KR101620812B1 - CLC-Kb 염화 이온 채널 조절물질 도출을 위한 세포기반 형광 이미징 고효율 검색 및 광범위 특성 연구용 세포주 - Google Patents

CLC-Kb 염화 이온 채널 조절물질 도출을 위한 세포기반 형광 이미징 고효율 검색 및 광범위 특성 연구용 세포주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CLC-Kb 채널을 코딩하는 유전자, Barttin(Y98A)를 코딩하는 유전자 및 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시킨 세포주에 관한 것으로서, 상기 CLC-Kb 채널 및 Barttin(Y98A)는 N-말단 또는 C-말단에 에피토프 태그되어 있고, 상기 형광 단백질은 할라이드 이온에 노란색으로 반응하는 것을 특징으로 하고, 상기 CLC-Kb 채널, Barttin(Y98A) 및 형광 단백질을 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 한다. 또한, 테트라사이클린 유도에 의해 발현되는 유도 안정적 발현시스템을 가지며, 세포기반 형광 이미징을 이용한 고효율 검색에 활용할 수 있으며, CLC-Kb 채널과 Barttin(Y98A)를 안정적으로 발현함으로써 CLC-Kb 채널과 Barttin이 관여하고 있는 세포 내 신호전달과정 연구에 이용이 가능함은 물론, 본 발명에 따른 세포주를 이용한 CLC-Kb 채널 작용기작에 대한 분자수준의 연구, 생리학적 기능 연구, 바터증후군, 고혈압 등 CLC-Kb 채널과 관련된 신장 및 심장질환의 예방 및 치료제 개발에 널리 활용될 수 있다.

Description

CLC-Kb 염화 이온 채널 조절물질 도출을 위한 세포기반 형광 이미징 고효율 검색 및 광범위 특성 연구용 세포주 {Cell line for cell-based high-throughput screening of CLC-Kb channel modulators using YFP fluorescence imaging and broad-spectrum studies of CLC-Kb channels}
본 발명은 CLC-Kb 염화 이온 채널 조절물질을 도출하기 위한 세포기반의 형광 이미징 고효율 검색 및 광범위 특성 연구용 세포주에 관한 것이다.
전압의존성 염화 이온 채널 (voltage-gated chloride channel)인 CLC 채널은 세포막 사이 염화 이온의 흐름을 조절함으로써 근육 이완 및 수축, 호르몬 분비, 염의 재흡수 등 다양한 세포내 작용을 조절한다. 이러한 인간 CLC 채널은 현재까지 CLC-1 채널부터 CLC-7 채널, 그리고 CLC-Ka 채널과 CLC-Kb 채널을 포함하여 총 9종이 알려져 있으며, 신경, 근육, 심혈관, 상피조직 등에서 중요한 기능을 담당하고 있다. 또한, CLC 채널은 근 무력증, 간질, 망막퇴화, 만성 신장질환, 골다공증, 희귀 유전질환인 바터증후군과 Dent 증후군 등에 연관되어 있는 것으로 알려져 있다.
이 중, CLC-Kb 채널은 신장과 귀에 발현하여 중요한 생리적 기능을 담당한다. 귀에 발현하는 CLC-Kb 채널은 내임파 (endolymph)로의 칼륨 분비를 도와 내이(內耳) 생모세포 (hair cells)에서 감각전달 기능을 담당하고, 신장에 발현하는 CLC-Kb 채널은 신장의 네프론에서 헨레 고리 (Henle's loop)의 굵은 오름 가지 부분에 발현하여 신장 피질로의 염화 이온 재흡수를 담당한다.
특히, CLC-Kb 채널의 유전적 결함은 희귀병인 바터증후군을 유발하며 이는 유아기 성장 장애를 일으킨다. 구체적으로, 바터증후군은 CLC-Kb 채널과 이에 선택적으로 결합하는 Barttin 단백질에 유전적 변형이 있을 경우 발생하며, 주로 소아에게 발병하는 희귀 난치성 유전병으로 1만 명당 1명꼴로 발병한다. 바터증후군 환자는 신장의 전해질 재흡수 기능 이상으로 소변으로 전해질이 과다하게 배출되어 체내 전해질이 부족해지며 이로 인한 다양한 임상적 문제가 야기된다. 이 중, antenatal 바터증후군은 신생아기 특이적으로, 심지어 출생 이전 자궁 내에서의 발육지연을 유발하며, classic 바터증후군은 유아 및 유년기 특이적으로, 저칼륨 혈증에 따른 근 쇠약과 근 경련 및 성장 장애를 초래한다. 그러나 바터증후군에 대한 진단 방법의 부재로 인해 현재는 다른 질환을 배제할 때에만 바터증후군 진단이 이루어지고 있는 실정이며, 또한 경구 칼륨 공급 등 이온수송 장애에 의한 이차적 현상만을 경감시키는 치료만 이루어지고 있을 뿐 이에 대한 근본적인 치료법은 알려져 있지 않다.
CLC-Kb 채널을 포함하는 CLC 채널은 발현 장소에 따라 각기 중요한 생리학적 기능을 담당하며 각종 질환에 연관되어 있으나 이에 선택적으로 작용하는 조절물질은 상당히 제한적이다. 지금까지 알려진 CLC 채널 조절물질은 DIDS (4,4'-diisothiocyanostilbene-2,2'-disulfonic acid) 또는 NPPB (5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid) 등으로 그 수에서 매우 제한적이며 (약 10종) 낮은 효능과 (IC50 값: 10~300 μM) 낮은 선택성으로 다른 종류의 염화 이온 채널과 수송체, 심지어는 양이온 채널도 저해하는 것으로 알려져 있다.
이 외에도, CLC-2 채널 저해제로 알려진 전갈 독소는 재연성이 없는 것으로 판명되었으며((Isolation and characterization of a high affinity peptide inhibitor of CLC-2 chloride channels. Thompson CH, Olivetti PR, Fuller MD, Freeman CS, McMaster D, French RJ, Pohl J, Kubanek J, McCarty NA. J Biol Chem. 2009; 284(38): 26051-26062), CLC-K 채널 저해제로 개발된 합성 화합물은(Molecular switch for CLC-K Cl- channel block/activation: optimal pharmacophoric requirements towards high-affinity ligands. Liantonio A, Picollo A, Carbonara G, Fracchiolla G, Tortorella P, Loiodice F, Laghezza A, Babini E, Zifarelli G, Pusch M, Camerino DC. Proc Natl Acad Sci USA. 2008; 105(4): 1369-1373) CLC-Ka 채널과 CLC-Kb 채널 사이의 선택성이 부족하다.
