WO2005097189A1 - 染色体安定化に関する遺伝子を標的とする癌細胞特異的アポトーシス誘導剤 - Google Patents

染色体安定化に関する遺伝子を標的とする癌細胞特異的アポトーシス誘導剤 Download PDF

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Akira Shimamoto
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Abstract

　本発明者らによって、染色体の安定化に関連する種々の遺伝子について、該遺伝子の発現を抑制することにより、癌細胞特異的にアポトーシスが誘導され、細胞増殖の抑制が引き起こされることが明らかになった。染色体の安定化に関連する遺伝子の発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物は、癌細胞特異的なアポトーシス誘導効果を有するものと考えられる。

Description

染色体安定化に関する遺伝子を標的とする癌細胞特異的アポトーシス誘 導剤
技術分野
[0001] 本発明は、染色体の安定化に関与する遺伝子を標的とする癌細胞特異的アポトー シス誘導剤、および該アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] 細胞においては、種々の機能 (遺伝子）の働きによって、染色体が安定に保たれて いる。この染色体の安定ィ匕に寄与する、細胞における代表的な機能 (遺伝子）として は、例えば、以下のようなものを挙げることができる。
[0003] (a)ヒト染色体不安定性疾患関連遺伝子
ヒト染色体不安定性疾患の患者由来細胞では、染色体の切断 '欠失 '転座'異数ィ匕 が見られ、またこれら疾患の患者由来細胞は DNA損傷を引き起こす薬剤に対して感 受性を示すなど、染色体の不安定ィ匕が生じていることから、ヒト染色体不安定性疾患 関連遺伝子は染色体安定化に関与して 、る。
[0004] (b)染色体 DNAの複製開始、複製フォークの進行を含む染色体 DNA複製反応 染色体 DNA複製反応は細胞が増殖する時に、染色体 DNAを複製する役割を担 つており、 1個の細胞が 2個に分裂する際に正確に染色体を 2倍に複製して染色体数 を維持する機能をもつ。
[0005] (c) DNA損傷チェックポイント
DNA損傷チェックポイントは、細胞周期が G1期、 S期、 G2期、 M期の各ステージ 力 次のステージへ移行する際に、染色体に切断'ィ匕学修飾'架橋を含む DNA損傷 をチ ックする役割を担っており、次の細胞周期のステージへ移行する前に染色体 上の DNA損傷を取り除く機能をもつ。
[0006] (d)姉妹染色分体凝集'分離
姉妹染色分体凝集 ·分離は、体細胞にお!ヽて複製を終えた姉妹染色分体を娘細 胞に正確に分離する役割を担っている。 [0007] (e)塩基除去修復
塩基除去修復は、染色体 DNA中の塩基に酸化やメチル化を含む化学修飾損傷 が生じた場合に、修飾された塩基を取り除く役割を担っている。
[0008] (f)ミスマッチ除去修復
ミスマッチ除去修復は、染色体 DNA中の正し 、塩基対 G— Cと A— T以外のミスマ ツチ塩基対を認識して、正 ヽ塩基対に修復する役割を担って!/ヽる。
[0009] (g)ヌクレオチド除去修復
ヌクレオチド除去修復は、紫外線照射によって染色体 DNA中に生じる、シクロブタ ン型ピリミジン 2量体や 6— 4光産物、またシスプラチンによって染色体 DNA中の隣り 合った塩基の間で生じる、 DNA鎖内架橋などの損傷を認識して、損傷部を除去して 修復する役割を担っている。
[0010] (h)相同組換え修復
相同組換え修復は、塩基除去修復、ミスマッチ除去修復、ヌクレオチド除去修復な どの修復機構が不完全で生じた DNA損傷、また染色体 DNA中に生じた切断、ギヤ ップなどを含む様々な DNA損傷を、損傷をもたな ヽ相同染色体を铸型として修復す る役割を担っている。
[0011] (i)非相同末端結合修復 (非相同組換え修復）
非相同末端結合修復 (非相同組換え修復）は、染色体 DNA中に生じた二重鎖切 断の末端を結合して修復する役割を担って ヽる。
[0012] (j)二本鎖 DNA切断修復
二本鎖 DNA切断修復は、染色体 DNA中に生じた二重鎖切断を修復する役割を 担っており、相同組換え修復や非相同末端結合修復 (非相同組換え修復）がこの修 復機構に含まれる。
[0013] (k) DNA複製後修復 (DNA損傷トレランス）
DNA複製後修復 (DNA損傷トレランス）は、損傷をもつ染色体 DNAが複製される 場合に、損傷が存在する DNA鎖の複製を可能にする機構で、残された DNA損傷 は複製後に修復される。
[0014] (l) DNA架橋損傷修復 DNA架橋損傷修復は、シスブラチンなどの架橋剤によって生じた、染色体内ゃ染 色体間における DNA架橋損傷を修復する役割を担って ヽる。
[0015] (m) DNA—タンパク質架橋損傷修復
DNA—タンパク質架橋損傷修復は、 DNA修復の反応中間体である酵素タンパク 質 DNAの共有結合体が形成された場合、また、染色体 DNA中の塩基とタンパク 質の架橋結合が形成された場合に、共有結合体や架橋結合体を除去する役割を担 つている。
[0016] (n) DNAポリメラーゼ
DNAポリメラーゼは、複製、組換え、修復などの染色体安定化機構において、 DN A合成反応を行う役割を担って ヽる。
[0017] (o)ヌクレアーゼ
ヌクレアーゼは、複製、組換え、修復などの染色体安定化機構において、 DNA分 解反応を行う役割を担って 、る。
[0018] (p)ヌクレオチド浄ィ匕
ヌクレオチド浄ィ匕は、 DNA合成反応の基質となるヌクレオチド中の塩基に酸ィ匕ゃメ チル化を含む化学修飾損傷が生じた場合に、修飾された塩基を取り除く役割を担つ ている。
[0019] (q)クロマチン構造維持
クロマチン構造維持は、染色体の高次構造を介した複製、組換え、修復などの染 色体安定化機構に働く。
[0020] (r)テロメァ構造維持
テロメァ構造維持は、染色体末端のテロメァ長の制御、テロメァ領域の特殊な高次 構造の形成 ·維持を介して、染色体安定ィ匕に重要な役割を担っている。
[0021] また、上記の機能に関連する種々の遺伝子について、染色体の安定化に関与する ことが報告されている。例えば、染色体の安定ィ匕に関与する種々の遺伝子について 、様々な知見が報告されて!、る (非特許文献 1〜83参照)。
しかしながら、染色体の安定化に関与する上述の機能 (遺伝子)と、癌細胞特異的 なアポトーシス誘導との関連は、これまでのところ知られていな力つた。 非特許文献 1： Wood, R.D., Mitchell, M., Sgourou, J. and Lindahl, T. (2001). Human DNA repair genes Science, 291, 1284-1289.
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発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0023] 本発明は、癌細胞特異的なアポトーシス誘導剤の提供を課題とする。より詳しくは、 染色体の安定化を阻害する化合物、染色体の安定化に関与する遺伝子の発現を阻 害する化合物、または、該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を阻害する 化合物を有効成分とする癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、並びに該アポトーシス 誘導剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。さらに、アポトーシス誘導剤を医薬 組成物として製造する方法の提供を課題とする。
課題を解決するための手段
[0024] 本発明者らは上記の課題を解決すベぐ細胞において染色体の安定ィ匕に関連す る種々の機能について、該機能の異常によってアポトーシスが癌細胞特異的に誘導 される力否かについての検討を行った。細胞における染色体の安定ィ匕に関連する機 能としては、染色体の安定ィ匕に深く関与する以下の機能を選択した。（a)ヒト染色体 不安定性疾患関連遺伝子、（b)染色体 DNAの複製開始、複製フォークの進行を含 む染色体 DNA複製反応、（c) DNA損傷チェックポイント、（d)姉妹染色分体凝集. 分離、（e)塩基除去修復、（f)ミスマッチ除去修復、（g)ヌクレオチド除去修復、（h)相 同組換え修復、（i)非相同末端結合修復 (非相同組換え修復)、（j)二本鎖 DNA切 断修復、（k) DNA複製後修復 (DNA損傷トレランス)、（l) DNA架橋損傷修復、（m) DNA—タンパク質架橋損傷修復、（n) DNAポリメラーゼ、（o)ヌクレアーゼ、（p)ヌク レオチド浄化、（q)クロマチン構造維持、（r)テロメァ構造維持。
[0025] 本発明者らは、上記の各種機能に関与する種々の遺伝子について、該遺伝子の 発現抑制効果を有する siRNAを用いて、該遺伝子の癌細胞におけるアポトーシス誘 導効果を検討した。その結果、前記の各機能に関与する複数の遺伝子について、そ の発現を抑制することにより、癌細胞においてアポトーシスが誘導され、細胞増殖の 抑制が引き起こされることを見出した。さらに本発明者らは、該遺伝子の発現を抑制 しても、正常細胞（野生型細胞）についてはアポトーシスの誘導が起こらないことを初 めて見出した。該遺伝子は、非常に優れた副作用の少ない抗癌剤 (制癌剤)のター ゲット分子と考えられる。
[0026] 上述の結果から、上記の各種機能に関与する遺伝子の発現を抑制することにより、 アポトーシスを誘導することが可能であることが示された。また、該遺伝子は、上記の 各種機能に深く関与しており、通常、該遺伝子の発現が抑制されることにより、上記 機能は細胞において正常に働力なくなる。従って、本発明者らによって見出された上 記知見は、とりもなおさず、上記の各種機能の異常によって、癌細胞特異的にアポト 一シスが誘導されることを示すものである。よって、上記の各種機能を阻害させる化 合物は、癌細胞特異的なアポトーシス誘導作用を有するものと考えられる。
[0027] さらに、上記の各種機能の異常により、染色体が不安定ィ匕することが知られている。
従って、細胞における染色体の不安定化が、癌細胞特異的なアポトーシス誘導の引 き金となっていることが考えられる。即ち、細胞における染色体安定ィ匕を阻害するィ匕 合物、あるいは、染色体安定ィ匕に関与する遺伝子の機能を阻害する化合物は、癌細 胞特異的なアポトーシス誘導剤となることが期待される。
[0028] 本発明は、染色体の安定化を阻害する化合物、染色体の安定化に関与する遺伝 子の発現を阻害する化合物、または、該遺伝子によってコードされるタンパク質の機 能を阻害する化合物を有効成分とする癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、並びに該 アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法に関し、より詳しくは、
〔1〕 染色体の安定化を阻害する化合物を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤
〔2〕 染色体の安定化の阻害が、以下の（a)〜(r)のいずれかの機能を阻害すること による、〔1〕に記載のアポトーシス誘導剤、
(a)ヒト染色体不安定性疾患関連遺伝子
(b)染色体 DNAの複製開始、複製フォークの進行を含む染色体 DNA複製反応
(c) DNA損傷チヱックポイント
(d)姉妹染色分体凝集 ·分離
(e)塩基除去修復 (f)ミスマッチ除去修復
(g)ヌクレオチド除去修復
(h)相同組換え修復
(i)非相同末端結合修復 (非相同組換え修復）
(j)二本鎖 DNA切断修復
(k) DNA複製後修復 (DNA損傷トレランス）
(l) DNA架橋損傷修復
(m) DNA—タンパク質架橋損傷修復
(n) DNAポリメラーゼ
(o)ヌクレアーゼ
(P)ヌクレオチド浄化
(q)クロマチン構造維持
(r)テロメァ構造維持
〔3〕 〔2〕の (a)〜 (r)の 、ずれかの機能に関与する遺伝子の発現を阻害する化合物 を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、
〔4〕 以下の 、ずれかに記載の遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分として含 有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、
APE2、 ATRゝ BRCA1、 Chkl、 Cdc5、 Cdc6、 Cdc7、 Cdc45、 Cdtl、 CSAゝ CSBゝ CtH8、 DDB1、 DDB2、 DNA2、 DUTゝ Elgl、 EndoV、 Espl、 Exonucleasel、 FBH1、 FEN1、 Geminin、 Husl、 KNTC2 (NDC80)、 Ku80、 Ligasel、 Mad2、 MBD4、 Mcm3、 Mcm4、 Mcm5、 Mcm6、 Mcm7、 Mcm8、 Mcml0、 MGMT、 MLH3、 Mms4、 MPG、 MSH2、 Mus81 、 NBS1、 NEIL2、 NEIL3、 NTH1、 Orel, Orc3、 PARP1、 PCNA、 Pifl、 PMS1、 PMS2、 PNK、 Pola pl80、 Pola p70、 Pola Sppl(Prim2a)、 Polb、 Pold pl25、 Pole Dpb3、 Pole Dpb4、 Pole Pol2、 Poli、 Poll, Polm、 Psfl、 Psf2、 Ps 、 Radl、 Radl8、 Rad23A、 Rad23B 、 Rad51、 Rad51D、 Rad54、 Rad6A、 RPA34、 RPA70、 Sccl、 Scc3、 Sir2、 SIRT1 (Sirtuin)ゝ TDG、 TDP1、 TIMELESS^ Tin2、 Topoisomerase I、 Topoisomerase IIIa、 Topoisomerase Illbゝ Ubcl3、 UNGゝ XAB2、 XPCゝ XPFゝ XPGゝ Xrcc2、 XRCC4
[5] 〔4〕に記載の各遺伝子の塩基配列が、配列番号： 1〜637、 810〜908に記載 の塩基配列からなる群より選択される、〔4〕に記載のアポトーシス誘導剤、
〔6〕 〔4〕に記載のいずれかの遺伝子の発現を抑制する化合物が、該遺伝子に対し て RNAi効果を有する二本鎖 RNA(siRNA)である、〔4〕に記載のアポトーシス誘導剤、 〔7〕 二本鎖 RNAが、〔4〕に記載のいずれかの遺伝子の mRNAにおける連続する任 意の 20〜30塩基と相同な配列からなるセンス RNAおよび該センス RNAに相補的な配 列からなるアンチセンス RNA力もなる二本鎖 RNAである、〔6〕に記載のアポトーシス誘 導剤、
[7b] RNAi効果を有する二本鎖 RNA力 該ニ本鎖の一方の鎖が配列番号： 724〜 809 (ただし、該配列において、末端の TTを除いた領域が二本鎖の一方の鎖を構成 する）、または 974〜1063のいずれかに記載の塩基配列であり、他方の鎖が該塩基 配列と相補的な塩基配列であることを特徴とする二本鎖 RNAである、〔6〕に記載のァ ポトーシス誘導剤、
[7c] RNAi効果を有する二本鎖 RNA力 該ニ本鎖の一方の鎖が配列番号： 724〜 809 (ただし、該配列において、末端の TTを除いた領域が二本鎖の一方の鎖を構成 する）、または 974〜1063のいずれかに記載の塩基配列において 1もしくは少数の 塩基が付加、欠失、置換された塩基配列であり、他方の鎖が該塩基配列と相補的な 塩基配列であることを特徴とする二本鎖 RNAであって、上記〔4〕に記載のいずれかの 遺伝子の発現を抑制する機能を有する二本鎖 RNAである、〔6〕に記載のアポトーシ ス誘導剤、
〔7d〕 前記二本鎖 RNAの一方の末端が閉じた構造である (ヘアピンを形成する）分 子を有効成分として含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、
〔8〕 〔4〕に記載のいずれかの遺伝子に対して RNAi効果を有する二本鎖 RNAを発現 し得る DNAを有効成分として含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、
〔9〕 〔4〕に記載の 、ずれかの遺伝子の発現を抑制する化合物が以下の（a)または（ b)である、〔4〕に記載のアポトーシス誘導剤、
(a)前記遺伝子の転写産物、またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b)前記遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する核酸
〔10〕 〔4〕に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制 する化合物を有効成分として含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、
〔11〕 〔4〕に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制 する化合物力 以下の（a)〜（c)のいずれかの化合物である、〔10〕に記載のアポト 一シス誘導剤、
(a)前記遺伝子によってコードされるタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を 有する変異体タンパク質
(b)前記遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体
(c)前記遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する低分子化合物
〔12〕 〔1〕〜〔11〕のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤を有効成分とする、抗癌 剤、
〔13〕 以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリー ユング方法、
(a)〔4〕に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分 ペプチドと被検化合物を接触させる工程
(b)前記タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合活性を測定する 工程
(c)前記遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチドと結合する 化合物を選択する工程
〔14〕 以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリー ユング方法、
(a)〔4〕に記載のいずれかの遺伝子を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化 合物を接触させる工程
(b)前記遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下にお ヽて測定した場合と比較して、該発現レベルを低下 させる化合物を選択する工程
〔15〕 以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリー ユング方法、
(a)〔4〕に記載のいずれかの遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的 に結合した構造を有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触さ せる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下にお ヽて測定した場合と比較して、前記発現レベルを低 下させる化合物を選択する工程
〔16〕 以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリー ユング方法、
(a)〔4〕に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質、または該タンパ ク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記タンパク質の活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活 性を低下させる化合物を選択する工程
