CN109153997A - 编码含报告分子、底物和去稳定化部分的多肽的重组多核苷酸，含其的宿主细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了编码包含报告分子部分、底物部分和去稳定化部分的多肽的重组多核苷酸，包含其的宿主细胞，以及通过其测量蛋白酶水平的方法。

Description

编码含报告分子、底物和去稳定化部分的多肽的重组多核苷 酸，含其的宿主细胞及其用途
技术领域
本公开涉及编码包含报告分子部分、底物部分和去稳定化部分的多肽的重组多核苷酸，包含其的宿主细胞，以及通过使用其使用重组多核苷酸测量蛋白酶水平的方法。
背景技术
蛋白酶是进行蛋白水解的酶。蛋白酶降解通过水解将多肽链中的氨基酸彼此连接的肽键。蛋白酶可包括神经毒素。肉毒杆菌和破伤风梭菌产生非常有效的神经毒素，例如肉毒杆菌毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素特异性结合神经元细胞并抑制神经递质的释放。一些蛋白酶(例如神经毒素)不仅具有非常强的毒性，而且还以非常少的量存在。因此，需要开发一种安全且准确地测量其活动的方法。
一方面提供了一种重组多核苷酸，其包含编码多肽的第一多核苷酸，所述多肽包括：报告分子部分；去稳定化部分；可操作地连接报告分子部分与去稳定化部分的底物部分，其中底物部分包括蛋白酶活性的切割位点。
另一方面提供了含有重组多核苷酸的宿主细胞。
另一方面提供了用于测定蛋白酶多肽的蛋白水解活性的试剂盒，该试剂盒包括由上述重组多核苷酸编码的多肽，以及测量由报告分子部分，内标报告分子或其产物发射的信号的检测剂。
另一方面提供了用于测定蛋白酶多肽的蛋白水解活性的试剂盒，该试剂盒包括含有上述重组多核苷酸的宿主细胞，以及测量由报告分子部分、内标报告分子或其产物发射的信号的检测剂。
另一方面提供了测定样品中蛋白酶多肽的蛋白酶活性的方法，该方法包括：使重组多核苷酸编码的多肽与怀疑含有蛋白酶多肽的样品接触；以及测量由报告分子部分或其产物在通过接触获得的产物中发射的信号。
另一方面提供了测定样品中蛋白酶多肽的蛋白酶活性的方法，该方法包括：使宿主细胞与怀疑含有蛋白酶多肽的样品接触；以及测量由报告分子部分、内标报告分子或其产物在通过接触获得的产物中发射的信号。
另一方面提供了测定样品中蛋白酶多肽特征的方法，该方法包括使重组多核苷酸编码的多肽与蛋白酶多肽接触；测量由报告分子部分或其产物在通过接触获得的产物中发射的信号；以及基于测量信号确定选自信号发射的起始时间和其持续时间中的一个或多个。
另一方面提供了确定样品中蛋白酶多肽特征的方法，该方法包括使宿主细胞与蛋白酶多肽接触；测量由报告分子部分、内标报告分子或其产物在通过接触获得的产物中发射的信号；以及基于测量信号确定选自信号发射的起始时间和其持续时间中的一个或多个。
发明内容
第一方面提供了重组多核苷酸，其包括编码多肽的第一多核苷酸，所述多肽包括：报告分子部分；去稳定化部分；可操作地连接报告分子部分与去稳定化部分的底物部分，其中底物部分包括蛋白酶活性的切割位点。
关于重组多核苷酸，报告分子部分在由其催化的反应中可以是发射可检测信号的材料或释放发射可检测信号的材料(下文中也称为“产物”)。报告分子部分可选自荧光蛋白，β-内酰胺酶，β-半乳糖苷酶，碱性磷酸酶，氯霉素乙酰转移酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，过氧化物酶和荧光素酶。荧光蛋白可选自GFP，YFP，Citrine，CFP，RFP，Kaede，PA-GFP，Emerald，Venus，DsRed，mHoneydew，mBanana，mOrange，tdTomato，mTangerine，mStrawberry，mCherry，mRasberry，mPlum，ZsGreen和ZsYellow蛋白质。
关于重组多核苷酸，与不存在去稳定化部分相比，去稳定化部分的特征在于降低细胞中第一多核苷酸的细胞内表达。表达可以是mRNA水平或蛋白质水平的表达。去稳定化部分可以促进细胞中第一多核苷酸在细胞内表达的mRNA或蛋白质的降解。去稳定化部分可以是PEST，CL1，或PEST和CL1的融合蛋白。
蛋白酶可以源自细菌。细菌可以是梭菌属。蛋白酶可以是神经毒素多肽。蛋白酶可以是内切蛋白酶。神经毒素多肽可以是肉毒杆菌毒素血清型A(BoNT/A)，BoNT/B，BoNT/C，BoNT/D，BoNT/CD，BoNT/DC，BoNT/E，BoNT/F，BoNT/FA，BoNT/G，破伤风神经毒素(TeNT)或其突变体。蛋白酶可切割底物部分中的切割位点。切割位点可以是被蛋白酶识别和切割的位点。这些肉毒杆菌毒素血清型中的每一种的氨基酸序列和编码氨基酸序列的多核苷酸是已知的。这些肉毒杆菌毒素血清型中的每一种的氨基酸序列和编码氨基酸序列的多核苷酸可以是例如具有WO2004-031355中公开的SEQ ID NO：1-14的序列的那些。
切割位点可以是肽底物，其可以通过蛋白酶在特定切割位点切割。切割位点可以是例如被神经毒素的内源性蛋白酶识别和切割的切割位点。神经毒素的切割位点可以是天然存在的或人工产生的。神经毒素的切割位点可以源自被例如BoNT/A蛋白酶，BoNT/E蛋白酶或其突变体识别和切割的蛋白质。蛋白质可以是SNAP-25，其同种型、旁系同源物或直系同源物。SNAP-25可以源自人，大鼠，小鼠，牛，丹鱼，鲫鱼，爪蟾，电鳐，海胆，枪乌贼，椎实螺或海兔。SNAP-25可以是SNAP-25A或SNAP-25B。
在一个实施方式中，神经毒素的切割位点可以源自被例如BoNT/B蛋白酶，BoNT/D蛋白酶，BoNT/F蛋白酶，BoNT/G蛋白酶或其突变体识别和切割的蛋白质。蛋白质可以是VAMP，其同种型、旁系同源物或直系同源物。蛋白质VAMP，其同种型、旁系同源物或直系同源物可以是例如人或小鼠VAMP-1，VAMP-2，VAMP-3/cellubravin，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，鸡VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，电鳗VAMP-1，海胆VAMP，果蝇sybA，synB，synC，synD或syn，水蛭VAMP，爪蟾VAMP-2或VAMP-3，丹鱼VAMP-1或VAMP-2，枪乌贼VAMP，椎实螺VAMP，海兔VAMP或线虫SNB1样。
神经毒素的切割位点可以源自被BoNT/C蛋白酶或其突变体识别和切割的蛋白质。蛋白质可以是突触融合蛋白或其直系同源物、旁系同源物或同种型。蛋白质可以是例如人或小鼠突触融合蛋白1A，突触融合蛋白1B1，突触融合蛋白2-1，突触融合蛋白2-2，突触融合蛋白2-3，突触融合蛋白3A或突触融合蛋白1B2，牛或大鼠突触融合蛋白1A，突触融合蛋白1B1或突触融合蛋白1B2，大鼠突触融合蛋白2或Rat突触融合蛋白3，小鼠突触融合蛋白1A，突触融合蛋白1B1，突触融合蛋白1B2，突触融合蛋白2，突触融合蛋白3A，突触融合蛋白3B或突触融合蛋白3C，鸡突触融合蛋白1A或突触融合蛋白2；爪蟾突触融合蛋白1A或突触融合蛋白1B，丹鱼突触融合蛋白1A，突触融合蛋白1B或突触融合蛋白3，电鳗突触融合蛋白1A或突触融合蛋白1B，海胆突触融合蛋白1A或突触融合蛋白1B，果蝇突触融合蛋白1A或突触融合蛋白1B，水蛭突触融合蛋白1A或突触融合蛋白1B，枪乌贼突触融合蛋白1A或突触融合蛋白1B，椎实螺突触融合蛋白1A或突触融合蛋白1B，或其直系同源物、旁系同源物或同种型。
重组多核苷酸可含有允许第一多核苷酸在细胞中表达的调节序列。重组多核苷酸可以是可表达的重组多核苷酸。调节序列可以是启动子，增强子，终止子序列或其组合。细胞可能能够与蛋白酶结合并内化。
关于重组多核苷酸，蛋白酶可以是神经毒素多肽，并且细胞可以经历与神经毒素多肽的结合，神经毒素的内化，释放细胞内的神经毒素，或结合、内化和释放的组合。细胞可以是能够被梭菌属的神经毒素中毒的细胞。神经毒素多肽可以是肉毒杆菌毒素血清型A(BoNT/A)，BoNT/B，BoNT/C，BoNT/D，BoNT/CD，BoNT/DC，BoNT/E，BoNT/F，BoNT/FA，BoNT/G，破伤风神经毒素(TeNT)或其突变体。细胞可以是内分泌细胞等。细胞可以是原代神经元，神经母细胞瘤细胞或从多能干细胞分化的神经元。
重组多核苷酸可以是载体。载体可以是表达载体。载体可以是病毒载体，质粒载体或线性核酸构建体。
重组多核苷酸可以进一步包括与第一多核苷酸的上游或下游连接的双顺反子序列。双顺反子序列可以是能够进行5'-帽独立翻译的核苷酸序列。双顺反子序列可以是允许核糖体在翻译期间从具有一个5'-帽的mRNA合成两个或更多个多肽以从mRNA合成多肽的核苷酸序列。双顺反子序列可以是内部核糖体进入位点(IRES)序列或允许核糖体跳过形成肽键的核苷酸序列。允许核糖体跳过形成肽键的双顺反子序列可以是编码P2A，T2A，E2A或F2A(例如SEQ ID NO：13，20，22或24)的多核苷酸序列(例如SEQ ID NO：5，19，21或23)。
重组多核苷酸可以进一步包括编码内标报告分子的多核苷酸，其可操作地连接在双顺反子序列的上游或下游。内标报告分子可以与报告分子部分不同。内标报告分子在由其催化的反应中可以是发射可检测信号的材料或转化成发射可检测信号的材料的材料。内标报告分子可选自荧光蛋白，β-内酰胺酶，β-半乳糖苷酶，碱性磷酸酶，氯霉素乙酰转移酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，过氧化物酶和荧光素酶。荧光蛋白可选自GFP，YFP，Citrine，CFP，RFP，Kaede，PA-GFP，Emerald，Venus，DsRed，mHoneydew，mBanana，mOrange，tdTomato，mTangerine，mStrawberry，mCherry，mRasberry，mPlum，ZsGreen和ZsYellow蛋白质。
