WO2015133611A1 - 標的タンパク質の量の低減のためのポリペプチド、単離された核酸、組み換えベクター、及び形質転換体 - Google Patents

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plasmid
polypeptide
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秀峰 鳥越
桜子 立澤
雅正 森
百合香 小林
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide for reducing the amount of a target protein, an isolated nucleic acid, a recombinant vector, and a transformant.
  • Diseases such as cancer are mainly caused by mutated proteins produced by mutations in genes introduced congenitally or by an external environment.
  • a technique for artificially suppressing the expression of a mutant protein has attracted attention.
  • Examples of techniques for artificially suppressing the expression of a target protein such as a mutant protein include an anti-gene method for suppressing gene expression at the transcriptional stage and an antisense method for suppressing protein expression at the translational stage (non- Patent Documents 1 and 2).
  • transcription and translation of a gene downstream from the binding site of the oligonucleotide is performed by adding the oligonucleotide from outside the cell and binding the oligonucleotide to DNA or mRNA encoding the target protein. Is a technique for inhibiting the expression of target proteins.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide a technique for specifically reducing the amount of a target protein.
  • the fusion protein in which a binding motif of a specific molecular chaperone involved in chaperone-mediated autophagy is added to a protein that specifically binds to a target protein, the fusion protein is bound to the target protein. Since the target protein can be specifically bound and degraded in the lysosome, the amount of the target protein can be specifically reduced, and the present invention has been completed. More specifically, the present invention provides the following.
  • a protein region comprising an amino acid sequence that specifically binds to a target protein; An amino acid sequence that binds to Hsc70; A polypeptide comprising an amino acid sequence containing at least
  • polypeptide according to any one of (1) to (3), comprising a plurality of amino acid sequences that bind to the Hsc70.
  • a recombinant vector comprising the nucleic acid according to (6).
  • a transformant comprising the recombinant vector according to (7) and being an isolated cell or non-human animal.
  • a technique for specifically reducing the amount of target protein is provided.
  • the present invention provides a polypeptide comprising an amino acid sequence including at least a protein region containing an amino acid sequence that specifically binds to a target protein and an amino acid sequence that binds to Hsc70.
  • the present invention uses a chaperone-mediated autophagy action via binding between an amino acid sequence that binds to Hsc70 and a heat shock-related protein Hsc70, and transports the target protein bound to the protein region to the lysosome. This technique reduces the amount of target protein by degrading the protein with a protease.
  • amino acid sequence binding to Hsc70 is a sequence containing a KFERQ-like sequence (also referred to as “Hsc70 binding motif (Hsc70bm)”) for the heat shock-related protein Hsc70, which is a molecular chaperone.
  • Hsc70bm region a region containing an amino acid sequence that binds to Hsc70.
  • the amino acid sequence that binds to Hsc70 is not particularly limited, and examples include the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 (animal species: human) and SEQ ID NO: 17 (animal species: human).
  • the animal species from which the amino acid sequence that binds to Hsc70 is derived is not particularly limited, and “Proc. Am. Thorac. Soc. (2010) Vol. 7, pp. 29-39” or “Autophagy (2007) 3, 295- Binding motifs defined in the literature such as 299 "can be used.
  • an amino acid sequence having 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more sequence identity with the amino acid sequence of the amino acid sequence that binds to Hsc70 can also be used.
  • the Hsc70bm region may be a region consisting of an amino acid sequence that binds to Hsc70, but may contain a spacer sequence or the like.
  • the Hsc70bm region may contain one or more amino acid sequences that bind to Hsc70.
  • the amino acid sequences may be bound in tandem or separated via a spacer sequence.
  • the length of the spacer sequence may be 10-20 amino acids.
  • the arrangement of the amino acid sequence that binds to Hsc70 in the Hsc70bm region is not particularly limited, but when the Hsc70bm region includes a plurality of amino acid sequences that bind to Hsc70, the amino acid sequence that binds to Hsc70 and Hsc70 are likely to bind. From this point, it is preferable to arrange the amino acid sequence at both ends of the Hsc70bm region.
  • a protein comprising an amino acid sequence that binds to Hsc70 specifically binds to Hsc70 via an amino acid sequence that binds to Hsc70, and then the complex of the protein and Hsc70 is a lysosome that is a field of proteolysis in cells.
  • Such protein degradation action through binding to Hsc70 is referred to as “chaperone-mediated autophagy action”.
  • the inventors of the present invention have arrived at the present invention by paying attention to target protein degradation utilizing chaperone-mediated autophagy action based on specific binding between Hsc70bm and Hsc70. That is, when a fusion protein in which an Hsc70bm region is added to a protein region containing an amino acid sequence that specifically binds to an arbitrary target protein (that is, a polypeptide in the present invention) is expressed in a cell, the fusion protein Binds to the target protein through the region.
  • the fusion protein bound to the target protein binds to intracellular Hsc70 via the Hsc70bm region, is transported to the lysosome, and the above-described chaperone-mediated autophagy action.
  • the target protein is degraded along with the fusion protein. Since target proteins that are degraded by chaperone-mediated autophagy are limited to those that specifically bind to the protein region to which the Hsc70bm region has been added, according to the present invention, the amount of the target protein can be specifically reduced. .
  • the polypeptide of the present invention may contain one or a plurality of Hsc70bm regions.
  • the polypeptide of the present invention can be more specifically bound to Hsc70.
  • the plurality of Hsc70bm regions may be bound in tandem, or may be separated via a protein region or other sequences.
  • the polypeptide of the present invention may contain an amino acid sequence called SUMO-interacting motif (SIM) together with the Hsc70bm region.
  • SIM is a sequence that specifically binds to “SUMO”, which is a small protein that binds to a SUMOylated protein that is one type of post-translational modification.
  • SUMO SUMO-interacting motif
  • the etiology of colorectal cancer is that a complex formed by binding ⁇ -catenin accumulated in the Wnt signaling pathway to T-cell factor-4 (TCF4), which is a transcription factor, binds to the upstream sequence of the target gene. It is known to be adenoma formation caused by activating transcription of the target gene.
  • TCF4 T-cell factor-4
  • RanBP2 a SUMO E3 ligase, forms a complex with TCF4, thereby summing TCF4 and increasing the binding affinity between TCF4 and ⁇ -catenin.
  • TCF4 subjected to SUMO modification can be specifically transported to the lysosome and degraded, so that a complex of TCF4 and ⁇ -catenin As a result, it is expected that the transcription of the target gene is suppressed and the growth of colon cancer cells can be inhibited.
  • Whether or not the amount of the target protein has been specifically reduced by the polypeptide of the present invention can be determined by detecting the amount of the target protein or the amount of the protein region by known immunostaining or the like. When a target protein or a degradation product of the protein region is observed, it can be determined that the amount of the target protein is specifically reduced.
  • the protein region in the present invention is not particularly limited as long as it includes an amino acid sequence that binds to an arbitrary target protein.
  • a Tpp1 region for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, or the sequence of SEQ ID NO: 9 and 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more
  • Amino acid sequence with identity for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, or the sequence of SEQ ID NO: 9 and 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more
  • Amino acid sequence with identity for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, or the sequence of SEQ ID NO: 9 and 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more
  • Amino acid sequence with identity for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, or the sequence of SEQ ID NO: 9 and 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more
  • the Tpp1 region may be the full-length sequence of Tpp1, but may be a partial sequence.
  • human Tpp1 full length 544 amino acids
  • mouse Tpp1 full length 416 amino acids
  • E168, E169, E171, R180, L183, L212, and E215 are particularly important for binding to telomerase.
  • the Tpp1 region is a protein that specifically binds to telomerase or telomere-binding protein (such as Tin2) that is a telomere elongation enzyme. That is, when the protein region is a Tpp1 region, the “target protein” is telomerase or a telomere-binding protein (such as Tin2).
  • the target protein is telomerase or a telomere-binding protein (such as Tin2).
  • telomerase is expressed, and in normal cells, telomeres that are shortened at each cell division are elongated, and the cells are permanently divided. Therefore, it is expected that cancer or the like can be treated by degrading the target protein telomerase with the polypeptide of the present invention.
  • telomere-binding protein which is the target protein
  • polypeptide of the present invention it is expected that the binding between the telomere-binding protein and telomerase will be lost, the telomerase will not be recruited to telomeres, and cancer can be treated.
