CN109790538A - 突变型人DNA聚合酶ε - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含1个以上氨基酸残基突变的突变型人DNA聚合酶ε，其中，氨基酸残基突变包含人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位的亮氨酸残基变为其他氨基酸残基的突变。利用所述方法，可提供能够判别高频突变型癌症的新型生物标志物。

Description

突变型人DNA聚合酶ε
技术领域
本发明涉及突变型人DNA聚合酶ε。本发明还涉及编码突变型人DNA聚合酶ε的核酸及其片段、判别癌症是否为高频突变型癌症的方法。
背景技术
癌症的基因突变模式之一为高频突变型(Hypermutation或Hypermutated)。高频突变型癌症有别于其他类型，其体细胞突变率较其他类型高。还已知，在胃癌、乳腺癌、大肠癌、胶质母细胞瘤、子宫癌等中存在显示出高频突变型特征的癌症(非专利文献1)。
高频突变型癌症在很多情况下具有微卫星不稳定性(其表现为DNA复制时的错配修复机制缺陷或不完整)的性质。认为这是由于：作为错配修复酶的MLH1、MLH3、MSH2、MSH3、MSH6、PMS2的基因发生突变，或MLH1基因的表达因甲基化而被抑制。
另外，由于作为DNA复制酶的DNA聚合酶ε的突变而导致以极高的频率引起体细胞突变从而成为高频突变型的情况也是已知的(非专利文献2)。DNA聚合酶ε除了具有对DNA沿5’→3’方向进行DNA合成的活性以外，还具有作为差错校正机制的3’→5’核酸外切酶活性，当错误的碱基被添加至DNA链上时，该碱基将通过3’→5’核酸外切酶活性而被除去，之后DNA合成重新开始。因此，有观点认为高频突变型癌症与DNA聚合酶ε的关联性是因DNA聚合酶ε的差错校正机制不再正常运作而导致的，并且，还已对核酸外切酶活性结构域(氨基酸序列的第87位～第426位)的突变与高频突变型的相关性进行了调查。
例如，作为引起高频突变型的DNA聚合酶ε的氨基酸残基的突变，已公开了D275V、P286R、S297F、H342R、F367S、V411L、L424V、A426V、S459F等突变(非专利文献3～7)。
近年来，癌症免疫逃逸机制已被阐明，将该机制作为靶标的新型癌症免疫治疗已被应用于临床。作为该机制，有亦被称为免疫检查点途径的PD-1(Programmed cell Death-1，程序性细胞死亡分子-1)/PD-L1(PD-1Ligand 1，PD-1配体1)途径。通过阻断转导免疫抑制辅助信号的PD-1/PD-L1途径，从而解除T细胞的免疫抑制，T细胞活化而发生对表达癌特异性抗原的肿瘤的抑制(专利文献1)。另外，CTLA-4也在活化T细胞中表达，由于T细胞的活化在抗原呈递细胞的CD28配体结合时被抑制，因此，阻断该途径也能够解除T细胞的免疫抑制从而引起肿瘤抑制(非专利文献8)。应用了如上所述原理的抗癌剂已经实用化(例如纳武单抗(nivolumab)、伊匹单抗(ipilimumab))(非专利文献9～12)。此外，还存在数种如上所述的免疫抑制性机制，期待将来能开发出阻断这些免疫抑制机制的抗肿瘤剂并加以实用化。
高频突变型癌症具有多种成为免疫机制靶标的癌特异性抗原，阻断免疫抑制的信号途径的疗法已显示出效果(非专利文献13～14)。因此，能够判别癌症为高频突变型的生物标志物在例如选择合适的治疗、确定治疗方针等方面是有用的。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4409430号公报
非专利文献
非专利文献1：Nat.Rev.Cancer，2014年，14卷(12期)，pp.786～800
非专利文献2：J.Pathol.，2013年，230卷，pp.148～153
非专利文献3：Int.J.Gynecol.Cancer，2015年，25卷(7期)，pp.1187-1193
非专利文献4：J.Pathol.，2013年，230卷，pp.148-153