〔17〕 以下の工程 (a)および (b)を含む、〔4〕または〔10〕に記載のアポトーシス誘導 剤を医薬組成物として製造する方法、
(a)〔13〕〜〔16〕のいずれかに記載の方法によって、化合物をスクリーニングするェ 程
(b)該化合物を薬学上許容される担体と混合する工程、を提供するものである。 また、本発明の具体的な一態様においては、配列番号： 724〜809、 974〜1063 の!、ずれかに記載の塩基配列を該ニ本鎖 RNAの一方の鎖とする siRNA分子（配列 番号： 724〜809、 974〜 1063のいずれ力に記載の塩基配列と、その相補鎖力らな る siRNA分子）を有効成分として含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤、 〔18〕 対象細胞へ、上記のいずれかのアポトーシス誘導剤を投与する（接触させる） 工程を含む、該細胞のアポトーシスを誘導する方法、
〔19〕 上記のアポトーシス誘導剤もしくは上記の抗癌剤を個体 (癌患者等)へ投与す る工程を含む、癌の治療方法、
〔20〕 染色体の安定化を阻害する化合物（例えば、上記〔4〕に記載の!/、ずれかの遺 伝子の発現、または該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合 物）のアポトーシス誘導剤の製造における使用、 〔21〕 上記のアポトーシス誘導剤の抗癌剤の製造における使用、
を提供する。
図面の簡単な説明
[図 1]図 1は、実施例にて用いた遺伝子名、ァクセッション番号 (Accession no.)、 siRNA配列、配列番号、 HeLa細胞における遺伝子発現抑制、 MTTアツセィ（HeLa細 胞）、 Tunel法の結果、 TIG3細胞における遺伝子発現抑制、 MTTアツセィ (TIG3細胞 )を示す。「HeLa細胞における遺伝子発現抑制」の列は、各遺伝子に対する siRNAを それぞれ HeLa細胞に導入し、導入 48時間後の各 mRNAの発現を Taqman PCRにより 定量した結果を示す。「MTTアツセィ（HeLa細胞）」の列は、各遺伝子に対する siRNA を HeLa細胞に導入し、導入 4日後の細胞生存率を MTTアツセィで調べた結果を示 す。「Tunel法」の列は、染色が認められた場合、即ちアポトーシス陽性の場合を YES と表示した。「TIG3細胞における遺伝子発現抑制」の列は、各遺伝子に対する siRNA を TIG3細胞に導入し、 72時間後の mRNAの発現を Taqman PCRにより定量した結果 を示す。 NDは検出不能を示す。「MTTアツセィ (TIG3細胞）」の列は、各遺伝子に対 する siRNAをそれぞれ TIG3細胞に導入し、 4日後の細胞生存率を MTTアツセィで調 ベた結果を示す。 なお、遺伝子はそれぞれの有する機能によって分別した。
[図 2]図 2は、図 1の続きの図である。
[図 3]図 3は、図 2の続きの図である。
[図 4]図 4は、図 3の続きの図である。
[図 5]図 5は、 HeLa細胞における各遺伝子の mRNA発現の抑制によるアポトーシスの 誘導を示す写真である。各遺伝子に対する siRNAをそれぞれ HeLa細胞に導入し、 TUNEL法を用いて導入 48時間後の HeLa細胞におけるアポトーシス誘導を検討した 結果を示す。各図左の緑色 (モノクロ図面を掲載）はアポトーシスが誘導された核を、 各図右は視野に存在する細胞の核を示す。
[図 6]図 6は図 5の続きの写真である。
[図 7]図 7は図 6の続きの写真である。
[図 8]図 8は図 7の続きの写真である。
[図 9]図 9は図 8の続きの写真である。 [図 10]図 10は、 anti-ssDNA抗体を用 、て染色体 DNA中の一本鎖 DNAが露出した領 域を免疫染色した結果を示す写真である。 1遺伝子に対し、 3枚組みの写真を示す。 左から anti-ssDNA像、核染色像、重ね合わせ像である。
[図 11]図 11は、図 10の続きの図である。
[図 12]図 12は、図 11の続きの図である。
[図 13]図 13は、図 12の続きの図である。
[図 14]図 14は、図 13の続きの図である。
[図 15]図 15は、図 14の続きの図である。
[図 16]図 16は、図 15の続きの図である。
[図 17]図 17は、図 16の続きの図である。
[図 18]図 18は、図 17の続きの図である。
[図 19]図 19は、図 18の続きの図である。
[図 20]図 20は、図 19の続きの図である。
[図 21]図 21は、図 20の続きの図である。
[図 22]図 22は、図 21の続きの図である。
[図 23]図 23は、図 22の続きの図である。
[図 24]図 24は、図 23の続きの図である。
[図 25]図 25は、図 24の続きの図である。
[図 26]図 26は、図 25の続きの図である。
[図 27]図 27は、図 26の続きの図である。
[図 28]図 28は、実施例にて用いた遺伝子名、ァクセッション番号 (ァクセッション No.) 、その他ァクセッション No.、 siRNA配列、配列番号、 HeLa細胞における遺伝子発現 抑制、 HeLa細胞における増殖抑制、 TIG3細胞における遺伝子発現抑制、 TIG3細胞 における増殖抑制を示す。 Γ40ηΜ HeLa細胞における遺伝子発現抑制」の列は、各 遺伝子に対する siRNA配列をそれぞれ HeLa細胞に導入し、導入 48時間後の各 mRNAの発現を Taqman PCRにより定量した結果を示す。「40nM HeLa細胞における 増殖抑制」の列は、各遺伝子に対する siRNA配列をそれぞれ HeLa細胞に導入し、導 入 4日後の細胞生存率を MTTアツセィで調べた結果を示す。「40nM TIG3細胞にお ける遺伝子発現抑制」の列は、各遺伝子に対する siRNAを TIG3細胞に導入し、 72時 間後の mRNAの発現を Taqman PCRにより定量した結果を示す。なお、図中の「* *」 は、 "未決定 (Not determined)"を表す。「40nM TIG3細胞における増殖抑制」の列は 、各遺伝子に対する siRNA配列をそれぞれ TIG3細胞に導入し、導入 4日後の細胞生 存率を MTTアツセィで調べた結果を示す。 なお、遺伝子はそれぞれの有する機能 によって分別した。
[図 29]図 29は、図 28の続きの図である。
[図 30]図 30は、図 29の続きの図である。
[図 31]図 31は、 KNTC2(NDC80)遺伝子の別名、ァクセッション番号（ァクセッション No.)、 mRNA登録、 siRNA ID、 siRNA配列、配列番号、 HeLa細胞における mRNA発現 、 HeLa細胞における増殖抑制、 HeLa細胞におけるアポトーシス、 HDF細胞における mRNA発現、 HDF細胞における増殖抑制、 HDF細胞におけるアポトーシスを示す。 HeLa細胞における「mRNA発現」の列は、 KNTC2(NDC80)遺伝子に対する siRNA配 列をそれぞれ HeLa細胞に導入し、導入 48時間後の各 mRNAの発現を Taqman PCR により定量した結果を示す。 HeLa細胞における「増殖抑制」の列は、 KNTC2(NDC80) 遺伝子に対する siRNA配列をそれぞれ HeLa細胞に導入し、導入 4日後の細胞生存 率を MTTアツセィで調べた結果を示す。 HeLa細胞における「アポトーシス」の列は、 染色が認められた場合、即ちアポトーシス陽性の場合を YESと表示した。 HDF細胞に おける「mRNA発現」の列は、 KNTC2(NDC80)遺伝子に対する siRNA配列をそれぞれ HDF細胞に導入し、導入 48時間後の各 mRNAの発現を Taqman PCRにより定量した 結果を示す。 HDF細胞における「増殖抑制」の列は、 KNTC2(NDC80)遺伝子に対す る siRNA配列をそれぞれ HDF細胞に導入し、導入 4日後の細胞生存率を MTTアツセ ィで調べた結果を示す。 HDF細胞における「アポトーシス」の列は、染色が認められ た場合、即ちアポトーシス陽性の場合を YESと表示した。
[図 32]図 32は、実施例にて用いた遺伝子名、 siRNA ID、 siRNA配列、配列番号、 HeLa細胞における mRNA発現、 HeLa細胞における増殖抑制、 HeLa細胞におけるァ ポトーシス、 HDF細胞における mRNA発現、 HDF細胞における増殖抑制、 HDF細胞 におけるアポトーシスを示す。 HeLa細胞における mRNA「発現」の列は、各遺伝子に 対する siRNA配列をそれぞれ HeLa細胞に導入し、導入 48時間後の各 mRNAの発現 を Taqman PCRにより定量した結果を示す。 HeLa細胞における「増殖」抑制の列は、 各遺伝子に対する siRNA配列をそれぞれ HeLa細胞に導入し、導入 4日後の細胞生 存率を MTTアツセィで調べた結果を示す。 HeLa細胞における「アポトーシス」の列は 、染色が認められた場合、即ちアポトーシス陽性の場合を + (プラス）と表示した。
HDF細胞における mRNA「発現」の列は、各遺伝子に対する siRNA配列をそれぞれ HDF細胞に導入し、導入 48時間後の各 mRNAの発現を Taqman PCRにより定量した 結果を示す。 HDF細胞における「増殖」抑制の列は、各遺伝子に対する siRNA配列を それぞれ HDF細胞に導入し、導入 4日後の細胞生存率を MTTアツセィで調べた結果 を示す。 HDF細胞における「アポトーシス」の列は、染色が認められた場合、即ちアポ トーシス陽性の場合を + (プラス）、アポトーシス陰性の場合を—（マイナス）と表示し た。
[図 33]図 33は、 HeLa細胞および TIG3細胞における Pifl、 Mms4、 Topoisomerasellla, Mus81、 SIRT1 (Sirtuin)、 Espl、 MPGゝ Poll, Polm、 EndoVの各遺伝子の mRNA発現の 抑制によるアポトーシスの誘導を示す写真である。各遺伝子に対する siRNAをそれぞ れ HeLa細胞および TIG3細胞に導入し、 TUNEL法を用いて導入 48時間後の HeLa細 胞および導入 72時間後の TIG3細胞におけるアポトーシス誘導を検討した結果を示 す。
[図 34]図 34は、図 33の続きの写真である。
[図 35]図 35は、 HeLa細胞および TIG3細胞における KNTC2(NDC80)遺伝子の mRNA 発現の抑制によるアポトーシスの誘導を示す写真である。 KNTC2(NDC80)遺伝子に 対する siRNAをそれぞれ HeLa細胞および TIG3細胞に導入し、 TUNEL法を用いて導 入 48時間後の HeLa細胞および導入 72時間後の TIG3細胞におけるアポトーシス誘導 を検討した結果を示す。左側の写真にはアポトーシスが誘導された核が写って 、る。 右側の写真には視野に存在する細胞の核が写っている。
[図 36]図 36は、 anti-ssDNA抗体を用いて染色体 DNA中の一本鎖 DNAが露出した領 域を免疫染色した結果を示す写真である。
発明を実施するための最良の形態 [0030] 本発明者らによって、細胞における染色体の安定ィ匕を阻害することにより、癌細胞（ 腫瘍細胞）において特異的にアポトーシスが誘導されることが見出された。
本発明はまず、染色体の安定化を阻害する化合物を含む、癌細胞特異的 (癌細胞 に対する)アポトーシス誘導剤を提供する。
[0031] 本発明のアポトーシス誘導剤は、癌細胞に対して選択的にアポトーシス誘導作用を 有することを特徴とするものである。本発明において「癌細胞特異的」とは、正常細胞 に対しては実質的なアポトーシス誘導作用を示さず、癌細胞に対して実質的にアポト 一シス誘導作用を示すことを言うが、好ましくは、正常細胞に対しては、アポトーシス 誘導作用が見られず、癌細胞に対してアポトーシス誘導作用を有することを言う。
[0032] アポトーシスとは一般的に、生理的条件下で細胞自らが積極的に引き起こす細胞 死を言う。アポトーシスの形態としては、例えば、細胞核の染色体凝集、細胞核の断 片化、細胞表層微絨毛の消失、細胞質の凝集等が挙げられる。従って、本発明にお けるアポトーシス誘導作用とは、例えば、細胞において上記のアポトーシスの形態を 誘導する作用を指すが、必ずしも、上記の形態の誘導のみに限定されるものではな い。当業者においては、細胞のアポトーシス誘導が起こっているか否かについて、適 宜、判断することが可能である。
[0033] 本発明の、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤は、例えばアポトーシス誘導作用を機 序とする抗癌剤 (制癌剤）となるものと考えられる。本発明のアポトーシス誘導剤は、 癌細胞特異的にアポトーシスを誘導し、正常細胞にはアポトーシスが誘導されな 、こ とから、副作用の少ない、安全な抗癌剤となるものと期待される。
[0034] なお、本発明における「抗癌剤」は、制癌剤と表記することも可能である。また、前記 「抗癌剤」は、「抗腫瘍剤」、「抗腫瘍薬剤」または「抗腫瘍医薬組成物」等と表現され る場合ちある。
[0035] 本発明において「染色体の安定ィ匕が阻害される」とは、例えば、染色体 DNA中に 修復されずに残った損傷が蓄積した状態となること等を指し、具体的には、染色体 D NA中に一本鎖が露出した領域が蓄積したり、二本鎖 DNA切断部分が多数出現す る状態を指すが、必ずしもこのような状態に限定されない。
[0036] 本発明における「染色体の安定化」は、例えば、細胞における以下の機能によって 維持されている。従って、以下の機能を阻害することによって、染色体の安定化が阻 害される。
(a)ヒト染色体不安定性疾患関連遺伝子
(b)染色体 DNAの複製開始、複製フォークの進行を含む染色体 DNA複製反応
(c) DNA損傷チヱックポイント
(d)姉妹染色分体凝集 ·分離
(e)塩基除去修復
(f)ミスマッチ除去修復
(g)ヌクレオチド除去修復
(h)相同組換え修復
(i)非相同末端結合修復 (非相同組換え修復）
(j)二本鎖 DNA切断修復
(k) DNA複製後修復 (DNA損傷トレランス）
(l) DNA架橋損傷修復
(m) DNA—タンパク質架橋損傷修復
(n) DNAポリメラーゼ
(o)ヌクレアーゼ
(P)ヌクレオチド浄化
(q)クロマチン構造維持
(r)テロメァ構造維持
[0037] 本発明の好ましい態様において、染色体の安定化阻害とは、例えば、上記の（a) 〜 (r)の 、ずれかの機能を阻害することを挙げることができる。
即ち本発明の好ま 、態様にぉ 、ては、上記 (a)〜 (r)の 、ずれかの機能を阻害 する化合物を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤に関する。
[0038] 本発明にお 、て、上記 (a)〜 (r)の 、ずれかの機能を阻害するためには、例えば、 該機能に関与する遺伝子 (本明細書においては、「染色体安定化関連遺伝子」と記 載する場合あり）の発現を阻害する、もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク 質の機能 (活性)を阻害することが挙げられる。 [0039] 上記の各機能に関与する遺伝子としては、例えば、以下の遺伝子を挙げることがで きるが、上記の各機能に関与する遺伝子であれば、特に制限されない。
[0040] (a)ヒト染色体不安定性疾患関連遺伝子
ヒト染色体不安定性疾患としては、例えば色素性乾皮症、コケイン症、ナイミーヘン 症、血管拡張性失調症、ファンコニー貧血症、あるいは早老症等が挙げられる。これ ら各疾患に関連する遺伝子を以下に記載する。
•色素性乾皮症：（al)XPB、（a2)XPD、（a3)XPG、（a4)XPF、（a5)XPC、（a6)RAD23B、
(a7)CETN2、（a8)RAD23A、 (a9)ERCCl
•コケイン症：（a10)CSA、（all)CSB、 (al2)XAB
'ナイミーヘン症： （al3) NBSl
•血管拡張性失調症： （al4)ATM
•ファンコ-ー貧血症：（a15)FANCA、（al6)FANCC、（al7)FANCD2、（al8)FANCEゝ
(al9)FANCFゝ (a20) FANCG
•早老症：（a21)WRN、（a22)BLM、 (a23)RTS
[0041] (b)染色体 DNAの複製開始、複製フォークの進行を含む染色体 DNA複製反応 (bl)McmlO, (b2)Orcl、（b3)Orc3、（b4)Cdc6、（b5)Cdtl、（b6)Geminin、（b7)Mcm3、 (b8)Mcm4、（b9)Mcm5、（blO)Mcm6、（bll)Mcm7、（bl2)Mcm8、（bl3)Cdc7、 (bl4)Cdc5 、（bl5)Psfl、（bl6)Psf2、（bl7)Psf3、（bl8)Cdc45、 (bl9)Pola pl80、 (b20)Pola p70、 (b21)Pola Sppl(Prim2a)ゝ（b22)RPA70、（b23)RPA34、（b24)PCNA、（b25)Elgl、
(b26)Ligasel、 (b27)Pole Pol2、 (b28)Pole Dpb3、 (b29)Topoisomerase I、（b30)TDPl、 (b31)Orc2、（b32)Orc4、（b33)Orc5、（b34)Orc6、（b35)Mcm2、（b36)Dbf4、 (b37)TopBPl 、（b38)SW5、 (b39)Pola Spp2、（b40)RFCl、（b41)RFC2、（b42)RFC3、（b43)RFC4、 (b44)RFC5、（b45)Pifl、 (b46)Pold p50、 (b47)Pole Dpb2、 (b48)Topoisomerase Iiaゝ (b49)Topoisomerase lib 、（b50)RPA14、（b51)FENl、（b52)DNA2、 (b53)Pold pl25、 (b54)Pold p68、 (b55)Pold pl2、 (b56)Pole Dpb4
[0042] (c) DNA損傷チェックポイント
(cl)ATRゝ（c2)Chkl、（c3)NBSl、（c4)Husl、（c5)Radl、（cll)Mad2、（cl2)BubRl、 (cl2)ATM、（cl3)Rad50、（cl4)Mrell、（cl5)Mdcl、（cl6)53BPl、（cl7)Radl7、
p () () () ()fhl3Rad5hl4Mrelhl5NBShl6Tooisomerasem
() () ()r () () ()h7}3CC3h8Rad52h9Rad54hloRad54BhllBS:Ahl2BS:A2
() () () () () ()hlRad5h2Rad51Lh3Rad51Ch4Rad51L3h5DMCh6XRCC2
Figure imgf000028_0001
P , () () () ()C53NBSC54T0BPC5553BPC56H2AX
, () () ()r () () () ()C46RFC5C47HUSc48Radc49Rad9C50P53c51Rad5c52Mrell
() () () () () ( ()C39weeC40ATRC41ATRIPc42Radl7C43RFC2C44FC3C45R?C4- g () ()f ()f () ()C34chk2c351433etc361433simc37cdc25AC38cdc25----
() (S () () () ()C28RFC3C2RFC4C30RFC5C31ATMC32BRCAC33chk
() () () () () ()c22BubRC23ATRIPC24chk2C25H2AXC26RFCC27RR:2 (hl7)TopoisomeraseIIIb, (hl8)WHIPゝ（hl9)WRN、（h20)BLM、（h21)RecQl、
(h22)RecQ5
[0048] (i)非相同末端結合修復 (非相同組換え修復）
(il)Ku70、（i2)Ku80、（i3)DNA— pkゝ（i4)Ligase4、（i5)XRCC4、（i6)Artemisゝ (i7)WRN [0049] (j)二本鎖 DNA切断修復
(jl)Rad51、 0'2)Rad51D, (j3)Xrcc2、（j4)Rad54、（j5)BRCAl、（j6)Ku80、 0'7)XRCC4,
(j8)Rad52、 0'9)Rad51C, (jlO)Dmcl、（jll)Rad54B、（jl2)DNA- pkゝ（jl3)Ku70、
(jl4)Ligase4、（jl5)Rad51Bゝ（jl6)XRCC3、（jl7)BRCA2、 (jl8)Artemis
[0050] (k) DNA複製後修復 (DNA損傷トレランス）
(kl)Rad6A、（k2)Rad6B、（k3)Radl8、（k4)Ubcl3、 (k5)FBHl
[0051] (1) DNA架橋損傷修復
(11)FANCA、（12)FANCC、（13)FANCD2、（14)FANCE、 (15)FANCF, (16)FANCG
[0052] (m) DNA-タンパク質架橋損傷修復
(ml)TDPl