图1显示了说明根据一个方面的重组多核苷酸的结构的视图。参考图1的A和B，R表示编码报告分子部分的核苷酸序列，S表示编码底物部分的核苷酸序列，D表示编码去稳定化部分的核苷酸序列。参考图2的B，I表示编码内标报告分子的核苷酸序列，B表示编码双顺反子序列的核苷酸序列。在图1中，重组多核苷酸以5'->3'的顺序从左至右描述。如图1的A所示，重组多核苷酸可具有R-S-D的结构。但是，这种结构仅是示例。在一个或多个实施方式中，重组多核苷酸可以在R和D之间进一步包括另外的-S-以编码至少两个(例如至少三个或四个)底物部分。在一个或多个实施方式中，重组多核苷酸可以进一步包括两个或更多个-D结构，例如至少三个或四个去稳定化部分。如图1的A所示，重组多核苷酸具有I-B-R-S-D的结构。但是，这种结构仅是示例。在一个或多个实施方式中，重组多核苷酸可以进一步包括与5'位连接的另外的-I-B-结构，以编码至少两个(例如至少三个或四个)内标报告分子。重组多核苷酸可具有R-S-D-B-I的结构。但是，这种结构仅是示例。在一个或多个实施方式中，重组多核苷酸可以进一步包括与3'位连接的另外的-B-I-结构，以含有编码至少两个(例如至少三个或四个)内标报告分子的核苷酸序列。
图2显示了根据一个方面的重组多核苷酸的结构和由此表达的多肽与蛋白酶之间的反应。参考图2，根据一个方面的重组多核苷酸表达的多肽在蛋白酶存在下在底物部分的切割位点处被切割，并且片段化为报告分子部分片段和其余部分。
图3显示了根据一个方面的重组多核苷酸与细胞中的蛋白酶接触的情况。参考图3，根据一个方面的重组多核苷酸表达的多肽在蛋白酶存在下在底物部分的切割位点处被切割，并且片段化为报告分子部分片段和其余部分。
如图3所示，当在细胞中转染蛋白酶时(上图)，具有R-S-D结构的多肽在S位点被切割，因此，与转染去稳定化部分(D)相比，报告分子部分与去稳定化部分(D)分离并稳定。因此，从报告分子部分或源自其的材料发射的信号比转染去稳定化部分(D)时更强。图3的底部显示当细胞中不存在蛋白酶时，具有R-S-D结构的多肽保留去稳定化部分(D)，因此具有R-S-D结构的多肽的水平被去稳定化部分(D)降低，并因此由此测量的信号也减少。
图4显示了根据一个方面的具有编码内标报告分子的核苷酸序列的重组多核苷酸与细胞中的蛋白酶接触的情况的视图。参考图4，根据一个方面的重组多核苷酸表达的多肽在蛋白酶存在下在底物部分的切割位点处被切割，并且片段化为报告分子部分片段和其余部分。
如图4所示，当在细胞(A)中转染蛋白酶时，具有R-S-D结构的多肽在S位点被切割，因此，与转染去稳定化部分(D)相比，报告分子部分与去稳定化部分(D)分离并稳定。因此，从报告分子部分或源自其的材料发射的信号比转染去稳定化部分(D)时更强。图4的底部显示当细胞中不存在蛋白酶时，具有R-S-D结构的多肽保留去稳定化部分(D)，因此具有R-S-D结构的多肽的水平被去稳定化部分(D)降低，并因此由此测量的信号也减少。在图4中，无论蛋白酶存在与否，从重组多核苷酸表达的内标报告分子蛋白在细胞中表达。另一方面，R-S-D多肽通过双顺反子序列通过5'-帽非依赖性翻译合成。因此，从内标报告分子发射的信号可用于标准化重组多核苷酸在宿主细胞中表达的条件。
第二方面提供了含有重组多核苷酸的宿主细胞。宿主细胞可能能够将蛋白酶转移到细胞中，例如转移到细胞质中。宿主细胞可以是可以将蛋白酶(例如神经毒素多肽)转移到细胞中，例如转移到细胞质中的细胞。宿主细胞可以通过受体与例如蛋白酶结合，并将由此形成的复合物转移到细胞中，例如转移到细胞质中。然而，本公开的实施方式不应解释为限于任何特定的易位机制。宿主细胞可以是能够表达编码蛋白酶的多核苷酸的细胞，例如细胞质中的蛋白水解活性神经毒素多肽。宿主细胞可包括编码蛋白酶的多核苷酸，例如细胞质中的蛋白水解活性神经毒素多肽。编码蛋白酶的多核苷酸，例如蛋白水解活性神经毒素多肽可以插入染色体或染色体外转染。编码蛋白酶的多核苷酸，例如蛋白水解活性神经毒素多肽可以瞬时或永久表达。编码蛋白酶的多核苷酸，例如蛋白水解活性神经毒素多肽可以是其自身形式或嵌入媒介物如载体中的形式。可以从宿主细胞外部引入多核苷酸。宿主细胞可以是重组细胞。宿主细胞可以是内分泌细胞。细胞可选自原代神经元，神经母细胞瘤细胞和从多能干细胞分化的神经元。
宿主细胞可能能够表达重组多核苷酸。宿主细胞可以从重组多核苷酸表达包含报告分子部分、去稳定化部分和可操作地将去稳定化部分与报告分子部分连接的底物部分的多肽，其中底物部分具有蛋白酶活性的切割位点，或者多肽和内标记报告分子蛋白。
第三方面提供了用于测定蛋白酶(例如神经毒素多肽)的蛋白水解活性的试剂盒，该试剂盒包括由上述重组多核苷酸编码的多肽和测量由报告分子部分、内标报告分子或其产物发射的信号的检测剂。关于试剂盒，报告分子可以是荧光素酶，试剂盒可以进一步包括荧光素酶底物，并且检测剂可以用于测量荧光素酶底物的酶促转化。例如，检测剂可以是光电检测器。报告分子可以是荧光蛋白，检测剂可以用于测量荧光蛋白发射的荧光。例如，检测剂可以是用激发光激发荧光蛋白并测量发射的荧光的装置。内标报告分子可以与报告分子部分不同。内标报告分子可以是荧光素酶或荧光蛋白，各自与报告分子部分不同。
第四方面提供了用于测定蛋白酶(例如神经毒素多肽)的蛋白水解活性的试剂盒，该试剂盒包括含有上述重组多核苷酸的宿主细胞和测量由报告分子部分、内标报告分子或其产物发射的信号的检测剂。关于试剂盒，报告分子可以是荧光素酶，试剂盒可以进一步包括荧光素酶底物，并且检测剂可以用于测量荧光素酶底物的酶促转化。报告分子可以是荧光蛋白，检测剂可以用于测量荧光蛋白发射的荧光。例如，检测剂可以是用激发光激发荧光蛋白并测量发射的荧光的装置。内标报告分子可以与报告分子部分不同。内标报告分子可以是荧光素酶或荧光蛋白，各自与报告分子部分不同。
第五方面提供了测定样品中蛋白酶活性的方法，该方法包括：使重组多核苷酸编码的多肽与怀疑含有蛋白酶多肽的样品接触；以及测量由报告分子部分或其产物在通过接触获得的产物中发射的信号。
第六方面提供了确定样品中蛋白酶多肽特征的方法，该方法包括使重组多核苷酸编码的多肽与蛋白酶多肽接触；测量由报告分子部分或其产物在通过接触获得的产物中发射的信号；以及基于测量信号确定选自信号发射的起始时间和信号发射的持续时间中的一个或多个。
根据第五和第六方面的方法各自包括使重组多核苷酸编码的多肽与怀疑含有蛋白酶多肽或蛋白酶的样品接触。接触可以在允许多肽中蛋白酶活性的切割位点降解的条件下进行。蛋白酶可以是神经毒素多肽。
接触可以在液体介质中进行。可以调节液体培养基以使蛋白酶的蛋白水解活性起作用。条件可包括pH，温度，辅因子，盐浓度和这些的组合。液体介质可以是缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
根据第五和第六方面的方法包括测量由报告分子部分或其产物在通过接触获得的产物中发射的信号。当报告分子部分是发射可检测信号的多肽时，可以直接测量信号。例如，当报告分子部分是荧光蛋白如GFP时，可以测量荧光。可以通过照射通过与激发光接触获得的产物并测量从通过接触获得的产物发射的光以测量荧光。可以根据所选择的荧光蛋白适当地选择激发光和发射光的波长。当报告分子部分是转化为在由报告分子部分催化的反应中发射可检测信号的物质的多肽时，该方法可以进一步包括将报告分子部分的催化活性所需的底物添加到通过接触获得的产物中。将材料转化为发射可检测信号的材料。接下来，测量由发射可检测信号的材料发射的信号。例如，报告分子部分是荧光素酶，并且可以进行信号的接触和测量以在反应溶液中添加荧光素酶底物，并且进行检测以测量荧光素酶底物的酶促转化。荧光素酶底物可以是荧光素。
根据第五和第六方面的方法可以进一步包括将测量信号与由对照组发射的信号进行比较。对照组可以以相同的程序测量，除了使用的样品不包括蛋白酶，例如神经毒素多肽或包括已知浓度的蛋白酶，例如神经毒素多肽。每种方法可以进一步包括基于通过比较获得的信号与样品中蛋白酶水平之间的相关性来确定样品中蛋白酶的水平。
根据第六方面的方法包括基于测量信号确定信号发射的起始时间和信号发射的持续时间中的至少一个。本领域普通技术人员可以基于测量信号容易地确定信号发射的起始时间和信号的发射持续时间中的至少一个。例如，本领域普通技术人员可以基于表示蛋白酶活性随时间的信号值(例如发射信号)来确定发射的起始时间和持续时间。表示蛋白酶活性随时间的信号值可以基于随时间发射的信号的测量值来确定发射的起始时间和持续时间。信号发射的起始时间和信号发射的持续时间中的至少一个可取决于蛋白酶的类型。当报告分子部分是发射可检测信号的多肽时，蛋白酶活性对切割位点的降解可导致发射信号的增加和当蛋白酶活性消失时发射信号的减少。例如，当在相同条件下测量时，可以根据蛋白酶的特征改变信号的起始时间和信号的持续时间中的至少一个。在一个实施方式中，除了该相对比较之外，蛋白酶可以在信号发射的起始时间和信号的持续时间中的至少一个的绝对值或其范围的方面与其它蛋白酶区别开。因此，该确定可以包括比较已知蛋白酶的信号发射的起始时间和信号的持续时间中的至少一个，或者基于信号发射的起始时间和信号的持续时间中的至少一个的绝对值或其范围来确定蛋白酶的特征。根据信号发射的起始时间和信号的持续时间中的至少一个，蛋白酶待治疗的指示可以变化。因此，每种方法可以包括基于所确定的蛋白酶特征确定蛋白酶在受试者中待治疗的指征。
第七方面提供了测定样品中蛋白酶活性的方法，该方法包括：使宿主细胞与怀疑含有蛋白酶多肽的样品接触；以及测量由报告分子部分、内标报告分子或其产物在通过接触获得的产物中发射的信号。
第八方面提供了测定样品中蛋白酶多肽特征的方法，该方法包括使宿主细胞与蛋白酶多肽接触；测量由报告分子部分、内标报告分子或其产物在通过接触获得的产物中发射的信号；以及基于测量信号确定选自信号发射的起始时间和其持续时间中的一个或多个。
根据第七和第八方面的每种方法包括使宿主细胞与怀疑含有蛋白酶多肽的样品接触。接触可以在允许蛋白酶活性的切割位点降解的条件下进行。蛋白酶可以是神经毒素多肽。接触可以在液体介质中进行。可以调节液体培养基以使蛋白酶的蛋白水解活性起作用。条件可包括pH，温度，辅因子，盐浓度和这些的组合。液体培养基可以是缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，或培养宿主细胞的培养基。
