JP4962981B2

JP4962981B2 - 強化された生物発光を示す発光タンパク質、及びその細胞内カルシウム指標としての使用

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Publication number: JP4962981B2
Application number: JP2008500125A
Authority: JP
Inventors: マストロヤンニ，ナディア; カイナルカ，シルヴィア; コラッツァ，サブリナ
Original assignee: AXXAM Srl
Current assignee: AXXAM Srl
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2006-03-09
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2026-03-09
Also published as: CN101137667A; RU2407750C2; WO2006094805A1; IL185857A; US7981602B2; KR20070121689A; CA2601029A1; PT1858921E; RU2007133797A; JP2008532504A; ES2321029T3; DE602006005141D1; ATE422504T1; DK1858921T3; IL185857A0; EP1858921A1; AU2006222182A1; US20070259389A1; EP1858921B1; EP1700865A1

Description

本発明は、強化された生物発光を示す発光タンパク質と、細胞内カルシウムの指標としてのこのタンパク質の使用に関する。この発光タンパク質は、クリチン（clytin）をコードする配列の突然変異により得られ、強い生物発光、カルシウムに対する高い親和性、及び発光の長時間に渡る持続を示す。この発光タンパク質は、細胞を用いて細胞内カルシウム濃度の変動を測定するアッセイに、特に、ハイ‐又はウルトラ‐ハイ‐スループット技術を用いた分子のスクリーニングに用いられるアッセイに、好適に用いられる。

生物発光は、生組織又は生組織に由来する基質によって、種々の化学発光反応系を通じて可視光線が放射される現象である。生物発光反応は、３つの主要な要素である、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及び酸素分子を要する。しかし、他の要素を必要とする反応も存在する。他の要素としては、カチオン（Ca⁺⁺及びMg⁺⁺）及び補因子（ATP, NAD(P)H）が挙げられる。ルシフェラーゼは、基質であるルシフェリンの酸化を触媒すると共に、不安定な中間体を生成する酵素である。光は、不安定な中間体が、酸化ルシフェリンを生じつつ基底状態にまで崩壊するときに放射される。ルシフェリンには、関連性のない異なる種類が多く存在する。にもかかわらず、生物の７つの門のうちの多くの種が、セレンテラジン（coelenterazine）として知られる同一のルシフェリンを用いる。動物の中には、ルシフェリン／ルシフェラーゼ系が、カルシウム結合により発光する安定な“発光タンパク質”の形で抽出されるものもいる（クラゲ等）。発光タンパク質は、ルシフェラーゼとルシフェリンとの安定な酸化中間体複合物である点で、ルシフェラーゼとは異なる。発光タンパク質は、多くの海洋性腔腸動物に存在し、これらの組織が、繁殖、摂食、及び防御行動等の様々な目的で発光することを可能とする（1）。多くの発光性組織が存在するが、これまでに単離されているのは、たった７つの発光タンパク質、すなわち、サラシコリン（Thalassicolin）（2，3）、イクオリン（Aequorin）、ミトロコミン（Mitrocomin（Halistaurinと同義である））（7，8）、クリチン（Clytin（Phialidinと同義である））（8，9）、オベリン（Obelin）（2，6，10，11)、メミオプシン（Mnemiopsin）（12，13）、及びベロビン（Berovin）（12，13）である。これらのタンパク質は全て、アポタンパク質、イミダゾピラジン発色団（セレンテラジン）、及び酸素により形成される複合体である。これらの複合体の構成、特に、３つのカルシウム結合部位（EF-hand 構造）を含む領域は、高度に保存されている。用語「発光タンパク質」は、ルシフェリン結合ポリペプチドと同等に用いられ、発光可能であるのに対して、「アポ発光タンパク質」はルシフェリンのないタンパク質を指す。

最もよく研究されている発光タンパク質は、Aequorea victoriaから分離されたセレンテラジン（14）、Obelia longissimaから分離されたオベリン（15）である。発光タンパク質は、セレンテラジン、酸素分子、EDTA、及び2-メルカプトエタノール又はジチオスレイトールとともにインキュベートされたアポ発光タンパク質から再生成可能である。セレンテラジンは、発光タンパク質イクオリン、ミトロコミン、クリチン、及びオベリンによって用いられる一般的な発光基質であるので、これら４つのタンパク質における発光反応はほぼ同一である（16，17）。

発光タンパク質であるクリチンは、1993年にInouyeらによってクローニングされた（18）。今まで、この発光タンパク質についてはあまり研究されていない。イクオリン、ミトロコミン、クリチン、及びオベリンの一次構造はアラインメントされ、アミノ酸配列の高度な同一性を示した。クリチンのCa²⁺結合部位は、同様に高度に保存されていることが見出された（19）。ヒドロのCa²⁺結合発光タンパク質は、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、プロリン、及びチロシン残基の量が比較的多いという点で、カルモジュリン及びトロポニンC等の他のCa²⁺結合タンパク質とは異なることが見出されている。

クリチンの一次構造解析は、クリチンが、198個のアミノ酸残基（aa）を含むこと、及び、発光タンパク質ファミリーに属することを示した。
発光タンパク質は、シグナル伝達及び遺伝子発現に関連する細胞事象を観察するレポーター遺伝子技術に広く用いられる。

細胞事象及びその制御の研究は、高感度で、非侵襲性の解析方法を要する。発光タンパク質及び生物発光の一般的使用は、蛍光系と比べてほとんどバックグラウンドが無く、優れたレポーター系である。