[0053] (n) DNAポリメラーゼ
(nl)Poliゝ（n2)Polh、（n3)Polqゝ（n4)Polkゝ（n5)Polz(REV3)、（n6)Poll、（n7)Polm、 (n8)Revl
、（n9)Polbゝ（nlO)Polgゝ (nll)Pold p50、 (nl2)Pole Pol2、（nl3)REV7、（nl4)Poln、
(nl5)Pola P180、 (nl6)Pola p70、 (nl7)Pola Sppl、 (nl8)Pola Spp2、 (nl9)Pold p68、
(n20)Pold pl2、 (n21)Pole Dpb2、 (n22)Pole Dpb3、 (n23)Pole Dpb4
[0054] (o)ヌクレアーゼ
(ol)FENl、（o2)TREXl、（o3)TREX2、（o4)Exonucleasel、（o5)SP011、 (o6)ENDO V、
(o7)APEl、（o8)APE2、（o9)Mrell、 (olO)Artemis
[0055] (p)ヌクレオチド浄化
(pl)MTHl、（p2)DUT、 (p3)p53R2
[0056] (q)クロマチン構造維持
(ql)H2AX、（q2)Sir2、 (q3)SIRTl (Sirtuin)
[0057] (r)テロメァ構造維持
(rl)Tin2、（r2)Sir2、（r3)hTert、（r4)TRFl、（r5)TRF2、（r6)Tankyraseゝ（r7)Potl、 (r8)Rapl、 (r9)Pifl
[0058] 上記 (a)〜(r)の各機能に関与する遺伝子としては、好ましくは、後述の実施例に 記載された遺伝子を好適に示すことができる。具体的には、以下に記載の遺伝子を 挙げることができる。
APE2、 ATRゝ BRCA1、 Chkl、 Cdc5、 Cdc6、 Cdc7、 Cdc45、 Cdtl、 CSAゝ CSBゝ CtH8、 DDB1、 DDB2、 DNA2、 DUTゝ Elgl、 EndoV、 Espl、 Exonucleasel、 FBH1、 FEN1、 Geminin、 Husl、 KNTC2 (NDC80)、 Ku80、 Ligasel、 Mad2、 MBD4、 Mcm3、 Mcm4、 Mcm5、 Mcm6、 Mcm7、 Mcm8、 Mcml0、 MGMT、 MLH3、 Mms4、 MPG、 MSH2、 Mus81 、 NBS1、 NEIL2、 NEIL3、 NTH1、 Orel, Orc3、 PARP1、 PCNA、 Pifl、 PMS1、 PMS2、 PNK、 Pola pl80、 Pola p70、 Pola Sppl(Prim2a)、 Polb、 Pold pl25、 Pole Dpb3、 Pole Dpb4、 Pole Pol2、 Poli、 Poll, Polm、 Psfl、 Psf2、 Ps 、 Radl、 Radl8、 Rad23A、 Rad23B 、 Rad51、 Rad51D、 Rad54、 Rad6A、 RPA34、 RPA70、 Sccl、 Scc3、 Sir2、 SIRT1 (Sirtuin入 TDG、 TDP1、 TIMELESS^ Tin2、 Topoisomerase I、 Topoisomerase IIIa、 Topoisomerase Illbゝ Ubcl3、 UNGゝ XAB2、 XPCゝ XPFゝ XPGゝ Xrcc2、 XRCC4
[0059] 本発明の好ま 、態様にぉ 、ては、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の 、 ずれかに記載の遺伝子）の発現、または、該遺伝子によってコードされるタンパク質 の機能を抑制する化合物を有効成分として含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘 導剤を提供する。
[0060] 本明細書において記載された遺伝子名は、広く一般的に知られた名称であること から、当業者であれば、該遺伝子の塩基配列についての情報を、遺伝子名を基に、 公共の文献データベース、あるいは、遺伝子データベース（例えば、 GenBank等）か ら、適宜取得することができる。
[0061] 本発明の上記のいずれかに記載の各遺伝子の塩基配列、および該遺伝子によつ てコードされるタンパク質のアミノ酸配列の具体例を、配列表に掲載する。上記遺伝 子の配列情報が取得可能な NCBIのァクセッション番号、および該番号によって取得 される遺伝子の塩基配列の配列番号との関係を表 1〜16に示す。また、本発明の上 記の各遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の一例についても、配 列表に示す。 1]
Figure imgf000031_0001
[ε挲] 900]
Figure imgf000032_0001
68T.60/S00Z OAV
Figure imgf000033_0001
t'l6900/S00idf/13d 68 60/S00Z ΟΛ\ [0065] [表 4]
Figure imgf000034_0001
[0066] [表 5]
Figure imgf000035_0001
6]
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000036_0002
9ε 68T.60/S00Z OAV
Figure imgf000037_0001
8]
Figure imgf000038_0001
Figure imgf000039_0001
Figure imgf000040_0001
6S 68T.60/S00Z OAV
Figure imgf000041_0001
[n [ oo]
017 68T.60/S00Z OAV
Figure imgf000042_0001
68 60/S00Z OAV \_nW\ [e oo]
Figure imgf000043_0001
[woo]
317 68T.60/S00Z OAV
Figure imgf000044_0001
15]
zoo]
Figure imgf000045_0001
1-T6900/S00Zdf/13d 68U60/S00Z OAV
Figure imgf000046_0001
なお、上記に記載の各遺伝子は、塩基配列中の多型の有無等により、同一の遺伝 子であっても複数のァクセッション番号が付与されて 、る場合がある。この「多型」とは 、一塩基の置換、欠失、挿入変異力 なる一塩基多型 (SNPs)に限定されず、連続す る数塩基の置換、欠失、挿入変異も含まれる。従って、上記の各遺伝子の塩基配列 としては、必ずしも表 1〜表 16に記載のァクセッション番号によって取得される配列、 あるいは、配列番号： 1〜637、 810〜908に記載された配列に限定されない。同様 に、上記の各遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列も、配列番号: 63 8〜723、 909〜973に記載されたアミノ酸配列に特に限定されない。
[0079] 本発明の上記タンパク質は、配列番号： 638〜723、 909〜973〖こ記載されたアミ ノ酸配列に限定されず、該アミノ酸配列において、 1もしくは複数のアミノ酸残基が付 カロ、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、配列番号: 63 8〜723、 909〜973に記載されたタンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれ る。
[0080] また、本発明の染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の各遺伝子）は特に制限 されるものではないが、通常、動物由来であり、より好ましくは哺乳動物由来であり、 最も好ましくはヒト由来である。
[0081] 即ち、本発明はヒトの癌細胞についての特異的なアポトーシス誘導剤に限定されず 、ヒト以外の動物の癌細胞に対するアポトーシス誘導剤も本発明に含まれる。従って 、本発明の遺伝子には、上記の各遺伝子についてのヒト以外の動物におけるホモ口 グ（カウンターパート）遺伝子が含まれる。例えば、配列番号： 1〜637、 810〜908に 記載の各塩基配列力 なる遺伝子に対応する他の動物における内在性の遺伝子（ ホモログ等）が含まれる。該塩基配列からなる DNAに対応する他の動物の内在性の DNAは、一般的に、該配列番号に記載の DNAと高い相同性を有する。高い相同性と は、 50%以上、好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 80%以上、より好ましくは 90% 以上 (例えば、 95%以上、さらには 96%、 97%、 98%または 99%以上)の相同性を意 味する。この相同性は、 mBLASTアルゴリズム (Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。また、該 DNAは、生体内から単離した場 合、該配列番号に記載の DNAとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズすると考え られる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2 X SSC、 0.1%SDS、 50°C」、 「2XSSC、 0.1%SDS、 42。C」、「1XSSC、 0.1%SDS、 37°C」、よりストリンジェントな条件 として「2XSSC、 0.1%SDS、 65°C」、「0.5XSSC、 0.1%SDS、 42°C」および「0.2XSSC、 0.1%SDS、 65°C」の条件を挙げることができる。当業者においては、他の動物におけ る本発明の上記の各遺伝子に相当する内在性遺伝子に関する情報 (配列等）につ V、て、配列表に掲載された塩基配列を基に適宜取得することが可能である。
[0082] また本発明は、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記のいずれかに記載の遺伝 子)の発現を抑制する化合物を提供する。
[0083] 本発明の染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の 、ずれかに記載の遺伝子）の 発現を抑制する化合物としては、例えば、該遺伝子に対して RNAi(RNA interferance ； RNA干渉)効果を有する二本鎖 RNAを好適に挙げることができる。一般的に RNAiと は、標的遺伝子の mRNA配列と相同な配列からなるセンス RNAおよびこれと相補的な 配列からなるアンチセンス RNAとからなる二本鎖 RNAを細胞内に導入することにより、 標的遺伝子 mRNAの破壊を誘導し、標的遺伝子の発現が阻害される現象を言う。
[0084] RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もある力 DICERといわれる酵素（ RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖 RNAと接触し、二本鎖 RNAが small interfering RNAまたは siRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられ ている。本発明における RNAi効果を有する二本鎖 RNAには、この siRNAも含まれる。 さら〖こ、本発明の二本鎖 RNAを発現し得る DNAもまた、本発明に含まれる。
[0085] 本発明の好ま 、態様にぉ 、ては、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の 、 ずれ力〖こ記載の遺伝子）の発現を RNAi効果により抑制し得る RNA(siRNA)であつて、 配列番号： 724〜809、 974〜 1063のいずれかに記載の塩基配列からなる RNAと、 該 RNAと相補的な配列カゝらなる RNAとがハイブリダィズした構造を含む二本鎖 RNAを 有効成分として含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤を提供する。
[0086] 例えば、配列番号： 724に記載の塩基配列（5'- ggaaaaucuggccacucucTT- 3，）を 含む本発明の siRNAとは、以下のような構造の RNA分子を例示することができる。
5 -ggaaaaucuggccacucuc-3
Ι Ι Ι Ι ΙΙ Ι ΙΙΙ Ι ΙΙΙ Ι Ι Ι Ι Ι
3 -ccuuuuagaccggugagag-5
(上記「I」は水素結合を表す。） [0087] なお、上記 RNA分子において一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構 造を有する siRNA(shRNA)も本発明に含まれる。即ち、分子内において二本鎖 RNA構 造を形成し得る分子もまた本発明に含まれる。
[0088] 例えば、
5 - ggaaaaucuggccacucuc、xxxx)n gagaguggccagauuuucc- 3' のよつな分子もま 7こ本発 明に含まれる。（上記「(xxxx)n」は任意塩基および配列数力 なるポリヌクレオチドを 表す。）
[0089] 上記 siRNAの好ま U、態様としては、染色体安定化関連遺伝子 (例えば上記の！/、 ずれ力〖こ記載の遺伝子）の発現を RNAi効果により抑制し得る RNA(siRNA)であつて、 配列番号： 724〜809、 974〜 1063のいずれかに記載の塩基配列からなる RNAと、 該 RNAと相補的な配列カゝらなる RNAとがハイブリダィズした構造を含む二本鎖 RNAを 好適に示すことができる。ただし、二本鎖 RNAの末端において、例えば、 1もしくは複 数の RNAが付加もしくは欠失された構造の二本鎖 RNAもまた、本発明に含まれる。
[0090] 即ち本発明は、本発明の二本鎖 RNAを発現し得る DNA (ベクター）を提供する。本 発明の上記二本鎖 RNAを発現し得る DNA (ベクター）は、通常、該ニ本鎖 RNAの一 方の鎖をコードする DNA、および該ニ本鎖 RNAの他方の鎖をコードする DNA力 そ れぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有する DNAである。本発明の 上記 DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、容易に作製する ことができる。より具体的には、本発明の RNAをコードする DNAを公知の種々の発現 ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能 である。
[0091] RNAiのために使用される RNAは、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の 、ず れかに記載の遺伝子)もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一 (相同）である必要 はな 、が、完全な同一湘同)性を有することが好ま 、。
[0092] 本発明の RNAi効果を有する二本鎖 RNAは、通常、染色体安定化関連遺伝子 (例 えば、上記のいずれかに記載の遺伝子）の mRNAにおける連続する任意の RNA領域 と相同な配列力もなるセンス RNA、および該センス RNAに相補的な配列からなるアン チセンス RNA力 なる二本鎖 RNAである。上記「連続する任意の RNA領域」の長さは 、通常 20〜30塩基であり、好ましくは 21〜23塩基である。例えば、配列番号： 724〜8 09、 974〜1063のいずれかに記載の RNAを一方の鎖とする siRNAの長さを挙げるこ とができる力 必ずしもこれらの長さに限定されない。しかしながら、そのままの長さで は RNAi効果を有さな!/、ような長鎖の RNAであっても、細胞にお!、て RNAi効果を有す る siRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖 RNAの長さは、 特に制限されない。また、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記のいずれかに記 載の遺伝子）の mRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖 RNAを 、例えば、予め DICERで分解させ、その分解産物を本発明のアポトーシス誘導剤とし て利用することが可能である。この分解産物には、 RNAi効果を有する二本鎖 RNA分 子 (siRNA)が含まれることが期待される。この方法によれば、 RNAi効果を有することが 期待される mRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、 RNAi効果を有する染 色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の 、ずれかに記載の遺伝子）の mRNA上の領 域は、必ずしも正確に規定される必要はない。ただし、より好ましくは、後述の実施例 にお 、て用いた各種 siRNAを好適に示すことができる。
[0093] また、通常、末端に数塩基のオーバーハングを有する二本鎖 RNAは、 RNAi効果が 高いことが知られており、本発明の二本鎖 RNAは、末端に数塩基のオーバーハング を有することが望ましい。このオーバーハングを形成する塩基の長さは特に制限され ない。また、このオーバーハングは、 DNAおよび RNAのいずれであってもよい。好まし くは、 2塩基のオーバーハングを例示することができる。本発明においては例えば、 TT (チミン力 ¾個）、 UU (ゥラシルが 2個）、その他の塩基のオーバーハングを有する二 本鎖 RNA (最も好ましくは 19塩基の二本鎖 RNAと 2塩基 (TT)のオーバーハングを有す る分子）を好適に用いることができる。本発明の二本鎖 RNAには、このようにオーバー ハングを形成する塩基力 ¾NAであるような分子や、標的 mRNA配列と相同な配列も含 まれる。
[0094] 例えば、オーバーハング部分の塩基が TTである場合には、本発明の siRNA分子と しては、
b -ggaaaaucuggccacucucTT-3'
l l l l l l l l l l l l l l l l l l l
3 -TTccuuuuagaccggugagag-5 のような分子 (3'側に TTが付加された分子)を例示することができる。
本発明の上記「染色体安定化関連遺伝子に対して RNAi効果を有する二本鎖 RNA 」は、当業者においては、該ニ本鎖 RNAの標的となる染色体安定ィ匕関連遺伝子 (例 えば、上記のいずれかに記載の遺伝子）の塩基配列をもとに、適宜作製することがで きる。染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子）の塩基 配列は、上述のように公共の遺伝子データベースから容易に取得することができる。 一例を示せば、配列番号： 1〜637、 810〜908のいずれかに記載の塩基配列をもと に、本発明の二本鎖 RNAを作製することができる。即ち、配列番号： 1〜637、 810〜 908の 、ずれかに記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物である mRNAの任意 の連続する RNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖 RNAを作製することは、 当業者においては、容易に行い得ることである。また、該配列の転写産物である mRNA配列から、より強い RNAi効果を有する siRNA配列を選択する方法は、例えば 文献（Reynold et al. Nature biotechnology 22. 326-330 (2004)、 Ui-Tei et al. Nucleic
Acids Res. 32. 936-948 (2004)、 Boese Q, Leake D, Reynolds A, Read S, Scaringe SA, Marshall WS, Khvorova A. Mechanistic insights aid computational short interfering RNA design.Methods Enzymol. 2005;392:73-96., Snove O Jr, Nedland M, Fjeldstad SH, Humberset H, Birkeland OR, Grunfeld T, Saetrom P. Designing effective siRNAs with off— target control. Biochem Biophys Res Commun.