  • the “target protein” is an antigen protein against the antibody.
  • the “target protein” is a substrate protein of the enzyme.
  • the “target protein” is a glycoprotein corresponding to the lectin.
  • the “target protein” is a hormone (peptide, protein, glycoprotein, etc.) corresponding to the receptor, or a signal transduction protein.
  • the “target protein” is a signal transduction protein related to the protein.
  • the “target protein” is an RNA polymerase and / or a transcription control factor corresponding to the factor.
  • the “target protein” is a histone-related protein (histone modifying enzyme, histone demodifying enzyme, histone-binding protein, histone chaperone) related to the histone.
  • the “target protein” is another protein constituting the complex.
  • the amino acid sequence of the protein region may be derived from any animal species. Examples of animal species include mouse, human, rat, guinea pig and the like.
  • the N-terminus of the Hsc70bm region may be arranged on the C-terminal side of the protein region, or the N-terminus of the protein region is arranged on the C-terminal side of the Hsc70bm region. It may be.
  • a small fragment of an amino acid sequence such as a linker sequence and / or a spacer sequence may be interposed between the protein region and the Hsc70bm region (between the protein region and the amino acid sequence that binds to Hsc70).
  • the polypeptide of the present invention can be more efficiently bound to Hsc70 or a target protein.
  • linker sequence examples include those having a restriction enzyme site and those expressing a fluorescent protein.
  • the length of the linker sequence may be 10 to 200 amino acids.
  • the spacer sequence is not particularly limited, but may be 5 to 30 amino acids. When the spacer sequence is 10 to 20 amino acids, the polypeptide of the present invention tends to be more efficiently bound to Hsc70 or a target protein.
  • a known tag peptide such as an HA tag, Myc tag, or His tag may be added to any site of the polypeptide of the present invention. By adding these tags, it is possible to easily detect the expression of the polypeptide of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by a gene recombination technique known in the technical field to which the present invention belongs. For example, by incorporating a nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention into a vector and introducing the vector into cells (such as HEK293 cells derived from human kidney), Escherichia coli, etc., it can be expressed in large quantities as a polypeptide.
  • a nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention into a vector and introducing the vector into cells (such as HEK293 cells derived from human kidney), Escherichia coli, etc., it can be expressed in large quantities as a polypeptide.
  • An isolated nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention can be prepared by a genetic recombination technique known in the technical field to which the present invention belongs.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide of the present invention can be obtained by ligating a nucleic acid encoding a protein region cloned by PCR or the like, or a nucleic acid encoding an Hsc70bm region by creating a primer from amino acid sequence information. Can be separated.
  • nucleic acid used in the present specification includes DNA, RNA and the like.
  • a recombinant vector containing an isolated nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention can be prepared by a gene recombination technique known in the technical field to which the present invention belongs. For example, it can be prepared by cleaving any plasmid with any restriction enzyme and binding an isolated nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention to the cleavage site.
  • the term “recombinant vector” refers to DNA used to transport heterologous DNA in recombinant DNA experiments and the like.
  • the recombinant vector of the present invention include, for example, a DNA fragment expressing the polypeptide of the present invention, a cloning vector having an arbitrary restriction enzyme recognition site, an arbitrary replication origin, etc., and a DNA fragment expressing the polypeptide of the present invention. And an expression vector having a transcription initiation point and the like.
  • a transformant containing the above recombinant vector can be prepared by a gene recombination technique known in the technical field to which the present invention belongs.
  • the term “transformant” as used herein is an isolated cell or non-human animal.
  • the cells are not particularly limited, and any cell line (for example, HEK293 cells derived from human kidney) can be used.
  • it does not specifically limit as a non-human animal, Escherichia coli, mammals (a mouse
  • the transformant of the present invention can be obtained, for example, by introducing a recombinant vector into an isolated cell by electroporation method, lipofection method, virus or the like.
  • a transformant of a non-human animal can be obtained by performing DNA microinjection into the pronucleus of a fertilized egg of a non-human animal, homologous recombination into an ES cell, infection with a recombinant virus, or the like.
  • Table 2 shows the entire base sequence and all amino acid sequences of mouse Tpp1 (hereinafter referred to as “mTpp1”) used for the preparation of the plasmid.
  • Table 3 shows the entire base sequence and all amino acid sequences of the Hsc70bm region used for the preparation of the plasmid.
  • the obtained reaction solution was treated with DpnI and then introduced into E. coli XL10-Gold to obtain a plurality of clones.
  • the clone (pGADT7-mTpp1 (1-416)) and pcDNA3.1 / mycHisC vector (Invitrogen, this vector corresponds to an expression vector) were digested with EcoRI and NotI, and the resulting DNA fragment was ligated high ver. . 2 (TOYOBO) was ligated and introduced into E. coli DH5 ⁇ to obtain a plurality of clones.
  • Plasmid DNA was prepared using the clone to obtain pcDNA3.1 / mycHisC-mTpp1 plasmid.
  • FIG. 1 A plasmid was prepared using the clone to obtain a Tpp1-Hsc70bm ( ⁇ ) HA plasmid.
  • “5aa” and “6aa” each represent a spacer sequence.
  • the sequence of “5aa” is AAARG (SEQ ID NO: 18), and the sequence of “6aa” is AGAAAAP (SEQ ID NO: 19).
  • Tpp1-Hsc70bm (+) HA plasmid Using Tpp1-Hsc70bm (-) HA plasmid as a template, QuikChange Lightning Multi-enzyme blend (Agilent Technologies), using the primers shown in Table 1 (mTPppAtagHsc70bmF) at 95 ° C for 2 minutes at 95 ° C for 2 minutes. Amplified by PCR with heat denaturation for 20 seconds, annealing at 55 ° C. for 30 seconds, extension at 65 ° C. for 4 minutes) ⁇ 30 cycles, (95 ° C. for 2 minutes) ⁇ 1 cycle.
  • Table 1 mTPppAtagHsc70bmF
  • a plasmid obtained by cloning a gene containing the HA tag sequence between mTpp1 and Hsc70bm was obtained by cloning a gene containing the HA tag sequence between mTpp1 and Hsc70bm.
  • the obtained reaction solution was treated with DpnI and then introduced into Escherichia coli XL10-Gold to obtain a plurality of clones.
  • a plasmid was prepared using the clone to obtain a Tpp1-Hsc70bm (+) HA plasmid.
  • the structure of the gene inserted into the Tpp1-Hsc70bm (+) HA plasmid is shown in FIG. 1 (B).
  • “12aa” and “6aa” each represent a spacer sequence.
  • the sequence of “12aa” is AAARGYDVPDYA (SEQ ID NO: 20), and the sequence of “6aa” is AGAAAP.
  • FIG. 1 A plasmid was prepared using the clone to obtain a Tpp1-Hsc70bm3 plasmid.
  • the structure of the gene inserted into the Tpp1-Hsc70bm3 plasmid is shown in FIG. 1 (C).
  • “5aa” and “6aa” each represent a spacer sequence.
  • the sequence of “5aa” is AAARG, and the sequence of “6aa” is AGAAAP.
  • composition of the cell culture medium used for the passage of 293T cells is as follows.
  • the transfection medium used in the transfection is Opti-MEM TM I (1 ⁇ ) + GlutaMAX TM -I (Gibco).
  • Cell preparation method The 293T cells stored in liquid nitrogen were allowed to stand for 5 minutes in a room temperature water bath and thawed. 9 ml of cell culture medium and 1 ml of cell solution were mixed, centrifuged at 3000 rpm for 2 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed to prepare a cell pellet. The pellet was suspended by adding 10 ml of a cell culture medium, seeded on a 100 mm ⁇ 20 mm cell dish, and cultured at 5.0% CO 2 and 37 ° C.
  • ⁇ Protein extraction from cells Wash the cells twice with PBS buffer, add 200 ⁇ l / well of M-PER (Mammalian Protein Extraction Reagent, Thermo SCIENTIFIC) (50 ⁇ l / well when adding autophagy inhibitor described later), and pipet the cells. It was crushed. The crushed material was put into a tube and reacted for 5 minutes in a small rotary incubator, and then centrifuged at 14,000 g for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant other than the pellet was recovered as the extracted protein.
  • M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent, Thermo SCIENTIFIC
  • composition of each buffer and gel is as follows.
  • composition of each buffer is as follows.