따라서, CLC-Kb 채널에 선택적인 조절물질 개발과 기능 및 기전 연구를 위해 CLC-Kb 채널을 연구할 수 있는 시스템이 절실히 요구된다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 테트라사이클린 유도에 의해 발현되는 유도 안정적 발현시스템을 가지며, 세포기반 형광 이미징을 이용한 고효율 검색에 활용할 수 있으며, 에피토프 태그가 연결된 CLC-Kb 채널과 Barttin(Y98A)를 안정적으로 발현함으로써 CLC-Kb 채널과 Barttin이 관여하고 있는 세포 내 신호전달과정 연구에 활용할 수 있는 세포주를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 상기 세포주를 이용하여, 세포기반 형광 이미징을 이용한 CLC-Kb 채널 조절물질의 고효율 검색방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여,
CLC-Kb 채널을 코딩하는 유전자, Barttin(Y98A)를 코딩하는 유전자 및 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시킨 세포주로서, 상기 CLC-Kb 채널 및 Barttin(Y98A)는 N-말단 또는 C-말단에 에피토프 태그되어 있고, 상기 형광 단백질은 할라이드 이온에 노란색으로 반응하는 것을 특징으로 하고, 상기 CLC-Kb 채널, Barttin(Y98A) 및 형광 단백질을 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 세포주를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 플라스미드는 상기 유전자들이 서열번호 7 또는 9로 표시되는 2A 펩타이드로 연결된 것일 수 있고, 도 2의 개열지도로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 의하면, 상기 CLC-Kb 채널을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 Barttin(Y98A)를 코딩하는 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 형광 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 5로 표시되는 YFP(H148Q/I152L)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 에피토프 태그는 HA(Hemagglutinin), c-MYC, FLAG, V5, VSV-G, HSV 또는 His6일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 의하면, 상기 세포주는 수탁번호 KCTC18307P로 기탁된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 세포주를 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 세포주를 염화 이온이 글루코네이트로 치환된 완충용액에서 세척하는 단계; (c) 상기 세척된 세포주에 요오드 이온을 주입하는 단계; 및 (d) 요오드 이온의 세포 내 유입에 따른 YFP 형광 소광을 측정하는 단계;를 포함하는 CLC-Kb 채널 조절물질의 고효율 검색방법을 제공한다.
본 발명에 따른 세포주는 인간 CLC-Kb 채널 유전자와 인간 Barttin(Y98A), 그리고 형광 단백질 유전자가 각각 안정적으로 발현함으로써 CLC-Kb 채널에 선택적으로 작용하는 조절물질의 검색 효율을 증가시키고, CLC-Kb 채널의 신호전달에 관여하는 선택적 결합 단백질에 대한 연구시간을 단축할 수 있으며, 특히 염화 이온을 검출할 수 있는 형광 단백질을 함께 발현시킴으로써 형광 물질의 표지 없이도 고효율 검색이 가능하도록 한다. 따라서, 본 발명에 따른 세포주를 이용한 CLC-Kb 채널 작용기작에 대한 분자수준의 연구, 생리학적 기능 연구, 바터증후군, 고혈압 등 CLC-Kb 채널과 관련된 신장 및 심장질환의 예방 및 치료제 개발에 널리 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 2A 펩타이드로 연결된 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L)의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자를 포함하는 플라스미드의 개열지도를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 co-transfection에 사용된 pOG44 플라스미드의 개열지도를 나타낸 도면이다.
도 4는 야생형 T-REx HEK293 세포의 Hygromycin B에 대한 세포 생존력을 측정한 그래프이다.
도 5는 RT-PCR 방법으로 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질 전환된 T-REx HEK293 세포주의 YFP(H148Q/I152L) mRNA의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 Western blot 방법으로 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질 전환된 T-REx HEK293 세포주에서 HA-CLC-Kb 채널, Barttin(Y98A)-Myc 및 YFP(H148Q/I152L) 단백질 각각의 개체로의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질 전환된 T-REx HEK293 세포주의 YFP(H148Q/I152L) 단백질의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주의 요오드 이온의 농도에 따른 YFP(H148Q/I152L) 형광 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주의 요오드 이온의 농도에 따른 CLC-Kb 채널의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
다양한 세포 내 작용을 조절하는 전압의존성 염화 이온 채널 (voltage-gated chloride channel)인 CLC 채널 중 하나로 알려진 CLC-Kb 채널은 신장과 귀에 발현하여 중요한 생리적 기능을 담당한다.
구체적으로, 귀에 발현하는 CLC-Kb 채널은 내임파 (endolymph)로의 칼륨 분비를 도와 내이(內耳) 생모세포 (hair cells)에서 감각전달 기능을 담당하고, 신장에 발현하는 CLC-Kb 채널은 신장의 네프론에서 헨레 고리 (Henle's loop)의 굵은 오름 가지 부분에 발현하여 신장 피질로의 염화 이온 재흡수를 담당한다.
CLC-Kb 채널의 유전적 결함은 희귀병인 바터증후군을 유발하며 이는 유아기 성장 장애를 일으킨다. 구체적으로, 바터증후군은 CLC-Kb 채널과 이에 선택적으로 결합하는 Barttin 단백질에 유전적 변형이 있을 경우 발생하며, 신장의 전해질 재흡수 기능 이상으로 소변으로 전해질이 과다하게 배출되어 체내 전해질이 부족해지며 이로 인한 다양한 임상적 문제가 야기된다. 그러나 현재로서는 경구 칼륨 공급 등 이온수송 장애에 의한 이차적 현상만을 경감시키는 치료만 이루어지고 있을 뿐 이에 대한 근본적인 치료법은 알려져 있지 않다.
CLC-Kb 채널을 포함하는 CLC 채널은 발현 장소에 따라 각기 중요한 생리학적 기능을 담당하며 각종 질환에 연관되어 있으나 이에 선택적으로 작용하는 조절물질은 상당히 제한적이다. 지금까지 알려진 CLC 채널 조절물질은 DIDS (4,4'-diisothiocyanostilbene-2,2'-disulfonic acid) 또는 NPPB (5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid) 등으로 그 수에서 매우 제한적이며 (약 10종) 낮은 효능과 (IC50 값: 10~300 μM) 낮은 선택성으로 다른 종류의 염화 이온 채널과 수송체, 심지어는 양이온 채널도 저해하는 것으로 알려져 있다.
따라서, CLC-Kb 채널에 선택적인 조절물질 개발과 기능 및 기전 연구를 위해 CLC-Kb 채널을 연구할 수 있는 시스템이 절실히 요구된다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해 연구를 수행한 결과, 인간 CLC-Kb 채널 유전자 및 인간 Barttin(Y98A) 유전자와, 형광 단백질 유전자가 각각 안정적으로 발현함으로써 CLC-Kb 채널에 선택적으로 작용하는 조절물질의 검색 효율을 증가시키며 CLC-Kb 채널과 결합하는 단백질 연구에 활용될 수 있는 세포주를 개발하였다.