発光タンパク質は、異なる刺激への反応におけるカルシウム変動を観察するために、哺乳類細胞で発現される。細胞内カルシウム濃度は、発光タンパク質を発現する哺乳類細胞に補因子セレンテラジンを加えると共に、光子放出を検出することによって測定可能である。光子放出は、細胞内カルシウム濃度を示す。細胞内カルシウム濃度の調節に関与する発光タンパク質及び受容体細胞の両方を発現する細胞を使用することにより、細胞内カルシウムの放出に及ぼす影響により物質をスクリーニングする有効な系が提供される。ハイスループットスクリーニングアッセイは、同様に、発光タンパク質をレポーター系として使用するよう設計されている。この系の感度は、ノイズに対するシグナルの比率が高いので、アッセイ容量の小さい用途を可能とする。イクオリンは、今や、これらのスクリーニングアッセイにおいて最も使用される発光タンパク質となっている。

カルシウム流入アッセイは、多数のサンプルの一斉分析に適すると共に、CCDカメラ検知器を有する発光イメージングシステムを備える光学スクリーニング装置利用HTS方式において、一般的に行われる。しかし、HTSにおいて最も用いられる機器の１つは、細胞を用いた蛍光アッセイのためのハイスループット光学スクリーニング機器として開発された、FLIPR（登録商標）（Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA, USA）である。この装置は、細胞単層上でのシグナル分離が可能な光学検知デバイスを備え、細胞を用いたアッセイの感度を増幅する。励起光源は、アルゴンレーザー又はキセノンランプのような広帯域光源のいずれであってもよい。

FLIPRシステムの最新のバージョン（FLIPR³ 及び FLIPR^TETRA）は、遮光容器、非常に高感度かつ高速度なカメラ、及び正確な同時オンライン液体分配を備えており、CCDカメラを用いる装置と比べると感度が低いにもかかわらず、発光アッセイにも好適に造られている。
上述した機器、FLIPR、FLIPR³、及びFLIPR^TETRAの使用、並びに一般に発光アッセイに対する感度の低い全ての器具に対して、光放射の増幅された発光タンパク質が非常に望ましい。

第１の側面によると、本発明は以下のアミノ酸配列：
a) セレンテラジン及びカルシウムに結合可能であって、生物発光をもたらし；
b) 配列番号１（クリチン）と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、さらに好ましくは少なくとも98%同一であり；
c) 配列番号１（クリチン）との配列アラインメントにおいて、以下の(i)〜(ix)からなる群から選択される１又は複数の置換が存在する（残基の位置は、配列番号１における位置である）、
i) C₅₄→S;
ii) S₁₃₂→C;
iii) K₄₈→R, N₁₉₅→D;
iv) Q₆₈→R, A₉₀→V, T₁₈₄→I;
v) Y₈₂→F, K₁₁₀→N, F₁₂₅→L, S₁₄₉→R;
vi) G₁₄₂→C;
vii) I₅₃→V, S₁₄₉→R;
viii) N₁₈→D, I₄₀→V, K₅₆→R並びに ix) Gly₅₈→Glu, Asp₆₉→Val, Ala₇₀→Cys, Lys₇₆→Arg, Lys₇₇→Gly, Ile₇₈→Cys, Asp₈₁→Glu, Val₈₆→Ile, Glu₈₇→Ala, Ala₉₀→Gln, Val₉₂→Leu, 及び Glu₉₇→Gln、を含む、強化された生物発光を示す単離された発光タンパク質を提供する。

好ましい実施形態においては、発光タンパク質は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。既に知られている又は市販されている発光タンパク質と比較すると、本発明の発光タンパク質は、より優れた生物発光活性、及び／又はカルシウムに対するより高い親和性、及び／又はより長時間持続する光放射を示す。

提示された残基（これらの残基が目的の発光タンパク質に生物発光活性を与える）の置換の他に、クリチン配列はさらに、発光タンパク質の生物発光活性を損なうことなく、提示された配列同一性の限度内で、特にアミノ酸配列の同類置換によって、さらに修飾されてもよい。さらに、クリチン配列は、発光タンパク質の活性を変化させない程度に小さな部分が欠損していてもよい。

さらなる側面において、本発明は、上述した発光タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。好ましい実施形態において、このポリヌクレオチド配列は、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９に従い、哺乳類コドン使用頻度に合わせて最適化されている。さらに好ましい実施形態において、核酸分子はミトコンドリアターゲティング配列と融合している（20，21，22)。

さらなる側面によると、本発明は、提示されるポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び宿主細胞を提供する。本発明の発光タンパク質を発現する宿主細胞は、カルシウム刺激に応答して強い生物発光を生じる。この生物発光は、天然の発光タンパク質、特に最もよく用いられる発光タンパク質であるイクオリンで観察されるよりもかなり強い。
さらなる側面において、本発明は、本発明の発光タンパク質を用いて細胞内カルシウム濃度を測定する、細胞を用いたアッセイを提供する。

好ましい実施形態において、細胞内カルシウム濃度の変動は、以下：
a) 配列番号２〜１０の発光タンパク質、その変異体、又はその断片を発現する細胞を準備すること；
b) この細胞にセレンテラジンを与えること；
c)カルシウム流入又は細胞内貯蔵からのカルシウム放出を促進する薬剤に、この細胞を接触させること；
d) 発光タンパク質の生物発光を検出すること、
により測定される。

アッセイは、好ましくは、ハイ‐若しくはウルトラハイ‐スループット装置用CCDカメラ検知器又は蛍光イメージングプレートリーダー（FLIPR（登録商標））を有する発光イメージングシステム等、多数のサンプルの分析に適する光学スクリーニング装置利用ハイスループット方式において実行される。これらのシステムのどちらにおいても、本発明の発光タンパク質は、自動化された細胞機能アッセイにおいて一般的に使用される既知の発光タンパク質と比較して、高いシグナルを示す。