2004;325(3):769- 73.、 Yiu SM, Wong PW, Lam TW, Mui YC, Kung HF, Lin M, Cheung YT. Filtering of Ineffective siRNAs and Improved siRNA Design Tool.
Bioinformatics. 200515;21(2): 144— 51、 Chalk AM, Wahlestedt C, Sonnhammer EL. Improved and automated prediction of effective siRNA. Biochem Biophys Res Commun. 2004;319(1):264- 74.、 Amarzguioui M, Prydz H. An algorithm for selection of lunctional siRNA sequences. Biochem Biophys Res Commun.
2004;316(4):1050- 8.、 Sioud M, Leirdal M. Potential design rules and enzymatic synthesis of siRNAs. Methods Mol Biol. 2004;252:457-69.)等を参考にして、当業者 においては、適宜実施することが可能である。また、一方の鎖 (例えば、配列番号： 7 24〜809、 974〜1063のいずれかに記載の塩基配列）が判明していれば、当業者 においては容易に他方の鎖 (相補鎖）の塩基配列を知ることができる。 siRNAは、当 業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、 所望の RNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することが可能であ る。
[0096] また、本発明における siRNAは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド
(RNA)でなくともよい。即ち、本発明において、 siRNAを構成する 1もしくは複数のリボ ヌクレオチドは、対応するデォキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」と は、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種 (アデニン、グァニン、シトシン、チ ミン (ゥラシル)）であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応 するデォキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデォキシリボヌクレオチドのこと を言う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは 2〜5個程度の少数を 指す。
[0097] また、本発明の二本鎖 RNAの基となる遺伝子 (標的遺伝子）の配列は、必ずしも遺 伝子全長の塩基配列が判明して 、る必要はな 、。選択すべき任意の連続する RNA 領域（例えば、 20〜30塩基）が判明していればよい。従って、 EST (Expressed Sequence Tag)等のように mRNAの一部は判明している力 全長が判明していない遺 伝子断片からも、該断片の塩基配列を基に本発明の二本鎖 RNAを作製することが可 能である。以下に、 GenBankデータベースにおいて、上記のいずれかに記載の遺伝 子と高い相同性を示した EST配列のァクセッション番号を、各遺伝子名ごとに分けて 記載する。但し、これらは多数存在する EST配列のうちの一例に過ぎず、当業者にお いては、適切な EST断片に関する情報を公共のデータベース力も容易に取得するこ とがでさる。
[0098] McmlO : BQ230201、 CK000876, BX324498, BM466246, BI086715, BE561621、
BM781578, BE397209, BM781561, BF797760, BE268770, AI133628、 BI860489、 CA488245, BE018388、 BM794417, AI005288、 AV759891、 BE536223, AI078425, BI023355、 CB120985、 AA305452、 BX324497, AI636632、 CB143720, BM465842, BM833978, AI962581、 BE206240, BE536858、 BQ432059, BX099770, BX346400, BE890219、 BU542039, AI750442, BU542210, BQ929138、 BG323332, AA312197, BG942019, BM755471, AA091854, BX346399、 BG493975, T97047, BU615340、 BG777950, BU618352, BG323324
[0099] Orel： BM556110、 AL558857、 AL528479, AL530422, AU125429, BQ229865,
BX370588, AL563154、 BU552785, BQ055912、 CD642483, BE903488、 BU854876, BM908744, BF205157, BX372245, BQ230059、 BX110476、 BM743410, BG821765 、 AL530421, BI222366, BU198520, BF796650、 BM476715, AL552393、 AU127396 、 BM740840, BE781976, AL580583、 BG391980、 BM852299, CD654548、
BQ423782, AW378723, AL582531、 AL561250、 BU194186、 BQ048846、 BG822626 、 AL552501、 BU854819、 BQ433201, BE782505, BG257286, BX281133、 CF140351 、 BF795920, BG390855、 BG831652、 BF794915, BF797918, BG325714, AI651655、 BM833692, BQ883238、 BX474463, AI038384、 AU129034, BP431296, BG328342, BP430683、 H51719、 AI739661、 T96858、 BE782390, BU630113、 BG025019、 BE937466, AA332534, AI343281、 AU149094, BP430714, BI087773, AW393255、 AU151220, BE076727, AI452809、 AW877655, AI003527, AI391554、 AW602975, AW877662, AA633915、 BF108860、 AU149996、 T96859、 R83277
[0100] Orc3 : BM478060、 BU509511、 BQ718539、 BU153003、 AL533919、 BQ220405,
AU118962、 BM550235, BG187255, AU117920, BQ719965、 BQ716606、 BQ953945 、 BU166296, AU119182、 BI769170, BI819545、 CD655888、 BX409716, BI520392, BG214275, BI770086, BI091781、 BM802602, BG187780, BU170385, BI769508、 BX433033、 BX507848, AU124361, BX488094, BM785800, BG205874, CD679490 、 BX490513、 CB153029、 AW967051、 BM826548, AU139285、 BG572634,
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[0101] Cdc6 :AL562624、 AL521818、 BM465884, BQ064897, BX451346, BX349920,
BU846236, BQ675107, BI260747, BU633837, BG256606、 BM464160, BQ228599, BG252312, BM559225, AL521819、 BE907412, BQ070080、 BU619893、 BF698043、 BE741201, AL526150、 BG765988、 BU173127, BF699051、 AA502608, BG165110、 AU129648, CA488634、 BM450676, BF028885、 CB135870、 BF185000、 BG026757, CA429336, BF977528, BF240966, BG766090、 AI478744, BM803439, AA045217, AA813386、 BE565947, BF571756, AL710150、 BF307679, AA723372, BG721945, AI433558、 BF208758, BI559407, BX482661, BF102841, BE779410, BQ441118、 N69246、 BF310791、 CF123750, BI006635、 BQ775002, AA907374, BM011340, CA429634, W03300、 BM845715, AA113790、 BF210909、 BM706052, H59204、 BI255053、 AI424746, H59203、 AI052065、 BE073887, BE550416、 AI341585、 BG025851、 BF221502, T83032、 T90351、 BG720011, AI953729, AI699473, BF115521、 BF223422, AI808683、 BE085836、 AI699980、 BX355209, BE086769, AW518847, AA099980、 BE965778, AA836395、 AI766778, BE869748, AI802324, AA584340、 BE693538、 AI567411
[0102] Cdtl : BX332414、 BQ935210、 BU931977, BM811548, BU849056、 BQ062875,
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[0117] Pola p70 : BU508486、 AL543898、 AU121118、 CB134498, AU132112, BX327138, BQ883339、 CB121808、 AW674983, CB149914, CB140712, CB152927, BQ882043 、 AL570197, BF210579, BE835570、 BE818389、 AA379019, BE837514, BQ312037 、 BE837504, AI354751, BM475170, CB122291, AL044294, BE771020, AA355814 、 BQ351870、 AW589637、 AA383406, BE717631, R72191, BX117096, AA828105, BF888988、 AI261685、 BE163167、 BE817842, CD000139、 CB999470, BF899310、 BG926114
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[0120] RPA34 : BX333932、 BQ064852, BX442975, BQ069120、 BQ943330、 BQ063763、
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[0123] FEN1 : BU538692、 BX397634, BQ058498、 BX424210, BX333531、 BU170538,
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Γ8930ΖΗ r8099S8W ΓΠ½^εΗ9 Γ32 0^Η9 Γ8ΐ8 εεΗ9 Γ6ΐ8ε3α
Figure imgf000096_0001
ree^89Av Γ6ε^ε89Λν r o^839 rs9½osiv Γ9ΐ996ζιν rzei80ziv
Γ669ΐΟΖΙΥ Γ29ΐ969ΙΥ ΐ^80ΐ93ΐν rZS868SIV rS9ST0WV rS2Z89SIV ΓΐΟΖ393ΐν、I'9 6 IV、I'98ISSSIV ^VfZLZZfW 'SIOSISIV Vmi6ZW 、ΐ rS2286TIV、Γΐ9ΐε IV Γ6½ΖΠΧ9、I'6S0I9IIV ΓΖ2ΐ8Ζ0ΐν roezz2oiv rozz^ooiv ri92686w re ^962 v rie^62 v 'TT^ SHD
ΓΖ86^Ζΐΐν r^8 S0 V r^ 60SWD rS00T80 V T 6S080 V ^VULl Z re^T9^Z F9½800 V 2"Z6TS6SX9 2^ 00^X9 2" S 2SSX9 2"9S 2SSX9 2"T^9 SX9 2 ^9 SX9 2 ^2^9SX9 2"6S2^9SX9 2"68ZS9SX9 2"88ZS9SX9 2"6SS62SX9 T^T8S669D F S½869D r869292VV rS8^92VV r6S8T92W riso8S2w r s 9S2w rs9oes8n9 r66sessvv rs62S6ivv r 60S6iw
Γ6 9Π8 ΐ εΐ929Π9 Γ8ΐ3Ζ8Ζ09、IHS6 8、I'S68 環 8 rSTS9T 09
、™εε a
Figure imgf000096_0002
roe 6is09 rzos96 rsi296 、ΓΟΟ^6Λ\ Γ626½Λ\ Γ89ΐΖ00θ9 Γ½ ^00θ9 Γ^ΐ98Λ\ ΐ "229828^9 r^ SS6VV r^T9TS8VV 9SW)S8VV Γ8Ζ8Π8νν r98^808W r T2 9 W FS9S 0H rSTS2^ W r6222^ W T89S88SW Γ 83^Ι r 98S8^W rS06S2WV rS9S2^W ΐ^8 0ΐ^νν r^8T9SW r802T9SW 'riSSSSSW rS92S2SVV r6S0T2SW rZ900ISW F69S88WD rnS6SWD F8 ^82WD F98292WD
rSTS8 2W ΓΖ6Ζ9ΐ8Ι9 ΓΖ2Π28Ι9 Γ3ΐ^8ΐ8Ι9 Γ98ΐ8ΐ8Ι9 Γ62266Ν Γ9εΖ36Η9 rSS S6H9 Γ238023Ι9 Γ922023Ι9、I'8S9 8 Γ3ΖΠ92Ι9
Γ32ΐ322Ι9 ΓΠ½ΐΟΙ9、 S99 ΐ "96983019、I'69S醒 8 T 06S80I9 ΐ 9299Ν、rS8SI8。、ΐ·0雨 8。 Γ99^Λ\ F 6S9^ Γΐ^9^Λ\、Γ ΐ6ε 9 ΐ "9^9028^9、I'ZUS6環 8 ΐ 63ΐ30 9 Γ3039^Λ\ Γ62½ΐ 9 Γ69829Ζ 9
Γ8903ΐΟ 9 Γ663Ζ8Ζ 9 Γ9ε030Λ\ Γ939606Ι9 ΓΐΟΖΐΖ8Ι9 FS6½6 9
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[0195] 本発明の好ましい態様においては、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記のい ずれかに記載の遺伝子)もしくは上記各 ESTに対応する mRNAにおける、連続する RNA領域を一方の鎖とする RNAi効果を有する二本鎖 RNA、を含むアポトーシス誘導 剤を提供する。
[0196] 上述のように上記のいずれかに記載の遺伝子には、同一の遺伝子であっても種々 の多型が含まれている場合がある。当業者においては、配列番号： 1〜637、 810〜 908のいずれかに記載の塩基配列もしくは上記の EST配列に対し、例えば、上記の いずれかに記載の遺伝子に関する公共の多型データベースからの情報をカ卩味し、 RNAi効果を有することが期待される RNAの配列を適宜設計することができる。このよ うな RNAを含むアポトーシス誘導剤もまた本発明に含まれる。また、当業者において は、複数種作製された本発明の二本鎖 RNAから、最適な RNAi効果を有する RNAを 適宜選択してアポトーシス誘導剤とすることも可能である。
[0197] 本発明の上記「RNAi効果を有する二本鎖 RNA」の具体例として、図 1〜図 4および 図 28〜32に記載の塩基配列（配列番号： 724〜809、 974〜1063のいずれ力に記 載の塩基配列）を該ニ本鎖 RNAの一方の鎖とする siRNA分子（配列番号： 724〜809 、 974〜1063のいずれかに記載の塩基配列と、その相補鎖からなる siRNA分子）を 挙げることができる。即ち本発明の一つの態様としては、 RNAi効果を有する二本鎖 RNAの一方の鎖が配列番号： 724〜809、 974〜 1063のいずれかに記載の塩基配 列からなる siRNA分子（配列番号： 724〜809、 974〜1063のいずれ力〖こ記載の塩 基配列と、その相補鎖力 なる siRNA分子)を有効成分として含む、癌細胞特異的ァ ポトーシス誘導剤を提供する。
また、上記 siRNA分子において二本鎖を形成する領域の一方の RNA配列は、必ず しも、上記の配列番号： 724〜809、 974〜1063のいずれかに記載の塩基配列と完 全に同一であることに制限されない。例えば、該塩基配列において 1もしくは複数の 塩基が改変された配列力 なる塩基配列を二本鎖 RNAの一方の鎖とする siRNA分子 であっても、本発明の遺伝子の発現を抑制する機能を有するものであればょ ヽ。 即ち、本発明の好ましい態様において、 RNAi効果を有する二本鎖 RNAとは、該ニ 本鎖の一方の鎖が配列番号： 724〜809、または 974〜1063のいずれかに記載の 塩基配列において 1もしくは複数の塩基が付加、欠失、置換された塩基配列であり、 他方の鎖が該塩基配列と相補的な塩基配列であることを特徴とする二本鎖 RNAであ つて、本発明の遺伝子の発現を抑制する機能を有する二本鎖 RNAである。なお、上 記「複数」とは、通常、少数を意味し、より具体的には、 2〜10を意味し、好ましくは 2 〜5を意味し、より好ましくは 2〜3を意味する。
[0198] また、本発明の好ましい態様としては、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の V、ずれかに記載の遺伝子）の発現を抑制する化合物が以下の（a)または (b)である、 アポトーシス誘導剤を提供する。
(a)本発明の染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の ヽずれかに記載の遺伝子） の転写産物、またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b)本発明の染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の ヽずれかに記載の遺伝子） の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する核酸
[0199] 本発明における「核酸」とは RNAまたは DNAを意味する。特定の内在性遺伝子の発 現を阻害 (抑制)する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によ く知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以 下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、 RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド 形成による転写阻害、合成の進みつつある RNAとのハイブリッド形成による転写阻害 、イントロンとェキソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、 スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、 mRNAとの ノ、イブリツド形成による核力も細胞質への移行阻害、キヤッビング部位やポリ (A)付カロ 部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのノ、ィ ブリツド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイプリ ッド形成による翻訳阻害、 mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形 成によるペプチド鎖の伸長阻害、および発現制御領域と転写調節因子との相互作用 部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス 核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺 伝子の発現を阻害する (平島および井上著、新生化学実験講座 2核酸 IV遺伝子の 複製と発現、 日本生化学会編、東京化学同人、 1993年、 p.319-347)。
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により染色体安定 化関連遺伝子 (例えば、上記の ヽずれかに記載の遺伝子）の発現を阻害してもよ 、。 一つの態様としては、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記のいずれかに記載の 遺伝子)の mRNAの 5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれ ば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは 3'側の非翻 訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、染色体安定化関連遺伝 子 (例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子)の翻訳領域だけでなぐ非翻訳領域 の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に 含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、 好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。また臨床応用を考慮 する場合、使用されるアンチセンス核酸は、通常、合成オリゴマーであり、ヌクレア一 ゼ分解に対する感受性を減らし、且つアンチセンス核酸としての活性を維持するため に、リン酸エステル結合部の 0 (酸素）を S (硫黄）に置換した Sオリゴ (ホスホロチォェ ート型オリゴヌクレオチド）の利用が一般に知られている。この Sオリゴは現在ではアン チセンス薬として、直接患部に注入される臨床試験が行なわれている。本発明にお いてもこの sオリゴを好適に使用することができる。アンチセンス核酸の配列は、標的 遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ま U、が、遺伝子の発現を有 効に抑制できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写された RNAは、標的遺伝子 の転写産物に対して好ましくは 90%以上、最も好ましくは 95%以上の相補性を有す る。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチ センス核酸の長さは少なくとも 15塩基以上であり、好ましくは 100塩基以上であり、さら に好ましくは 500塩基以上である。
[0201] また、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の 、ずれかに記載の遺伝子）の発 現の阻害は、リボザィム、またはリボザィムをコードする DNAを利用して行うことも可能 である。リボザィムとは触媒活性を有する RNA分子を指す。リボザィムには種々の活 性を有するものが存在し、 RNAを部位特異的に切断するリボザィムの設計も可能であ る。リボザィムには、グループ Iイントロン型や RNase Pに含まれる Ml RNAのように 400 ヌクレオチド以上の大きさのものもある力 ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる 40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子、蛋白 質核酸酵素、 1990年、 35、 2191)。
[0202] 例えば、ハンマーヘッド型リボザィムの自己切断ドメインは、 G13U14C15という配列 の C15の 3'側を切断する力 その活性には U14と A9との塩基対形成が重要とされ、 C15の代わりに A15または U15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M.ら著 、 FEBS Lett, 1988年、 228、 228.) 0基質結合部位が標的部位近傍の RNA配列と相 補的なリボザィムを設計すれば、標的 RNA中の UC、 UUまたは UAという配列を認識 する制限酵素的な RNA切断リボザィムが作出できる（Koizumi, M.ら著、 FEBS Lett, 1988年、 239, 285.、小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素、 1990年、 35, 2191.、 Koizumi, M.ら著、 Nucl Acids Res、 1989年、 17, 7059.)。
[0203] また、ヘアピン型リボザィムも本発明の目的に有用である。このリボザィムは、例え ばタバコリングスポットウィルスのサテライト RNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986年、 323, 349.)。ヘアピン型リボザィムからも、標的特異的な RNA切 断リボザィムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y. & Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋，化学と生物， 1992, 30, 112.)。このように、リボザィム を用いて本発明における染色体安定ィ匕関連遺伝子の転写産物を特異的に切断する ことで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
[0204] さらに本発明は、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記のいずれかに記載の遺 伝子）によってコードされるタンパク質の機能 (活性)を抑制する化合物を有効成分と して含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤に関する。
[0205] 本発明の染色体安定化関連遺伝子によってコードされるタンパク質には、該タンパ ク質のアミノ酸配列において 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され たアミノ酸配列を含む、染色体安定化関連遺伝子によってコードされるタンパク質の 変異タンパク質もしくはホモログタンパク質であって、染色体安定化関連遺伝子によ つてコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。ここで「機能的 に同等なタンパク質」とは、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記のいずれかに記 載の遺伝子）によってコードされるタンパク質における機能 (例えば、上述の（a)〜（s )のいずれかの機能)と同様の機能を備えたタンパク質である。
[0206] あるいは染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の ヽずれかに記載の遺伝子）に よってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して、たとえば 90%以上、望ましくは 95%以上、更に望ましくは 99%以上の相同性を有するタンパク質を、染色体安定化関 連遺伝子によってコードされるタンパク質と機能的に同等なタンパク質として示すこと ができる。