非专利文献5：Cancer，2015年，121卷(3期)，pp.386-394
非专利文献6：Clin.Cancer Res.，2015年，21卷(14期)，pp.3347-3355
非专利文献7：European Journal of Human Genetics，2011年，19卷，pp.320-325
非专利文献8：Annals of the Japanese Respiratory Society，2014年，3卷(1期)，pp.43-49
非专利文献9：International Immunology，2007年，19卷(7期)，pp.813-824
非专利文献10：Cancer Immunol.Res.，2014年，2卷(9期)，pp.846-856
非专利文献11：The New England Journal of Medicine，2010年，363卷(8期)，pp.711-723
非专利文献12：Cancer Cell，2015年，27卷(4期)，pp.439-449
非专利文献13：Science，2015年，348卷(6230期)，pp.124-128
非专利文献14：The New England Journal of Medicine，2015年，372卷(26期)，pp.2509-2520
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供能够判别高频突变型癌症的新型生物标志物。
用于解决课题的手段
本申请的发明人发现了高频突变型癌症中DNA聚合酶ε的DNA合成活性结构域(氨基酸序列的第624位～第1145位)中第952位氨基酸残基的突变。此前，高频突变型癌症与DNA聚合酶ε的核酸外切酶活性结构域中的氨基酸残基突变之间的关联性是已知的。但另一方面，高频突变型癌症与DNA聚合酶ε的DNA合成活性结构域中的氨基酸残基突变之间的关联性在此前尚属未知。本发明是基于这一新发现而完成的。
本发明提供突变型人DNA聚合酶ε，其包含1个以上氨基酸突变，其中，该氨基酸突变包含人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位的亮氨酸残基变为其他氨基酸残基的突变。
本发明涉及的突变型人DNA聚合酶ε是在高频突变型癌症中发现的，因此可用作例如判别高频突变型癌症的新型生物标志物。
上述其他氨基酸残基为亮氨酸残基以外的氨基酸残基即可，但优选为丝氨酸残基。通过为丝氨酸残基，对高频突变型癌症进行判别时的判别精度进一步提高。
本发明还涉及编码本发明涉及的突变型的核酸。另外，本发明还涉及与编码本发明涉及的突变型人DNA聚合酶ε的核酸互补的核酸。上述核酸或互补核酸可以是包含编码上述其他氨基酸残基的碱基序列(密码子序列)或其互补序列的片段。该片段也是核酸，其碱基长度可以为例如20～300个碱基长度。
本发明还提供在患有癌症的人患者中判别癌症是否为高频突变型癌症的方法，所述方法包括下述步骤：使用从上述人患者采集的含有来自癌细胞的成分的样品，确定来自上述癌细胞的人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位氨基酸残基是否存在突变；该氨基酸残基存在突变则表示上述癌症为高频突变型癌症。
根据本发明涉及的方法，能够在患有癌症的人患者中判别癌症是否为高频突变型癌症。
对于本发明涉及的方法而言，上述氨基酸残基是否存在突变的确定可以包括：对编码人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位氨基酸残基的碱基序列的突变进行检测。
本发明涉及的方法中，上述氨基酸残基的突变优选为L952S。由此，判别精度进一步提高。
本发明涉及的方法中，上述癌症可以是大肠癌或直肠癌。癌症为大肠癌或直肠癌时，能够以更高的可靠性判别癌症是否为高频突变型癌症。