  • Example 1 Examination of decomposition efficiency of mTpp1>
  • a fusion protein containing the mTpp1 region and the Hsc70bm region When expressed, the Hsc70bm region and the molecular chaperone Hsc70 are bound, and the conjugate is transported to the lysosome by the action of chaperone-mediated autophagy.
  • the conjugate is degraded by proteases in lysosomes. Therefore, whether chaperone-mediated autophagy has occurred can be confirmed by detecting a degradation product of mTpp1. Therefore, in this example, in order to examine whether chaperone-mediated autophagy occurs, according to the following method, a degradation product of mTpp1 expressed using each plasmid prepared above was detected, The decomposition efficiency was calculated.
  • the medium is either (1) cell culture medium only, (2) cell culture medium and 50 mM NH 4 Cl, or (3) cell culture medium, 15 mM NH 4 Cl and 100 ⁇ M chloroquine.
  • Exchanged. NH 4 Cl and chloroquine are both chaperone-mediated autophagy inhibitors.
  • the protein extracted by the above method was separated by SDS-PAGE using 200 ⁇ l of M-PER, and after Western blotting, the protein was detected by immunostaining. The result is shown in FIG. Note that ⁇ -actin was used as an internal standard.
  • the leftmost lane is the result of using mTpp1 (ie, a protein not containing Hsc70bm) expressed using pcDNA3.1 / mycHisC-mTpp1 plasmid.
  • the rightmost lane is the result of using a protein expressed using the pcDNA3.1 / mycHisC vector (expression vector) (that is, a protein not containing mTpp1 and Hsc70bm).
  • lanes 1 to 3 on the left side show the results of using the Tpp1-Hsc70bm ( ⁇ ) HA plasmid and using the medium of any of (1) to (3) above.
  • lanes 1 to 3 in the middle show the results of using the Tpp1-Hsc70bm (+) HA plasmid and using any one of the above media (1) to (3).
  • lanes 1 to 3 on the right side show the results of using the Tpp1-Hsc70bm3 plasmid and using the medium of any of (1) to (3) above.
  • MTpp1 degradation efficiency was determined by dividing the total band intensity of “Tpp1 degradation products” in each lane of FIG. 2B by the total band intensity excluding endogenous proteins. The result is shown in FIG.
  • any of the plasmids Tpp1-Hsc70bm ( ⁇ ) HA, Tpp1-Hsc70bm (+) HA and Tpp1-Hsc70bm3 can be used.
  • the degradation efficiency of mTpp1 was high (23.5%, 30.5%, 33.0%, respectively).
  • the degradation efficiency of mTpp1 was low. In the lane, it can be seen that autophagy was inhibited and mTpp1 was not degraded. That is, it can be seen that the degradation of mTpp1 observed in each lane 1 of FIGS. 2A and 2B is due to chaperone-mediated autophagy.
  • Example 2 Study on chaperone-mediated autophagy action>
  • Example 1 Study on chaperone-mediated autophagy action>
  • the medium was changed to (1) cell culture medium only, (2) cell culture medium and 10 mM or 50 mM 3-MA, (3) cell culture medium and 5 ⁇ M or 50 ⁇ M.
  • 3-MA (3-methyladenine) is a macroautophagy inhibitor.
  • MG132 is a ubiquitin / proteasome degradation system inhibitor.
  • Tpp1 is a result of using mTpp1 (ie, a protein not containing Hsc70bm) expressed using pcDNA3.1 / mycHisC-mTpp1 plasmid.
  • Tpp1-Hsc70bm (+) HA”, “(+) NH 4 Cl”, “(+) NH 4 Cl, chloroquine” show the same results as in lanes 1 to 3 in the middle of FIG. is there.
  • mTin2 Mouse Tin2
  • mTpp1 mouse Tin2
  • Hsc70bm region and mTin2 a fusion protein containing mTpp1 region and Hsc70bm region and mTin2 are co-expressed in cells, mTpp1 and mTin2 bind specifically.
  • a conjugate of mTin2 and a fusion protein containing the mTpp1 region and the Hsc70bm region can be prepared.
  • the conjugate is transported to the lysosome by the action of chaperone-mediated autophagy by binding the Hsc70bm region and the molecular chaperone Hsc70.
  • the conjugate is degraded by proteases in lysosomes. Whether mTin2 is degraded can be detected by analyzing the degradation product of mTin2.
  • SR-HisB-Tin2 plasmid [Construction of SR-HisB-Tin2 plasmid] SR-HisB-Tin2 plasmid was prepared according to the following method. Table 8 shows the base sequences of the primers used.
  • Table 9 shows the entire base sequence and amino acid sequence of mTin2.
  • the resulting reaction solution and the SR-HisB vector were cleaved with BglII and KpnI, and each DNA fragment was purified with QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN) and then ligated using Ligation-Convenience Kit (Nippon Gene). A plurality of clones were obtained by introducing into E. coli DH10b. Plasmid DNA was prepared using the clone to obtain SR-HisB-Tin2 plasmid.
  • SR-HisB-Tin2 plasmid and Tpp1-Hsc70bm3 plasmid were transfected into 293T cells by the following method.
  • Table 4 shows the composition of the cell culture medium used for the passage of 293T cells.
  • Table 10 shows the composition of the transfection medium used when transfection of SR-HisB-Tin2 plasmid and Tpp1-Hsc70bm3 plasmid into 293T cells.
  • Cell preparation method The 293T cells stored in liquid nitrogen were allowed to stand for 5 minutes in a room temperature water bath and thawed. 9 ml of cell culture medium and 1 ml of cell solution were mixed, centrifuged at 3000 rpm for 2 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed to prepare a cell pellet. The pellet was suspended by adding 10 ml of cell culture medium, seeded on a 100 mm ⁇ 20 mm cell dish, and cultured at 5.0% CO 2 and 37 ° C.
  • Opti-MEM TM I (1 ⁇ ) + GlutaMAX TM -I (Gibco) was mixed in advance with an expression plasmid, a total amount of 4.0 ⁇ g, and Lipofectamine 2000 (invitrogen) 15 ⁇ l.
  • the cells were cultured at 5.0% CO 2 and 37 ° C. for 24 hours.
  • composition of each buffer and gel is as follows.
  • composition of each buffer is as shown in Table 6.
  • the cells were collected 24 hours after transfection of the plasmid into 293T cells by the above method, the proteins were collected, separated by SDS-PAGE, and then detected by Western blotting and immunostaining. Tin2 was detected with Rabbit anti-T7-tag pAb.
  • the degradation efficiency of mTin2 was determined by dividing the total band intensity of “Tin2 degradation products” in each lane of FIG. 4B by the total band intensity excluding endogenous proteins. The result is shown in FIG.
  • the rightmost lane is the result of cells to which no expression plasmid was added, and the detected band is the endogenous protein of 293T cells.
  • mTin2 As shown in “without Hsc70bm” and “with Hsc70bm” in FIGS. 4 (A) and (B), when using the Tpp1-Hsc70bm3 plasmid, mTin2 The decomposition efficiency of increased. That is, when co-expressed with a fusion protein containing the mTpp1 region and the Hsc70bm region, the degradation efficiency of mTin2 increased.