[0207] 本発明の好ま 、態様にぉ 、ては、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の 、 ずれかに記載の遺伝子）によってコードされるタンパク質の機能 (活性)を抑制する化 合物が、以下の（a)〜（c)のいずれかに記載の化合物である、アポトーシス誘導剤を 提供する。これらの化合物は、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記のいずれか に記載の遺伝子）によってコードされるタンパク質の機能もしくは活性を阻害する (低 下させる）ことにより、癌細胞に対してアポトーシス誘導作用を有するものと考えられる
(a)本発明の染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の ヽずれかに記載の遺伝子） によってコードされるタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有する変異体 タンパク質 (b)本発明の染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の ヽずれかに記載の遺伝子） によってコードされるタンパク質に結合する抗体
(c)本発明の染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の ヽずれかに記載の遺伝子） によってコードされるタンパク質に結合する低分子化合物
[0208] 上記 (a)にお 、て「ドミナントネガティブの性質を有する変異体タンパク質」とは、内 在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有する、染色体安 定ィ匕関連遺伝子 (例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子）によってコードされるタ ンパク質変異体を指す。
[0209] また上記 (b)の「抗体」は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。
ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然もしくは 組換えの染色体安定ィ匕関連遺伝子 (例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子）によ つてコードされるタンパク質、あるいは GSTとの融合タンパク質として大腸菌等の微生 物において発現させたリコンビナントである染色体安定ィ匕関連遺伝子によってコード されるタンパク質、またはその部分ペプチドをゥサギ等の小動物に免疫し血清を得る 。これを、例えば、硫安沈殿、プロテイン Aカラムおよびプロテイン Gカラム、 DEAEィォ ン交換クロマトグラフィー、染色体安定ィ匕関連遺伝子によってコードされるタンパク質 や合成ペプチドをカップリングしたァフィユティーカラム等により精製することにより調 製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、染色体安定化関連遺伝子 (例 えば、上記のいずれかに記載の遺伝子）によってコードされるタンパク質若しくはその 部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これ をすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコー ル等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞 (ハイブリドーマ）の中から
、染色体安定化関連遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体を産生 するクローンを選択する。次いで、得られたハイプリドーマをマウス腹腔内に移植し、 同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロ ティン Aカラムおよびプロテイン Gカラム、 DEAEイオン交換クロマトグラフィー、染色体 安定ィ匕関連遺伝子によってコードされるタンパク質や合成ペプチドをカップリングした ァフィユティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。 [0210] 本発明の抗体は、本発明の染色体安定ィ匕関連遺伝子 (例えば、上記のいずれか に記載の遺伝子）によってコードされるタンパク質に結合し得るものであれば特に制 限されず、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかに、ヒト抗体、遺伝子 組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物等も含まれる。
[0211] 抗体取得の感作抗原として使用される本発明の染色体安定化関連遺伝子 (例えば 、上記のいずれかに記載の遺伝子）によってコードされるタンパク質は、その由来とな る動物種に制限されないが哺乳動物、例えばマウス、ヒト由来のタンパク質が好ましく 、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。
[0212] 本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質の他 に該タンパク質の部分ペプチドであってもよ 、。タンパク質の部分ペプチドとしては、 例えば、タンパク質のアミノ基 (N)末端断片やカルボキシ (C)末端断片が挙げられる 。本明細書における「抗体」とは通常、タンパク質の全長又は断片に反応する抗体を 意味する。
[0213] また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球 、例えば EBウィルスに感染したヒトリンパ球を in vitroでタンパク質、タンパク質発現細 胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエロー マ細胞、例えば U266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を 産生するハイプリドーマを得ることもできる。本発明の抗体を人体に投与する目的 (抗 体治療)で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が 好ましい。
[0214] 染色体安定化関連遺伝子によってコードされるタンパク質と結合することが既に知 られている化合物として、例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子によってコードさ れるタンパク質に対するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体を挙げることができ る。
[0215] 本発明の染色体安定ィ匕関連遺伝子 (例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子）の 発現もしくは該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能 (活性)を抑制する化合 物は、天然または人工の化合物のいずれであってもよい。通常、当業者に公知の方 法を用いることによって製造または取得 ·単離可能な化合物である。例えば、有機化 合物、無機化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、糖などの単一化合物、あるいは、化 合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発 酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等もしくは該抽出物から単離精製さ れる化合物を挙げることができる。
[0216] さらに本発明は、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリーニング方法を提供す る。
本発明の上記方法の好ましい態様においては、染色体安定化関連遺伝子 (例えば 、上記のいずれかに記載の遺伝子）によってコードされるタンパク質またはその部分 ペプチドと被検化合物との結合活性を指標とする方法である。通常、染色体安定ィ匕 関連遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチドと結合する化合 物は、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子）によつ てコードされるタンパク質の機能を阻害する効果を有することが期待される。
[0217] 本発明の上記方法においては、まず、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の いずれかに記載の遺伝子）によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチド と被検化合物を接触させる。染色体安定化関連遺伝子によってコードされるタンパク 質またはその部分ペプチドは、被検化合物との結合を検出するための指標に応じて 、例えば、染色体安定化関連遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分 ペプチドの精製された形態、細胞内または細胞外に発現した形態、あるいはァフィ二 ティーカラムに結合した形態であり得る。この方法に用 、る被検化合物は必要に応じ て適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等 を挙げることができる。
[0218] 本方法においては、次いで、染色体安定化関連遺伝子によってコードされるタンパ ク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合活性を測定する。染色体安定ィ匕 関連遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物と の結合活性は、例えば、染色体安定化関連遺伝子によってコードされるタンパク質ま たはその部分ペプチドに結合した被検化合物に付された標識によって測定すること ができる。また、細胞内または細胞外に発現している染色体安定化関連遺伝子によ つてコードされるタンパク質またはその部分ペプチドへの被検化合物の結合により生 じる該タンパク質の活性の変化を指標として測定することも可能である。
[0219] 本方法においては、次いで、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記のいずれか に記載の遺伝子）によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチドと結合す る被検化合物を選択する。
[0220] 本方法に用いる被検化合物としては、特に制限はない。例えば、天然化合物、有 機化合物、無機化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、糖などの単一化合物、並びに 、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清 、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、人工作出化合物等が挙げら れるが、これらに限定されない。
[0221] 本発明のスクリーニング方法の別の態様においては、まず染色体安定化関連遺伝 子 (例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子）を発現する細胞もしくは細胞抽出液と 、被検化合物を接触させる。上記「染色体安定化関連遺伝子を発現する細胞」として は、内因性の染色体安定化関連遺伝子を発現している細胞、または外来性の染色 体安定化関連遺伝子が導入され、該遺伝子を発現して!/ヽる細胞を利用することがで きる。外来性の染色体安定化関連遺伝子が発現した細胞は、通常、該遺伝子を含 む発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。この発現べク ターは、当業者においては一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる 。本発明のスクリーニング方法において、染色体安定化関連遺伝子を発現する細胞 として例えば、 MCF7 (乳癌)、 A549 (肺癌)、 U20S (骨肉腫)、 C33A (子宮頸癌)、 HT1080 (繊維肉腫)、 PA-1 (卵巣の奇形癌）、 Tera2 (胎生期癌）、 T24 (膀胱癌）、 K562 (慢性骨髄性白血病）、 Molt4 (急性リンパ芽球性白血病）、 A172 (神経膠芽細 胞腫)、 HeLa (子宮頸癌）、 HepG2 (肝癌)、 ACC62 (メラノーマ)、 KP4 (脾臓癌)、 CaKi - 1 (腎臓癌)、 MKN45 (胃癌)、 LNcap (前立腺癌)、 MDA- MB435 (乳癌)、 EJ 1 (膀胱 癌）、 OVCAR3 (卵巣癌)等の各種腫瘍細胞を好適に使用することができる。
[0222] 上記染色体安定化関連遺伝子を発現する細胞への被検化合物の「接触」は、通常 、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子）を発現する 細胞の培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されな い。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現する DNAベクターを 、該細胞へ導入することにより、「接触」を行うことができる。
[0223] 次 、で本方法にぉ ヽては、染色体安定化関連遺伝子の発現レベルを測定する。こ こで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現レベル の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、染色体安定化関 連遺伝子を発現する細胞から mRNAを定法に従って抽出し、この mRNAを铸型とした ノーザンノ、イブリダィゼーシヨン法または RT-PCR法を実施することによって、該遺伝 子の転写レベルの測定を行うことができる。また、上記の染色体安定化関連遺伝子 を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、該遺伝子によってコードされるタンパク 質の発現を SDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳レベル の測定を行うこともできる。さらに、上記遺伝子によってコードされるタンパク質に対す る抗体を用いて、ウェスタンブロッテイング法を実施することにより、該タンパク質の発 現を検出し、遺伝子の翻訳レベルの測定を行うことも可能である。上記遺伝子によつ てコードされるタンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば、 特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を 禾 IJ用することがでさる。
[0224] 本方法においては更に、被検化合物の非存在下において測定した場合 (対照）と 比較して、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。このようにして選択された 化合物は、癌細胞に対してアポトーシスを誘導する作用を有することが期待される。 さらに、該化合物は、アポトーシス誘導を作用機序とする制癌剤 (抗癌剤）となること が期待される。
[0225] 本発明の方法の更に別の態様においては、本発明の染色体安定ィ匕関連遺伝子（ 例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子）の発現レベルを低下させるような化合物 を、レポーター遺伝子を利用してスクリ一二ングする方法である。
[0226] 本方法にお!、ては、まず、上記の染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記の 、ず れかに記載の遺伝子)の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構 造を有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。ここで「 機能的に結合した」とは、上記の染色体安定化関連遺伝子の転写調節領域に転写 因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、該遺伝子 の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター 遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成す る場合であっても、該遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、 該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意 に含まれる。染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子） の cDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在する該遺伝子の 転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。
[0227] 本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制 限されず、例えば、 CAT遺伝子、 lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、および GFP遺 伝子等が挙げられる。「染色体安定化関連遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝 子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞」として、例えば、染色体安定 化関連遺伝子 (例えば、上記の 、ずれかに記載の遺伝子）の転写調節領域とレポ一 ター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するベクターが導入された細胞等が挙げ られる。上記ベクターは、当業者においては一般的な遺伝子工学技術によって作製 することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシ ゥム沈殿法、電気パルス穿孔法、リボフエタミン法、マイクロインジェクション法等によ つて実施することができる。「染色体安定ィ匕関連遺伝子の転写調節領域とレポーター 遺伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞」には、染色体に該構造 が挿入された細胞も含まれる。染色体への DNA構造の挿入は、当業者に一般的に 用いられる方法、例えば、ランダムインテグレーションや、相同組み換えを利用した遺 伝子導入法により行うことができる。
[0228] 「染色体安定化関連遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合 した構造を有する DNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳 キットに含まれる細胞抽出液に、染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記のいずれ 力に記載の遺伝子)の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造 を有する DNAを添カロしたものを挙げることができる。
[0229] 本方法における「接触」は、「染色体安定化関連遺伝子の転写調節領域とレポータ 一遺伝子とが機能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞」の培養液に被検化 合物を添加する、または該 DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物 を添加することにより行うことができるが、これらの方法に限定されない。被検化合物 力 Sタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現する DNAベクターを、該細胞 へ導入することにより接触を行うことも可能である。
[0230] 本方法にお!、ては、次 、で、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポ 一ター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知 の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子が CAT遺伝子である 場合には、該遺伝子産物によるクロラムフエ-コールのァセチルイ匕を検出することに よって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子が lacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発 色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発 現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、 GFP遺伝 子である場合には、 GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝 子の発現量を測定することができる。
[0231] 本方法にお!、ては、次 、で、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを、被検化 合物の非存在下において測定した場合と比較して、低下させる化合物を選択する。 このようにして選択されたィ匕合物は、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤となる。
[0232] 本発明の方法の別の態様においては、本発明の染色体安定ィ匕関連遺伝子 (例え ば、上記のいずれかに記載の遺伝子）によってコードされるタンパク質の活性を指標 とする、化合物のスクリーニング方法である。
[0233] 本方法においては、まず染色体安定ィ匕関連遺伝子 (例えば、上記のいずれかに記 載の遺伝子）によってコードされるタンパク質、または該タンパク質を発現する細胞も しくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。次いで、該タンパク質の活性を測定 する。該タンパク質の活性としては、例えば、上記 (a)〜(r)に示した機能 (活性)等を 挙げることができる。当業者においては、スクリーニングにおいて指標とするタンパク 質につ 、ての機能 (活性)、および該機能 (活性)の評価 (測定)方法につ!、ての情報 を、例えば、文献データベース等により適宜、入手することができる。
[0234] 一例を示せば、指標とされるタンパク質力 Pernioである場合は、例えば、 ARS(Autonomously replicating sequences)の挙動を二次元電気泳動で検出すること によって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(MCB(1997)3261- 3271.)。
[0235] 指標とされるタンパク質が Orelである場合は、例えば、該タンパク質を含む Orcl-6 の複合体形成、あるいは CaC12存在下での Orcl-6複合体の電気泳動的移動度の変 化を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(JBC(1998)273,32421-32429.)0
[0236] 指標とされるタンパク質が Orc3である場合は、例えば、該タンパク質を含む Orcl-6 の複合体形成、該タンパク質の Ori特異的な結合を検出することによって、該タンパク 質の機能を評価（測定)することができる (JCB(1998)273,32421-32429.)。
[0237] 指標とされるタンパク質力 SCdc6である場合は、例えば、 Cell-free DNA replication assayを用いて、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(EMBO(1998)17,7219-7229.)o
[0238] 指標とされるタンパク質力 Cdtlである場合は、例えば、該タンパク質と Gemininとの 結合を検出することによって、あるいは CeU-free DNA replication assayを用いて、該 タンパク質の機能を評価（測定）することができる (Science(2000)290,2309-2312.)。
[0239] 指標とされるタンパク質が Gemininである場合は、例えば、 Cell-free DNA
replication assayを用いた DNA複製阻害活性を検出することにより、該タンパク質の 機能を評価（測定)することができる (Cell(1998)93, 1043-1053.)。
[0240] 指標とされるタンパク質力Mcm3である場合は、例えば、該タンパク質を含む
Mcm2,3,5複合体による Mcm4,6,7の helicase活性阻害活性を検出することによって、 該タンパク質の機能を評価（測定)することができる (JBC(1998)273,8369-8375.)。
[0241] 指標とされるタンパク質力Mcm4である場合は、例えば、該タンパク質を含む
Mcm4,6,7複合体による ssDNA結合活性、 ATPase活性、 Helicase活性を検出すること によって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(JBC(1997)272,24508-24513.)o
[0242] 指標とされるタンパク質力Mcm5である場合は、例えば、該タンパク質を含む
Mcm2,3,5複合体による Mcm4,6,7の helicase活性阻害活性を検出することによって、 該タンパク質の機能を評価（測定)することができる (JBC(1998)273,8369-8375.)。
[0243] 指標とされるタンパク質力Mcm6である場合は、例えば、該タンパク質を含む
Mcm4,6,7複合体による ssDNA結合活性、 ATPase活性、 Helicase活性を検出すること によって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(JBC(1997)272,24508-24513.)o
[0244] 指標とされるタンパク質力 SMcm7である場合は、例えば、該タンパク質を含む
Mcm4,6,7複合体による ssDNA結合活性、 ATPase活性、 Helicase活性を検出すること によって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(JBC(1997)272,24508-24513.)o
[0245] 指標とされるタンパク質が Mcm8である場合は、例えば、該タンパク質と Mcm4,6,7複 合体との結合を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することが できる (Nucleic.Acids Res.(2003)31,570— 579.)。
[0246] 指標とされるタンパク質が Cdc7である場合は、例えば、 MCM複合体を基質とした該 タンパク質のリン酸ィ匕活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定
)することができる (EMBO(1997)16,4340- 4351.)。
[0247] 指標とされるタンパク質が cdc5である場合は、例えば、該タンパク質の転写活性ィ匕 能を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(JBC(1998)273,4666- 4671.)。
[0248] 指標とされるタンパク質が Psflである場合は、例えば、該タンパク質を含む Psfl-4と
SW5による GINS複合体形成、 GINSによる Dpbll,Sld3,Cdc47の Ori配列への結合を検 出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる (Genes&Dev.