关于根据第七和第八方面的方法，宿主细胞可能能够将蛋白酶转移到细胞中，例如转移到细胞质中。宿主细胞可以是可以将蛋白酶(例如神经毒素多肽)转移到细胞中，例如转移到细胞质中的细胞。宿主细胞可以通过受体与例如蛋白酶结合，并将由此形成的复合物转移到细胞中，例如转移到细胞质中。然而，本公开的实施方式不应解释为限于任何特定的易位机制。宿主细胞可以是能够表达编码蛋白酶的多核苷酸的细胞，例如细胞质中的蛋白水解活性神经毒素多肽。宿主细胞可包括编码蛋白酶的多核苷酸，例如细胞质中的蛋白水解活性神经毒素多肽。编码蛋白酶的多核苷酸，例如具有蛋白水解活性的神经毒素多肽可以插入染色体中，或者可以存在于染色体外。编码蛋白酶的多核苷酸，例如具有蛋白水解活性的神经毒素多肽可以瞬时或稳定表达。编码蛋白酶的多核苷酸，例如蛋白水解活性神经毒素多肽可以是其自身形式或嵌入媒介物如载体中的形式。可以从宿主细胞外部引入多核苷酸。宿主细胞可以是重组细胞。宿主细胞可以是内分泌细胞。宿主细胞可选自原代神经元，神经母细胞瘤细胞和从多能干细胞分化的神经元。宿主细胞可能能够表达重组多核苷酸。宿主细胞可以从重组多核苷酸表达包含报告分子部分、去稳定化部分和可操作地将去稳定化部分与报告分子部分连接的底物部分的多肽，其中底物部分具有蛋白酶活性的切割位点，或者多肽和内标报告分子蛋白。
根据第七和第八方面的方法包括测量由报告分子部分或内标报告分子或其产物在通过接触获得的产物中发射的信号。当报告分子部分或内标报告分子是发射可检测信号的多肽时，可以直接测量信号。例如，当报告分子部分是荧光蛋白如GFP时，可以测量荧光。可以通过照射通过与激发光接触获得的产物并测量从通过接触获得的产物发射的光以测量荧光。可以根据所选择的荧光蛋白适当地选择激发光和发射光的波长。当报告分子部分或内标报告分子是转化为在由报告分子部分催化的反应中发射可检测信号的物质的多肽时，该方法可以进一步包括将报告分子部分的催化活性所需的底物添加到报告分子部分。通过接触获得的产物将材料转化为发射可检测信号的材料。接下来，测量由发射可检测信号的材料发射的信号。例如，报告分子部分或内标报告分子是荧光素酶，可以进行信号的接触和测量以在反应溶液中添加荧光素酶底物，并且进行检测以测量荧光素酶底物的酶促转化。荧光素酶底物可以是荧光素。例如，报告分子部分是荧光素酶，并且可以进行信号的接触和测量以在反应溶液中添加荧光素酶底物，并且进行检测以测量荧光素酶底物的酶促转化。荧光素酶底物可以是荧光素。
在根据第七和第八方面的方法中，报告分子可以是荧光蛋白，并且可以进行测量以测量由荧光蛋白发射的荧光。
根据第七和第八方面的方法可以进一步包括将测量信号与从对照组测量的信号进行比较。对照组可以以相同的程序测量，除了使用的样品不包括神经毒素多肽或包括已知浓度的神经毒素多肽。每种方法可以进一步包括基于通过比较获得的信号与样品中神经毒素的水平之间的相关性来确定样品中神经毒素多肽的水平。
根据第七和第八方面的每种方法，重组多核苷酸还包括编码在第一多核苷酸的上游或下游连接的双顺反子序列的多核苷酸和可操作地连接在双顺反子序列的上游或下游的内标报告分子。在这种情况下，每种方法还可以包括测量由内标报告分子发射的信号。每种方法可以进一步包括确定报告分子部分发射的信号相对于内标报告分子发射的信号的水平。
根据第八方面的方法包括基于测量信号确定信号发射的起始时间和信号发射的持续时间中的至少一个。本领域普通技术人员可以基于测量信号容易地确定信号发射的起始时间和信号发射的持续时间中的至少一个。例如，本领域普通技术人员可以确定表示蛋白酶活性随时间的信号值，例如，基于发射信号测量的信号发射的起始时间和信号发射的持续时间。表示蛋白酶活性随时间的信号值，即信号发射的起始时间和信号发射的持续时间可以基于发射信号随时间的测量来确定。信号发射的起始时间和信号发射的持续时间中的至少一个可取决于蛋白酶的类型。当报告分子部分是发射可检测信号的多肽时，蛋白酶活性对切割位点的降解可导致发射信号的增加和当蛋白酶活性消失时发射信号的减少。例如，当在相同条件下测量时，可以根据蛋白酶的特征改变信号发射的起始时间和信号发射的持续时间中的一个或多个。在一个实施方式中，除了该相对比较之外，蛋白酶可以在信号发射的起始时间和信号的持续时间中的至少一个的绝对值或其范围的方面与其它蛋白酶区别开。因此，该确定可以包括比较已知蛋白酶的信号发射的起始时间和信号的持续时间中的至少一个，或者基于发射信号的起始时间和信号的持续时间中的至少一个的绝对值或其范围来确定蛋白酶的特征。根据信号发射的起始时间和信号的持续时间中的至少一个，蛋白酶待治疗的指示可以变化。因此，每种方法可以包括基于所确定的蛋白酶特征确定蛋白酶在受试者中待治疗的指征。
根据第八方面的方法可以包括基于测量信号确定信号发射的起始时间和信号发射的持续时间中的至少一个，而没有细胞损伤，例如，细胞裂解。
第九方面提供了测量宿主细胞表达或抑制蛋白酶的能力的方法，该方法包括：将编码蛋白酶多肽的多核苷酸引入宿主细胞；以及培养已引入多核苷酸的宿主细胞，并测定培养物中报告分子部分或内标报告分子或其产物发射的信号。
该方法包括将编码蛋白酶多肽的多核苷酸引入宿主细胞中。宿主细胞和蛋白酶与上述相同。引入可以通过例如转化、转染或转导进行。宿主细胞可以是能够表达编码蛋白酶的多核苷酸的细胞，例如，在细胞质中具有蛋白水解活性的神经毒素多肽。宿主细胞可包括编码蛋白酶的多核苷酸，例如，具有蛋白水解活性的神经毒素多肽。编码蛋白酶的多核苷酸，例如具有蛋白水解活性的神经毒素多肽可以插入染色体中，或者可以存在于染色体外。编码蛋白酶的多核苷酸，例如具有蛋白水解活性的神经毒素多肽可以瞬时或稳定表达。编码蛋白酶的多核苷酸，例如蛋白水解活性神经毒素多肽可以是其自身形式或嵌入媒介物如载体中的形式。可以从宿主细胞外部引入多核苷酸。宿主细胞可以是重组细胞。宿主细胞可以是内分泌细胞。宿主细胞可选自原代神经元，神经母细胞瘤细胞和从多能干细胞分化的神经元。
该方法包括培养已引入多核苷酸的宿主细胞，并测量培养物中报告分子部分或内标报告分子或其产物发射的信号。培养可以在测试材料的存在下进行。测试材料可以是聚合物，例如蛋白质和多糖，或小分子化合物。测试材料可以是被认为抑制或促进蛋白酶的材料。宿主细胞可以是已引入编码候选测试材料的多核苷酸的宿主细胞。因此，该方法可以是筛选调节蛋白酶活性的材料的方法。筛选方法可以包括比较通过使用测试材料获得的测试组信号和通过使用对照组获得的对照信号。对照组可以是阳性对照组，其使用已知对照蛋白酶活性的材料，或阴性对照组，其以与用于测试组的除了候选测试材料外的相同方式获得。该方法可以包括基于从比较操作获得的比较结果确定候选测试材料是否是调节蛋白酶活性的材料。在一个实施方式中，当测试组信号大于阴性对照组的信号时，可以确定该材料具有促进蛋白酶活性的活性。在一个实施方式中，当测试组信号小于阴性对照组的信号时，可以确定该材料具有抑制蛋白酶活性的活性。
附图说明
图1显示了说明根据一个方面的重组多核苷酸的结构的视图。
图2显示了根据一个方面的重组多核苷酸的结构和由此表达的多肽与蛋白酶之间的反应。
图3显示了根据一个方面的重组多核苷酸与细胞中的蛋白酶接触的情况。
图4显示了根据一个方面的具有编码内标报告分子的核苷酸序列的重组多核苷酸与细胞中的蛋白酶接触的情况的视图。
图5显示了在用pFB载体1转染的NG108-15细胞分化成神经元并然后用肉毒杆菌毒素A中毒后，报告分子部分活性的测量。
图6显示了在细胞分化成神经元并然后用肉毒杆菌毒素A中毒后，用pFB载体2转染的NG108-15细胞的荧光显微图像。
图7显示了在细胞分化成神经元并然后用肉毒杆菌毒素A中毒后，用pFB载体3转染的NG108-15细胞的报告分子部分的活性的测量。
图8显示了在细胞分化成神经元并然后用肉毒杆菌毒素A中毒后，用pFB载体3转染的SiMa细胞的报告分子部分的活性的测量。
图9显示了在细胞分化成神经元并然后用肉毒杆菌毒素A中毒后，用pFB载体3转染的NT2细胞的报告分子部分的活性的测量。
图10显示了在细胞分化成神经元并然后用表达肉毒杆菌毒素B轻链的pCDNA4_BLC载体瞬时转染后，用pFB载体6转染的NG108-15细胞表达的报告分子部分和内标报告分子蛋白的活性的测量。
图11显示了在将细胞建立为稳定的单克隆衍生细胞系、分化成神经元并然后用不同浓度的BoNT/A中毒后，用pFB载体2转染的NT2细胞表达的报告分子部分蛋白发射的信号的测量。
图12至14显示了在将细胞建立为稳定的单克隆衍生细胞系、分化成神经元并然后用不同浓度的BoNT/A中毒后，用pFB载体2转染的NT2细胞各自表达的报告分子部分蛋白或内标报告分子发射的信号的测量。
具体实施方式
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明目的，并且本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1：编码报告分子部分-底物部分-去稳定化部分(下文中也称为“R-S-D”)多肽的重组多核苷酸和含有重组多核苷酸的细胞的制备
(1)编码报告分子部分-底物部分-去稳定化部分(下文中也称为“R-S-D”)多肽的重组多核苷酸的制备
制备两种具有不同结构的重组多核苷酸。一种是编码具有R-S-D结构的多肽，另一种是编码具有I-B-R-S-D结构的多肽。这里，I表示编码内标报告分子的核苷酸序列，B表示双顺反子序列。重组多核苷酸是质粒载体的形式。