Abstract

　標的タンパク質の量を特異的に低減する技術を提供すること。　本発明は、標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域と、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列と、を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。前記タンパク質領域は、Ｔｐｐ１領域であってもよい。前記タンパク質領域と、前記Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列との間にリンカー配列及び／又はスペーサー配列が介在していてもよい。

Description

標的タンパク質の量の低減のためのポリペプチド、単離された核酸、組み換えベクター、及び形質転換体
　本発明は、標的タンパク質の量の低減のためのポリペプチド、単離された核酸、組み換えベクター、及び形質転換体に関する。
　癌等の疾患は、先天的、又は外的環境等によって後天的に導入された遺伝子の変異によって生成される変異型タンパク質が主要な病因である。癌等の疾患の治療において、変異型タンパク質の発現を人工的に抑制する技術が着目されている。
　変異型タンパク質等の標的タンパク質の発現を人工的に抑制する技術としては、転写段階で遺伝子の発現を抑制するアンチジーン法、翻訳段階でタンパク質の発現を抑制するアンチセンス法等が挙げられる（非特許文献１及び２）。これらの技術はいずれも、細胞外からオリゴヌクレオチドを添加し、標的タンパク質をコードするＤＮＡやｍＲＮＡに対して該オリゴヌクレオチドを結合させることで、オリゴヌクレオチドの結合部位よりも下流の遺伝子の転写及び翻訳を阻害し、標的タンパク質の発現を抑制する技術である。
Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，　Ｊ．　"Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ"　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．（２０１１）　７６４，　１－１５ Ｍａｌｉｋ，　Ｒ．，　Ｒｏｙ，　Ｉ．　"Ｍａｋｉｎｇ　ｓｅｎｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　ｕｓｉｎｇ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ"　Ｅｘｐｅｒｔ　Ｏｐｉｎ．　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖ．（２０１１）　６（５），　５０７－５２６
　しかし、従来の技術においては、標的遺伝子中の適切な標的配列を選択しなければ標的タンパク質の発現を抑制できないという問題、細胞外から添加したオリゴヌクレオチドが、核酸分解酵素等で分解されて標的配列に到達できないという問題、変異型タンパク質のみならず正常タンパク質の発現も同時に抑制してしまい得るという問題等があった。
　本発明は、以上のような課題に鑑みてなされたものであり、標的タンパク質の量を特異的に低減する技術を提供することを目的とする。
　本発明者らは、標的タンパク質に特異的に結合するタンパク質に、シャペロン介在性オートファジー作用に関与する特定の分子シャペロンの結合モチーフを付加させた融合タンパク質によれば、該融合タンパク質が標的タンパク質に特異的に結合し、該標的タンパク質をリソソーム内で分解することができるので、標的タンパク質の量を特異的に低減できる点を見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のものを提供する。
　（１）　標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域と、
　Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列と、
を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
　（２）　前記タンパク質領域は、Ｔｐｐ１領域である、（１）に記載のポリペプチド。
　（３）　前記タンパク質領域と、前記Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列との間にリンカー配列及び／又はスペーサー配列が介在する（１）又は（２）に記載のポリペプチド。
　（４）　前記Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列を複数含む（１）から（３）のいずれかに記載のポリペプチド。
　（５）　前記標的タンパク質は、Ｔｉｎ２領域である、（２）から（４）のいずれかに記載のポリペプチド。
　（６）　（１）から（５）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
　（７）　（６）に記載の核酸を含む組み換えベクター。
　（８）　（７）に記載の組み換えベクターを含み、単離された細胞又は非ヒト動物である形質転換体。
　本発明によれば、標的タンパク質の量を特異的に低減する技術が提供される。
本発明の実施例において調製したプラスミドに挿入した遺伝子の構造を示す図である。 本発明の実施例における、ｍＴｐｐ１の分解効率の検討結果を示す図である。 本発明の実施例において認められたｍＴｐｐ１の分解が、シャペロン介在性オートファジー作用によるものであるかについての検討結果を示す図である。 本発明の実施例において、ｍＴｐｐ１に結合するｍＴｉｎ２の分解効率の検討結果を示す図である。
　以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されない。
＜本発明のポリペプチド＞
　本発明は、標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域と、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列と、を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供する。本発明は、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列と、熱ショック関連タンパク質Ｈｓｃ７０との結合を介した、シャペロン介在性オートファジー作用を利用して、タンパク質領域に結合した標的タンパク質をリソソームまで運搬し、該標的タンパク質をプロテアーゼによって分解することで標的タンパク質の量を低減する技術である。
［Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列］
　「Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列」とは、分子シャペロンである熱ショック関連タンパク質Ｈｓｃ７０に対するＫＦＥＲＱ様配列（「Ｈｓｃ７０結合モチーフ（Ｈｓｃ７０ｂｍ）」とも呼ばれる。）を含む配列である。以下、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列を含む領域を「Ｈｓｃ７０ｂｍ領域」という。
　Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列としては、特に限定されないが、配列番号１６（動物種：ヒト）、配列番号１７（動物種：ヒト）で表されるアミノ酸配列が挙げられる。Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列の由来する動物種は特に限定されず、“Ｐｒｏｃ．　Ａｍ．　Ｔｈｏｒａｃ．　Ｓｏｃ．　（２０１０）　Ｖｏｌ．　７，　ｐｐ．２９－３９”や、“Ａｕｔｏｐｈａｇｙ　（２００７）　３，　２９５－２９９”等の文献において定義される結合モチーフを使用できる。
　本発明においては、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列のアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列も使用できる。
　Ｈｓｃ７０ｂｍ領域は、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列からなる領域であってもよいが、スペーサー配列等を含んでいてもよい。Ｈｓｃ７０ｂｍ領域には、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列が単数又は複数含まれていてもよい。Ｈｓｃ７０ｂｍ領域に、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列が複数含まれている場合、該アミノ酸配列は、タンデムに結合されていてもよいし、スペーサー配列を介して離れていてもよい。該スペーサー配列の長さは、１０～２０アミノ酸であってもよい。
　Ｈｓｃ７０ｂｍ領域におけるＨｓｃ７０に結合するアミノ酸配列の配置は特に限定されないが、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域に、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列が複数含まれている場合、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列と、Ｈｓｃ７０とが結合しやすいという点から、該アミノ酸配列を、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域の両末端に配置することが好ましい。
　Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質は、Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列を介してＨｓｃ７０に特異的に結合し、次いで、該タンパク質とＨｓｃ７０との複合体は、細胞内におけるタンパク質分解の場であるリソソームまで運搬される。該複合体は、リソソームまで運搬された後、リソソームシャペロンＬｙｓ－Ｈｓｃ７３の働きにより、リソソーム関連膜タンパク質Ｔｙｐｅ－２ａ　ＬＡＭＰ－２ａを通過して、リソソーム内に取り込まれ、リソソーム内部のプロテアーゼにより分解される。このような、Ｈｓｃ７０に対する結合を介したタンパク質の分解作用を、「シャペロン介在性オートファジー作用」という。
