서 3시간 동안 대체하였다. IMETIT 화합물(2X)을 다른 농도로 셀에 주입하였다(25μl/웰).

도 16에서 FLIPR^TETRA 기구로 측정된 발광은 RLU(Relative light unit)으로 보고되고, 이는 CHOK1/mito25No3b/A3에 가하여진 IB-MECA 자극에 의해 유도된 빛 방출을 측정함으로써 얻은 값이다. 2500 셀/웰을 384 MTP에 실험 24시간 전에 씨딩하였다. 배지를 바꾸고 2 mM의 Ca² ⁺를 포함하는 티로드 버퍼 내에서 희석된 세포 2X 농도의 코엘렌테라진(10 μM) 25μl로 처리하고 암소에서 37 ℃, 5 %의 CO₂ 대기에서 3시간 동안 대체하였다. IB-MECA 화합물(2X)는 다른 농도로 셀에 주입되었다(25μl/웰).

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180 cccgagcaga ccaagcggca ccaagtgtgc gtggaggcct tcttccgcgg ctgcggcatg 240 gagtacggca aggagatcgc cttcccccag ttcctggacg gctggaagca gctggccaca 300 agcgagctga agaagtgggc ccggaacgag cccaccctga tccgcgagtg gggcgacgcc 360 gtgttcgaca tcttcgacaa ggacggcagc ggcagcatct ctctggacga gtggaaggcc 420 tacggccgga tcagcggcat ctgcagcagc gacgaggacg ccgagaaaac cttcaagcac 480 tgcgacctgg acaacagcgg caagctggac gtggacgaga tgacccggca gcacctgggc 540 ttctggtaca ccctggaccc caacgccgac ggcctgtacg gcaacttcgt gccctga 597 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic primer <400> 20 gatgacgacg acaagatggc cgacaccgcc ag 32 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic primer <400> 21 gaggagaagc ccggtttatc aaggacacga agt 33 <210> 22 <211> 33 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic primer <400> 22 tcgttgggat ccgccaccat ggccgacacc gcc 33 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> synthetic primer <400> 23 gggccctcta gattatcaag gcacgaa 27 <210> 24 <211> 99 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 atgtccgtcc tgacgccgct gctgctgcgg ggcttgacag gctcggcccg gcggctccca 60 gtgccgcgcg ccaagatcca ttcgttggga tccgccacc 99

Claims

a) 칼슘 및 코엘렌테라진과 결합할 수 있어서, 생발광을 생성하고,

b) 서열번호:1(클리틴)에 대하여 적어도 90%는 동일하고,

c) 서열 번호:1(클리틴)에 서열 정렬되어, 하기의 단일 또는 다수의 대체물(잔기 부분은 서열 번호;1로 언급된다) 중 하나를 나타내는 아미노산 서열 또는 이 아미노산 서열의 기능적 유도체(derivative) 또는 조각(fragment)을 포함하는 단리된 포토프로테인.

i) C₅₄→S;

ii) S₁₃₂→C;

iii) K₄₈→R, N₁₉₅→D;

iv) Q₆₈→R, A₉₀→V, T₁₈₄→I;

v) Y₈₂→F, K₁₁₀→N, F₁₂₅→L, S₁₄₉→R;

vi) G₁₄₂→C;

vii) I₅₃→V, S₁₄₉→R;

viii) N₁₈→D, I₄₀→V, K₅₆→R;

ix) Gly₅₈→Glu, Asp₆₉→Val, Ala₇₀→Cys, Lys₇₆→Arg, Lys₇₇→Gly, Ile₇₈→Cys, Asp₈₁ →Glu, Val₈₆→Ile, Glu₈₇→Ala, Ala₉₀→Gln, Val₉₂→Leu, 및 Glu₉₇→Gln
제1 항에 있어서,

서열번호: 1에 대해 적어도 95%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 포토프로테인.
제2 항에 있어서,

서열번호: 1에 대해 적어도 98%가 동일한 아미노산 서열을 포함하는 포토프로테인.
제3 항에 있어서,

서열 번호:2,3,4,5,6,7,8,9,10로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 포토프로테인.
제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 아미노산 서열은 미토콘드리아의 표적 서열에 융합되는 포토프로테인.
제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항의 포토프로테인을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
제6 항에 있어서,

서열 번호:11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19의 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드.
제6 항 또는 제7 항에 따른 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제8 항에 따른 상기 벡터를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주 세포.
제9 항에 따른 포유류 숙주 세포.
a) 청구항 제1 항 내지 제5 항에 따른 포토프로테인을 발현시키는 세포를 제공하고;

b) 세포내 저장소로부터 칼슘 유입 또는 칼슘 방출을 자극시키는 약제를 세포에 접촉시키고;

c) 포토프로테인의 생발광을 검출하는 것을 포함하는 생체 외 세포내 칼슘 농도 변화 검출 방법.
a) 청구항 제1 항 내지 제5 항에 따른 포토프로테인을 발현시키는 세포를 제공하고,

b) 후보 화합물과 세포를 접촉시키고;

c) 상기 프로테인의 생발광을 검출하는 것을 포함하는 세포내 칼슘 농도를 조절하 는 화합물을 스크리닝하는 방법.
제11 항 또는 제12 항에 있어서,

고 생산 형식(format) 내에서 수행되는 방법.
제13 항에 있어서,

다수의 시료 분석에 적합한 고 생산 광학 스크리닝 기구로 수행되는 방법.
세포내 칼슘 인디케이터로서 제1 항 내지 제 5항에 따른 포토프로테인의 용도.
제15 항에 있어서,

세포에 기초한 고 생산 어세이에서 포토프로테인의 용도.
진단 조성물의 제조를 위한 청구항 제1 항 내지 제5 항에 따른 포토프로테인의 용도.