好ましい実施形態において、発光タンパク質及び細胞内カルシウム移動に関与する受容体を発現する細胞は、候補分子について、受容体修飾における効果を試験するのに用いられる。一般的には、細胞は、発光タンパク質をコードする配列、及び、対象となる受容体又はチャネルが内在しない場合はこの受容体又はチャネルを含む発現ベクターによって、トランスフェクトされる。陽性クローンは選択されて適当な培地にまかれ、培養された細胞はセレンテラジン基質を付与され、アッセイは、試験される分子又は刺激物を細胞に加えることで開始される。発せられた光は、適当な検出システム（CCDカメラ又は照度計）によって読み取られる。アッセイは同様に、特にFLIPRシステムのような多穴プレートリーディング機構を備えた自動装置により行われてもよい。この場合、発光タンパク質を発現する細胞はマイクロプレートのウェルにまかれ、試験分子／刺激物が加えられた後、マイクロプレートはシグナル記録装置によって一斉に読み取られる。

発光タンパク質を用いたレポーター系を含むハイスループットスクリーニングアッセイは、感度、及びノイズに対するシグナルの比率が改良されている。本発明の発光タンパク質を発現する細胞は、カルシウム刺激への応答により強い生物発光を示す。この生物発光は通常、天然の発光タンパク質において観察される発光よりも強い。

さらなる側面において、本発明は、ステイブルプローモータ又は誘導プローモータの制御の下で、本発明の発光タンパク質を発現する細胞の作製物、及びアッセイを行うのに適した試薬を含むアッセイキットを提供する。

さらに、本発明の発光タンパク質は、細胞のカルシウムイオン濃度及び／又は細胞のカルシウムイオン流入／流出の測定に基づく診断方法において、細胞内のカルシウム指標として使用可能である。

本発明については、後述の実験例の欄にて、より詳細に説明する。
〔材料及び方法〕
＜試薬＞
制限酵素はNew England Biolabsから購入し、供給元の説明書に沿って使用した。Ligation Independent Cloning（LIC）キットは、Novagen (Nottingham, UK)のものを用いた。in vitroでの転写及び翻訳には、TNT Quick coupled kit from Promega (Madison, WI)を用いた。PCRの試薬並びに大腸菌XL-1Blue及び BL21-Gold(DE3)のコンピテントセルは、Stratagene（La Jolla, CA）のものを用いた。オリゴヌクレオチドはPrimm（Milan）から購入した。セレンテラジンはPharma Tech. International Inc. (Fairfield, NJ) のものを用いた。他の試薬は全て標準的な供給元のものであり、一級（ragent grade）又は上級（better grade）のものを用いた。

１．ランダム突然変異ライブラリの作製及びスクリーニング
１．１哺乳類細胞における発現に対する発光タンパク質の最適化（GENEART GmbH, Regensburg, Germany）
野生型クリチン遺伝子のコドン使用頻度を、高発現する哺乳類の遺伝子のコドンバイアスに適合させた。さらに、GC含量の非常に高い（＞80%）又は非常に低い（＜30%）領域は、可能であれば避けた。
効率的な転写開始のために、コザックコンセンサス配列を開始コドンの上流に導入した。効率的なターミネーションを確実なものとするために、２つの停止コドンを加えた。

１．２ランダム突然変異
GeneMorph II Random Mutagenesis kit（Stratagene）を、説明書に従って用いた。高い突然変異率を得るために、標的DNAの初期量を、0.1ngと0.01ngの２種類用意した。
PCRプライマーは、Ek/LIC Cloning Kit（Novagen）に述べられている配列に対応する5' LIC伸長（イタリック体で示す部分）を含む。

増幅は、Perkin Elmer 2400 thermocycler によって、以下の手順：
以下のステップを１回：
プレPCR 2分 94℃
以下のステップを３０回：
変性 30秒94℃
アニーリング 30秒 56℃
伸長 40秒 72℃
以下のステップを１回：
伸長 10分 72℃
特異的なPCR産物の予測長：630bp
で行った。

Maniatisらにより説明されているような標準的な手技に従って、1%アガロースゲルを用い、1xTAE泳動バッファー中での電気泳動により増幅産物を解析することで、得られたDNA量を定量的に測定した。試料を、DNA 分子量マーカー (MWXVI, Roche) と比較した。

１．３ Ek/LICクローニング
PCR産物を、制限酵素による消化又はライゲーション反応を必要とせずに、直接的にクローニングするため、Novagen Ligation Independent Cloning (LIC) キットを、供給元の説明書に従って用いた。ベクターとしては、pET-30 Ek/LICベクターを選択した。pET-30 Ek/LICベクターは、エンテロキナーゼ切断部位の直下流に配された標的タンパク質を発現するように構築されている。

１．４形質転換
タンパク質を高発現させるために、発明者らは、E.coli Bの一種であり、BL21コンピテントセルの改良種であるBL21-Gold(DE3)細胞（Stratagene）を選択した。この細胞の遺伝子型は、“E.coli B F^- ompT hsdS (r_B ^- m_B ^-) dcm⁺ Tet^r gal ((DE3) endA Hte”である。この細胞は、精製中にタンパク質を分解するlon 及び ompT プロテアーゼを欠いている。Hte遺伝子型は、高い形質転換効率（>1x10⁸ cfu/μg pUC18 DNA）を示す。さらにendA遺伝子型により、エンドヌクレアーゼIが不活性になっているので、プラスミドDNAの分解が起きない。