本发明还提供对高频突变型癌症的罹患情况进行诊断的方法，所述方法包括下述步骤：使用从人检体采集的含有来自细胞的成分的样品，对来自细胞的人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位氨基酸残基的突变进行检测；该氨基酸残基存在突变的情况下，诊断为人检体罹患高频突变型癌症。
发明效果
根据本发明，可提供能够判别高频突变型癌症的新型生物标志物。
附图说明
[图1]为示出实施例结果的图。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。需要说明的是，本发明不限于以下实施方式。
〔高频突变型癌症〕
高频突变型(hypermutation或hypermutated)的癌症是癌特异性突变的突变率比通常的癌症更高的癌症。此处，所谓突变率，是指相对每106个碱基(以下也称为“Mb”)中发生的导致氨基酸残基改变的突变数量。高频突变型癌症通过与通常的癌症的突变率比较来判断。虽然突变率根据所调查的基因的数量、种类而有所不同，另外也根据癌的种类而有所不同，但当突变率相对性地高于通常的癌症的情况下，判断为高频突变型癌症。
〔人DNA聚合酶ε〕
人DNA聚合酶ε为DNA复制酶，野生型DNA聚合酶ε具有序列号1所示的氨基酸序列。人DNA聚合酶ε的DNA合成活性结构域相当于序列号1所示氨基酸序列的第624位～第1145位，核酸外切酶活性结构域相当于序列号1所示氨基酸序列的第87位～第426位。
本说明书中，氨基酸残基的突变是指蛋白质的氨基酸序列中的特定氨基酸残基变为与对应的野生型氨基酸序列中的氨基酸残基不同的氨基酸残基。氨基酸残基的突变可以是氨基酸残基的替换、缺失或插入中的任一者。例如，序列号1所示的野生型人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位氨基酸残基为亮氨酸，在其变为亮氨酸以外的氨基酸残基的情况下，认为存在突变。
本实施方式涉及的突变型人DNA聚合酶ε包含1个以上氨基酸残基突变，该氨基酸残基的突变至少包含人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位的亮氨酸残基变为其他氨基酸残基的突变。
此处，其他氨基酸残基只要是亮氨酸残基以外的氨基酸残基即可，没有特别限制，例如可以是丝氨酸残基、蛋氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基、或苯丙氨酸残基。
本实施方式涉及的突变型人DNA聚合酶ε优选至少包含人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位的亮氨酸残基被替换为其他氨基酸残基的突变，更优选至少包含人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位的亮氨酸残基被替换为丝氨酸残基的突变(L952S)。由此，用作用于判别高频突变型癌症的生物标志物时，判别精度进一步提高。
本实施方式涉及的突变型人DNA聚合酶ε可以仅包含L952S的突变(序列号2)，也可以除了L952S的突变以外还包含1个以上氨基酸残基突变。
作为除了L952S的突变以外还可以包含的氨基酸残基的突变，可举出例如D275V、P286R、S297F、H342R、F367S、V411L、L424V、A426V、S459F等突变。
本实施方式涉及的突变型人DNA聚合酶ε可以从含有其的人癌细胞中提取及纯化而得到，另外，也可以在利用化学合成等得到编码该突变型人DNA聚合酶ε的核酸后、在合适的蛋白质表达系统中使其表达而得到。
〔核酸〕
一个实施方式涉及的核酸为编码上述突变型人DNA聚合酶ε的核酸(以下也称为“核酸1”)。核酸1可以是具有包含内含子的基因组DNA序列的核酸，也可以是具有mRNA序列的核酸。需要说明的是，野生型人DNA聚合酶ε基因的基因组DNA序列为NCBI登记号NG_033840。另外，野生型人DNA聚合酶ε的mRNA序列为NCBI登记号L09561。