　本発明者らは、Ｈｓｃ７０ｂｍとＨｓｃ７０との特異的な結合に基づく、シャペロン介在性オートファジー作用を利用した標的タンパク質の分解に着目し、本発明に想到した。すなわち、任意の標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域にＨｓｃ７０ｂｍ領域が付加された融合タンパク質（つまり、本発明におけるポリペプチド）を細胞内で発現させると、該融合タンパク質は、タンパク質領域を介して標的タンパク質に結合する。次いで、標的タンパク質と融合タンパク質との結合と同時に、標的タンパク質に結合した融合タンパク質は、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域を介して、細胞内のＨｓｃ７０に結合し、リソソームまで運搬され、上記のシャペロン介在性オートファジー作用によって、融合タンパク質とともに標的タンパク質が分解される。シャペロン介在性オートファジー作用によって分解される標的タンパク質は、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域が付加されたタンパク質領域に特異的に結合するものに限られるので、本発明によれば、標的タンパク質の量を特異的に低減できる。
　本発明のポリペプチドには、単数又は複数のＨｓｃ７０ｂｍ領域が含まれていてもよい。本発明のポリペプチドに複数のＨｓｃ７０ｂｍ領域が含まれていると、本発明のポリペプチドを、より特異的にＨｓｃ７０に結合させやすくなる。複数のＨｓｃ７０ｂｍ領域は、タンデムに結合されていてもよいし、タンパク質領域やその他の配列を介して離れていてもよい。
　本発明のポリペプチドと、標的タンパク質とを、より特異的に結合させるために、本発明のポリペプチドには、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域とともに、ＳＵＭＯ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ　ｍｏｔｉｆ（ＳＩＭ）と呼ばれるアミノ酸配列を含んでいてもよい。「ＳＩＭ」とは、翻訳後修飾の１種であるＳＵＭＯ化を受けたタンパク質に結合する小さなタンパク質である「ＳＵＭＯ」に特異的に結合する配列である。本発明のポリペプチドにＳＩＭが含まれていると、ＳＵＭＯ化を受けたタンパク質のみを特異的にリソソームに運搬できる。
　例えば、大腸癌の病因は、Ｗｎｔシグナル経路において蓄積したβ－カテニンが転写因子であるＴ－ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒ－４（ＴＣＦ４）と結合して形成された複合体が、標的遺伝子の上流配列に結合し、標的遺伝子の転写を活性化することによって生じる腺腫形成であることが知られている。ＳＵＭＯ　Ｅ３リガーゼであるＲａｎＢＰ２は、ＴＣＦ４とともに複合体を形成することでＴＣＦ４をＳＵＭＯ化し、ＴＣＦ４とβ－カテニンとの結合親和性を増加させる。そのため、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域とともに、ＳＩＭを含む本発明のポリペプチドによれば、ＳＵＭＯ化修飾を受けたＴＣＦ４のみを特異的にリソソームに運搬して分解することができるので、ＴＣＦ４及びβ－カテニンの複合体の核への移行量が抑制され、その結果、標的遺伝子の転写が抑制され、大腸癌細胞の成長を阻害できることが期待される。
　本発明のポリペプチドによって、標的タンパク質の量が特異的に低減されたかどうかは、標的タンパク質の量や、タンパク質領域の量を公知の免疫染色等によって検出することで特定できる。標的タンパク質や、タンパク質領域の分解物が認められた場合、標的タンパク質の量が特異的に低減されたものと判断できる。
［タンパク質領域］
　本発明におけるタンパク質領域は、任意の標的タンパク質に結合するアミノ酸配列を含むものであれば特に限定されない。このようなタンパク質領域として、具体的には、Ｔｐｐ１領域（例えば、配列番号９で表されるアミノ酸配列、又は配列番号９と８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列）、抗体、酵素、レクチン、受容体、シグナル伝達タンパク質、基本転写因子、ヒストン、複数のタンパク質が集合して形成されるタンパク質複合体（リボソーム、プロテアソーム、基本転写因子、ヒストン、クロマチン・リモデリング複合体等）を構成するタンパク質等が挙げられる。
　Ｔｐｐ１領域は、Ｔｐｐ１の全長配列であってもよいが、部分配列であってもよい。例えば、ヒトＴｐｐ１（全長５４４アミノ酸）については、８７－２５１アミノ酸領域を含む部分配列であれば、標的タンパク質であるテロメラーゼに結合できる。同様に、マウスＴｐｐ１（全長４１６アミノ酸）については、１－１６３アミノ酸領域を含む部分配列であれば、標的タンパク質であるテロメラーゼに結合できる。ヒトＴｐｐ１の８７－２５１アミノ酸領域のうち、Ｅ１６８、Ｅ１６９、Ｅ１７１、Ｒ１８０、Ｌ１８３、Ｌ２１２、Ｅ２１５がテロメラーゼとの結合に特に重要である。
　上記のタンパク質領域の例示のうち、Ｔｐｐ１領域とは、テロメア伸長酵素であるテロメラーゼやテロメア結合タンパク質（Ｔｉｎ２等）に特異的に結合するタンパク質である。つまり、タンパク質領域がＴｐｐ１領域である場合、「標的タンパク質」はテロメラーゼや、テロメア結合タンパク質（Ｔｉｎ２等）である。癌細胞においては、テロメラーゼが発現することによって、正常細胞においては細胞分裂の度に短縮していくテロメアを伸長させ、細胞が永続的に分裂することが知られる。そのため、本発明のポリペプチドによって、標的タンパク質であるテロメラーゼを分解することで、癌等を治療できることが期待される。また、本発明のポリペプチドによって、標的タンパク質であるテロメア結合タンパク質を分解することで、テロメア結合タンパク質とテロメラーゼとの結合が失われ、テロメラーゼがテロメアにリクルートされなくなり、癌等を治療できることが期待される。
　タンパク質領域が抗体である場合、「標的タンパク質」は、該抗体に対する抗原タンパク質である。
　タンパク質領域が酵素である場合、「標的タンパク質」は、該酵素の基質タンパク質である。
　タンパク質領域がレクチンである場合、「標的タンパク質」は、該レクチンに対応する糖タンパク質である。
　タンパク質領域が受容体である場合、「標的タンパク質」は、該受容体に対応するホルモン（ペプチド、タンパク質、糖タンパク質等）、シグナル伝達タンパク質である。
　タンパク質領域がシグナル伝達タンパク質である場合、「標的タンパク質」は、該タンパク質に関連するシグナル伝達タンパク質である。
　タンパク質領域が基本転写因子である場合、「標的タンパク質」は、該因子に対応するＲＮＡポリメラーゼ及び／又は転写制御因子である。
　タンパク質領域がヒストンである場合、「標的タンパク質」は、該ヒストンに関連するヒストン関連タンパク質（ヒストン修飾酵素、ヒストン脱修飾酵素、ヒストン結合タンパク質、ヒストンシャペロン）である。
　タンパク質領域が、タンパク質複合体を構成するタンパク質である場合、「標的タンパク質」は、該複合体を構成する他のタンパク質である。
　タンパク質領域のアミノ酸配列は、いずれの動物種に由来するものであってもよい。動物種としては、マウス、ヒト、ラット、モルモット等が挙げられる。
　タンパク質領域及びＨｓｃ７０ｂｍ領域の位置関係は特に限定されないが、タンパク質領域のＣ末端側にＨｓｃ７０ｂｍ領域のＮ末端が配置されていてもよいし、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域のＣ末端側にタンパク質領域のＮ末端が配置されていてもよい。
［その他の領域］
　タンパク質領域と、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域との間（タンパク質領域とＨｓｃ７０に結合するアミノ酸配列との間）には、リンカー配列及び／又はスペーサー配列等のアミノ酸配列の小断片が介在していてもよい。このような配列の種類や長さを調整することにより、本発明のポリペプチドを、より効率的にＨｓｃ７０や標的タンパク質に結合させることができる。
　リンカー配列としては、制限酵素部位を有するもの、蛍光タンパク質を発現するもの等が挙げられる。リンカー配列の長さは、１０～２００アミノ酸であってもよい。
　スペーサー配列は、特に限定されないが、５～３０アミノ酸のものであってもよい。スペーサー配列が１０～２０アミノ酸であると、本発明のポリペプチドを、より効率的にＨｓｃ７０や標的タンパク質に結合させることができる傾向にある。
　本発明のポリペプチドの任意の部位には、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ等の公知のタグペプチドが付加されていてもよい。これらのタグを付加することにより、本発明のポリペプチドの発現の検出等を容易に行うことができる。
＜本発明のポリペプチドの製造方法＞
　本発明のポリペプチドは、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、本発明のポリペプチドをコードする核酸をベクターに組み込み、該ベクターを細胞（ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞等）、大腸菌等に導入することによって、ポリペプチドとして大量に発現させることができる。
＜核酸＞
　本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸は、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、アミノ酸配列情報からプライマーを作成し、ＰＣＲ等によってクローニングしたタンパク質領域をコードする核酸や、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域をコードする核酸を、ライゲーション反応等によってつなげることにより本発明のポリペプチドをコードする核酸を単離することができる。
　本願明細書で使用される用語「核酸」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が含まれる。
＜組み換えベクター＞
　本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸を含む組み換えベクターは、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。例えば、任意のプラスミドを、任意の制限酵素で切断し、その切断部位に、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸を結合させることによって作製できる。
　本願明細書で使用される用語「組み換えベクター」は、組み換えＤＮＡ実験等において異種ＤＮＡの運搬に使用されるＤＮＡを指す。本発明の組み換えベクターとしては、例えば、本発明のポリペプチドを発現するＤＮＡ断片、任意の制限酵素認識部位、任意の複製開始点等を有するクローニングベクターや、本発明のポリペプチドを発現するＤＮＡ断片、転写開始点等を有する発現ベクター等が挙げられる。
＜形質転換体＞
　上記の組み換えベクターを含む形質転換体は、本発明の属する技術分野において公知の遺伝子組み換え技術によって作製できる。本願明細書で使用される用語「形質転換体」は、単離された細胞又は非ヒト動物である。細胞としては特に限定されず、任意の細胞株（例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞等）を使用できる。また、非ヒト動物としては特に限定されず、大腸菌、哺乳類（マウス、ラット等）、モデル動物等を使用できる。