구체적으로, 본 발명은 CLC-Kb 채널을 코딩하는 유전자, Barttin(Y98A)을 코딩하는 유전자 및 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환시킨 세포주로서, 상기 CLC-Kb 채널 및 Barttin(Y98A)는 N-말단 또는 C-말단에 에피토프 태그되어 있고, 상기 형광 단백질은 할라이드 이온에 노란색으로 반응하는 것을 특징으로 하고, 상기 CLC-Kb 채널, Barttin(Y98A) 및 형광 단백질을 안정적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 세포주를 제공한다.
이때, 사용되는 숙주세포는 HEK293, COS-7, CHO-K1 또는 CHO-G5A인 것이 바람직하며, HEK293인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 따른 형질전환은 형질주입(transfection) 시스템 및 Flp-In 재조합(recombination) 시스템을 이용하여 수행되며, 이때 상기 형질주입은 리포펙타민(Lipofectamine), Dojindo사의 Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene 및 DreamFect로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 상용화된 시약을 이용하여 수행되는 것이 바람직하고, 칼슘-인산(calcium-phosphate), 양전하성 고분자, 리포좀, 나노입자, 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기청공법(electroporation), 열충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection) 및 레트로 바이러스를 이용하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 플라스미드는 CLC-Kb 채널을 코딩하는 유전자, Barttin(Y98A)을 코딩하는 유전자 및 형광 단백질을 코딩하는 유전자, 유전자들이 서열번호 7 또는 9로 표시되는 2A 펩타이드로 연결되어 하나의 유전자를 구성하며, 이를 통해 한 유전자에서 인간 CLC-Kb 채널, 인간 Barttin(Y98A) 및 YFP(H148Q/I152L)가 각각의 단백질 개체로 발현될 수 있도록 하였다.
이때, 상기 2A 펩타이드는 Thoseaasigna virus 2A (T2A) 또는 Equine rhinitis A virus 2A (E2A)인 것이 바람직하며, T2A의 염기서열은 서열번호 7에, 이의 아미노산 서열은 서열번호 8에 기재된 바와 같고, E2A의 염기서열은 서열번호 9에, 이의 아미노산 서열은 서열번호 10에 기재되어 있는 바와 같다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 플라스미드는 도 2의 개열지도로 표시되는 pcDNA5/FRT/TO 인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 상기 CLC-Kb 채널을 코딩하는 유전자의 염기서열은 서열번호 1에 기재되어 있는 바와 같고, 아미노산 서열은 서열번호 2에 기재되어 있는 바와 같다.
본 발명에 사용된 Barttin(Y98A) 돌연변이는 Barttin의 98번째 아미노산인 타이로신 (Tyrosine; Y)을 알라닌 (Alanine; A)으로 치환한 형태로 Barttin의 단백질 안정성을 증가시켜 CLC-Kb 채널의 기능적 발현을 증가시키지만, 그 전기 생리학적 성질은 변화시키지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 Barttin(Y98A) 단백질은 heterologous 발현 시스템에서 야생형 Barttin을 대신하여 널리 사용되고 있으며, 상기 Barttin(Y98A)를 코딩하는 유전자의 염기서열은 서열번호 3에 기재되어 있는 바와 같고, 아미노산 서열은 서열번호 4에 기재되어 있는 바와 같다.
또한, 본 발명에 사용된 형광 단백질은 할라이드 이온에 노란색으로 반응하는 것을 특징으로 하며, 특히 노란색 형광 단백질 (Yellow Fluorescence Protein; YFP)의 148번째 아미노산인 히스티딘 (Histidine; H)이 글루타민 (Glutamine; Q)으로, 그리고 152번째 아미노산인 아이소루신 (Isoleucine; I)이 루신 (Leucine; L)으로 치환된 돌연변이 YFP(H148Q/I152L)인 것이 바람직하다. YFP(H148Q/I152L)은 할라이드 계열의 이온에 의해 형광 소광 (fluorescence quenching)을 나타내므로 CLC-Kb 채널을 통한 염화 이온의 흐름을 YFP 형광으로 측정할 수 있고 이는 새로운 CLC-Kb 채널 조절물질 개발에 이용될 것으로 기대된다. 특히, YFP(H148Q/I152L)을 이용하는 방법은 고비용의 형광 염료를 사용할 필요가 없으므로 검색 비용과 시간을 크게 줄일 수 있으며 염료 사용에 따른 세포 독성에서도 자유로울 수 있다. 본 발명에 사용된 형광 단백질인 상기 YFP(H148Q/I152L)을 코딩하는 유전자의 염기서열은 서열번호 5에 기재되어 있는 바와 같고, 아미노산 서열은 서열번호 6에 기재되어 있는 바와 같다.
본 발명에 따른 상기 CLC-Kb 채널 및 Barttin(Y98A)은 N-말단 또는 C-말단에 에피토프 태그(epitope tag)를 코딩하는 서열을 추가로 포함하여 발현되는 단백질의 추적이 용이하도록 한다. 이때, 사용되는 상기 에피토프 태그는 HA(Hemagglutinin), c-MYC, FLAG, V5, VSV-G, HSV 또는 His6인 것이 바람직하고, 본 발명의 일 실시예에 따르면, HA(Hemagglutinin) 또는 c-MYC인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 상기 HA 태그는 인간 인플루엔자 헤마글루티닌에서 유래한 단편을 말하는 것으로, 일반적으로 발현 벡터에 포함되어 정제 및 분리를 용이하게 하기 위한 태그 용도로 사용된다. 상기 HA 태그는 괄호의 염기서열(tac cct tac gat gtt cca gat tac gct) 및 아미노산 서열(YPYDVPDYA)을 가지는 것일 수 있으며, 또한, 상기 c-MYC 태그는 괄호의 염기서열(gag cag aaa ctc atc tct gaa gag gat ctg) 및 아미노산 서열(EQKLISEEDL)을 가지는 것일 수 있으며, 상기 서열과 다소 차이가 있더라도, 단백질 발현을 유도함에 있어 실질적으로 동등한 활성을 가지는 서열 변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 세포주는 2014년 6월 20일 자로 한국생명공학연구원 미생물 자원센터(Korean Collection for Type Cultures; KCTC)에 기탁된 것으로 수탁번호 KCTC18307P인 것을 특징으로 하며, 구체적으로 상기 기탁된 본 발명에 따른 세포주는 도 1에 표시된 바와 같이 T-REX HEK293 세포를 N-말단에 HA 태그된 인간 CLC-Kb 채널을 코딩하는 유전자, C-말단에 c-MYC 태그된 인간 Barttin(Y98A)를 코딩하는 유전자, 그리고 YFP(H148Q/I152L)을 코딩하는 유전자가 포함된 것으로, 이를 포함하는 도 2의 개열지도로 표시되는 플라스미드로 형질전환시킨 것으로서, HA-CLC-Kb와 Barttin(Y98A)-Myc 사이에 Thoseaasigna virus 2A (T2A) 펩타이드를, 그리고 Barttin(Y98A)-Myc과 YFP(H148Q/I152L) 사이에 Equine rhinitis A virus 2A (E2A) 펩타이드를 삽입하여 하나의 유전자로 구성하였고, 이를 통해 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 한 유전자에서 HA-CLC-Kb 채널과 Barttin(Y98A)-Myc, 그리고 YFP(H148Q/I152L)이 각각의 단백질 개체로 발현되도록 한 것을 특징으로 한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명은 테트라사이클린-조절 발현 인간 신장 배아 세포주인 T-REx HEK293 (Tetracycline-Regulated Expression Human Embryonic Kidney cell line)를 사용하였고, 도 1의 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자를 BamH I과 Xho I 제한효소로 처리한 후 이를 동일하게 처리한 pcDNA5/FRT/TO 벡터에 도입한 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L)-pcDNA5/FRT/TO 플라스미드를 사용하여 야생형 T-REx HEK293 세포를 형질전환시킨 후 배양하여 HA-CLC-Kb 채널과 Barttin(Y98A)-Myc, 그리고 YFP(H148Q/I152L)을 개별 단백질로 각각 안정적으로 발현하는 본 발명의 세포주를 얻을 수 있었다.