形質転換率の高いコンピテントセルを得るために、本発明者らは、E. coli Pulser Transformation 装置の取扱説明書（BioRad）に記載された標準的な作製法及び電気的形質転換法に沿って、BL21-Gold(DE3) の形質転換を行った。

pUC18 DNA 及びpET DNAベクターを用いて、形質転換効率の試験を行った。得られた形質転換効率は、
・1x10¹⁰ cfu/μg pUC18
・1x10⁸ cfu/μg pET
であった。
これらの電気的なコンピテントセルを用いることで、ランダム変異したクリチン発光タンパク質を発現する約84,000個のコロニーからなるライブラリを作製することができた。

１．５プレーティング、誘導、チャージ
形質転換された細胞をLB寒天プレートにまき、37℃で一晩培養した。一晩でコロニーが生長した後、10 mM IPTG及び5 mM EDTAを加えて、37℃で4時間誘導を行うことで、誘導を実行した。コロニーを10μMセレンテラジン溶液によりチャージし、4℃で一晩、遮光状態でインキュベートした。

１．６ CCD カメラ測定
最初の測定から0分、3分後、及び5分後に、30秒の一定時間、シグナルを検知することによって生物発光を分析した。

１．７コロニー選択及び再試験
最良のコロニーを選択し、1 ml LB液体培地にて培養し、上述したのと同一の実験条件にて再度試験を行った。

２．In vitro転写及び翻訳
発光タンパク質の転写を、ウサギの網状赤血球細胞の無細胞系（TNT Quick coupled kit, Promega）にて供給元の通常の説明書に沿って、実行した。500 ngのDNAを、in vitroの転写反応液及び翻訳反応液にそれぞれ用いた。反応容量（10μl）には、8μlのTNT T7 Quick Master Mix、1.6μlのDNA、0.2μlのメチオニンバッファー、及び0.2μlのセレンテラジン（0.5 mM）を含めた。目的を達成するために、翻訳反応液の各サンプルから採取した5μl について、カルシウム溶液を導入し、Ascent Luminoskan (Labsystems) によって測定することで、光放射の試験を行った。

３．組換えタンパク質の生成
組換えタンパク質の生成のために、本発明者らは、非変性条件下での小規模でのタンパク質精製プロトコルに従った。本発明者らが使用したコンストラクトにはN末Hisタグが存在することから、本発明者らは、Ni-NTAスピンカラム（Qiagen）にて、供給元のプロトコルに従って、発現されたタンパク質を精製することとした。

４．カルシウム濃度曲線
異なるカルシウム濃度に対する発光タンパク質の反応を評価するために、0.05 ng/ウェル（96 穴）の組換えタンパク質を、10μMのセレンテラジンにて4℃で一晩チャージした。
インキュベート後、異なる濃度のCaCl₂を導入して、積分時間20 msで総時間を10秒として、Ascent Luminoskanにて光放出を測定した。

５．哺乳類細胞における変異発光タンパク質の発現
＜試薬＞
制限酵素は、New England Biolabs（Beverly, MA）から購入し、供給元の説明書に沿って使用した。Rapid DNA ligationキット及びFugeneトランスフェクション試薬はRoche（Basel, CH）から購入した。セレンテラジンはPharma Tech. International Inc.（Fairfield, NJ）のものを用いた。他の試薬は全て標準的な供給元のものであり、一級（ragent grade）又は上級（better grade）のものを用いた。

＜クローニングの手順＞
有望な変異タンパク質については、哺乳類細胞で発現試験を行うためにサブクローニングを行った。
2μlのプラスミドをPCR解析のテンプレートとして用いた。ネガティブコントロールはテンプレートを用いずに同様の操作を行った。

Perkin Elmerによる説明に沿って、標準的なPCR手順を行った。PCRのプロトコルは以下の手順：
・プライマー：
Upper primer: TCGTTGGGATCCGCCACCATGGCCGACACCGCC （配列番号２２）
Lower primer: GGGCCCTCTAGATTATCAAGGCACGAA （配列番号２３）
・PCR反応液：
2μl テンプレート
5μl 10 x Pfx バッファー（GIBCO-LifeTechnologies）
1.5μl 10 mM dNTPs
1μl 50 mM MgSO₄ （GIBCO-LifeTechnologies）
2.5μl upper primer（10μM）
2.5μl lower primer（10μM）
2.5 U Platinum Pfx （GIBCO-LifeTechnologies）
35μl H₂O
・Perkin Elmer 2400 thermocycler による増幅プロトコル：
以下のステップを１回：
プレ PCR 2分 94°C
以下のステップを25回：
変性 15秒 94°C
アニーリング 30秒 56°C
伸長 40秒 68°C
以下のステップを１回：
伸長 10分 68°C
・特異的なPCR産物の予測長：630bp
で行われた。

Maniatisらにより説明されているような標準的な手技に従って、1%アガロースゲルを用い、1xTAE泳動バッファー中での電気泳動により、増幅産物を解析した。
PCR産物をQiagenのカラムを用いてゲルから精製し、制限酵素BamHI 及びXbaIにて消化した。

［pcDNA3neo-/mitoMutated-clytin コンストラクション］
pcDNA3ベクター（Invitrogen）を、ヒトシトクロム c オキシダーゼのサブユニットVIII（20、21、22）由来のミトコンドリアターゲティングペプチドをコードする配列を含むように自社で修飾し、このベクターを、コドン使用頻度に応じて最適化された発光タンパク質遺伝子の5'末端のフレームに用いることができるようにした。上述のPCRによって得られた増幅産物を、哺乳類細胞におけるネオマイシン耐性遺伝子の発現が欠如しているこの修飾pcDNA3にクローニングした。
ミトコンドリアターゲティングのシグナル配列は、
5^'-ATGTCCGTCCTGACGCCGCTGCTGCTGCGGGGCTTGACAGGCTCGGCCCGGCGGCTCCCAGTGCCGCGCGCCAAGATCCATTCGTTGGGATCCGCCACC-3^'（配列番号２４）
である。