　本発明の形質転換体は、例えば、単離された細胞に、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウイルス等によって組み換えベクターを導入することによって、単離された細胞の形質転換体が得られる。また、非ヒト動物の受精卵前核中へＤＮＡ顕微注入、ＥＳ細胞への相同組み換え、組み換えウイルスによる感染等を行うことによって非ヒト動物の形質転換体が得られる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
＜プラスミドの構築＞
　下記の方法にしたがい、プラスミドを作製した。使用したプライマーの塩基配列を、表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　プラスミドの調製に使用したマウスのＴｐｐ１（以下、「ｍＴｐｐ１」という。）の全塩基配列及び全アミノ酸配列を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　プラスミドの調製に使用したＨｓｃ７０ｂｍ領域の全塩基配列及び全アミノ酸配列を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣ－ｍＴｐｐ１プラスミドの構築］
　ｍＴｐｐ１（マウスＴｐｐ１の１－４１６アミノ酸領域）をコードするＤＮＡ断片をｐＧＡＤＴ７ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングしたプラスミドを鋳型として、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｍｕｌｔｉ　ｅｎｚｙｍｅ　ｂｌｅｎｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び、表１に示した２種のプライマー（ＭＰＴＯＰ１ＢＡＳＥＦ、ＭＰＴＯＰ１２４８ＢＡＳＥＦ）を用いて、（９５℃で１分間）×１サイクル、（９５℃で２０秒間熱変性、５５℃で３０秒間アニーリング、６５℃で６分間伸長）×３０サイクル、（６５℃で５分間）×１サイクルでＰＣＲにより増幅した。こうして、５’末端にＥｃｏＲＩ及びＫｏｚａｋ配列、３’末端にＮｏｔＩを含むｍＴｐｐ１（１－４１６）遺伝子をクローニングしたプラスミドの取得を目指した。
　得られた反応溶液をＤｐｎＩ処理後、大腸菌ＸＬ１０－Ｇｏｌｄに導入し、複数のクローンを得た。該クローン（ｐＧＡＤＴ７－ｍＴｐｐ１（１－４１６））及びｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、このベクターは発現ベクターに相当する。）をＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断し、得られたＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いてライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣ－ｍＴｐｐ１プラスミドを得た。
［Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（－）ＨＡプラスミドの構築］
　表１に示したオリゴヌクレオチド（Ｈｓｃ７０ｂｍＦ２、Ｈｓｃ７０ｂｍＲ２）を等量ずつ混合し、９０℃で５分間静置した後、一晩徐冷しＨｓｃ７０ｂｍを２個含むオリゴヌクレオチドを作製した。ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣ－ｍＴｐｐ１プラスミドをＮｓｐＶとＸｈｏＩで切断した。得られたＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて上記オリゴヌクレオチドとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドを調製し、Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（－）ＨＡプラスミドを得た。Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（－）ＨＡプラスミドに挿入された遺伝子の構造を図１（Ａ）に示す。図１（Ａ）中、「５ａａ」、「６ａａ」とは、それぞれスペーサー配列を示す。「５ａａ」の配列はＡＡＡＲＧ（配列番号１８）であり、「６ａａ」の配列はＡＧＡＡＡＰ（配列番号１９）である。
［Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（＋）ＨＡプラスミドの構築］
　Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（－）ＨＡプラスミドを鋳型として、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ　Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ　Ｍｕｌｔｉ　ｅｎｚｙｍｅ　ｂｌｅｎｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、表１に示したプライマー（ｍＴｐｐＨＡｔａｇＨｓｃ７０ｂｍＦ）を用いて、（９５℃で２分間）×１サイクル、（９５℃で２０秒間熱変性、５５℃で３０秒間アニーリング、６５℃で４分間伸長）×３０サイクル、（９５℃で２分間）×１サイクルでＰＣＲにより増幅した。こうして、ｍＴｐｐ１とＨｓｃ７０ｂｍの間にＨＡ　ｔａｇ配列を含む遺伝子をクローニングしたプラスミドの取得を目指した。得られた反応溶液をＤｐｎＩ処理後、大腸菌ＸＬ１０－Ｇｏｌｄに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドを調製し、Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（＋）ＨＡプラスミドを得た。Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（＋）ＨＡプラスミドに挿入された遺伝子の構造を図１（Ｂ）に示す。図１（Ｂ）中、「１２ａａ」、「６ａａ」とは、それぞれスペーサー配列を示す。「１２ａａ」の配列はＡＡＡＲＧＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号２０）であり、「６ａａ」の配列はＡＧＡＡＡＰである。
［Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドの構築］
　表１に示したオリゴヌクレオチド（Ｈｓｃ７０ｂｍＦ３、Ｈｓｃ７０ｂｍＲ３）を等量ずつ混合し、９０℃、５分間静置した後、一晩徐冷しＨｓｃ７０ｂｍを４個含むオリゴヌクレオチドを作製した。ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣ－ｍＴｐｐ１プラスミドをＮｓｐＶとＸｈｏＩで切断した。得られたＤＮＡ断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて上記オリゴヌクレオチドとライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドを調製し、Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドを得た。Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドに挿入された遺伝子の構造を図１（Ｃ）に示す。図１（Ｃ）中、「５ａａ」、「６ａａ」とは、それぞれスペーサー配列を示す。「５ａａ」の配列はＡＡＡＲＧであり、「６ａａ」の配列はＡＧＡＡＡＰである。
＜細胞培養及びトランスフェクション＞
　下記の方法で、上記で調製した各プラスミドを、２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎細胞）にトランスフェクションした。
［細胞培養用培地の調製］
　２９３Ｔ細胞の継代に使用した細胞培養用培地の組成は下記のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
［トランスフェクション用培地の調製］
　トランスフェクションにおいて使用したトランスフェクション用培地は、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ（１×）＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）である。
［細胞の調製方法］
　液体窒素中に保存された２９３Ｔ細胞を常温の水浴中で５分間静置し、解凍した。細胞培養用培地９ｍｌと細胞液１ｍｌとを混合し、４℃、３０００ｒｐｍで、２分間遠心分離を行い、上清を除去して細胞ペレットを作製した。該ペレットに細胞培養用培地１０ｍｌを加え懸濁した後、１００ｍｍ×２０ｍｍ細胞用ディッシュに播種し５．０％ＣＯ２、３７℃で培養した。
［トランスフェクション］
　上記で調製された８０～９０％コンフルエントの細胞を、ＰＢＳバッファー　１０ｍｌで２回洗い、０．２５％－Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍＭ－ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク）１ｍｌを加え、３７℃、５分間保温後に細胞培養用培地１０ｍｌを加えて細胞を剥がした。得られた細胞を、血球計算板を用いて４．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、６ウェルプレートに播種し、５．０％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養後、細胞をＰＢＳバッファーで２回洗い、ＯｐｔｉＭＥＭ　Ｉ＋ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を各ウェルに１．５ｍｌ加えた。次いで、各ウェルあたり、各プラスミド　８．０μｇ（トランスフェクション用培地２５０μｌ中で混合させたもの）及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００　２０μｌ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）の混合物（室温で２０分間静置したもの）を添加し、５．０％ＣＯ２、３７℃で４時間培養した。
＜細胞からのタンパク質抽出＞
　細胞をＰＢＳバッファーで２回洗い、Ｍ－ＰＥＲ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）２００μｌ／ｗｅｌｌ（後述するオートファジー阻害剤を添加する場合は、５０μｌ／ｗｅｌｌ）を加えて、ピペッティングにより細胞を破砕した。破砕物をチューブに入れ、小型回転培養機にて５分間反応させた後、４℃、１４０００ｇ、１０分間遠心分離し、ペレット以外の上清を抽出されたタンパク質として回収した。