编码发光或荧光蛋白的核苷酸序列用作内标报告分子或报告分子部分。编码发光蛋白的序列的实例是编码萤火虫荧光素酶(FLuc)蛋白(例如SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：1)和编码纳米荧光素酶(NLuc)蛋白(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列(例如SEQ ID NO：2)，编码荧光蛋白的序列的实例是编码增强型绿色荧光蛋白(eGFP)(SEQ IDNO：11)的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)或编码mCherry蛋白(SEQ ID NO：12)的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。
本文使用的双顺反子序列是编码源自猪捷申病毒-1的自切割肽的核苷酸序列(P2A)(SEQ ID NO：5)。
本文使用的蛋白水解酶的底物部分，在A型肉毒杆菌毒素的情况下，是编码总共207个氨基酸序列的145至207的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)作为人SNAP25的C-末端区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)，或者在B型肉毒杆菌毒素的情况下，是编码人VAMP2(SEQ IDNO：18)的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)。
本文使用的去稳定化部分是编码PEST序列(SEQ ID NO：16)的核苷酸序列(SEQ IDNO：8)和编码CL1序列(SEQ ID NO：15)的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。
重组多核苷酸构建如下：
首先，编码萤火虫荧光素酶(FLuc)(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)(以下称为“FLuc序列”)获自pGL4.31载体(Promega)，编码纳米荧光素酶(NLuc)(SEQ IDNO：10)的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)(以下称为“NLuc序列”)获自pNL1.1载体(Promega)，编码增强型绿色荧光蛋白(eGFP)(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)获自pEGFP-C1载体(clontech)，编码mCherry(SEQ ID NO：12)的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)(以下称为“mCherry序列”)获自pmCherry-C1载体。编码总共207个氨基酸序列的145至207的氨基酸序列作为人SNAP25的C-末端区域的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)(以下称为“SNAP25序列”)和编码人VAMP2的核苷酸序列(以下称为“VAMP2序列”)通过RT-PCR从人源细胞系的mRNA合成。编码CL1与PEST融合的CL1-PEST多肽的序列(以下称为“CL1-PEST序列”)和编码源自猪捷申病毒-1的自切割肽P2A的核苷酸序列(以下称为“P2A序列”)通过基因合成获得。
接下来，使用限制酶使用序列组合通过基因克隆构建具有R-S-D或I-B-R-S-D结构的重组多核苷酸，并连接至pCDNA4载体(Invitrogen)或pFB载体(Agilent)的BamHI/XhoI限制性位点以构建重组载体。例如，构建了其中将由NLuc序列、SNAP25序列和CL1-PEST序列组成的重组多核苷酸引入pCDNA4载体的BamHI/XhoI酶位点的载体(以下称为“pCDNA4载体1”)，或其中将由NLuc序列、SNAP25序列和CL1-PEST序列组成的重组多核苷酸引入pFB载体的BamHI/XhoI酶位点的载体(以下称为“pFB载体1”)。例如，构建了其中将由mCherry序列、SNAP25序列和CL1-PEST序列组成的重组多核苷酸引入pCDNA4载体的BamHI/XhoI酶位点的载体(以下称为“pCDNA4载体2”)，或其中将由mCherry序列、SNAP25序列和CL1-PEST序列组成的重组多核苷酸引入pFB载体的BamHI/XhoI酶位点的载体(以下称为“pFB载体2”)。例如，构建了将由FLuc序列、P2a序列、NLuc序列、SNAP25序列和CL1-PEST序列组成的重组多核苷酸引入pCDNA4载体的BamHI/XhoI酶位点的载体(以下称为“pCDNA4载体3”)，或其中将由FLuc序列、P2a序列、NLuc序列、SNAP25序列和CL1-PEST序列组成的重组多核苷酸引入pFB载体的BamHI/XhoI酶位点的载体(以下称为“pFB载体3”)。构建了其中将由FLuc序列、P2a序列、NLuc序列、VAMP2序列和CL1-PEST序列组成的重组多核苷酸引入pFB载体的BamHI/XhoI酶位点的载体(以下称为“pFB载体4”)。
这里，pCDNA4载体是源自质粒的载体，用于在细胞中瞬时表达重组多核苷酸。本文使用的pFB载体是源自莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)的载体，并用于构建通过转染修饰的细胞系，即其中将重组多核苷酸引入染色体的细胞系。
通过测序确认构建的质粒载体和病毒载体的结构，纯化质粒载体DNA并分离至细胞培养水平。
(2)表达R-S-D或I-B-R-S-D多肽的细胞的产生
为了构建稳定且恒定地表达(1)中构建的载体的细胞系，进行了用MMLV来源的病毒载体(即pFB载体)的转导。用MMLV来源的病毒载体转染是本领域广泛实施的方法和参考文献(Felts Ka等人，Mol Biotechnol.2002 Sep；22(1):25-32)。简而言之，将HEK-293T细胞(ATCC-CRL-3216)，一种用于包装的细胞，以1×107个细胞的群体接种于55cm2培养皿中的10ml含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中，并在37℃和5％CO2培养箱中培养24小时，然后，根据本发明的重组多核苷酸pFB载体(即pFB载体1、2、3或4)和pCMV-gagpol(CellBiolabs，Inc.)和pCMV-VSV-G(Cell Biolabs，inc.)以3：2：1的比例混合。此时，pFB载体以7.5μg的量使用。将该载体的混合物用于Lipofectamine TM 3000(Invitrogen)的转染，并根据制造商的说明书进行转导方法。转导后，细胞在相同条件下培养48小时。因此，从HEK293T细胞产生感染性包装的含pFB载体1、2、3或4的病毒。
然后，将感染性包装的含pFB载体1、2、3或4的病毒转染到靶细胞中以产生能够稳定恒定表达的细胞系。这里使用的靶细胞是NG108-15细胞(ATCC-HB-12317)，SiMa细胞(DSMZ：ACC-164)和NT2细胞(ATCC-CRL-1973)。NG108-15细胞是大鼠神经母细胞瘤和大鼠神经胶质瘤的杂交细胞，并且已经通过分化成神经元而鉴定为对A型肉毒杆菌毒素敏感的细胞系(Whitemarsh RC等人，Biochem Biophys Res Commun.2012 Oct 19；427(2):426-30)。SiMa细胞是源自人神经母细胞瘤的细胞系，并且已经通过分化成神经元而鉴定为对A型肉毒杆菌毒素敏感(Fernandez-Salas E等人，PLoS One.2012；7(11):e49516)。NT2细胞是源自人睾丸的胚胎癌细胞系，具有多种分化潜能，并且可以在特定条件下分化成神经元，并且当分化成神经元时，发现NT2细胞对A型肉毒杆菌毒素敏感(Tegenge等人，Cell MolNeurobiol.2012 Aug；32(6):1021-9)。
稳定表达靶多肽的细胞系的具体步骤如下。
首先，在感染前一天将靶细胞以每孔约1×105个细胞的群体接种于含有0.5ml含有10％FBS的DMEM培养基的24孔板中，然后在5％CO2培养箱中在37℃下培养一天。使用0.45-μm注射过滤器过滤从其收集的HEK-293T细胞的培养上清液，以获得病毒溶液，其中除去细胞和细胞碎片。将病毒溶液加入已培养靶细胞并从其中除去培养基的孔中，浓度为1ml/孔(24孔)，并在相同条件下培养细胞6小时以诱导感染。以8mg/ml的水平加入聚凝胺，以提高感染靶细胞的效率。6小时后，用含有10％FBS的DMEM培养基替换培养基作为正常细胞培养的培养基，并在相同条件下培养细胞2天。
接下来，将24孔中感染的靶细胞培养2天，然后转移到55cm2培养皿中，并在向其中添加500至1000μg/ml遗传霉素(Gibco)(pFB载体的选择性抗生素)后培养。基于靶细胞和遗传霉素的滴定确定适当剂量的抗生素。当NT2细胞是靶细胞时，将它们在含有10ml细胞培养基的培养皿中在800μg/ml遗传霉素存在下培养5天。
接下来，为了形成单细胞克隆，将靶细胞以2个细胞/孔的浓度转移到96孔孔中。在含有100μl用于在55cm2培养皿中培养的相同培养基的96孔板的每个孔中，通过细胞培养显微镜选择在相同条件下培养4周的单细胞克隆形成的菌落，然后对选择的菌落进行扩增培养。
在该过程中，可以根据产生的重组多核苷酸的结构进行预选过程。也就是说，当内标报告分子蛋白是荧光蛋白时，预选过程可以通过使用荧光显微镜进行，或当内标报告分子蛋白是发光蛋白时，预选过程可以通过发光分析进行。
为了预选其中不存在内标报告分子蛋白的重组多核苷酸，或者预选具有内标报告分子蛋白的单克隆细胞系中具有优异灵敏度的单克隆细胞系，蛋白酶体抑制剂MG132(Sigma)以10μM培养基的浓度添加，或当重组多核苷酸包含SNAP25序列时，A型肉毒杆菌毒素的轻链DNA与LipofectamineTM 3000(Invitrogen)一起使用，并且当重组多核苷酸包括VAMP2序列时，B型肉毒杆菌毒素的轻链DNA与LipofectamineTM 3000(Invitrogen)一起使用，并且根据制造商的说明书进行转导。此时，将BoNT/A LC和BoNT B LC引入pCDA4的BamHI/XhoI位点。详细地说，仅对于在96孔中培养约3至4周时鉴定出单克隆菌落的细胞，将相同数量的细胞分别接种在两个96孔板中：一个板用于筛选实验，且另一个板用于维持培养。