(2003)17,1153—1165.)。
[0249] 指標とされるタンパク質が Psf2である場合は、例えば、該タンパク質を含む Psfl-4と SW5による GINS複合体形成、 GINSによる Dpbll,Sld3,Cdc47の Ori配列への結合を検 出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる (Genes&Dev. (2003)17,1153—1165.)。
[0250] 指標とされるタンパク質が Psf3である場合は、例えば、該タンパク質を含む Psfl-4と SW5による GINS複合体形成、 GINSによる Dpbll,Sld3,Cdc47の Ori配列への結合を検 出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる (Genes&Dev. (2003)17,1153—1165.)。
[0251] 指標とされるタンパク質力 Cdc45である場合は、例えば、該タンパク質と Mcm7、 Pola p70との結合を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することがで きる (Eur. J .Biochem.265 , 936—943.)0
[0252] 指標とされるタンパク質が Pola pl80である場合は、例えば、該タンパク質を含む
Pola pl80、 p70、 p58、 p48による 4量体开成、あるいはこの複合体の Primerse、
Polymerase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)すること ができる (Eur.J.Biochem.222,781— 793.)。
[0253] 指標とされるタンパク質が Pola p70である場合は、例えば、該タンパク質を含む Pola pl80、 p70、 p58、 p48による 4量体形成、あるいはこの複合体の Primase、 Polymerase 活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(Eur.J.Biochem.222,781— 793.)。
[0254] 指標とされるタンパク質が Pola Sppl(p58)である場合は、例えば、該タンパク質を含 む Pola pl80、 p70、 p58、 p48による 4量体开成、あるいはこの複合体の Primase、
Polymerase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)すること ができる (Eur.J.Biochem.222,781— 793.)。
[0255] 指標とされるタンパク質が RPA70である場合は、例えば、該タンパク質の ssDNAへ の結合を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(Nature(1997)385,176-181.)0
[0256] 指標とされるタンパク質が RPA34である場合は、例えば、該タンパク質の ssDNAへ の結合を検出することによって、あるいは該タンパク質を含む in vitro replication assayを用いて、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる。
JBC(1990)265,3177-3182.
[0257] 指標とされるタンパク質が PCNAである場合は、例えば、該タンパク質を含む in vitro replication assayを用いて、、該タンパク質の機能を評価（測定)することができる
(JBC (1990) 265,3177-3182.)。
[0258] 指標とされるタンパク質が Ligaselである場合は、例えば、該タンパク質を含む DNA ligation活性によって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(PNAS(1990)87,6679-6683.)o
[0259] 指標とされるタンパク質が Pole Pol2である場合は、例えば、該タンパク質を含む Pole 精製標品の DNA合成活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定
)することができる (PNAS 1990 87: 6664-6668.)。
[0260] 指標とされるタンパク質が Pole Dpb3である場合は、例えば、該タンパク質を含む
Pole精製標品の DNA合成活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価（ 測定）することができる (PNAS 1990 87: 6664-6668.)。
[0261] 指標とされるタンパク質力Topoisomeraselである場合は、例えば、 plasmid DNAを基 質とした該タンパク質のリラクシング活性を検出することよって、該タンパク質の機能を 評価（測定）することができる (PNAS(1988)85,2543-2547.)。
[0262] 指標とされるタンパク質力TDP1である場合は、例えば、 ssDNAの 3'末端に結合させ たチロシン残基の、該タンパク質による遊離活性を検出することによって、該タンパク 質の機能を評価（測定）することができる (Science(1999)286,552-555.)。
[0263] 指標とされるタンパク質力 FEN1である場合は、例えば、 5 ' -overhanging flap構造を もつ二本鎖 DNAを基質とした、 flap構造の除去活性を検出することによって、該タンパ ク質の機能を評価（測定）することができる (Genomics(1995)25,220-225.)。
[0264] 指標とされるタンパク質が Pold P125である場合は、例えば、該タンパク質と Pold
P68, P50, P12とのへテロ 4量体形成を検出することによって、該タンパク質の機能を 評価（測定）することができる (Biochemistry. 2002 41(44):13133-13142.)0
[0265] 指標とされるタンパク質が Pole Dpb4である場合は、該タンパク質を含む Pole精製標 品の DNA合成活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)するこ とができる (PNAS 1990 87: 6664-6668.)。
[0266] 指標とされるタンパク質力 ¾NA2である場合は、例えば、 ssDNA結合能、 ATPase活 性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(PNAS(1995)92,7642-7646.)0
[0267] 指標とされるタンパク質が ATRである場合は、例えば、 UV損傷部位をもった二本鎖
DNAへの該タンパク質の結合、あるいは p53タンパク質を基質とした該タンパク質によ るリン酸ィ匕を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができ る (PNAS (2002) 99, 6673-6678.)。
[0268] 指標とされるタンパク質力 Chklである場合は、例えば、 p53タンパク質を基質とした 該タンパク質によるリン酸ィ匕を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測 定）することができる (Genes Dev. (2000) 14, 289-300)。
[0269] 指標とされるタンパク質力NBS1である場合は、例えば、 DNA損傷に応答した該タン ノ ク質と Mrell/Rad50との複合体形成を検出することによって、該タンパク質の機能 を評価（測定)することができる (Cell(1998)93,477-486.)。
[0270] 指標とされるタンパク質力 ¾uslである場合は、例えば、 DNA損傷に応答した該タン ノ ク質と Radl,Rad9との複合体形成を検出することによって、該タンパク質の機能を評 価（測定）することができる (JCB(1999)274,567-570.)。
[0271] 指標とされるタンパク質が Radlである場合は、例えば、 DNA損傷に応答した該タン ノ ク質と Radl,Rad9との複合体形成を検出することによって、該タンパク質の機能を評 価（測定）することができる (JCB(1999)274,567-570.)。
[0272] 指標とされるタンパク質力Mad2である場合は、例えば、該タンパク質と Madlとの複 合体形成を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができ る (Science274 (1996)246—248)。
[0273] 指標とされるタンパク質力 Ctfl8である場合は、例えば、該タンパク質と Ctffi,Dcclと の複合体形成を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することが できる (JBC(2003)30051-30056.)。
[0274] 指標とされるタンパク質が Scclである場合は、例えば、該タンパク質と
Smcl,Smc3,Scclとの 14S cohesin複合体形成を検出することによって、該タンパク質 の機能を評価 (測定)することができる (JCB(2000)151,749-761.)。
[0275] 指標とされるタンパク質が Scc3である場合は、例えば、該タンパク質と
Smcl,Smc3,Scclとの 14S cohesin複合体形成を検出することによって、該タンパク質 の機能を評価 (測定)することができる (JCB(2000)151,749-761.)。
[0276] 指標とされるタンパク質力 ¾NGである場合は、例えば、 ssDNA中の deoxyuridineを 基質としたグリコシラーゼ活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価（ 測定）することができる (EMBO(1989)8,3121- 3125.)。
[0277] 指標とされるタンパク質力MBD4である場合は、例えば、該タンパク質のメチルイ匕
CpG配列への結合活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定） することができる (MCB(1998)18,6538- 6547.)。
[0278] 指標とされるタンパク質力NTH1である場合は、例えば、該タンパク質のグリコシラー ゼ活性や AP lyase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定） することができる (PNAS(1997)94, 109-114.)。
[0279] 指標とされるタンパク質力NEIL2である場合は、例えば、塩基に損傷をもった DNAを 基質とした該タンパク質の AP lyase活性を検出することによって、該タンパク質の機能 を評価（測定）することができる (JBC(2002)277,30417-30420.)。
[0280] 指標とされるタンパク質力NEIL3である場合は、例えば、 8-oxo, AP site, 5-ヒドロキ シシトシンを含む DNAを基質とした該タンパク質の AP lyase活性を検出することによつ て、該タンパク質の機能を評価（測定)することができる (Nucleic Acids
Res.(2002)316,853-866.)o
[0281] 指標とされるタンパク質力APE2である場合は、例えば、該タンパク質の AP
endonuclease活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)するこ とができる (JMB(2002)316,853- 866.)。
[0282] 指標とされるタンパク質が PARP1である場合は、例えば、 ADP-riboseを基質とした 該タンパク質のニック DNAへの ADP-ribose polymerase活性を検出することによって
、該タンパク質の機能を評価（測定)することができる (JBC(1990)35,21907-21913.)。
[0283] 指標とされるタンパク質が PNKである場合は、例えば、 ologo(dT)を基質にした
polynucleotide kinase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価（測定
)することができる (JBC(1999)274,24176-24186.)。
[0284] 指標とされるタンパク質が Polbである場合は、例えば、該タンパク質の gap-filling polymerase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)すること ができる (Biochemistry(1988)901- 909.)。
[0285] 指標とされるタンパク質力MGMTである場合は、例えば、該タンパク質によるメチル ィ匕 DNAからのメチル基転移反応を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定）することができる (JBC(1990)265, 14754-14762.)。
[0286] 指標とされるタンパク質力TDGである場合は、例えば、該タンパク質によるミスマツ チチミジンの切断活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)す ることができる (JBC(1993)268,21218- 21224.)。
[0287] 指標とされるタンパク質が MSH2である場合は、例えば、該タンパク質のミスマッチを 含む二本鎖 DNAへの結合を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定
)することができる (Cancer Res.(1994)54,5539- 5542.)。
[0288] 指標とされるタンパク質が PMS1である場合は、例えば、該タンパク質の DNA結合能
、 ATPase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することが できる (Nucleic Acids Res. (2003) 31, 2025-2034.)。
[0289] 指標とされるタンパク質が PMS2である場合は、例えば、該タンパク質と MLH1との相 互作用を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(Hum.Mutat.19, 108-113.)o
[0290] 指標とされるタンパク質が Exonucleaselである場合は、例えば、該タンパク質の exonuclease活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)すること 力 Sできる (Nucleic Acids Res.(1998)26,3762-3768.)0
[0291] 指標とされるタンパク質力 ¾PCである場合は、例えば、該タンパク質の ssDNAへの 結合能を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(EMBO(1994)15, 1831-1843.)o
[0292] 指標とされるタンパク質が Rad23Aである場合は、例えば、該タンパク質の N末端で の 26S proteasomeとの相互作用、 C末端での Rad4との結合を検出することによって、 該タンパク質の機能を評価（測定)することができる (Nature(1998)391, 715-718.)。
[0293] 指標とされるタンパク質が Rad23Bである場合は、例えば、該タンパク質の N末端で の 26S proteasomeとの相互作用、 C末端での Rad4との結合を検出することによって、 該タンパク質の機能を評価（測定)することができる (Nature(1998)391, 715-718.)。
[0294] 指標とされるタンパク質が CSAである場合は、例えば、該タンパク質と CSB,TFIIHと の相互作用を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することがで きる (Cell(1995)82,555- 564.)。 [0295] 指標とされるタンパク質力 CSBである場合は、例えば、該タンパク質の DNA依存的
ATPase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することがで きる (JBC(1997)272, 1885-1890.)。
[0296] 指標とされるタンパク質力 ¾PGである場合は、例えば、バブル構造をもつ partial duplexを基質とした該タンパク質の endonuclease活性を検出することによって、該タン パク質の機能を評価（測定)することができる (Nature(1994)371, 423-425.)。
[0297] 指標とされるタンパク質力 ¾PFである場合は、例えば、該タンパク質と ERCC1との複 合体形成、 stem- loop構造 DNAを基質とした該タンパク質の endonuclease活性を検出 すること〖こよって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(Cell(1996)86,811-822.)0
[0298] 指標とされるタンパク質力 ¾DB1である場合は、例えば、該タンパク質の UV照射
DNAへの結合を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することが できる (JBC(1993)268,21293- 21300.)。
[0299] 指標とされるタンパク質が XAB2である場合は、例えば、該タンパク質と XPA, CSA,
CSB, RNA polymerasellとの相互作用を検出することによって、該タンパク質の機能を 評価（測定）することができる (JBC(2000)275,34931-34937.)。
[0300] 指標とされるタンパク質力 ¾DB2である場合は、例えば、該タンパク質の UV損傷
DNAへの結合活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)するこ とができる (DNA repair(2002)6,601-616.)。
[0301] 指標とされるタンパク質力Topoisomeraselllbである場合は、例えば、 RecQ5 helicase との相互作用を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することが できる (Nucleic Acids Res. (2000) 28, 1647—1655.)。
[0302] 指標とされるタンパク質が Rad51である場合は、例えば、該タンパク質の ssDNA依存 性 ATPase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することが できる (JBC(2002)277,14417- 14425.)。
[0303] 指標とされるタンパク質が Rad51Dである場合は、例えば、該タンパク質を含む
Rad51B/ Rad51C/ Rad51D/Xrcc2複合体の ssDNAへの結合能、 ssDNA依存的
ATPase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することがで きる (Genes.Dev.(2001)15,329- 3307.)。
[0304] 指標とされるタンパク質力 ¾RCC2である場合は、例えば、該タンパク質を含む
Rad51B/ Rad51C/ Rad51D/Xrcc2複合体の ssDNAへの結合能、 ssDNA依存的
ATPase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することがで きる (Nature(1999)401,397- 399.)。
[0305] 指標とされるタンパク質が Rad54である場合は、例えば、該タンパク質の DNA依存的
ATPase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することがで きる (Curr.Biol(1996)6,828- 838.)。
[0306] 指標とされるタンパク質力 ¾RCA1である場合は、例えば、該タンパク質の E3
ubiquitin ligase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)する ことができる (EMBO J. (2002) 21, 6755-6762.)。
[0307] 指標とされるタンパク質が Ku80である場合は、例えば、該タンパク質の DNA末端へ の結合、および Ku70との複合体形成を検出することによって、該タンパク質の機能を 評価（測定）することができる (PNAS(1990)87,1777- 1781.)。
[0308] 指標とされるタンパク質力 ¾RCC4である場合は、例えば、該タンパク質と Ligase4と の結合、および該タンパク質の DNA結合を検出することによって、該タンパク質の機 能を評価（測定）することができる (Cell(1995)83, 1079-1089.)。
[0309] 指標とされるタンパク質力 ¾bcl3である場合は、例えば、該タンパク質のュビキチン conjugating活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)すること ができる (Cell(1999)96,645-653.)。
[0310] 指標とされるタンパク質が Rad6Aである場合は、例えば、該タンパク質と Radl8との 複合体形成を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することがで きる (PNAS(1991)88,8865- 8869.)。
[0311] 指標とされるタンパク質が Radl8である場合は、例えば、該タンパク質の DNA結合を 検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(Nucleic.Acids Res.(2000)28,2847-2854.)o
[0312] 指標とされるタンパク質が FBH1である場合は、例えば、該タンパク質の helicase活 性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる (JCB(2002)277,24530-24537.)o
[0313] 指標とされるタンパク質が Poliである場合は、例えば、ミスマッチ partial duplex DNA 力もの primer extension活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価（測 定）することができる (JBC(2001)276,30615-30622.)。
[0314] 指標とされるタンパク質力 ¾UT1である場合は、例えば、該タンパク質の dUTPase活 性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる (J.