［pcDNA3neo-/cytoMutated-clytin コンストラクション］
pcrScript/hMutated-clytin ベクターをBamHI及びXbaIによって消化することによって変異クリチン遺伝子を得た。pcDNA3neo-を制限酵素BamHI及びXbaIによって消化し、精製した。
変異クリチン遺伝子をpcDNA3neo-ベクター内に連結することによって、pcDNA3neo-CYTO-hMutated-clytin を得た。
どちらのコンストラクトについても、全長ジデオキシ配列決定法により、配列を確認した。

＜細胞培養＞
培地、シーディング、及びインキュベーション：
Glutamax（GIBCO cod. 31331-028）、10% FBS、1% Pen./Strep.（Invitrogen cod.15140-122）、 25 mM Hepes 緩衝液（GIBCO cod. 15630-056）、1.0 mM ピルビン酸ナトリウム（GIBCO cod. 11360-039）、 1.5 g/L 重炭酸ナトリウム（GIBCO cod. 25080-060）の入ったDMEM/F12を用いた。

前培養の条件： 70-80%コンフルエントになったときに実験用に細胞を植え替えた。
細胞培養の条件：週に２回、細胞が3.0x10⁵ 個／フラスコ T75になるように植え替えた（回復時：細胞数8x10⁶個)。

クローンの選択手順：
・CHO-K1をpcDNA3Neo^-/MITO-hMutated-clytin 又はpcDNA3Neo^-/CYTO-hMutated-clytin によりトランスフェクトした。
・トランスフェクトから48時間後、トランスフェクトされた細胞を完全培地（complete DMEM）に10x96 w/p で播いた。
・コンフルエントになったところで、10x96 w/pを10枚のホワイトプレートに複製した。測定の3 ス時間前に、培地を50μl/ウェルのタイロード液（2 mM Ca²⁺ 及びセレンテラジン 10μM)で置換した。
・陽性クローンを、以下を評価して選択した：
・第１の選択を、TRITON X-100で細胞を溶解することで行った。CCDカメラの条件：低感度、5秒の読み取りで積分時間1秒。
・5個のクローンを、それぞれ3x96 w/pに希釈した。
・コンフルエントになったところで、15x96 w/pを15枚のホワイトプレートに複製した。測定の3 ス時間前、培地を50μl/ウェルのタイロード液（2 mM Ca²⁺ 及びセレンテラジン 10μM)で置換した。
・第２の選択を、10μM ATPを用いて、反応速度を観察することで行い、その後細胞をTRITON X-100で溶解させた。CCDカメラの条件：低感度、ATP測定について30秒、続いてTRITON X-100について30秒の読み取りで積分時間1秒とした。
・最良のクローンについて4回の限界希釈を行い、10x96 w/pで１ウェルにつき細胞を0.3個とした。
・最終的なクローンを4回目のLD後にATP 0.25μM、セレンテラジン5μMで選択した。
・アッセイの完全な最適化を、反応が最良だったクローンを用いて行った。

CCDカメラ測定パラメーター：
CHO細胞を、上述の通りに補完された増殖培地内で、384MTPに、異なる細胞密度で（500, 750, 1,000, 1,500 個/ウェル）まいた。そして、細胞をまいてから24時間後及び48時間後にCCDカメラにて測定した。実験に先立って、増殖培地を除き、セレンテラジンを加えたタイロードバッファーに37℃で細胞を3時間浸した。アゴニストを加えた後、発光をCCDカメラで最終的に観察した（30秒動態）。

＜Fluorometric Imaging Plate Reader （FLIPR（登録商標））を用いた測定＞
発光検知のためのアッセイの標準的プロトコルに向けたFLIPR³のセッティング
・384の壁が白く底面が透明なプレートを用いる。
・実験の24時間前に細胞を播く。
・培地を除く。
・セレンテラジン 25μl/ウェルを添加したタイロード液を添加する。
・37℃で4時間インキュベート
・FLIPR³で実験を行う：タイロードバッファー（25μl/ウェル）中に化合物（2X）を導入する。

以下の条件：
プレアッセイステップ：
1) カメラの設定：
露出長 = 0.7
カメラゲイン= 200
2) 配列パラメータ：
384穴ヘッドを用いる。
高さ= 30μl
速度= 25μl/sec
以外は、全てのパラメータ値を機器の初期設定値とした。

発光検知のためのアッセイの標準的プロトコルに向けたFLIPR^TETRAのセッティング
・384の壁が白く底面が透明なプレートを用いる。
・実験の24時間前に細胞を播く。
・培地を除く。
・セレンテラジン 25μl/ウェルを添加したタイロード液を添加する。
・37℃で4時間インキュベート
・FLIPR^TETRAで実験を行う：タイロードバッファー（25μl/ウェル）中に化合物（2X）を導入する。

以下の条件：
セットアップリードモード：
1) カメラの設定
カメラゲイン= 200
露出長 = 0.50
2) 配列パラメータ：
高さ= 30μl
速度= 25μl/sec
に述べる以外は、全てのパラメータ値を機器の初期設定値とした。

その他の化合物：
ATP（Sigma, A-7699）は、H₂Oに、100 mMの濃度で溶解させて、分注して-20℃で保存した。希釈標準溶液は、タイロードバッファーにて新しく調整した。
タイロードバッファーの組成：NaCl 130 mM, KCl 5 mM, CaCl₂ 2 mM, MgCl₂ 1 mM, NaHC0₃ 5 mM e HEPES 20 mM, pH 7.4
IMETIT (Sigma, I-135)