＜タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動＞
　各タンパク質をサンプルバッファー中に溶かし、トリシン系緩衝液（陽極バッファー、又は陰極バッファー）中で、室温、定電流下（３０ｍＡ）で泳動した。
　各バッファー及びゲルの組成は下記のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
＜ウエスタンブロット及び免疫染色＞
　上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、ゲル上のタンパク質を、ウエスタンブロット及び免疫染色によって検出した。
［ウエスタンブロット（セミドライ式）］
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のゲル上のタンパク質を、室温、定電流下（１．３ｍＡ／ｃｍ２）で、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＦＬ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）へ一時間転写した。転写の際には、ブロッティングバッファーＡ乃至Ｃを使用した。転写後のメンブレンは１×ＰＢＳで洗浄し、ブロッキングバッファーに一晩浸した。ブロッキングされたメンブレンは、一次抗体溶液（一次抗体　５μｌ、０．１％　ＳＤＳ、０．１％　カゼイン／１×ＰＢＳ）５ｍｌで一時間免疫染色した後、０．１％　ＰＢＳＴで洗浄した。さらに遮光条件下で、二次抗体溶液（二次抗体　５μｌ、０．１％　ＳＤＳ、０．１％　カゼイン／１×ＰＢＳ）５ｍｌで一時間免疫染色した後、０．１％　ＰＢＳＴ、１×ＰＢＳで洗浄した。タンパク質の検出は、Ｉｎｆｒａｒｅｄ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｏｄｙｓｓｅｙ（ＬＩ－ＣＯＲ）を用いて７００ｎｍ又は８００ｎｍで行った。
　各バッファーの組成は下記のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　１次抗体及び２次抗体は下記のものを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜実施例１：ｍＴｐｐ１の分解効率の検討＞
　ｍＴｐｐ１領域及びＨｓｃ７０ｂｍ領域を含む融合タンパク質が発現した場合、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域と分子シャペロンであるＨｓｃ７０とが結合し、シャペロン介在性オートファジーの作用により、該結合体がリソソームまで運搬される。その結果、該結合体はリソソーム内のプロテアーゼによって分解される。したがって、シャペロン介在性オートファジーが生じたかどうかは、ｍＴｐｐ１の分解物を検出することによって確認できる。そこで、本実施例においては、シャペロン介在性オートファジーが生じるかどうかを検討するために、下記の方法にしたがい、上記で調製した各プラスミドを使用して発現させたｍＴｐｐ１の分解物を検出し、その分解効率を算出した。
　トランスフェクションから４時間後に、培地を（１）細胞培養用培地のみ、（２）細胞培養用培地及び５０ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ、（３）細胞培養用培地及び１５ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ及び１００μＭ　クロロキンのいずれかに交換した。ＮＨ４Ｃｌ及びクロロキンは、いずれもシャペロン介在性オートファジー阻害剤である。
　トランスフェクションから２４時間後にＭ－ＰＥＲ　２００μｌを用いて、上記の方法によって抽出したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロッティング後、免疫染色でタンパク質を検出した。その結果を図２（Ｂ）に示す。なお、内部標準としてβ－アクチンを使用した。
　図２（Ｂ）において、最も左端のレーンは、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣ　－ｍＴｐｐ１プラスミドを使用して発現させたｍＴｐｐ１（つまり、Ｈｓｃ７０ｂｍを含まないタンパク質）を使用した結果である。
　図２（Ｂ）において、最も右端のレーンは、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣベクター（発現ベクター）を使用して発現させたタンパク質（つまり、ｍＴｐｐ１及びＨｓｃ７０ｂｍを含まないタンパク質）を使用した結果である。
　図２（Ｂ）において、左側の１乃至３レーンは、Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（－）ＨＡプラスミドを使用し、かつ、上記（１）乃至（３）のいずれかの培地を使用した結果を示す。
　図２（Ｂ）において、真ん中の１乃至３レーンは、Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（＋）ＨＡプラスミドを使用し、かつ、上記（１）乃至（３）のいずれかの培地を使用した結果を示す。
　図２（Ｂ）において、右側の１乃至３レーンは、Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドを使用し、かつ、上記（１）乃至（３）のいずれかの培地を使用した結果を示す。
　ｍＴｐｐ１の分解効率は、図２（Ｂ）の各レーンにおける「Ｔｐｐ１分解産物」のバンド強度の合計値を、内在性タンパク質を除いたバンド強度の合計値で割ることによって求めた。その結果を図２（Ａ）に示す。
　図２（Ａ）及び（Ｂ）の各レーン１に示されるとおり、Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（－）ＨＡプラスミド、Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（＋）ＨＡプラスミド及びＴｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドのいずれのプラスミドを使用しても、ｍＴｐｐ１の分解効率は高かった（それぞれ、２３．５％、３０．５％、３３．０％）。他方、オートファジー阻害剤の存在下で細胞培養して得られたタンパク質を示す図２（Ａ）及び（Ｂ）の各レーン２及び３においては、ｍＴｐｐ１の分解効率が低かったことから、これらのレーンにおいては、オートファジーが阻害され、ｍＴｐｐ１の分解が生じなかったことがわかる。つまり、図２（Ａ）及び（Ｂ）の各レーン１において認められたｍＴｐｐ１の分解は、シャペロン介在性オートファジーによるものであることがわかる。
　また、Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（－）ＨＡプラスミドを使用した結果と、Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（＋）ＨＡプラスミドを使用した結果とを比較すると、ｍＴｐｐ１とＨｓｃ７０ｂｍの間のスペーサー配列が長い後者のプラスミドの方が高い分解効率を示した。
　Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（－）ＨＡプラスミドを使用した結果と、Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドを使用した結果とを比較すると、付加されたＨｓｃ７０ｂｍの数が２個多い後者のプラスミドの方が高い分解効率を示した。
＜実施例２：シャペロン介在性オートファジー作用に関する検討＞
　実施例１で認められたオートファジーが、シャペロン介在性オートファジーによるものかどうかを確認するため、シャペロン介在性オートファジー以外の経路のオートファジー阻害剤の存在下で実施例１同様の試験を行った。
　具体的には、トランスフェクションから４時間後に、培地を（１）細胞培養用培地のみ、（２）細胞培養用培地及び１０ｍＭ又は５０ｍＭの３－ＭＡ、（３）細胞培養用培地及び５μＭ又は５０μＭのＭＧ１３２のいずれかに交換した。３－ＭＡ（３－メチルアデニン）は、マクロオートファジー阻害剤である。ＭＧ１３２は、ユビキチン・プロテアソーム分解系阻害剤である。
　トランスフェクションから２４時間後にＭ－ＰＥＲ　２００μｌを用いて、上記の方法によって回収したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロッティング後、免疫染色でタンパク質を検出した。その結果に基づき、実施例１同様にＴｐｐ１の分解効率を算出した結果を図３に示す。なお、図３において、「Ｔｐｐ１」は、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣ－ｍＴｐｐ１プラスミドを使用して発現させたｍＴｐｐ１（つまり、Ｈｓｃ７０ｂｍを含まないタンパク質）を使用した結果である。「Ｔｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ（＋）ＨＡ」、「（＋）ＮＨ４Ｃｌ」、「（＋）ＮＨ４Ｃｌ，クロロキン」は、それぞれ、図２（Ａ）の真ん中の１乃至３レーンと同一の結果である。
　図３に示されるとおり、シャペロン介在性オートファジー機構以外のタンパク質分解に対する阻害剤（３－ＭＡ、及びＭＧ１３２）を添加した場合には、シャペロン介在性オートファジー阻害剤（ＮＨ４Ｃｌ、及びクロロキン）を添加した時と比較して、ｍＴｐｐ１の分解効率が低下しなかった。つまり、実施例１で認められたｍＴｐｐ１の分解は、主にシャペロン介在性オートファジー作用によって生じたものであることがわかる。
＜実施例３：ｍＴｉｎ２の分解効率の検討＞
　マウスのＴｉｎ２（以下、「ｍＴｉｎ２」という。）は、テロメア結合タンパク質であり、ｍＴｐｐ１と特異的に結合することが知られている。よって、「標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域」がｍＴｐｐ１である場合、標的タンパク質はｍＴｉｎ２であり得る。ｍＴｐｐ１領域及びＨｓｃ７０ｂｍ領域を含む融合タンパク質と、ｍＴｉｎ２とを細胞内で共発現させた場合、ｍＴｐｐ１とｍＴｉｎ２とは特異的に結合する。かかる性質を利用し、ｍＴｐｐ１領域及びＨｓｃ７０ｂｍ領域を含む融合タンパク質と、ｍＴｉｎ２との結合体を作製できる。該結合体は、Ｈｓｃ７０ｂｍ領域と分子シャペロンＨｓｃ７０が結合することで、シャペロン介在性オートファジーの作用により、リソソームに運搬される。その結果、該結合体はリソソーム内のプロテアーゼによって分解される。ｍＴｉｎ２が分解されているかは、ｍＴｉｎ２の分解産物を解析することによって検出できる。