본 발명에서 확립한 세포주가 HA-CLC-Kb 채널과 Barttin(Y98A)-Myc, 그리고 YFP(H148Q/I152L)을 개별 단백질로 각각 안정적으로 발현하는지 여부는 하기에서 설명할 실시예 등에서 RT-PCR 방법과 Western blot 방법으로 mRNA 수준과 단백질 수준에서 각각 확인하였다. 특히, 본 발명에 따른 세포주는 테트라사이클린 유도로만 단백질을 발현함으로써 배양과정에서 CLC-Kb 채널의 과발현에 의한 세포 유해성을 방지할 수 있다. 또한 세포주에서 같이 발현되는 YFP(H148Q/I152L) 형광을 이용하여 CLC-Kb 채널을 통한 세포 내 할라이드 이온 농도변화를 확인함으로써 본 발명에서 확립한 세포주가 발현하는 CLC-Kb 채널이 세포 내에서 정상적인 기능을 보임을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에서 확립한 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) T-REx HEK293 세포주는 CLC-Kb 채널을 체계적으로 연구할 수 있는 토대를 제공함이 밝혀졌다.
또한, 본 발명에 따른 상기 세포주를 이용하여, 세포기반 형광 이미징을 이용한 CLC-Kb 채널 조절물질의 고효율 검색방법을 제공할 수 있으며, 구체적으로 (a) 상기 세포주를 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 세포주를 염화 이온이 글루코네이트로 치환된 완충용액에서 세척하는 단계; (c) 상기 세척된 세포주에 요오드 이온을 주입하는 단계; 및 (d) 요오드 이온의 세포 내 유입에 따른 YFP 형광 소광을 측정하는 단계;를 포함하는 CLC-Kb 채널 조절물질의 고효율 검색방법을 제공한다.
이하에서는 바람직한 실시예 등을 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 등은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
이하의 실시예 등에서 사용된 세포주는 T-REx HEK293 (Invitrogen) 세포주이다. T-REx HEK293 세포주는 테트라사이클린-조절 발현 인간 신장 배아 세포주로 본 발명에 사용된 pcDNA5/FRT/TO 벡터에 적합한 세포주이다. 야생형 T-REx HEK293 세포주를 대조군으로, HA-CLC-Kb, Barttin(Y98A)-Myc, 그리고 YFP(H148Q/I152L)을 안정적으로 발현하는 본 발명의 T-REx HEK293 세포주 (HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) T-REx HEK293)에 대해 실험을 진행한다.
실시예 1. 형질전환 세포주 제작
1-1. 야생형 세포주 배양
T-REx HEK293 세포주를 10% 태아 소 혈청 (FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Penicillin/Streptomycin), 15 ㎍/㎖의 블라스티시딘 (Blasticidin), 100 ㎍/㎖의 제오신 (Zeocin)이 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 37 ℃, 95% 공기와 5% CO2의 가습 조건에서 배양하였다. 상기 배양액은 3-4일에 한번씩 교환하고, 세포는 매 주마다 분주(sub-culture)한다.
1-2. 야생형 T- REx HEK293 세포의 Hygromycin B에 대한 세포 생존력 측정
도 4는 야생형 T-REx HEK293 세포의 Hygromycin B에 대한 세포 생존력을 측정한 그래프이다. HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자로 형질 전환하기 전, 야생형 T-REx HEK293 세포주의 Hygromycin B에 대한 저항성 및 생존력을 확인하기 위한 것으로서, 0~600 ㎍/㎖ 사이의 상이한 Hygromycin B 농도에서 야생형 T-REx HEK293 세포를 배양하여 세포 생존력을 확인한 결과, 100 ㎍/㎖ 이상의 Hygromycin B를 처리할 경우 대부분의 세포가 사멸하는 것을 확인하였다.
상기의 결과를 바탕으로 형질 전환 이후 실험에서는 상기 농도의 Hygromycin B를 이용하여 형질 전환된 세포를 선별하였고, 배양과정에서도 동일한 농도를 사용하였다.