〔実施例〕
１．ランダム突然変異ライブラリ及びスクリーニングの作製
ランダム変異ライブラリを、GeneMorph II Random Mutagenesis kit （Stratagene）を用いて得た。高い突然変異発生率を得るために、標的DNAの初期量を２種類（0.1 ng、及び0.01 ng）用いた。総数83305個の菌コロニーについて、発光活性を行った。これらのうち、1089個が陽性、つまり生物発光特性を有していた。最良のコロニーを289個選択したところ、これらのうちの16個が再試験で良好な結果を示した。最終的に9個のコロニーをクローニングして解析した。
図１は、8個の変異体について得られたCaCl₂用量反応曲線の３点で得られた結果を示す。

２．発光タンパク質アッセイ
5μlの翻訳混合液を、Luminometer（Berthold）に搭載可能な96穴プレート中で、95μlのPBS溶液に直接混合した。発光タンパク質の光放出の引き金として5 pM CaCl₂溶液を各ウェルに加え、発光を１０秒間記録した。
8個の変異体のDNAのin vitro転写及び翻訳の結果を図２に示す。
新たなin vitro転写及び翻訳実験を、最も反応の良かった変異体すなわち25N03b （配列番号１６)、及び発光タンパク質イクオリンを用いて行い、1mM CaCl₂溶液の導入下における光放射を比較した（図３）。

３．組換え発光タンパク質及びカルシウム濃度曲線
いくつかの変異体に対応する組換え発光タンパク質は、小規模精製プロトコル後に非変性条件下で製造される。1 mMカルシウム導入において光放出を測定し、対応する反応速度を図４に示す。

クローン25N03bに対応する組換え変異発光タンパク質について、図５に示すように、さらにカルシウム用量反応曲線を描いた。
他の実験において、組換え発光タンパク質25N03bを組換えイクオリンと比較した。1 mM CaCl₂導入下で記録した光放出は、25N03b変異体の場合、図６に示すように、非常に高い値を示した。

４．細胞を用いた機能分析
４．１ CHOmito25N03b発現クローン（CHOK1/mito25N03b）を、CHO-K1細胞（材料及び方法欄参照）のトランスフェクションにより得た。トランスフェクションから48時間後、細胞をトリプシン処理し、10x96 MTP （マイクロタイタープレート）の完全MEM培地にまいた。コンフルエントになったところで、 10x96 MTPを、MATRIX（Hudson, NH, USA）を用いて、10x96 ホワイトMTPに複製した。測定の3時間前に培地を2 mM Ca²⁺ 及び10μMセレンテラジンを含む50μl/ウェルのタイロードバッファーにて置換した。ATPに対する機能的反応（発光シグナル）を基準として、クローンを選択した。ATPは、CHO内因性レセプタP2Yを刺激し、細胞性Ca²⁺濃度を上昇させることで知られる。各実験の最後に、細胞をTriton X-100を含む溶液により溶解させた。活性を有する発光タンパク質を、細胞を2 mM Ca²⁺を含むタイロードバッファーに希釈された10μMセレンテラジンと共に、暗所、37℃、5% CO₂中、3時間インキュベートすることにより再構成した。光放出を測定するために、細胞をカルシウムの存在下で溶解させ、放出された光を記録した。最初の30秒間で放出された光子は、CCDカメラで積分され、スクリーン上に表示された。空のプラスミドをトランスフェクトされた細胞又はトランスフェクトされなかった細胞は、光子放出を増大させなかった。カルシウム濃度による変化を検出するために、10μM ATPを導入し、反応速度を測定した。図７に示す曲線が得られた。

最終的に選択されたクローンを384 w/p にまき、ATP濃度を上昇させながら試験を行い、図８に示すように、用量反応曲線を描いた。
CHOK1/mito25N03b細胞株を、同様にG-タンパク質連結受容体、アデノシンA3受容体、及びキメラ化Gαタンパク質にてトランスフェクトし、PLC/IP経路へシグナルを切り替えさせた。こうしてステイブル細胞株が作製された（以下、CHOK1/mito25N03b /A3クローンと称する）。

アゴニストによる刺激を受けると、A3受容体は細胞内カルシウム濃度を増大させる。この細胞内カルシウム濃度を、mito25N03b発光によって測定した。
mito25N03b及びヒトアデノシンA3受容体を発現するCHO細胞の最終的なクローンを、組織培養フラスコで80〜95%コンフルエントになるまで培養し、トリプシン処理することで回収した。細胞を増殖培地（10% 牛胎児血清を含むDMEM/F12）中、384 w/pに異なる細胞密度に希釈し、24時間及び48時間、37℃、5% CO₂を含む加湿インキュベータ中でインキュベートした。実験の当日、培地を除き、発光実験のために、細胞に3時間、37℃、5%CO₂中で、5μMのセレンテラジンを与えた。各ウェルに対して異なる濃度のATPを加えることによってカルシウム反応を刺激した。CCDカメラを用いて発光の変動を追跡し、試薬を加え、各ウェルからの光の放出を記録した。

アゴニスト及びアンタゴニストをタイロードバッファーにより希釈し、異なる濃度とした。この溶液を約25μl、各ウェルにそれぞれ加え、CCDカメラ機器を用いて反応を測定した。放出された光を、異なる時間間隔を開けて速やかに記録した。A3 特異的アゴニストであるIB-MECAについての結果を図１４に示す。同様の実験を他のCCDカメラ機器を用いて行った結果を、図１５に示す。

４．２ pcDNA3neo-mitoにクローニングした変異12mutCly（配列番号１９）により、CHOK1細胞についてステーブルトランスフェクトを行い、CHOK1/mito12mutCly（材料及び方法欄参照）を得た。