将通过这些筛选方法获得的单克隆衍生细胞系进行扩增培养，并冷冻保存。通过冷冻一般的哺乳动物细胞进行冻干。简而言之，将5×107至1×107个细胞稀释于1ml含有5％或10％DMSO的培养基中，并将稀释的细胞置于冷冻小瓶中。将温度降至-80℃，然后储存在液氮罐的气相中。
结果是，建立了稳定恒定表达含pFB载体1、2、3、4或6的病毒的细胞系NG108-15细胞、SiMa细胞和NT2细胞。
(3)将已建立的NG108-15细胞、SiMa细胞和NT2细胞分化为神经元并毒素中毒
NG108-15细胞、SiMa细胞和NT2细胞是神经母细胞瘤细胞系或胚胎癌细胞系，已知它们在分化成神经元时对肉毒杆菌毒素敏感。因此，根据以下程序将这些细胞分化成神经元。
将NG108-15细胞在含有10(v/v)％FBS的DMEM培养基中在5％CO2培养箱中在37℃的温度下维持培养。对于神经元分化，将细胞以2×104个细胞/孔的浓度接种在96孔基质胶(BD科学)包被的板的每个孔中用于细胞培养，并在补充有50μM维甲酸和25μM嘌呤胺的神经基质培养基(Gibco)中温育约5天。神经基质培养基含有B27(Gibco)，Glutamax(Gibco)和非必需氨基酸(Gibco)作为补充剂，各自的量为1X。
将SiMa细胞在补充有10(v/v)％FBS的DMEM培养基中在5％CO2培养箱中在37℃的温度下维持培养。对于神经元分化，将细胞以5×104个细胞/孔的浓度接种在96孔基质胶(BD科学)包被的板的每个孔中用于细胞培养，并在补充有50μM维甲酸的无血清MEM培养基(Welgene)中温育约5天。MEM培养基含有B27(Gibco)，N2(Gibco)，Glutamax(Gibco)，HEPES(Gibco)和非必需氨基酸(Gibco)作为补充剂，各自的量为1X。
将NT2细胞(也称为“NTteraA2”)在补充有10(v/v)％FBS的α-MEM培养基(Welgene)中在5％CO2培养箱中在37℃的温度下维持培养。对于神经元分化，将细胞以1×105个细胞/ml的浓度接种在培养皿的每个孔中，并在相同条件下在补充有50μM维甲酸的分化培养基中培养1周，同时每2至3天更换培养基。对于分化培养基，使用补充有10(v/v)％FBS的DMEM/F12(Welgene)培养基。
培养的细胞形成球体，培养1周后，收集球体并转移到具有相同面积的常规细胞培养板中。将细胞作为粘附细胞在补充有50μM维甲酸的分化培养基上培养1周，同时每2至3天更换培养基。随后，通过使用胰蛋白酶使粘附细胞解聚并分离，并计数细胞数。
将1×107个细胞转移到175T烧瓶(Nunc)中，并在相同条件下在补充有丝分裂抑制剂的分化培养基中培养10天，同时每2至3天更换培养基。本文使用的有丝分裂抑制是1μMAraC，10μM尿苷和10μM氟尿苷。通过使用胰蛋白酶分离分化成神经元的细胞，并将获得的细胞冷冻保存。将冷冻用培养基用作冷冻保存用培养基，通过细胞冷冻法进行冷冻。将分化的神经元以每孔1×105个细胞的群体接种在96孔基质胶包被的板中用于细胞培养，并在分化培养基中培养10天或更长时间，并且每2至3天更换培养基。
(4)用肉毒杆菌毒素使分化的神经元中毒
如下进行用A型肉毒杆菌毒素使分化神经元中毒。为了使纯化的毒素蛋白质中毒，将纯化的毒素蛋白质在分化培养基中稀释至适当的浓度，然后更换为在5％CO2培养箱中在37℃的温度下培养的神经元的培养基。此后，将细胞在相同条件下培养24小时以诱导毒素中毒。然后，用分化培养基替换培养基，并在相同条件下培养细胞72小时。
将分化培养基加入到市售的肉毒杆菌毒素药瓶(Meditoxin injectionable，Neuronox)中以悬浮冻干的毒素蛋白和赋形剂，然后将分化培养基更换为在5％CO2培养箱在37℃的温度下维持培养的细胞培养基。通过使用毒素安慰剂小瓶对最终产品小瓶进行毒素效力测试，以使赋形剂的量相同。通过仅从最终产品毒素小瓶中除去毒素蛋白来制备毒素安慰剂小瓶。
也就是说，将相同量的最终产品毒素小瓶和毒素安慰剂小瓶以相同的量悬浮，然后，根据每种处理浓度以相同的方式处理中毒培养基的总量。
(5)报告分子部分或内标报告分子的定量分析
从重组多核苷酸表达的报告分子部分或内标报告分子蛋白的定量分析如下进行。
关于根据本发明的重组多核苷酸，当发光蛋白用作报告分子部分或内标报告分子蛋白时，通过发光分析定量分析发光蛋白。当报告分子部分是NLuc时，使用纳米荧光素酶测定试剂盒(Promega)。
当报告分子部分是NLuc且内标报告分子蛋白是FLuc时，使用One-glo双纳米荧光素酶测定试剂盒(Promega)并且根据供应商手册进行测试。通过使用SpectraMax(Molecular Device Inc)测量发光。通过使用通过将测量的NLuc值除以内标报告分子蛋白FLuc值而获得的结果值进行标准化。
关于根据本发明的重组多核苷酸，当荧光蛋白用作报告分子部分或内标报告分子蛋白时，通过荧光计定量分析荧光值。当报告分子部分是mCherry且内标报告分子蛋白质是eGFP时，mCherry在610nm的波长下被激发，并且通过使用荧光计SpectraMax(MolecularDevice)测量波长为507nm处的发射光。对于eGFP，eGFP在488nm的波长下被激发，并且测量波长为507nm处的发射光。通过使用通过将测量的mCherry发射值除以内标报告分子蛋白eGFP发射值而获得的结果值来进行标准化。另外，GFP和RFP的荧光值可以通过使用Incucyte装置(Essen Bioscience Inc.)测量以进行标准化。eGFP属于GFP家族且mCherry属于RFP家族。
(6)结果
图5显示了用pFB载体1转染的NG108-15细胞分化成神经元并然后用肉毒杆菌毒素A中毒后，报告分子部分活性的测量。如图5所示，生产用pFB载体1转染的NG108-15细胞，分化成神经元，用肉毒杆菌毒素A中毒和测量报告分子部分活性与(3)、(4)和(5)中所述的相同。参考图5，为了测量纳米荧光素酶的活性，使用纳米荧光素酶试剂盒测量已经培养中毒总共72小时的细胞的发光。如图5所示，当用10nM肉毒杆菌毒素A中毒时，与未中毒时相比，通过相对发光单位评估的纳米荧光素酶的测量活性显著增加。
图6显示了在细胞分化成神经元并然后用肉毒杆菌毒素A中毒后，用pFB载体2转染的NG108-15细胞的荧光显微图像。如图6所示，产生用pFB载体2转染的NG108-15细胞，分化成神经元和用肉毒杆菌毒素A中毒与(3)和(4)中所述的相同。图6显示了通过使用OlympusFSX-100装置(其为荧光显微镜)获得的培养中毒总共72小时的细胞的荧光图像。
参考图6，对照组是具有0nM肉毒杆菌毒素A的对照组，并且BoNT/A 1nM是具有1nM肉毒杆菌毒素A的测试组。如图6所示，试验组显示出具有红色荧光的细胞数量的显著增加。
图5和图6显示了当SNAP25的切割位点未被肉毒杆菌毒素A切割时，NLuc-SNPA25底物部分-CL1-PEST结构的多肽易于降解并且相对发光单位低，并且当切割位点为SNAP25被肉毒杆菌毒素A切割，NLuc-SNPA25底物部分-CL1-PEST结构的多肽稳定免于降解，并且相对发光单元高。
图7显示了在细胞分化成神经元然后用肉毒杆菌毒素A中毒后，用pFB载体3转染的NG108-15细胞的荧光显微图像。如图7所示，生产用pFB载体3转染的NG108-15细胞，分化成神经元，用肉毒杆菌毒素A中毒和测量报告分子部分活性与(3)、(4)和(5)中所述的相同。参考图7，通过使用One-glo纳米双荧光素酶试剂盒测量培养中毒总共72小时的细胞的发光来测量FLuc和NLuc的活性。
如图7所示，当用10nM肉毒杆菌毒素A中毒细胞与未用中毒时相比，通过相对发光单位评估的NLuc相对于FLuc的相对活性显著增加。参考图6，BoNT/A是具有0nM肉毒杆菌毒素A的对照组，并且BoNT/A 1nM是具有1nM肉毒杆菌毒素A的测试组。如图7所示，当用10nM肉毒杆菌毒素A中毒细胞与未中毒时相比，通过相对发光评估的NLuc的测量活性显著增加。
图8显示了在细胞分化成神经元然后用肉毒杆菌毒素A中毒后，用pFB载体3转染的SiMa细胞的荧光显微图像。
图9显示了在细胞分化成神经元然后用肉毒杆菌毒素A中毒后，用pFB载体3转染的NT2细胞的荧光显微图像。
图8和9显示了以与用于获得图7中所示结果相同的方式获得的结果，除了使用SiMa细胞和NT2细胞代替NG108-15细胞。如图8和9所示，当用10nM肉毒杆菌毒素A中毒细胞与未中毒时相比，通过相对发光评估的NLuc的测量活性显著增加。
图10显示了在BoNT/B轻链(pCDNA4-BLC)在NG108-15细胞中任意表达后，由报告分子部分蛋白和内标报告分子蛋白发射的信号的测量，所述细胞通过使用pFB载体4诱导转染至稳定表达多肽。这里，关于pCDNA4-BLC载体，使用LipofectamineTM 3000(Invitrogen)，并根据制造商的说明书进行转导。转导后，细胞在相同条件下培养48小时。因此，pCDNA4-BLC载体在NG108-15细胞中瞬时表达。在图10中，纵轴表示通过相对于Fluc归一化NLuc值而获得的值。
如图10所示，当引入编码10μg肉毒杆菌毒素B的轻链的pCDNA4-BLC的DNA与未引入时相比时，通过相对发光评估的相对于FLuc测量的NLuc的活性显著增加。