　そこで、上記の結合体を使用した場合のｍＴｉｎ２の分解効率を検討すべく、下記の方法にしたがい、ＳＲ－ＨｉｓＢベクター（横浜市立大学医学部第二生化学教室（現　分子生物学教室）の大野茂男博士より供与）にｍＴｉｎ２をコードする遺伝子を挿入したＳＲ－ＨｉｓＢ－Ｔｉｎ２プラスミドを構築した。このプラスミド及びＴｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドを２９３Ｔ細胞内で発現させた場合の、ｍＴｉｎ２の分解産物を検出し、ｍＴｉｎ２の分解効率を算出した。
［ＳＲ－ＨｉｓＢ－Ｔｉｎ２プラスミドの構築］
　下記の方法にしたがい、ＳＲ－ＨｉｓＢ－Ｔｉｎ２プラスミドを作製した。使用したプライマーの塩基配列を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　ｍＴｉｎ２の全塩基配列及び全アミノ酸配列を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　ＮＩＨ３Ｔ３細胞由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｈｕｓｉｏｎ　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び、表８に示した２種類のプライマー（ＹＫ１９ＢｇＭｍＴＩＮ２Ｆ、ＫＳ７Ｔｉｎ２ｓｔｏｐｒｅｖＫｐｎ）を用いて、（９８℃で２分間）×１サイクル、（９８℃で１５秒間熱変性、７０℃で１５秒間アニーリング、６８℃で３０秒間伸長）×４０サイクル、（６８℃で７分間）×１サイクルで、ｍＴｉｎ２の１－４１４アミノ酸領域をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅した。得られた反応溶液、及びＳＲ－ＨｉｓＢベクターをＢｇｌＩＩとＫｐｎＩで切断し、それぞれのＤＮＡ断片をＱＩＡＥＸ　ＩＩ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ－Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ　Ｋｉｔ（ニッポンジーン）を用いてライゲーションし、大腸菌ＤＨ１０ｂに導入し、複数のクローンを得た。該クローンを用いてプラスミドＤＮＡを調製し、ＳＲ－ＨｉｓＢ－Ｔｉｎ２プラスミドを得た。
＜細胞培養及びトランスフェクション＞
　下記の方法で、ＳＲ－ＨｉｓＢ－Ｔｉｎ２プラスミド、及びＴｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。
［細胞培養用培地の調製］
　２９３Ｔ細胞の継代に使用した細胞培養用培地の組成は表４のとおりである。
［トランスフェクション用培地の調製］
　ＳＲ－ＨｉｓＢ－Ｔｉｎ２プラスミド、及びＴｐｐ１－Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドを、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションする際に使用したトランスフェクション用培地の組成は表１０のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
［細胞の調製方法］
　液体窒素中に保存された２９３Ｔ細胞を常温の水浴中で５分間静置し、解凍した。細胞培養用培地９ｍｌと細胞液１ｍｌとを混合し、４℃、３０００ｒｐｍで、２分間遠心分離を行い、上清を除去して細胞ペレットを作製した。該ペレットに細胞用培地１０ｍｌを加え懸濁した後、１００ｍｍ×２０ｍｍ細胞用ディッシュに播種し５．０％ＣＯ２、３７℃で培養した。
［トランスフェクション］
　上記で調製された８０～９０％コンフルエントの細胞を、ＰＢＳバッファー　１０ｍｌで２回洗い、０．２５％－Ｔｒｙｐｓｉｎ／１ｍＭ－ＥＤＴＡ溶液（ナカライテスク）１ｍｌを加え、３７℃、３分間保温後に細胞培養用培地１０ｍｌを加えて細胞を剥がした。得られた細胞を、血球計算板を用いて１．５×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製し、６ウェルプレートに播種し、５．０％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。細胞をＰＢＳバッファーで２回洗い、トランスフェクション用培地を各ウェルに１．５ｍｌ加えた。次いで、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ（１×）＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉ（Ｇｉｂｃｏ）５００μｌに発現プラスミド、総量４．０μｇ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１５μｌをあらかじめ混合し、２０分間放置したものを各ウェルに加え、５．０％ＣＯ２、３７℃で２４時間培養した。
＜細胞からのタンパク質抽出＞
　細胞をＰＢＳバッファーで２回洗い、Ｍ－ＰＥＲ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）２００μｌ／ｗｅｌｌを加えて、ピペッティングにより細胞を破砕した。破砕物をチューブに入れ、小型回転培養機にて５分間反応させた後、４℃、１４０００ｇ、１０分間遠心分離し、ペレット以外の上清を抽出されたタンパク質として回収した。
＜タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動＞
　各タンパク質をサンプルバッファー中に溶かし、トリシン系緩衝液（陽極バッファー、又は陰極バッファー）中で室温、定電流下（３５ｍＡ）で泳動した。
　各バッファー及びゲルの組成は下記のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
＜ウエスタンブロット及び免疫染色＞
　上記ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、ゲル上のタンパク質を、ウエスタンブロット及び免疫染色によって検出した。
［ウエスタンブロット（セミドライ式）］
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のゲル上のタンパク質を、室温、定電流下（１．３ｍＡ／ｃｍ２）で、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＦＬ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）へ１時間転写した。転写の際には、ブロッティングバッファーＡ乃至Ｃを使用した。転写後のメンブレンは１×ＰＢＳで洗浄し、ブロッキングバッファーに一晩浸した。ブロッキングされたメンブレンは、一次抗体溶液（一次抗体　５μｌ、０．１％　ＳＤＳ、０．１％　カゼイン／１×ＰＢＳ）５ｍｌで１時間免疫染色した後、０．１％　ＰＢＳＴで洗浄した。さらに遮光条件下で、二次抗体溶液（二次抗体　１μｌ、０．１％　ＳＤＳ、０．１％　カゼイン／１×ＰＢＳ）５ｍｌで１時間免疫染色した後、０．１％　ＰＢＳＴ、１×ＰＢＳで洗浄した。タンパク質の検出はＩｎｆｒａｒｅｄ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｏｄｙｓｓｅｙ（ＬＩ－ＣＯＲ）を用いて７００ｎｍ又は８００ｎｍで行った。
　各バッファーの組成は表６のとおりである。
　１次抗体及び２次抗体は下記のものを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　上記の方法で２９３Ｔ細胞にプラスミドをトランスフェクションした２４時間後に細胞を集め、タンパク質を回収し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離後、ウエスタンブロッティング及び免疫染色でタンパク質を検出した。Ｒａｂｂｉｔ抗Ｔ７－ｔａｇ　ｐＡｂにてＴｉｎ２を検出した。ｍＴｉｎ２の分解効率は、図４（Ｂ）の各レーンにおける「Ｔｉｎ２分解産物」のバンド強度の合計値を、内在性タンパク質を除いたバンド強度の合計値で割ることによって求めた。その結果を図４（Ａ）に示す。
　図４（Ａ）において、「Ｈｓｃ７０ｂｍなし」は、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣ－ｍＴｐｐ１プラスミドを１．５μｇ、ＳＲ－ＨｉｓＢ－Ｔｉｎ２プラスミドを２．５μｇ使用して発現させた結果（平均値２９．５％、エラーバー７．０％）である。一方、「Ｈｓｃ７０ｂｍあり」はＴｐｐ１―Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドを１．５μｇ、ＳＲ－ＨｉｓＢ－Ｔｉｎ２プラスミドを２．５μｇ使用して発現させた結果（平均値４２．３％、エラーバー４．４％）である。
　図４（Ｂ）において、最も右端のレーンは発現プラスミドを加えていない細胞の結果であり、検出されるバンドは２９３Ｔ細胞の内在性タンパク質である。
　図４（Ａ）及び（Ｂ）の「Ｈｓｃ７０ｂｍなし」と「Ｈｓｃ７０ｂｍあり」に示されるとおり、Ｔｐｐ１―Ｈｓｃ７０ｂｍ３プラスミドを使用すると、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃＨｉｓＣ－ｍＴｐｐ１プラスミドを使用した時と比較して、ｍＴｉｎ２の分解効率が増加した。つまり、ｍＴｐｐ１領域及びＨｓｃ７０ｂｍ領域を含む融合タンパク質と共発現させると、ｍＴｉｎ２の分解効率が増加した。

Claims (8)

  1. 　標的タンパク質に特異的に結合するアミノ酸配列を含むタンパク質領域と、
    　Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列と、
    を少なくとも含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  2. 　前記タンパク質領域は、Ｔｐｐ１領域である、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 　前記タンパク質領域と、前記Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列との間にリンカー配列及び／又はスペーサー配列が介在する請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  4. 　前記Ｈｓｃ７０に結合するアミノ酸配列を複数含む請求項１から３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  5. 　前記標的タンパク質は、Ｔｉｎ２領域である、請求項２から４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
  6. 　請求項１から５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離された核酸。
  7. 　請求項６に記載の核酸を含む組み換えベクター。
  8. 　請求項７に記載の組み換えベクターを含み、単離された細胞又は非ヒト動物である形質転換体。
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