Biol. Chem., (1996) 271, 7745-7751.)。
[0315] 指標とされるタンパク質力Tin2である場合は、例えば、該タンパク質と TRF1との相互 作用を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる (Nat
Genet(1999)23,405-412.)o
[0316] 指標とされるタンパク質力 ir2である場合は、例えば、該タンパク質のヒストン脱ァセ チルイ匕アツセィによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(Gene(1999)234,161-168.)0
[0317] 指標とされるタンパク質が Elglである場合は、例えば、該タンパク質と RFC2、 RFC3
、 RFC4、 RFC5との複合体形成を検出する事によって、該タンパク質の機能を評価す る事ができる（EMBO J. (2003) 22, 4304-4313.) 0
[0318] 指標とされるタンパク質力 TIMELESSである場合は、例えば、該タンパク質と
mammalian clock Period proteins (mPERs)との複合体形成を検出することによって、 該タンパク質の機能を評価（測定)することができる（Science (2003) 302, 439-442.) 0 [0319] 指標とされるタンパク質が Piflである場合は、例えば、該タンパク質の ATP依存的 helicase活性、 DNA依存的 ATPase活性を検出することによって、該タンパク質の機能 を評価 (測定)することができる。
[0320] 指標とされるタンパク質が Mms4である場合は、例えば、該タンパク質と Mus81タンパ ク質と複合体が有する endonuclease活性を検出することによって、該タンパク質の機 能を評価（測定)することができる (JBC(2003)278,21715-21720.)。
[0321] 指標とされるタンパク質が Topoisomeraselllaである場合は、例えば、該タンパク質の topoisomerase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)するこ とができる (Nucleic Acids Res.(2002)30,4823-4829.)o [0322] 指標とされるタンパク質が Mus81である場合は、例えば、該タンパク質と Mms4タンパ ク質との複合体が有する endonuclease活性を検出することによって、該タンパク質の 機能を評価（測定)することができる (JBC(2003)278,21715- 21720.)。
[0323] 指標とされるタンパク質力 IRT1である場合は、例えば、該タンパク質の NAD依存性 histone deacetylaseを検出することによって、該タンパク質の機能を評価（測定)する ことができる (Nature(2000)403, 795- 800.)。
[0324] 指標とされるタンパク質が ESP1である場合は、例えば、該タンパク質のプロテア一 ゼ活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(FEBS Lett.(2002)528,246-250.)o
[0325] 指標とされるタンパク質が MPGである場合は、例えば、該タンパク質の glycosylase 活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)することができる
(Carcinogenesisd 996)17,2177-2182.)0
[0326] 指標とされるタンパク質が Pollである場合は、例えば、該タンパク質の DNA
polymerase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)すること 力 sできる 0 Biol Chem.(2000)275,31233-31238.)o
[0327] 指標とされるタンパク質が Polmである場合は、例えば、該タンパク質の DNA
polymerase活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)すること ができる 0 Biol Chem.(2002)277,44582-44587.)o
[0328] 指標とされるタンパク質が EndoVである場合は、例えば、該タンパク質の
endonuclease活性を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定)するこ とがでさる。
[0329] 指標とされるタンパク質が KNTC2 (NDC80)である場合は、例えば、該タンパク質とヒ ト Nuf2タンパク質との複合体形成を検出することによって、該タンパク質の機能を評価 (測定）することができる (Mol Biol Cell.(2005)16,519-531.)o
[0330] 次 ヽで、被検化合物の非存在下にお!/ヽて測定した場合と比較して、染色体安定ィ匕 関連遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を低下させる化合物を選択する。 上記方法に使用する該遺伝子によってコードされるタンパク質は、変異を含まない全 長タンパク質であることが好まし 、が、該タンパク質と同等の活性を有するものであれ ば、一部のアミノ酸配列が置換および zある 、は欠失されたタンパク質であってもよ い。
[0331] また本発明は、本発明の癌細胞特異的アポトーシス誘導剤を有効成分として含有 する抗癌剤 (癌治療のための医薬組成物)を提供する。
[0332] さらに本発明は、アポトーシス誘導剤もしくは抗癌剤を医薬組成物として製造する 方法を提供する。本方法においてはまず、本発明の上記スクリーニング方法によって 、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤となる化合物を選択する。次いで、選択された化 合物を薬学上許容される担体と混合する。これら薬学上許容される担体として、例え ば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張 ィ匕剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに 制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。
[0333] 本発明のアポトーシス誘導剤もしくは抗癌剤等の薬剤の製剤化にあたっては、常法 に従い、必要に応じて上記担体を添加することができる。具体的には、軽質無水ケィ 酸、乳糖、結晶セルロース、マン-トール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメ ロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース 、ポリビュルァセタールジェチルァミノアセテート、ポリビュルピロリドン、ゼラチン、中 鎖脂肪酸トリダリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60、白糖、カルボキシメチ ルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
[0334] 上記薬剤の剤型の種類としては、例えば経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、 顆粒剤、細粒剤、軟 '硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ぺ 一スト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が 挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶこ とができる。染色体安定化関連遺伝子 (例えば、上記のいずれかに記載の遺伝子） によってコードされるタンパク質を発現する DNA、染色体安定化関連遺伝子を抑制 するアンチセンス RNA、リボザィム、 siRNAを発現する DNAを生体内に投与する場合 、レトロウイルス、アデノウイルス、センダイウィルスなどのウィルスベクターゃリポソ一 ムなどの非ウィルスベクターを利用することができる。また、染色体安定化関連遺伝 子を抑制する合成アンチセンス核酸や合成 siRNAを生体内に投与する場合、リポソ ーム、高分子ミセル、カチオン性キャリアなどの非ウィルスベクターを利用することが できる。投与方法としては、例えば in vivo法および ex vivo法を挙げることができる。
[0335] 本発明には、アポトーシス誘導作用を有する上記の医薬組成物も含まれる。
本発明の薬剤または医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年 齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師の判断により適宜決定するこ とがでさる。
[0336] また本発明は、所望の癌細胞についてアポトーシスを誘導する方法に関する。該方 法の好ましい態様としては、アポトーシスを誘導させたい細胞 (対象細胞)へ、本発明 のアポトーシス誘導剤を投与する（接触させる）工程を含む、該細胞のアポトーシスを 誘導する方法である。例えば、本発明のアポトーシス誘導剤の有効成分が核酸であ る場合には、該薬剤 (核酸)を対象細胞内へ導入させることが好ましい。
[0337] さらに本発明は、本発明のアポトーシス誘導剤もしくは本発明の抗癌剤を個体 (癌 患者等)へ投与する工程を含む、癌の治療方法に関する。
上記の治療方法における個体とは、通常、癌疾患の患者を指し、特に制限されな いが、好ましくはヒトである。個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静 脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患 者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を 適宜選択することが可能である。また、該化合物が DNAによりコードされうるものであ れば、該 DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる 。遺伝子治療用ベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスべ クタ一、アデノ随伴ウィルスベクターなどのウィルスベクターやリボソームなどの非ウイ ルスベクターなどを例示することができる。該ベクターを利用して、 ex vivo法や in vivo 法などにより患者へ目的の DNAの投与を行うことができる。また本発明の核酸を直接 、個体へ投与することも可能である。
[0338] さらに本発明は、染色体の安定ィ匕を阻害する化合物 (例えば、本発明の遺伝子の 発現、または該遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制する化合物等） のアポトーシス誘導剤もしくは抗癌剤の製造における使用に関する。
[0339] なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
実施例
[0340] 以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これに限定されるも のではない。
[0341] 本実施例において「染色体安定ィ匕に関連する遺伝子」として用いた遺伝子は、以 下に示す 97個の遺伝子である：
APE2、 ATRゝ BRCA1、 Chkl、 Cdc5、 Cdc6、 Cdc7、 Cdc45、 Cdtl、 CSAゝ CSBゝ CtH8、 DDB1、 DDB2、 DNA2、 DUTゝ Elgl、 EndoV、 Espl、 Exonucleasel、 FBH1、 FEN1、 Geminin、 Husl、 KNTC2 (NDC80)、 Ku80、 Ligasel、 Mad2、 MBD4、 Mcm3、 Mcm4、 Mcm5、 Mcm6、 Mcm7、 Mcm8、 Mcml0、 MGMT、 MLH3、 Mms4、 MPG、 MSH2、 Mus81 、 NBS1、 NEIL2、 NEIL3、 NTH1、 Orel, Orc3、 PARP1、 PCNA、 Pifl、 PMS1、 PMS2、 PNK、 Pola pl80、 Pola p70、 Pola Sppl(Prim2a)、 Polb、 Pold pl25、 Pole Dpb3、 Pole Dpb4、 Pole Pol2、 Poli、 Poll, Polm、 Psfl、 Psf2、 Ps 、 Radl、 Radl8、 Rad23A、 Rad23B 、 Rad51、 Rad51D、 Rad54、 Rad6A、 RPA34、 RPA70、 Sccl、 Scc3、 Sir2、 SIRT1 (Sirtuin入 TDG、 TDP1、 TIMELESS^ Tin2、 Topoisomerase I、 Topoisomerase IIIa、 Topoisomerase Illbゝ Ubcl3、 UNGゝ XAB2、 XPCゝ XPFゝ XPGゝ Xrcc2、 XRCC4
[0342] 〔実施例 1〕 細胞培養
ヒト培養細胞として、 HeLa (ヒト子宫頸部癌細胞）、 TIG3 (正常二倍体線維芽細胞)を 使用した。これらのヒト培養細胞を 10%牛胎児血清、 50 g/mlゲンタマイシンを含む Dulbecco's modified Eagle's mediumで 37度、 5% CO条件下で培養した。
2
[0343] 〔実施例 2〕 染色体安定化に関連する遺伝子の発現抑制が癌細胞の増殖に及ぼす 影響の検討
染色体安定化に関連する遺伝子の発現抑制が癌細胞の増殖に及ぼす影響を検 討する目的で、上記各遺伝子に対する siRNAを選定した。 siRNAの合成は、株式会 社キアゲン（東京）および、 Dhamacon, Inc. (Colorado, USA)において行われた。 上記各遺伝子の siRNA配列を図 1〜4の「siRNA配列」の列に示す。なお、配列表に はセンス鎖のみ記載し、対応するアンチセンス鎖は配列表から省略した。また、各 siRNA配列の「dTdT」の記載は配列表では「TT」と省略した。 [0344] これら siRNAをヒト子宫頸部癌由来 HeLa細胞に導入した。具体的には、 siRNAのトラ ンスフエクシヨンを行う 24時間前に、 24ゥエルプレートに HeLa細胞を播種して生着さ せ、 20— 50%コンフレントの状態でトランスフエクシヨンを行った。トランスフエクシヨン 試薬として、 Oligofectoamine (Invitrogen)を使用し、添付のマニュアルに従ってトラン スフエクシヨンを行った。導入 48時間後に上記各遺伝子の mRNAの発現を Taqman PCRにより定量した。
[0345] 詳しくは、 siRNAをトランスフエクシヨン後、 48時間の細胞から、 RNeasy Mini Kit (
Qiagen)を用いて、全 RNAを抽出した。定量的 PCRには、 ABI PRISM 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)を用いた。上記各遺伝子および、 β -ァクチ ン遺伝子の RT- PCR用プライマーおよび、 TaqManプローブを、 Applied Biosystemsよ り購入した。 RT- PCR反応試薬として、 TaqMan One-Step RT- PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosysytems)を用い、添付のマニュアルに従い RT- PCRを行つ た。 j8 -ァクチンを標準として用いて、比較定量を行った。
[0346] コントロール RNA(NS)を導入した細胞における各 mRNAの発現を 100%として、各 siRNAを導入した細胞における各 mRNAの発現を比較したところ、図 1〜4の「HeLa細 胞における遺伝子発現抑制」の列に示すように、各遺伝子に対する siRNAはそれぞ れの mRNA発現を効率的に抑制した。
[0347] 〔実施例 3〕 HeLa細胞の生存率
実施例 2で選定した上記各遺伝子に対する siRNAをそれぞれ HeLa細胞に導入し、 導入 4日後の細胞生存率を MTTアツセィにより調べた。導入 96時間後の生細胞数を 、生細胞数測定試薬 SFけ力ライテスタ)を用いて測定した。
その結果、図 1〜4の「MTTアツセィ（HeLa細胞）」の列に示すように、上記各遺伝子 の siRNAを導入した HeLa細胞にお!、て、顕著な生存率の低下が認められた。
[0348] 〔実施例 4〕 siRNAの HeLa細胞におけるアポトーシス誘導効果
上記各遺伝子に対する siRNAを導入した HeLa細胞における生存率の低下がアポト 一シスによるものかどうかを調べた。各遺伝子に対する siRNAをそれぞれ HeLa細胞に 導入し、 TUNEL法を用いて導入 48時間後の HeLa細胞におけるアポトーシス誘導を 検討した。 [0349] 結果、図 1〜4の「Tunel法」の列、および図 5から図 9の写真に示すように、上記各 遺伝子に対する siRNAを導入した HeLa細胞全てにお!、て、顕著にアポトーシスの誘 導が認められた。一方、コントロール RNA(NS)が導入された HeLa細胞ではアポトー シスの誘導は認められな力つた（図 5の左上「非特異的」 )。
即ち、本発明の上記の各遺伝子の発現を抑制することにより、効果的なアポトーシ スの誘導が起こることが明ら力となった。
[0350] 〔実施例 5〕 siRNAが正常細胞の増殖に及ぼす影響
上記各遺伝子に対する siRNAが正常細胞であるヒト胎児肺由来二倍体線維芽細胞 株 TIG3細胞の増殖に及ぼす影響を検討した。トランスフエクシヨン試薬として
Lipofectoamine2000 (Invitrogen)を用い、 TIG3細胞に上記各遺伝子に対する siRNA をそれぞれ導入し、導入 48時間後に上記各遺伝子の mRNAの発現を Taqman PCR〖こ より測定した。この実験ではコントロール RNA(NS)を導入した TIG3細胞における各 mRNAの発現を 100%として、各 siRNAを導入した TIG3細胞における各 mRNAの発現を 比較した。
[0351] その結果、図 1〜4の「TIG3細胞における遺伝子発現抑制」の列に示すように、各 siRNAを導入した TIG3細胞では上記各遺伝子の mRNAの発現は、コントロール RNA ( NS)を導入した TIG3細胞におけるこれらの mRNAの発現と比較して、顕著に抑制され ていた。
[0352] 〔実施例 6〕 TIG3細胞の生存率
上記の siRNAをそれぞれ TIG3細胞に導入し、導入 4日後の細胞生存率を MTTアツ セィにより調べた。その結果、図 1〜4の「MTTアツセィ（TIG3細胞）」の列に示すよう に、上記各遺伝子に対する siRNAを導入した TIG3細胞の生存率は、該 siRNAを導入 した HeLa細胞の生存率と比較して高ぐ顕著な低下は認められな力つた。