图11显示了在用pFB载体3转导并稳定化的细胞系NT2细胞用不同浓度的BoNT/A中毒后，由报告分子部分蛋白发射的信号的测量。在图11中，BoNT/A API代表用于制造含有BoNT/A的产品的活性药物成分。在此，活性药物成分用作BoNT/A。BoNT/A API由MeditoxCo.，Ltd.提供。根据制造商的说明书，使用LipofectamineTM 3000(Invitrogen)转导pFB载体3。转导后，细胞在相同条件下培养48小时。因此，pFB载体3在NT2细胞中瞬时表达。在图11中，RLU代表相对荧光素酶单位。如图11所示，通过相对发光单位评估的相对于FLuc测量的NLuc的活性取决于浓度为1pM至10nM的肉毒杆菌毒素A的浓度。这表明通过测量RLU，可以测量样品中肉毒杆菌毒素的水平，例如A型水平。
图12至14显示了在细胞用不同浓度的含BoNT/A的终产物中毒后稳定后，由用pFB载体3转染并稳定化的NT2细胞中表达的报告分子部分和内标报告分子蛋白发射的信号的测量。如图12至14所示的结果以与结合图11描述的相同方式获得，除了作为BoNT/A，使用含有BoNT/A的最终产品代替用于生产含有BoNT/A的产品的活性药物成分。与BoNT/A API相比，该产品还含有诸如赋形剂的成分。图12，13和14分别显示FLuc值，NLuc值和NLuc/FLuc值。
如图14所示，通过相对发光单位评估的NLuc相对于FLuc的活性取决于浓度为1U至10U的肉毒杆菌毒素A的浓度。这表明通过测量RLU，肉毒杆菌的水平可以测量样品中的毒素，例如A型的水平。
工业实用性
根据第一方面的重组多核苷酸可用于测定神经毒素多肽在含有重组多核苷酸的宿主细胞或样品中的蛋白酶活性。
根据第二方面的含有重组多核苷酸的宿主细胞可以有效地用于测定样品中神经毒素多肽的蛋白酶活性。
根据第三和第四方面的用于测定神经毒素多肽的蛋白水解活性的试剂盒可用于测定神经毒素多肽的蛋白水解活性。
根据第五和第七方面的根据确定样品中神经毒素多肽的特征的方法，可以有效地确定神经毒素多肽的特征。
根据第六和第八方面的根据确定样品中神经毒素多肽的特征的方法，可以有效地确定样品中神经毒素多肽的蛋白酶活性。
根据第九方面的根据测量宿主细胞表达或抑制蛋白酶的能力的方法，可以有效地测量宿主细胞表达或抑制蛋白酶的能力，或者可以确定测试材料是否控制蛋白酶活性。
<110> 玫帝托克斯股份有限公司
<120> 编码含报告分子、底物和去稳定化部分的多肽的重组多核苷酸，含其的宿主细胞及其用途
<130> PX53965OV
<160> 24
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1653
<212> DNA
<213> 萤火虫
<400> 1
atggaagatg ccaaaaacat taagaagggc ccagcgccat tctacccact cgaagacggg 60
accgccggcg agcagctgca caaagccatg aagcgctacg ccctggtgcc cggcaccatc 120
gcctttaccg acgcacatat cgaggtggac attacctacg ccgagtactt cgagatgagc 180
gttcggctgg cagaagctat gaagcgctat gggctgaata caaaccatcg gatcgtggtg 240
tgcagcgaga atagcttgca gttcttcatg cccgtgttgg gtgccctgtt catcggtgtg 300
gctgtggccc cagctaacga catctacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatc 360
agccagccca ccgtcgtatt cgtgagcaag aaagggctgc aaaagatcct caacgtgcaa 420
aagaagctac cgatcataca aaagatcatc atcatggata gcaagaccga ctaccagggc 480
ttccaaagca tgtacacctt cgtgacttcc catttgccac ccggcttcaa cgagtacgac 540
ttcgtgcccg agagcttcga ccgggacaaa accatcgccc tgatcatgaa cagtagtggc 600
agtaccggat tgcccaaggg cgtagcccta ccgcaccgca ccgcttgtgt ccgattcagt 660
catgcccgcg accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat cctcagcgtg 720
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cgggtcgtgc tcatgtaccg cttcgaggag gagctattct tgcgcagctt gcaagactat 840
aagattcaat ctgccctgct ggtgcccaca ctatttagct tcttcgctaa gagcactctc 900
atcgacaagt acgacctaag caacttgcac gagatcgcca gcggcggggc gccgctcagc 960
aaggaggtag gtgaggccgt ggccaaacgc ttccacctac caggcatccg ccagggctac 1020
ggcctgacag aaacaaccag cgccattctg atcacccccg aaggggacga caagcctggc 1080
gcagtaggca aggtggtgcc cttcttcgag gctaaggtgg tggacttgga caccggtaag 1140
acactgggtg tgaaccagcg cggcgagctg tgcgtccgtg gccccatgat catgagcggc 1200
tacgttaaca accccgaggc tacaaacgct ctcatcgaca aggacggctg gctgcacagc 1260
ggcgacatcg cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg gctgaagagc 1320
ctgatcaaat acaagggcta ccaggtagcc ccagccgaac tggagagcat cctgctgcaa 1380
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aaggccaaga agggcggcaa gatcgccgtg tga 1653
<210> 2
<211> 516
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米荧光素酶
<400> 2
atggtcttca cactcgaaga tttcgttggg gactggcgac agacagccgg ctacaacctg 60
gaccaagtcc ttgaacaggg aggtgtgtcc agtttgtttc agaatctcgg ggtgtccgta 120
actccgatcc aaaggattgt cctgagcggt gaaaatgggc tgaagatcga catccatgtc 180
atcatcccgt atgaaggtct gagcggcgac caaatgggcc agatcgaaaa aatttttaag 240
gtggtgtacc ctgtggatga tcatcacttt aaggtgatcc tgcactatgg cacactggta 300
atcgacgggg ttacgccgaa catgatcgac tatttcggac ggccgtatga aggcatcgcc 360
gtgttcgacg gcaaaaagat cactgtaaca gggaccctgt ggaacggcaa caaaattatc 420
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accggctggc ggctgtgcga acgcattctg gcgtga 516
<210> 3
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 增强的GFP
<400> 3
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtga 720
720
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<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry
<400> 4
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
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<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 5
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ggacct 66
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分SNAP25
<400> 6
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<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CL1
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<210> 8
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PEST
<400> 8
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120