1-3. HA - CLC - Kb - Barttin ( Y98A )- Myc - YFP ( H148Q / I152L )- pcDNA5 / FRT / TO 플라스미드에 의한 형질전환 세포주 제작
HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L)-pcDNA5/FRT/TO 플라스미드를 이용하여 HA-CLC-Kb, Barttin(Y98A)-Myc, 그리고 YFP(H148Q/I152L)이 안정적으로 발현되는 T-REx HEK293 세포주를 다음과 같이 제작한다. 35-mm 배양접시에 1x106개의 야생형 T-REx HEK293 세포를 분주하여 37 ℃, 공기와 CO2가 95:5(%) 비율로 충전된 배양기에서 12시간 동안 배양한다. 배양 후, 도 2의 개열지도로 표시되는 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L)-pcDNA5/FRT/TO 플라스미드와 도 3의 개열지도로 표시되는 pOG44 플라스미드 및 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000)을 1:9:25의 비율 (HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L)-pcDNA5/FRT/TO 플라스미드 0.4 ㎍, pOG44 플라스미드 3.6 ㎍, Lipofectamine 10 ㎕)로 Opti-MEM에 섞은 혼합액을 배양접시에 넣어 세포주를 형질 전환시킨다. 또한, co-transfection하는 pOG44 플라스미드에 의한 Hygromycin B 저항성 획득을 확인하기 위해 pOG44 플라스미드와 Lipofectamine 2000을 1:2.5의 비율로 (pOG44 4 ㎍ , Lipofectamine 10 ㎕) 같은 조건 하에서 형질 전환시킨다. 6시간 후에 DMEM 배지(10% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin, 15 ㎍/㎖의 Blasticidin, 100 ㎍/㎖의 Zeocin)를 교환하고, 24시간 배양 후 같은 배지에 선별 항생제(selective antibiotics)인 100 ㎍/㎖의 하이그로마이신 B (Hygromycin B)를 첨가하여 저항성 있는 세포를 선택적으로 배양한다. 4주 동안 선택 배양을 통해 HA-CLC-Kb, Barttin(Y98A)-Myc, 그리고 YFP(H148Q/I152L)을 안정적으로 발현하는 세포주를 얻을 수 있다. pOG44 플라스미드로만 형질 전환한 세포는 대부분 사멸하므로 pOG44 플라스미드에 의한 Hygromycin B 저항성 획득은 없다고 할 수 있다. 상기 세포는 100 ㎍/㎖의 Hygromycin B로 선택 배양된 세포이므로 이후의 배지에는 해당 농도의 Hygromycin B를 첨가한다.
실시예 2. 테트라사이클린 유도발현 시스템의 확인
상기 실시예 1-3에 의해 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질 전환된 T-REx HEK293 세포에서 테트라사이클린에 의해 HA-CLC-Kb, Barttin(Y98A)-Myc, 그리고 YFP(H148Q/I152L)을 유도 발현하기 위해 다음과 같이 실험을 진행한다. 100-㎜ 배양접시에 5x106개의 세포를 분주하고, 24시간 후 테트라사이클린 유도 발현을 위해 기존의 배지를 제거하고 PBS로 1회 세척한 후, 새로운 배지에 6 ㎍/㎖의 doxycycline을 처리한다. 12시간 후 RT-PCR 방법으로 YFP mRNA 발현을, Western blot 방법으로 각각의 단백질 발현을, 그리고 형광 현미경으로 YFP 단백질 발현을 확인한다.
2-1. YFP mRNA 발현 확인을 위한 RT - PCR 방법
HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질 전환된 T-REx HEK293 세포에서 YFP mRNA 발현을 확인하기 위해 다음과 같이 실험을 진행한다. R&A-BLUE Total RNA Extraction Kit (Intron)를 이용하여 RNA를 추출한 후, Maxime RT PreMix Kit (Intron)를 이용하여 역전사(reverse transcription)을 수행한다. YFP의 cDNA 증폭을 위해 forward primer (5'-AAGTTCATCTGCACCACCG-3')와 reverse primer (5'-AGCTCAGGTAGTGGTTGTCG-3')를 제작하고 총 20 ㎕의 PCR reaction mixture (0.8 ㎍/㎕ RT product, HiPi Plus 5x PCR Master Mix, 10 pmol forward primer, 10 pmol reverse primer)로 PCR 반응을 수행한다. Negative control로 야생형 T-REx HEK293 세포 (N/C)를 사용하였고 positive control로 ß-actin primers (forward primer: 5'-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3', reverse primer: 5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3')를 이용하여 PCR 반응을 수행한다. 1.2% agarose gel에서 전기영동 (electrophoresis)으로 PCR 결과물 (YFP: 474 bp, ß-actin: 315 bp)을 확인한다.
도 5는 RT-PCR 방법으로 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주의 YFP(H148Q/I152L) mRNA의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
상기의 RT-PCR 실험을 통해 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질 전환시킨 6개 (1~6)의 서로 다른 T-REx HEK293 세포를 테스트한 결과, 예상되는 크기(474 bp)의 밴드가 형성된 1, 3, 4, 6번 세포에서 YFP mRNA가 발현되고 있음을 확인할 수 있었다.
2-2. Western blot 방법으로 HA - CLC - Kb 채널과 Barttin ( Y98A )- Myc , 그리고 YFP(H148Q/I152L) 단백질 각각의 개체로의 발현 확인
100-㎜ 배양 접시에 배양한 5x106개 세포를 Protease Inhibitor Cocktail (Sigma)이 첨가된 RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) 완충용액 (Cell Nest)에서 분쇄 (lysis) 시킨 후, BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific Pierce)를 이용하여 단백질을 정량한다. Gradi-Gel Gradient PAGE Analysis Kit (ELPiS)로 제작한 polyacrylamide gradient gel(10% running gel, 5% stacking gel)에 웰 당 50 ㎍의 단백질 시료를 로딩(loading)하여 200 V에서 35분 동안 전기영동 한다. 크기에 따라 분리된 단백질을 PVDF membrane으로 100 V에서 45분 동안 transfer시킨 후, PVDF membrane을 5% skim milk로 상온에서 2시간 동안 blocking한다. HA-CLC-Kb, Barttin-Myc, YFP 단백질에 각각 특이적으로 결합하는 HA antibody (F-7), c-Myc antibody (9E10), GFP antibody (B-2)(Santa Cruz Biotechnology)를 5% skim milk에 1:200 비율로 희석하여 4 ℃에서 약 12-16시간 동안 반응시킨다. 정량 및 positive control로 사용하는 ß-actin antibody (8H10D10) (Cell Signaling Technology)는 1:1,000 비율로 희석한다. Primary antibody host에 특이적으로 결합하는 anti-mouse IgG, HRP-linked antibody (Cell Signaling Technology)를 5% skim milk에 1:10,000 비율로 희석하여 상온에서 2시간 동안 반응시킨다. Secondary antibody에 tagged된 horseradish peroxidase를 Super Signal West Pico (c-Myc, ß-actin) 또는 Femto(HA, GFP) Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific)를 이용하여 검출한다.
도 6은 Western blot 방법으로 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질 전환된 T-REx HEK293 세포주에서 HA-CLC-Kb 채널, Barttin(Y98A)-Myc 및 YFP(H148Q/I152L) 단백질 각각의 개체로의 발현을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
이를 통해, 본 발명에 따른 세포주는 인간 CLC-Kb 채널 유전자와 인간 Barttin(Y98A), 그리고 형광 단백질 유전자가 각각 안정적으로 발현된다는 것을 확인할 수 있고, 따라서 CLC-Kb 채널에 선택적으로 작용하는 조절물질의 검색 효율을 증가시키고, CLC-Kb 채널의 신호전달에 관여하는 선택적 결합 단백질에 대한 연구시간을 단축할 수 있으며, 특히 염화 이온을 검출할 수 있는 형광 단백질을 함께 발현시킴으로써 형광 물질의 표지 없이도 고효율 검색이 가능하도록 하는 등, 본 발명에서 확립한 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) T-REx HEK293 세포주는 CLC-Kb 채널을 체계적으로 연구할 수 있는 토대를 제공할 수 있음을 알 수 있다.