最終的に得られたクローンを、ATPに対する機能的反応（発光シグナル）に基づいて選択した。ATPは、CHO内在性受容体P2Yを刺激し、細胞内Ca²⁺濃度を上昇させることが知られている。各実験の最後で、細胞をTriton X-100を含む溶液により溶解させた。2 mM Ca²⁺を含むタイロードバッファーにより希釈した2.5又は5μMセレンテラジンと共に、細胞を、暗所で、37℃、5％CO₂下で、3時間インキュベートすることにより、活性発光タンパク質を再構成した。光放出を記録するために、細胞をカルシウム存在下で溶解させ、光放出を記録した。最初の30秒に放出された光子の数はCCDカメラを用いたルミノメータで積分され、スクリーンに表示された。空プラスミドをトランスフェクトされた細胞又はトランスフェクトされなかった細胞は、光子放出を増大させなかった。異なる量の細胞を384MTPにまいた。24時間後、カルシウム濃度の変化を検出するために、異なる濃度のATPを導入し、反応速度を測定した。試験の24時間前に細胞を500個/ウェルの密度でまいたときの反応速度の例を、図９に示す。

CHOK1 mito12mutCly細胞株で観察される高い光放出量及びCa²⁺に対する感受性により、発光タンパク質を用いた標準的な細胞アッセイ条件と比較して、細胞数をより少なく、セレンテラジン濃度をより小さく、さらには時間もより短縮することができる。

細胞を、試験の24時間前に100〜600 個/ウェルの密度でまき、2 mM Ca²⁺を含むタイロードバッファーにより希釈された2.5μM及び5μMセレンテラジンと共に、暗所、37℃、5% CO₂下で、2及び3時間インキュベートすることによって得られたATP用量反応曲線を、図１０（ａ）、及び図１０（ｂ）に示す。
CHOK1 cyto12mutCly細胞株を、CHO-K1 細胞（材料及び方法欄参照）をトランスフェクトすることによって得た。

最終的に得られたクローンを、ATPに対する機能的反応（発光シグナル）に基づいて選択した。ATPは、CHO内在性受容体P2Yを刺激し、細胞内Ca²⁺濃度を高めることが知られている。各実験の最後で、細胞をTriton X-100を含む溶液により溶解させた。2 mM Ca²⁺を含むタイロードバッファーにより希釈した2.5又は5μMセレンテラジンと共に、細胞を、暗所で、37℃、5％CO₂下で、3時間インキュベートすることにより、活性発光タンパク質を再構成した。光放出を記録するために、細胞をカルシウム存在下で溶解させ、光放出を記録した。最初の30秒に放出された光子の数はCCDカメラを用いたルミノメータで積分され、スクリーンに表示された。空プラスミドをトランスフェクトされた細胞又はトランスフェクトされなかった細胞は、光子放出を増大させなかった。異なる量の細胞を384MTPにまいた。24時間後及び48時間後、カルシウム濃度の変化を検出するために、異なる濃度のATPを導入し、反応速度を測定した。試験の24時間前に細胞を500、1000、及び2000個/ウェルの密度でまき、2 mM Ca²⁺を含むタイロードバッファーにより希釈した2.5又は5μMセレンテラジンと共に、細胞を、暗所で、37℃、5％CO₂下で、2及び3時間インキュベートしたときのATP用量反応曲線を、図１１に示す。

CHOK1 mito12mutCly細胞株を、G タンパク質連結受容体、ヒスタミン-3受容体、及びキメラ化Gαタンパク質によりトランスフェクトすることで、シグナルをPLC/IP経路に切り換えた。こうしてステイブル細胞株を作製した（以下、この細胞をCHOK1/mito12mutCly/H3細胞株と称する）（材料及び方法欄参照）。

そのアゴニスト（IMETIT）により刺激することで、H3受容体は細胞内カルシウム濃度の増大を引き起こし、このカルシウム濃度の増大は、mito12mutClyの発光により測定される。

試験の24時間前に、細胞を250、500、750、及び1000個/ウェルの密度で細胞をまき、2 mM Ca²⁺を含むタイロードバッファーにより希釈した5μMセレンテラジンと共に、暗所で、37℃、5％CO₂下で、3時間インキュベートすることにより得られたIMETIT用量反応曲線を、図１２に示す。

５．FLIPRによる細胞を用いたアッセイ
CHOK1/mito25N03b/A3及びCHOK1/mito12mutCly/H3 を、トランスフェクトされた受容体の活性化により誘導された発光シグナルを、FLIPRにて測定することで、試験した。

FLIPR機器を用いて測定された発光を、図１３に発光強度変化単位（Luminescence Change Units）として示す。図１３には、CHOK1/mito12mutCly/H3におけるIMETIT刺激による光放出の誘導を測定することで得られた結果を示す。実験の24時間前に、5000 個/ウェルの密度で細胞を384MTPにまいた。培地を2 mM Ca²⁺を含むタイロードバッファーにより希釈した25μlの2X濃度セレンテラジン（10μM）に置換し、暗所で、37℃、5％CO₂下で、3時間インキュベートした。IMETIT化合物（2X）を異なる濃度で細胞に与えた（25μl/ウェル）。

図１６では、FLIPR^TETRAで測定した発光強度を、RLU（Relative Light Units）として示す。図１６には、CHOK1/mito25N03b/A3におけるIB-MECA刺激により誘導された光放射を測定することで得られた結果を示す。試験の24時間前に細胞を2500 個/ウェルの密度で、384 MTPにまいた。培地を除き、2 mM Ca²⁺を含むタイロードバッファーにより希釈した25μlの2X濃度セレンテラジン（10μM）に置換し、暗所で、37℃、5％CO₂下で、3時間インキュベートした。 IB-MECA化合物（2X）を異なる濃度で細胞に与えた（25μl/ウェル）。