<210> 9
<211> 550
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 萤火虫荧光素酶
<400> 9
Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro
1 5 10 15
Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg
20 25 30
Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu
35 40 45
Val Asp Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val
65 70 75 80
Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu
85 90 95
Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg
100 105 110
Glu Leu Leu Asn Ser Met Gly Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val
115 120 125
Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro
130 135 140
Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe
165 170 175
Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile
180 185 190
Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val
195 200 205
Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp
210 215 220
Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val
225 230 235 240
Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu
245 250 255
Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu
260 265 270
Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val
275 280 285
Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr
290 295 300
Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser
305 310 315 320
Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile
325 330 335
Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr
340 345 350
Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe
355 360 365
Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val
370 375 380
Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly
405 410 415
Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe
420 425 430
Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln
435 440 445
Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile
450 455 460
Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu
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Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys
485 490 495
Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu
500 505 510
Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly
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Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Lys Ile Ala Val
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<210> 10
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米荧光素酶
<400> 10
Met Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala
1 5 10 15
Gly Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu
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Phe Gln Asn Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu
35 40 45
Ser Gly Glu Asn Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr
50 55 60
Glu Gly Leu Ser Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys
65 70 75 80
Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr
85 90 95
Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe
100 105 110
Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr
115 120 125
Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu
130 135 140
Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val
145 150 155 160
Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala
165 170
<210> 11
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 增强的GFP
<400> 11
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 12
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry
<400> 12
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe
1 5 10 15
Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe
20 25 30
Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr
35 40 45
Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp
50 55 60
Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His
65 70 75 80
Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe
85 90 95
Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val
100 105 110
Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys
115 120 125
Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys
130 135 140
Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly
145 150 155 160
Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly
165 170 175
His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val
180 185 190
Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser
195 200 205
His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly
210 215 220
Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 13
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 13
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 14
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 部分SNAP25
<400> 14
Glu Met Asp Glu Asn Leu Glu Gln Val Ser Gly Ile Ile Gly Asn Leu
1 5 10 15
Arg His Met Ala Leu Asp Met Gly Asn Glu Ile Asp Thr Gln Asn Arg
20 25 30
Gln Ile Asp Arg Ile Met Glu Lys Ala Asp Ser Asn Lys Thr Arg Ile
35 40 45
Asp Glu Ala Asn Gln Arg Ala Thr Lys Met Leu Gly Ser Gly
50 55 60
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CL1
<400> 15
Ala Cys Lys Asn Trp Phe Ser Ser Leu Ser His Phe Val Ile His Leu
1 5 10 15
<210> 16
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PEST
<400> 16
Ser His Gly Phe Pro Pro Glu Val Glu Glu Gln Ala Ala Gly Thr Leu
1 5 10 15
Pro Met Ser Cys Ala Gln Glu Ser Gly Met Asp Arg His Pro Ala Ala
20 25 30
Cys Ala Ser Ala Arg Ile Asn Val
35 40
<210> 17
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Vamp
<400> 17
atgtcggcta ccgctgccac cgtcctgcct gccgccccgg ccggcgaggg tggcccccct 60
gcacctcctc caaaccttac tagtaacagg agactgcagc agacgcaggc ccaggtggat 120
gaggtggtgg acatcatgag ggtgaatgtg gacaaggtcc tggagcggga ccagaagttg 180
tcggagctgg atgaccgtgc agatgccctc caggcagggg cctcccagtt tgaaacaagt 240
gcagccaagc tcaagcgcaa atactggtgg aaaaacctca agatgatgat catcttggga 300
gtgatctgcg ccatcatcct catcatcatc atcgtttact tcagc 345
<210> 18
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Vamp
<400> 18
Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Val Leu Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu
20 25 30
Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val
35 40 45
Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp
50 55 60
Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser
65 70 75 80
Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met
85 90 95
Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val
100 105 110
Tyr Phe Ser
115
<210> 19
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 19
ggaaccggag agggcagagg aagtctgcta acatgcgctg acgtcgagga gaatcctgga 60
cct 63
<210> 20
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 20
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 21
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 21
ggaagcggac agtgtactaa ttatgctctc ttgaaattgg ctggagatgt tgagagcaac 60
cctggacct 69
<210> 22
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 22
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 23
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 23
ggaagcggag tgaaacagac tttgaatttt gaccttctca agttggcggg agacgtggag 60
tgcaaccctg gacct 75
<210> 24
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 24
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15
Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25

Claims (14)

1.一种重组多核苷酸，其包括编码多肽的第一多核苷酸，所述多肽包括：报告分子部分；去稳定化部分；可操作地连接所述报告分子部分与所述去稳定化部分的底物部分，其中所述底物部分包括蛋白酶活性的切割位点。
2.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其中，所述蛋白酶是神经毒素多肽，并且所述神经毒素多肽是肉毒杆菌毒素血清型A(BoNT/A)，BoNT/B，BoNT/C，BoNT/CD，BoNT/D，BoNT/DC，BoNT/E，BoNT/F，BoNT/FA，BoNT/G或破伤风神经毒素(TeNT)。
3.根据权利要求1所述的重组多核苷酸，其还包含多核苷酸，所述多核苷酸编码：连接在所述第一多核苷酸的上游或下游的双顺反子序列；以及可操作地连接在所述双顺反子序列的上游或下游的内标报告分子。
4.根据权利要求3所述的重组多核苷酸，其中，所述双顺反子序列是内部核糖体进入位点(IRES)序列或允许核糖体跳过形成肽键的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其包含权利要求1所述的重组多核苷酸。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是能够将神经毒素多肽转移到细胞质中的细胞。
7.根据权利要求5所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞是NT2细胞、SiMa细胞或NG108-15细胞。
8.根据权利要求5所述的宿主细胞，其中，所述宿主细胞包含编码蛋白酶的外源多核苷酸，例如具有蛋白水解活性的神经毒素多肽。
9.一种测定样品中神经毒素多肽的蛋白水解活性的方法，该方法包括使权利要求5所述的宿主细胞与怀疑含有神经毒素多肽的样品接触；以及
测量由所述报告分子部分在通过接触获得的产物中发射的信号。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述重组多核苷酸进一步包含多核苷酸，所述多核苷酸编码连接在第一多核苷酸的上游或下游的双顺反子序列和可操作地连接在所述双顺反子序列的上游或下游的内标报告分子。
11.根据权利要求9所述的方法，其还包括在所述接触之前在培养基中培养所述宿主细胞以分化成神经元细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述宿主细胞是NT2细胞、SiMa细胞或NG108-15细胞。
13.一种测量宿主细胞表达或抑制蛋白酶的能力的方法，该方法包括：将编码蛋白酶多肽的多核苷酸引入权利要求5所述的宿主细胞中；培养已引入所述多核苷酸的所述宿主细胞，并测量培养物中所述报告分子部分或所述内标报告分子或者所述报告分子部分或所述内标报告分子的产物发出的信号。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述培养在测试材料存在下进行。
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