2-3. YFP 단백질 발현 확인을 위한 형광 이미징 방법
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질 전환된 T-REx HEK293 세포주의 YFP(H148Q/I152L) 단백질의 발현을 형광측정한 결과를 나타낸 도면이다.
이를 통해, 본 발명에 따른 세포주는 염화 이온을 검출할 수 있는 형광 단백질을 함께 발현시킴으로써, 형광 물질의 표지 없이도 고효율 검색이 가능하다는 것을 알 수 있다.
실시예 3. 플레이트 리더를 이용한 CLC - Kb 채널 활성 측정 및 그에 따른 YFP 형광변화
형광 이미징 고효율 검색을 위해 사용한 기기는 미국 Molecular Devices 사의 FlexStation3이다. 이 기기는 파장 가변형 형광 리더와 pipettor를 결합하였고, 약물 이동 시스템 (compound transfer system)과 8 채널 또는 16 채널의 dispenser를 내장하여 세포 기반 고효율 검색에 최적화되어있다.
3-1. 플레이트 리더용 96-웰 플레이트 세포배양 조건
FlexStation3를 이용한 형광 이미징은 플레이트 아래에서 빛이 투과하는 방식으로 형광 측정이 가능한 96-웰 플레이트(Nunc)를 사용하여 실험한다. 활성검색 24시간 전에 폴리-L-라이신(0.05 ㎎/㎖)이 처리된 96-웰 플레이트에 웰 당 6 ㎍/㎖의 doxycycline으로 발현이 유도된 1x105개 세포를 분주하고 37 ℃, 습한 조건의 95% 공기와 5% CO2 배양기에서 배양한다. 실험 당일 96-웰 플레이트에 부착된 세포를 염화 이온이 글루코네이트로 치환된 HBSS-HEPES 완충용액 (150 mM Na-Gluconate, 5 mM KCl, 0.5 mM CaCl2, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4)에서 세척한 후 최종 부피를 108 ㎕로 맞춘다.
3-2. 플레이트 리더를 이용한 CLC - Kb 채널 활성측정
세포주에서 CLC-Kb 채널과 같이 발현하며 세포내 요오드 이온의 농도에 민감한 YFP(H148Q/I152L)을 이용하여 CLC-Kb 채널 활성에 따른 YFP 형광을 측정한다. 구체적으로 FlexStation3에 장착된 제논램프 광원에서 시료의 excitation에 필요한 485-㎚ 파장을 선택적으로 세포에 노출시킨다. 515-㎚ cut-off 조건에서 매 30초 간격으로 방출 형광 (emitter fluorescence light)을 96 웰 각각에 대해 520-㎚ 파장에서 측정한다. 데이터 분석은 Molecular Devices 사에서 제공한 FlexStation3 전용 프로그램을 이용한다. 세포가 준비된 96-웰 플레이트 외에 상이한 농도의 요오드 이온을 포함한 96-웰 약물 플레이트를 준비한다. FlexStation3의 경우 약물 주입 시스템은 있지만 흡입 시스템은 없기 때문에 5배로 농축된 요오드 이온을 HBSS-HEPES 완충용액에 27 ㎕ 준비하여 최종 부피 135 ㎕(배양세포 108 ㎕ + 5배 요오드 이온 27 ㎕)에서 측정한다. 2분 pre-reading 후 0~100 mM 사이의 상이한 농도로 준비한 요오드 이온을 96-웰 플레이트에서 배양한 세포에 처리하고 40분 동안 CLC-Kb 채널 활성에 의한 YFP 형광 시그널을 구한다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주의 요오드 이온의 농도에 따른 YFP(H148Q/I152L)의 형광 측정 결과를 나타낸 그래프이다. RFU (Relative Fluorescence Unit)는 485-nm excitation 파장과 520-nm emission 파장에서 측정한 형광 세기를 나타내며, 도 8a를 통해 세포 밖 요오드 이온의 농도가 높아질수록 CLC-Kb 채널에 의한 요오드 이온의 세포 내 유입이 증가하고 결과적으로 YFP 형광이 소광(quenching) 된다는 것을 알 수 있다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) 유전자가 형질전환된 T-REx HEK293 세포주의 요오드 이온의 농도에 따른 CLC-Kb 채널의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 이를 통해, 본 발명을 통해 확립된 HA-CLC-Kb-Barttin(Y98A)-Myc-YFP(H148Q/I152L) T-REx HEK293 세포주는 요오드 이온에 대하여 농도 의존성을 가짐을 알 수 있다.