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３つのカルシウム濃度による変異コロニーの再試験。 in vitro転写及び翻訳。5 pM カルシウム導入による光放射の測定。 in vitro転写及び翻訳。1 mM カルシウム導入による光放射の測定。 1 mM カルシウム導入下での組換え発光タンパク質の光放射の測定値の動向。組換え発光タンパク質25N03bのカルシウム用量反応曲線。 1 mM カルシウム導入下での組換えタンパク質からの光の強度のピーク。 CHOK1/mito25N03b細胞株における10μM ATP存在下の反応のCCDカメラによる測定結果。 CHOK1/mito25N03b細胞株のATP用量反応曲線。細胞を播いてから24時間後の500 個/ウェルについてCCDカメラにより得られたCHOK1/mito12mutCly細胞株のATP用量反応曲線。１ウェル中の細胞数、及びセレンテラジン濃度、及びインキュベーション時間を異ならせたときに、CCDカメラにより得られたCHOK1/mito12mutCly細胞株のATP用量反応曲線。１ウェル中の細胞数の値が異ならせたときに、CCDカメラにより得られたCHOK1/mito12mutCly細胞株のATP用量反応曲線。１ウェル中の細胞数の値が異ならせたときに、CCDカメラにより得られたCHOK1/mito12mutCly/H3 細胞株のIMETIT用量反応曲線。 FLIPR³により得られたCHOK1/mito12mutCly/H3 細胞株のIMETIT用量反応曲線。１ウェル中の細胞数が500、播いてから24時間後、5μM セレンテラジン存在下におけるLumibox CCDカメラによる試験で得られた、CHOK1/mito25N03b-A3胞株の、A3アゴニスト（IB MECA）を用いた用量反応曲線。カメラの感度は5、60秒測定とした。１ウェル中の細胞数が2500、播いてから24時間後、5μM CTZ存在下におけるCyBi Lumax HT CCDカメラによる試験で得られた、CHOK1/mito25N03b-A3胞株の、A3アゴニスト（IB MECA）を用いた用量反応曲線。１ウェル中の細胞数が2500、播いてから24時間後、10μM セレンテラジン存在下におけるFLIPR^TETRAによる試験で得られた、CHOK1/mito25N03b-A3胞株の、A3アゴニスト（IB MECA）を用いた用量反応曲線。露光時間は2秒、ゲインは240とした。

Claims

以下のアミノ酸配列：
a) 生物発光を生じてセレンテラジン及びカルシウムに結合可能であり、
b) 配列番号１（クリチン）と少なくとも90%同一であり、
c) 配列番号１（クリチン）との配列アラインメントにおいて、以下の(i)〜(ix)からなる群から選択される１又は複数の置換が存在する（残基の位置は、配列番号１における位置である）、
i) C₅₄→S;
ii) S₁₃₂→C;
iii) K₄₈→R, N₁₉₅→D;
iv) Q₆₈→R, A₉₀→V, T₁₈₄→I;
v) Y₈₂→F, K₁₁₀→N, F₁₂₅→L, S₁₄₉→R;
vi) G₁₄₂→C;
vii) I₅₃→V, S₁₄₉→R;
viii) N₁₈→D, I₄₀→V, K₅₆→R;並びに
ix) Gly₅₈→Glu, Asp₆₉→Val, Ala₇₀→Cys, Lys₇₆→Arg, Lys₇₇→Gly, Ile₇₈→Cys, Asp₈₁→Glu, Val₈₆→Ile, Glu₈₇→Ala, Ala₉₀→Gln, Val₉₂→Leu及びGlu₉₇→Gln; を含む強化された生物発光を示す単離発光タンパク質。
配列番号１と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含む請求項１に記載の発光タンパク質。
配列番号１と少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を含む請求項２に記載の発光タンパク質。
配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項３に記載の発光タンパク質。
上記アミノ酸配列は、ミトコンドリアターゲット配列と融合されている請求項１〜４のいずれか１つに記載の発光タンパク質。
請求項１〜５のいずれか１つに記載の発光タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
配列番号１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９の配列を有する請求項６に記載のポリヌクレオチド。
請求項６又は７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
請求項８に記載のベクターを含む真核又は原核宿主細胞。
哺乳類宿主細胞である請求項９に記載の細胞。
細胞内カルシウム濃度の変化をin vitroで検出する方法であって、
a) 請求項１〜５のいずれか１つに記載の発光タンパク質を発現する細胞を準備すること、
b) 上記細胞をカルシウム流入又は細胞内貯蔵からのカルシウム放出のいずれかを促進させる薬剤と接触させること、
c) 発光タンパク質の生物発光を検出すること、を含む方法。
細胞内カルシウム濃度を変動させる物質のスクリーニング方法であって、
a) 請求項１〜５のいずれか１つに記載の発光タンパク質を発現する細胞を準備すること、
b) 上記細胞を候補物質と接触させること、
c) 発光タンパク質の生物発光を検出すること、を含む方法。
ハイスループット方式により実行される請求項１１又は１２に記載の方法。
多試料分析に適したハイスループット光学スクリーニング装置を用いて実行される請求項１３に記載の方法。
請求項１〜５のいずれか１つに記載の発光タンパク質の細胞内カルシウム指標としての使用。
細胞を使用したハイスループットにおける請求項１５に記載の発光タンパク質の使用。
請求項１〜５のいずれか１つに記載の発光タンパク質の診断組成物の調製への使用。