其他实施方式涉及的核酸为具有与核酸1互补的碱基序列的核酸(以下也称为“核酸2”)。
一个实施方式中，核酸可以是核酸1的片段，该片段包含编码上述突变型人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位的其他氨基酸残基的碱基序列(密码子序列)(以下将该片段涉及的核酸亦称为“核酸3”)。
另一实施方式中，核酸可以是核酸2的片段，该片段包含编码上述突变型人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位的其他氨基酸残基的碱基序列(密码子序列)的互补序列(以下将该片段涉及的核酸亦称为“核酸4”)。
核酸1～核酸4可以用作用于判别高频突变型癌症的生物标志物。即，例如，通过检测核酸1～核酸4中的碱基序列的突变，可以对突变型人DNA聚合酶ε的氨基酸残基的突变进行检测。核酸1～核酸4也可以是具有从基因组DNA序列中除去内含子后的cDNA型碱基序列的核酸。
本说明书中的“碱基序列的突变”是指：碱基序列中的碱基的至少一部分以导致该碱基序列编码的氨基酸残基与由对应的野生型碱基序列编码的氨基酸残基不同的方式被替换为其他碱基(也称为“错义突变”)。
另外，核酸1～核酸4也可以通过例如克隆至合适的克隆载体中，从而用作用于对碱基序列的突变进行检测的探针。
核酸3及核酸4(片段)的碱基长度没有特别限制，从例如能够更高效地实施新一代测序仪中的碱基序列突变检测的观点考虑，核酸3及核酸4的碱基长度优选为20～300个碱基长度，更优选为50～250个碱基长度，进一步优选为70～200个碱基长度，进一步更优选为100～200个碱基长度。
另外，从例如能够更高效地实施新一代测序仪中的碱基序列突变检测的观点考虑，核酸3及核酸4(片段)优选为编码包含上述“其他氨基酸残基”的连续至少7个氨基酸残基的核酸，更优选为编码包含“其他氨基酸残基”的连续至少10个氨基酸残基的核酸。
〔判别癌症是否为高频突变型癌症的方法〕
本实施方式涉及的判别方法是在患有癌症的人患者中判别癌症是否为高频突变型癌症的方法，所述方法包括下述步骤：使用从人患者采集的含有来自癌细胞的成分的样品，确定来自癌细胞的人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位氨基酸残基是否存在突变；该氨基酸残基存在突变则表示癌症为高频突变型癌症。
含有来自癌细胞的成分的样品是指：含有癌细胞自身、癌细胞的细胞核、癌细胞的细胞质、来自癌细胞的蛋白质、来自癌细胞的肽、及来自癌细胞的核酸中的一种以上的样品。作为含有来自癌细胞的成分的样品，可举出例如癌切除组织检体、活检检体、腹水浸润癌细胞、血液循环癌细胞、血清、血浆、血液、粪便、尿、痰、脑脊液、胸腔内液、乳头抽吸液、淋巴液、细胞培养液、以及从患者采集的其他组织及液体。从以更高的可靠性判别高频突变型癌症的观点考虑，含有来自癌细胞的成分的样品优选为癌切除组织检体、活检检体、腹水浸润癌细胞、血液循环癌细胞、血清、或血浆，更优选为癌切除组织检体或活检检体。另外，含有来自癌细胞的成分的样品为癌切除组织检体或活检检体的情况下，这些检体可经历过冷冻、乙醇固定、福尔马林固定、石蜡包埋或上述处理的组合处理。
人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位氨基酸残基的突变可以是亮氨酸残基变为丝氨酸残基、蛋氨酸残基、缬氨酸残基、色氨酸残基、或苯丙氨酸残基的突变。氨基酸残基的突变为上述突变的情况下，能够以更高的可靠性判别高频突变型癌症。其中，在突变是从亮氨酸残基被替换为丝氨酸残基的突变(L952S)的情况下，能够进一步以更高的可靠性判别高频突变型癌症。
氨基酸残基的突变的检测可通过已知方法进行。突变的检测例如可包括：对编码人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位氨基酸残基的碱基序列的突变进行检测。