한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC) KCTC18307P 20140620
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Cell line for cell-based high-throughput screening of CLC-Kb channel modulators using YFP fluorescence imaging and broad-spectrum studies of CLC-Kb channels <130> HPC-5242 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2061 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggaggagt ttgtggggct gcgtgaaggc tcctcaggga accctgtgac tctgcaggag 60 ctgtggggcc cctgtcccct catccgccga ggcatccgag gtggcctgga gtggctgaag 120 cagaagctct tccgcctggg cgaggactgg tacttcctga tgaccctcgg ggtgctcatg 180 gccctggtca gctgtgccat ggacttggct gttgagagtg tggtccgagc gcaccagtgg 240 ctgtatcgcg agattgggga cagccacctg ctccggtatc tctcctggac tgtgtaccct 300 gtggccctcg tctctttctc ttcgggcttc tctcagagca tcacaccctc ctctggaggt 360 tctggaatcc cggaggtgaa gaccatgttg gcgggtgtgg tcttggagga ctacctggat 420 atcaagaact ttggggccaa agtggtgggc ctctcctgca ccctggcctg tggcagcacc 480 ctcttcctcg gcaaagtggg ccctttcgtg cacctgtctg tgatgatggc tgcctacctg 540 ggccgtgtgc gcaccacgac catcggggag cctgagaaca agagcaagca 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1440 accatctcca cggcgctgct ggccttcgag gtgaccggcc agatagtaca tgcactgccc 1500 gtgctgatgg cggtgctggc agccaacgcc attgcacaga gctgccagcc ctccttctat 1560 gatggcaccg tcattgtcaa gaagctgcca tacctgccac ggattctggg ccgcaacatc 1620 ggatcccacc gcgtgagggt ggagcacttc atgaaccaca gcatcaccac actggccaag 1680 gacacgccac tggaggaggt ggtcaaggtt gtgacctcca cagacgtggc cgagtatccc 1740 ttggtggaga gcacagagtc ccagatcctg gtgggcatag tgcgaagggc ccagctggtg 1800 caggccctga aggctgagcc tccttcctgg gctcctggac accagtgtct ccaggacatc 1860 ttggctgcag gctgccccac agaaccagtg accctgaagc tgtccccaga gacttccctg 1920 catgaggcac acaacctctt tgagctgttg aaccttcatt ccctctttgt gacgtcgcgg 1980 ggcagagctg tgggctgcgt gtcctgggtg gagatgaaga aagcaatttc caacctgaca 2040 aatccgccag ccccaaagtg a 2061 <210> 2 <211> 686 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Glu Phe Val Gly Leu Arg Glu Gly Ser Ser Gly Asn Pro Val 1 5 10 15 Thr Leu Gln Glu Leu Trp Gly Pro Cys Pro Leu Ile Arg Arg Gly Ile 20 25 30 Arg Gly Gly Leu Glu Trp Leu Lys Gln Lys Leu Phe Arg Leu Gly Glu 35 40 45 Asp Trp Tyr Phe Leu Met Thr Leu Gly Val Leu Met Ala Leu Val Ser 50 55 60 Cys Ala Met Asp Leu Ala Val Glu Ser Val Val Arg Ala His Gln Trp 65 70 75 80 Leu Tyr Arg Glu Ile Gly Asp Ser His Leu Leu Arg Tyr Leu Ser Trp 85 90 95 Thr Val Tyr Pro Val Ala Leu Val Ser Phe Ser Ser Gly Phe Ser Gln 100 105 110 Ser Ile Thr Pro Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ile Pro Glu Val Lys Thr 115 120 125 Met Leu Ala Gly Val Val Leu Glu Asp Tyr Leu Asp Ile Lys Asn Phe 130 135 140 Gly Ala Lys Val Val Gly Leu Ser Cys Thr Leu Ala Cys Gly Ser Thr 145 150 155 160 Leu Phe Leu Gly Lys Val Gly Pro Phe Val His Leu Ser Val Met Met 165 170 175 Ala Ala Tyr Leu Gly Arg Val Arg Thr Thr Thr Ile Gly Glu Pro Glu 180 185 190 Asn Lys Ser Lys Gln Asn Glu Met Leu Val Ala Ala Ala Ala Val Gly 195 200 205 Val Ala Thr Val Phe Gly Ala Pro Phe Ser Gly Val Leu Phe Ser Ile 210 215 220 Glu Val Met Ser Ser His Phe Ser Val Trp Asp Tyr Trp Arg Gly Phe 225 230 235 240 Phe Ala Ala Thr Cys Gly Ala Phe Met Phe Arg Leu Leu Ala Val Phe 245 250 255 Asn Ser Glu Gln Glu Thr Ile Thr Ser Leu Tyr Lys Thr Ser Phe Arg 260 265 270 Val Asp Val Pro Phe Asp Leu Pro Glu Ile Phe Phe Phe Val Val Leu 275 280 285 Gly Gly Leu Cys Gly Ile Leu Gly Ser Ala Tyr Leu Phe Cys Gln Arg 290 295 300 Ile Phe Phe Gly Phe Ile Arg Asn Asn Arg Phe Ser Ser Lys Leu Leu 305 310 315 320 Ala Thr Ser Lys Pro Val Tyr Ser Ala Leu Ala Thr Leu Val Leu Ala 325 330 335 Ser Ile Thr Tyr Pro Pro Ser Ala Gly Arg Phe Leu Ala Ser Arg Leu 340 345 350 Ser Met Lys Gln His Leu Asp Ser Leu Phe Asp Asn His Ser Trp Ala 355 360 365 Leu Met Thr Gln Asn Ser Ser Pro Pro Trp Pro Glu Glu Leu Asp Pro 370 375 380 Gln His Leu Trp Trp Glu Trp Tyr His Pro Arg Phe Thr Ile Phe Gly 385 390 395 400 Thr Leu Ala Phe Phe Leu Val Met Lys Phe Trp Met Leu Ile Leu Ala 405 410 415 Thr Thr Ile Pro Met Pro Ala Gly Tyr Phe Met Pro Ile Phe Val Tyr 420 425 430 Gly Ala Ala Ile Gly Arg Leu Phe Gly Glu Thr Leu Ser Phe Ile Phe 435 440 445 Pro Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Ile Thr Asn Pro Ile Met Pro Gly 450 455 460 Gly Tyr Ala Leu Ala Gly Ala Ala Ala Phe Ser Gly Ala Val Thr His 465 470 475 480 Thr Ile Ser Thr Ala Leu Leu Ala Phe Glu Val Thr Gly Gln Ile Val 485 490 495 His Ala Leu Pro Val Leu Met Ala Val Leu Ala Ala Asn Ala Ile Ala 500 505 510 Gln Ser Cys Gln Pro Ser Phe Tyr Asp Gly Thr Val Ile Val Lys Lys 515 520 525 Leu Pro Tyr Leu Pro Arg Ile Leu Gly Arg Asn Ile Gly Ser His Arg 530 535 540 Val Arg Val Glu His Phe Met Asn His Ser Ile Thr Thr Leu Ala Lys 545 550 555 560 Asp Thr Pro Leu Glu Glu Val Val Lys Val Val Thr Ser Thr Asp Val 565 570 575 Ala Glu Tyr Pro Leu Val Glu Ser Thr Glu Ser Gln Ile Leu Val Gly 580 585 590 Ile Val Arg Arg Ala Gln Leu Val Gln Ala Leu Lys Ala Glu Pro Pro 595 600 605 Ser Trp Ala Pro Gly His Gln Cys Leu Gln Asp Ile Leu Ala Ala Gly 610 615 620 Cys Pro Thr Glu Pro Val Thr Leu Lys Leu Ser Pro Glu Thr Ser Leu 625 630 