上述の結果から、本発明の遺伝子の発現を抑制することによって、癌細胞特異的 にアポトーシスが誘導されるものと考えられる。
[0353] 〔実施例 7〕 抗シングル鎖 DNA抗体を用いたゲノム崩壊過程の解析
anti-ssDNA (抗シングル鎖 DNA)抗体は、一本鎖 DNAを特異的に認識する抗体で ある。本来、二重鎖力もなる DNAにおいて、 DNA損傷等の染色体不安定ィ匕によりゲノ ム構造が崩壊すると、部分的に一本鎖領域が露出されると言われている。したがって 本抗体を用いることにより、このゲノムの崩壊過程を特異的に認識し、可視化すること が可能である。
[0354] スライドガラス上に HeLa細胞を播種し、上記各遺伝子に対する siRNAをトランスフエ クシヨンした。 siRNA導入約 30時間後に細胞をホルマリンにて固定し、一次抗体とし て anti-ssDNA抗体を反応させた。 anti_ssDNA抗体に対する蛍光標識抗体を二次抗 体として用い、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。その結果、図 10〜27に示すよ うに、一本鎖 DNAを有する核が緑色に染色された。
即ち、上記の各遺伝子の発現を抑制することにより、一本鎖 DNAの生成を伴う DNA 損傷が生じることが確認された。
[0355] 〔実施例 8〕 細胞培養
下記の実施例においては、「染色体安定化に関連する遺伝子」として、以下に示す 11個の遺伝子を用いた。
Pifl、 Mms4、 Topoisomeraselllaゝ Mus81、 SIRT1 (Sirtuin)、 Espl、 MPG、 Poll, Polm、 EndoV、 KNTC2(NDC80)
また、ヒト培養細胞として、実施例 1に記載の HeLa細胞および TIG3細胞の他に、正 常細胞としてヒト皮膚由来二倍体線維芽細胞 (HDF細胞)を使用した。培養は、実施 例 1と同様の条件にて行った。
[0356] 〔実施例 9〕 染色体安定化に関連する遺伝子の発現抑制が癌細胞の増殖に及ぼす 影響の検討
染色体安定ィ匕に関連する上記 11個の遺伝子の発現抑制が癌細胞の増殖に及ぼ す影響を検討する目的で、上記各遺伝子に対する siRNAを選定した。 siRNAの合成 は、実施例 2と同様に行った。
上記 11個の各遺伝子の siRNA配列を図 28〜32の「siRNA配列」の列に示す。なお 、配列表にはセンス鎖のみ記載し、対応するアンチセンス鎖は配列表から省略した。 これら siRNAを HeLa細胞へ導入した。具体的には、実施例 2に記載の条件と同様に して実施した。導入 48時間後に上記 11遺伝子の mRNAの発現を Taqman PCRにより 定量した。定量方法は実施例 2と同様にして行った。 コントロール RNA(NS)を導入した細胞における各 mRNAの発現を 100%として、各 siRNAを導入した細胞における各 mRNAの発現を比較したところ、図 28〜30の「 40nM HeLa細胞における遺伝子発現抑制」の列、図 31の HeLa細胞における「mRNA 発現」の列、あるいは図 32の HeLa細胞における「発現」の列に示すように、各遺伝子 に対する siRNAはそれぞれの mRNA発現を効率的に抑制した。
[0357] 〔実施例 10〕 HeLa細胞の生存率
上記 11個の各遺伝子に対する siRNAをそれぞれ HeLa細胞に導入し、導入 4日後 の細胞生存率を MTTアツセィにより調べた。導入 96時間後の生細胞数を、生細胞数 測定試薬 SFけ力ライテスタ)を用いて測定した。
その結果、図 28〜30の「40nM HeLa細胞における増殖抑制」の列、図 31の HeLa 細胞における「増殖抑制」の列、ある 、は図 32の HeLa細胞における「増殖」の列に示 すように、上記各遺伝子の siRNAを導入した HeLa細胞において、顕著な生存率の低 下が認められた。
[0358] 〔実施例 11〕 siRNAの HeLa細胞におけるアポトーシス誘導効果
上記 11個の各遺伝子に対する siRNAを導入した HeLa細胞における生存率の低下 がアポトーシスによるものかどうかを調べた。各遺伝子に対する siRNAをそれぞれ HeLa細胞に導入し、 TUNEL法を用いて導入 48時間後の HeLa細胞におけるアポトー シス誘導を検討した。
結果、図 31の HeLa細胞における「アポトーシス」の列、図 32の HeLa細胞における「 アポトーシス」の列、さらに図 33および 34の「HeLa細胞」の写真、および図 35の HeLa細胞の TUNEL染色の写真に示すように、上記各遺伝子に対する siRNAを導入 した HeLa細胞全てにお!、て、顕著にアポトーシスの誘導が認められた。
即ち、本発明の上記の各遺伝子の発現を抑制することにより、効果的なアポトーシ スの誘導が起こることが明ら力となった。
[0359] 〔実施例 12〕 siRNAが正常細胞の増殖に及ぼす影響
上記 11個の各遺伝子に対する siRNAが正常細胞であるヒト胎児肺由来二倍体線 維芽細胞株 TIG3細胞あるいはヒト皮膚繊維芽細胞株 HDF細胞の増殖に及ぼす影響 を検討した。トランスフエクシヨン試薬として Lipofectoamine2000 (Invitrogen)を用い、 TIG3細胞あるいは HDF細胞に上記各遺伝子に対する siRNAをそれぞれ導入し、導 入 48時間後に上記各遺伝子の mRNAの発現を Taqman PCRにより測定した。この実 験ではコントロール RNA(NS)を導入した TIG3細胞あるいは HDF細胞における各 mRNAの発現を 100%として、各 siRNAを導入した TIG3細胞あるいは HDF細胞におけ る各 mRNAの発現を比較した。
[0360] その結果、図 28〜30の「40 nM TIG3細胞における遺伝子発現抑制」の列、図 31 の HDF細胞における「mRNA発現」の列、あるいは図 32の HDF細胞における「発現」 の列に示すように、各 siRNAを導入した TIG3細胞あるいは HDF細胞では上記各遺伝 子の mRNAの発現は、コントロール RNA(NS)を導入した TIG3細胞あるいは HDF細胞 におけるこれらの mRNAの発現と比較して、顕著に抑制されて 、た。
[0361] 〔実施例 13〕 TIG3細胞あるいは HDF細胞の生存率
上記 11個の各遺伝子の siRNAをそれぞれ TIG3細胞あるいは HDF細胞に導入し、 導入 4日後の細胞生存率を MTTアツセィにより調べた。その結果、図 28〜30の「40 nM TIG3細胞における増殖抑制」の列、図 31の HDF細胞における「増殖抑制」の列 、あるいは図 32の HDF細胞の「増殖」の列に示すように、上記各遺伝子に対する siRNAを導入した TIG3細胞ある!/、は HDF細胞の生存率は、該 siRNAを導入した HeLa 細胞の生存率と比較して高ぐ顕著な低下は認められな力つた。
上述の結果から、本発明の遺伝子の発現を抑制することによって、癌細胞特異的 にアポトーシスが誘導されるものと考えられる。
[0362] 〔実施例 14〕 抗シングル鎖 DNA抗体を用いたゲノム崩壊過程の解析
スライドガラス上に HeLa細胞を播種し、 Pifl、 Mms4、 TopoisomeraseIIIa、 Mus81、 SIRT1 (Sirtuin), Espl、 MPG、 Poll, Polm、 EndoVの各遺伝子に対する siRNAをトラン スフエクシヨンした。 siRNA導入約 30時間後に細胞をホルマリンにて固定し、一次抗 体として antト ssDNA抗体を反応させた。 anti-ssDNA抗体に対する蛍光標識抗体を二 次抗体として用い、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。その結果、図 36に示すよ うに、一本鎖 DNAを有する核が緑色に染色された。
即ち、上記の各遺伝子の発現を抑制することにより、一本鎖 DNAの生成を伴う DNA 損傷が生じることが確認された。 産業上の利用可能性
[0363] 本発明の、細胞における染色体安定化を阻害する化合物、あるいは、染色体安定 化に関与する遺伝子の機能を阻害する化合物は、癌細胞特異的なアポトーシス誘 導作用を有する。該化合物を含む医薬組成物は、アポトーシス誘導作用を機序とす る副作用の少ない抗癌剤となるものと考えられる。本発明によって、染色体安定化に 関する遺伝子を標的としたアポトーシス誘導作用を機序とする癌細胞特異的な抗癌 剤が初めて提供された。
[0364] ある化合物についてアポトーシス誘導作用を有することが分力つた場合であっても 、正常細胞に対するアポトーシス誘導作用の有無が不明な化合物は、医薬品として 使用することは難しい。該化合物が正常細胞においてもアポトーシス誘導作用が見ら れる場合、副作用の危険を伴うからである。即ち、アポトーシス誘導作用が癌細胞特 異的なものでなければ、実際に医薬品として使用することは、通常困難である。本発 明の薬剤 (化合物）は、アポトーシス誘導作用が癌細胞特異的である点で、非常に実 用的かつ実効性の高い薬剤であると言える。
[0365] また、染色体安定化の阻害により、癌細胞特異的にアポトーシスが誘導されるメカ -ズムについて、本発明者らによって見出された知見から、以下のように考察するこ とが可能である。
[0366] 多くの癌細胞では癌抑制遺伝子である p53に突然変異や欠損のあることが知られて おり、また DNA損傷チェックポイント機構に異常が生じて癌化するケースも知られて いる。 p53や DNA損傷チェックポイント機構の異常な癌細胞では、機能的な染色体 安定ィヒ遺伝子の発現が siRNA等により抑制され機能しなくなると、染色体安定化機 構が破綻して染色体 DNAに生じた損傷を修復することができず、このような細胞で は、修復されずに残って ヽる DNA損傷が原因でアポトーシスが誘導されるものと考 えられる。一方、二倍体線維芽細胞のような正常細胞では、機能的な染色体安定ィ匕 遺伝子の発現力 RNA等により抑制され機能しなくなると、 p53や DNA損傷チェック ポイント機構の作用により細胞周期が一時的に停止して、染色体 DNAに生じた損傷 が修復されるものと考えられる。
[0367] 本発明は、癌細胞特異的なアポトーシス誘導剤を提供したことに加えて、癌細胞特 異的なアポトーシス誘導のメカニズムの解明における非常に有用な学術的な知見を 提供するものである。

Claims

請求の範囲
[1] 染色体の安定化を阻害する化合物を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤。
[2] 染色体の安定化の阻害が、以下の（a)〜 (r)の 、ずれかの機能を阻害することによ る、請求項 1に記載のアポトーシス誘導剤。
(a)ヒト染色体不安定性疾患関連遺伝子
(b)染色体 DNAの複製開始、複製フォークの進行を含む染色体 DNA複製反応
(c) DNA損傷チヱックポイント
(d)姉妹染色分体凝集 ·分離
(e)塩基除去修復
(f)ミスマッチ除去修復
(g)ヌクレオチド除去修復
(h)相同組換え修復
(i)非相同末端結合修復 (非相同組換え修復）
(j)二本鎖 DNA切断修復
(k) DNA複製後修復 (DNA損傷トレランス）
(l) DNA架橋損傷修復
(m) DNA—タンパク質架橋損傷修復
(n) DNAポリメラーゼ
(o)ヌクレアーゼ
(P)ヌクレオチド浄化
(q)クロマチン構造維持
(r)テロメァ構造維持
[3] 請求項 2の (a)〜 (r)の 、ずれかの機能に関与する遺伝子の発現を阻害する化合 物を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤。
[4] 以下のいずれかの遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分として含有する、癌 細胞特異的アポトーシス誘導剤。
APE2、 ATRゝ BRCA1、 Chkl、 Cdc5、 Cdc6、 Cdc7、 Cdc45、 Cdtl、 CSAゝ CSBゝ CtH8、 DDB1、 DDB2、 DNA2、 DUTゝ Elgl、 EndoV、 Espl、 Exonucleasel、 FBH1、 FEN1、 Geminin、 Husl、 KNTC2 (NDC80)、 Ku80、 Ligasel、 Mad2、 MBD4、 Mcm3、 Mcm4、 Mcm5、 Mcm6、 Mcm7、 Mcm8、 Mcml0、 MGMT、 MLH3、 Mms4、 MPG、 MSH2、 Mus81 、 NBS1、 NEIL2、 NEIL3、 NTH1、 Orel, Orc3、 PARP1、 PCNA、 Pifl、 PMS1、 PMS2、 PNK、 Pola pl80、 Pola p70、 Pola Sppl(Prim2a)、 Polb、 Pold pl25、 Pole Dpb3、 Pole Dpb4、 Pole Pol2、 Poliゝ Poll, Polm、 Psfl、 Psf2、 Psl3, Radl、 Radl8、 Rad23A、 Rad23B 、 Rad51、 Rad51D、 Rad54、 Rad6A、 RPA34、 RPA70、 Sccl、 Scc3、 Sir2、 SIRT1 (Sirtuin入 TDG、 TDP1、 TIMELESS^ Tin2、 Topoisomerase I、 Topoisomerase IIIa、 Topoisomerase Illbゝ Ubcl3、 UNGゝ XAB2、 XPCゝ XPFゝ XPGゝ Xrcc2、 XRCC4
[5] 請求項 4に記載の各遺伝子の塩基配列が、配列番号： 1〜637、 810〜908に記 載の塩基配列からなる群より選択される、請求項 4に記載のアポトーシス誘導剤。
[6] 請求項 4に記載のいずれかの遺伝子の発現を抑制する化合物力 該遺伝子に対し て RNAi効果を有する二本鎖 RNAである、請求項 4に記載のアポトーシス誘導剤。
[7] 二本鎖 RNA力 請求項 4に記載のいずれかの遺伝子の mRNAにおける連続する任 意の 20〜30塩基と相同な配列からなるセンス RNAおよび該センス RNAに相補的な配 列からなるアンチセンス RNA力もなる二本鎖 RNAである、請求項 6に記載のアポトー シス誘導剤。
[8] 請求項 4に記載の 、ずれかの遺伝子に対して RNAi効果を有する二本鎖 RNAを発 現し得る DNAを有効成分として含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤。
[9] 請求項 4に記載のいずれかの遺伝子の発現を抑制する化合物が以下の（a)または
(b)である、請求項 4に記載のアポトーシス誘導剤。
(a)前記遺伝子の転写産物、またはその一部に対するアンチセンス核酸
(b)前記遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザィム活性を有する核酸
[10] 請求項 4に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制 する化合物を有効成分として含有する、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤。
[11] 請求項 4に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を抑制 する化合物力 以下の（a)〜（c)のいずれかの化合物である、請求項 10に記載のァ ポトーシス誘導剤。
(a)前記遺伝子によってコードされるタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を 有する変異体タンパク質
(b)前記遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体
(c)前記遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する低分子化合物
[12] 請求項 1〜11のいずれかに記載のアポトーシス誘導剤を有効成分とする、抗癌剤
[13] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリーニン グ方法。
(a)請求項 4に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質またはその 部分ペプチドと被検化合物を接触させる工程
(b)前記タンパク質またはその部分ペプチドと被検化合物との結合活性を測定する 工程
(c)前記遺伝子によってコードされるタンパク質またはその部分ペプチドと結合する 化合物を選択する工程
[14] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリーニン グ方法。
(a)請求項 4に記載のいずれかの遺伝子を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被 検化合物を接触させる工程
(b)前記遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下にお ヽて測定した場合と比較して、該発現レベルを低下 させる化合物を選択する工程
[15] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリーニン グ方法。
(a)請求項 4に記載の 、ずれかの遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機 能的に結合した構造を有する DNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を 接触させる工程
(b)前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
(c)被検化合物の非存在下にお ヽて測定した場合と比較して、前記発現レベルを低 下させる化合物を選択する工程
[16] 以下の（a)〜（c)の工程を含む、癌細胞特異的アポトーシス誘導剤のスクリーニン グ方法。
(a)請求項 4に記載のいずれかの遺伝子によってコードされるタンパク質、または該タ ンパク質を発現する細胞もしくは細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
(b)前記タンパク質の活性を測定する工程
(c)被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、前記タンパク質の活 性を低下させる化合物を選択する工程
[17] 以下の工程 (a)および (b)を含む、請求項 4または 10に記載のアポトーシス誘導剤 を医薬組成物として製造する方法。
(a)請求項 13〜16のいずれかに記載の方法によって、化合物をスクリーニングする 工程
(b)該化合物を薬学上許容される担体と混合する工程
PCT/JP2005/006914 2004-04-09 2005-04-08 染色体安定化に関する遺伝子を標的とする癌細胞特異的アポトーシス誘導剤 WO2005097189A1 (ja)

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