635 640 His Glu Ala His Asn Leu Phe Glu Leu Leu Asn Leu His Ser Leu Phe 645 650 655 Val Thr Ser Arg Gly Arg Ala Val Gly Cys Val Ser Trp Val Glu Met 660 665 670 Lys Lys Ala Ile Ser Asn Leu Thr Asn Pro Pro Ala Pro Lys 675 680 685 <210> 3 <211> 963 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atggctgacg agaagacctt ccggatcggc ttcattgtgc tggggctttt cctgctggcc 60 ctcggtacgt tcctcatgag ccatgatcgg ccccaggtct acggcacctt ctatgccatg 120 ggcagcgtca tggtgatcgg gggcatcatc tggagcatgt gccagtgcta ccccaagatc 180 accttcgtcc ctgctgactc tgactttcaa ggcatcctct ccccaaaggc catgggcctg 240 ctggagaatg ggcttgctgc cgagatgaag agccccagtc cccagccgcc cgctgtaagg 300 ctgtgggagg aagccgccta tgaccagagc ctgcctgact tcagccacat ccagatgaaa 360 gtcatgagct acagtgagga ccaccgctcc ttgctggccc ctgagatggg gcagccgaag 420 ctgggaacca gtgatggagg agaaggtggc cctggcgacg ttcaggcctg gatggaggct 480 gccgtggtca tccacaaggg ctcagacgag agtgaagggg aaagacgcct aactcagagc 540 tggcccggcc ccctggcctg tccccagggc cctgccccct tggcttcctt ccaagatgac 600 ctggacatgg actccagtga aggcagcagc cccaatgcat ctccacatga cagggaggaa 660 gcttgttccc cacaacagga acctcagggc tgcaggtgcc cgctggaccg cttccaagac 720 tttgccctga ttgatgcccc aacgttggag gatgagcccc aagaggggca gcagtgggaa 780 atagccctgc ccaacaactg gcagcggtac ccaaggacaa aggtggagga gaaggaggct 840 tcggacacag gtggggagga acctgagaag gaagaggaag acctgtacta tgggctgcca 900 gatggagccg gggacctcct cccggacaag gagctgggtt ttgagcctga cacccaaggc 960 tga 963 <210> 4 <211> 320 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Asp Glu Lys Thr Phe Arg Ile Gly Phe Ile Val Leu Gly Leu 1 5 10 15 Phe Leu Leu Ala Leu Gly Thr Phe Leu Met Ser His Asp Arg Pro Gln 20 25 30 Val Tyr Gly Thr Phe Tyr Ala Met Gly Ser Val Met Val Ile Gly Gly 35 40 45 Ile Ile Trp Ser Met Cys Gln Cys Tyr Pro Lys Ile Thr Phe Val Pro 50 55 60 Ala Asp Ser Asp Phe Gln Gly Ile Leu Ser Pro Lys Ala Met Gly Leu 65 70 75 80 Leu Glu Asn Gly Leu Ala Ala Glu Met Lys Ser Pro Ser Pro Gln Pro 85 90 95 Pro Ala Val Arg Leu Trp Glu Glu Ala Ala Tyr Asp Gln Ser Leu Pro 100 105 110 Asp Phe Ser His Ile Gln Met Lys Val Met Ser Tyr Ser Glu Asp His 115 120 125 Arg Ser Leu Leu Ala Pro Glu Met Gly Gln Pro Lys Leu Gly Thr Ser 130 135 140 Asp Gly Gly Glu Gly Gly Pro Gly Asp Val Gln Ala Trp Met Glu Ala 145 150 155 160 Ala Val Val Ile His Lys Gly Ser Asp Glu Ser Glu Gly Glu Arg Arg 165 170 175 Leu Thr Gln Ser Trp Pro Gly Pro Leu Ala Cys Pro Gln Gly Pro Ala 180 185 190 Pro Leu Ala Ser Phe Gln Asp Asp Leu Asp Met Asp Ser Ser Glu Gly 195 200 205 Ser Ser Pro Asn Ala Ser Pro His Asp Arg Glu Glu Ala Cys Ser Pro 210 215 220 Gln Gln Glu Pro Gln Gly Cys Arg Cys Pro Leu Asp Arg Phe Gln Asp 225 230 235 240 Phe Ala Leu Ile Asp Ala Pro Thr Leu Glu Asp Glu Pro Gln Glu Gly 245 250 255 Gln Gln Trp Glu Ile Ala Leu Pro Asn Asn Trp Gln Arg Tyr Pro Arg 260 265 270 Thr Lys Val Glu Glu Lys Glu Ala Ser Asp Thr Gly Gly Glu Glu Pro 275 280 285 Glu Lys Glu Glu Glu Asp Leu Tyr Tyr Gly Leu Pro Asp Gly Ala Gly 290 295 300 Asp Leu Leu Pro Asp Lys Glu Leu Gly Phe Glu Pro Asp Thr Gln Gly 305 310 315 320 <210> 5 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vectors <400> 5 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccttcggcta cggcctgcag tgcttcgccc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccagaac gtctatctga tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagct accagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720 720 <210> 6 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Yellow Fluorescence Protein <400> 6 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Phe Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser Gln Asn Val Tyr Leu Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 7 <211> 54 <212> DNA <213> Thoseaasigna virus 2A <400> 7 gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54 <210> 8 <211> 18 <212> PRT <213> Thoseaasigna virus 2A <400> 8 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Equine rhinitis A virus 2A <400> 9 caatgtacta actacgcttt gttgaaactc gctggcgatg ttgaaagtaa ccccggtcct 60 60 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> Equine rhinitis A virus 2A <400> 10 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA tag <400> 11 tacccttacg atgttccaga ttacgct 27 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> c-MYC tag <400> 12 gagcagaaac tcatctctga agaggatctg 30

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  9. (a) 서열번호 11로 표시되는 HA 태그 유전자, 서열번호 1로 표시되는 염화 이온 채널-Kb(CLC-Kb)을 코딩하는 유전자, 서열번호 7로 표시되는 2A 유전자, 서열번호 3으로 표시되는 Barttin(Y98A)를 코딩하는 유전자, 서열번호 12로 표시되는 c-MYC 태그 유전자, 서열번호 9로 표시되는 2A 유전자 및 서열번호 5로 표시되는 노란색 형광단백질(YFP(H148Q/I152L)) 유전자를 순차적으로 하나의 유전자로 결합하고, 이를 포함하는 플라스미드로 테트라사이클린-조절 발현 인간 신장 배아 세포주(Tetracycline-Regulated Expression Human Embryonic Kidney cell line, T-REx HEK293)에서 형질 전환시킨 수탁번호 KCTC18307P로 기탁된 세포주를 웰 플레이트에서 배양하는 단계;
    (b) 상기 웰 플레이트에 부착된 배양된 세포주를 염화 이온이 글루코네이트로 치환된 완충용액으로 세척하는 단계;
    (c) 상기 세척된 세포주에 요오드 이온 및 염화 이온 채널-Kb(CLC-Kb) 조절 후보물질을 주입하는 단계; 및
    (d) 요오드 이온의 세포 내 유입에 따른 노란색 형광의 소광을 측정하는 단계;를 포함하는 염화 이온 채널-Kb(CLC-Kb) 조절물질의 탐색방법.
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