碱基序列的突变的检测可通过已知方法进行。碱基序列的突变的检测可通过例如DNA测序(例如利用新一代测序仪进行的测序)、聚合酶链式反应、等位基因特异性扩增、等位基因特异性探针杂交、错配切割分析、单链高级结构多态性、变性梯度凝胶电泳或温度梯度凝胶电泳来进行。这些技术可单独使用，也可组合使用多种技术。
癌细胞的人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位氨基酸残基存在突变的情况下，可判别该癌症为高频突变型癌症。
作为可利用本实施方式涉及的发明的癌症，可举出例如大肠癌、直肠癌、结肠癌、胃癌、肝癌、甲状腺癌、子宫癌、肾癌、胰癌、舌癌、前列腺癌、肺癌、皮肤癌、卵巢癌、胆囊癌、头颈癌、睾丸肿瘤、肾上腺癌、口腔癌、骨软组织肿瘤、脑肿瘤、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、白血病、恶性淋巴瘤、及多发性骨髓瘤。其中，癌症为大肠癌或直肠癌的情况下，能够以更高的可靠性判别高频突变型癌症。
〔对高频突变型癌症的罹患情况进行诊断的方法〕
本实施方式涉及的诊断方法是对高频突变型癌症的罹患情况进行诊断的方法，所述方法包括下述步骤：使用从人检体采集的含有来自细胞的成分的样品，对来自细胞的人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位氨基酸残基的突变进行检测；该氨基酸残基存在突变的情况下，诊断为人检体罹患高频突变型癌症。
含有来自细胞的成分的样品是指：含有细胞自身、细胞的核、细胞的细胞质、来自细胞的蛋白质、来自细胞的肽、及来自细胞的核酸中的一种以上的样品。作为含有来自细胞的成分的样品，可举出例如活检检体、血清、血浆、血液、粪便、尿、痰、脑脊液、胸腔内液、乳头抽吸液、淋巴液、细胞培养液、以及从人采集的其他组织及液体。从以更高的可靠性判别高频突变型癌症的观点考虑，含有来自细胞的成分的样品可以是活检检体、血清、或血浆。含有来自细胞的成分的样品为活检检体的情况下，可对活检检体进行冷冻、乙醇固定、福尔马林固定、石蜡包埋或上述处理的组合处理。
上述诊断方法中，关于氨基酸残基的突变及其检测、以及能利用该诊断方法的癌症等，可以与上文中记载的相同。
实施例
以下，基于实施例更具体地说明本发明。但是，本发明不限于以下的实施例。
(样品制备)
将201例大肠癌患者的癌切除检体制成福尔马林固定的石蜡包埋检体，将其薄切并制备2份厚度为20μm的切片。将所制备的2份切片贴附于载玻片，用作DNA提取用样品。
除上述DNA提取用样品之外，还另行制备厚度为4μm的切片，将所制备的切片贴附于载玻片，制成显微镜观察用样品。
(DNA提取)
用苏木精伊红对显微镜观察用样品进行染色。用显微镜对染色后的样品进行观察，确定切片中含有大量癌细胞的部位。用刀片从DNA提取用样品中刮取利用显微镜观察用样品确定的部位，从所刮取的部位提取DNA。DNA的提取采用BiOstic(注册商标)FFPE组织DNA提取试剂盒(FFPE Tissue DNA Isolation Kit，商品名)进行。
(序列分析)
使用从201例大肠癌患者的癌切除检体的福尔马林固定石蜡包埋检体中提取的DNA，利用新一代测序仪(MiSeq测序仪，Illumina,Inc.)对415个基因的癌特异性突变(伴有氨基酸残基突变的突变)进行了分析。分析结果示于图1。
图1为针对各检体分别对突变率(每1Mb的突变数量)进行制图而得到的图。图1的横轴中，以从左向右突变率呈现为由高至低的顺序排列的方式对检体制图。如图1所示，在17个检体中检测到大量突变，认为这些检体为高频突变型。17个检体中，4个检体(图1中示为A～D的检体)的突变率显著高于其他检体。并且，图1中示为A、B及D的检体中不存在错配修复基因的突变。为了探明其原因，针对上述4个检体，还对人DNA聚合酶ε基因的序列进行了分析。
对突变率显著高的4个检体的人DNA聚合酶ε基因的序列进行了分析，结果，从1个检体(图1中示为D的检体)中检测出L952S(此前并不知晓其是引起高频突变型癌症的突变)。需要说明的是，从图1中示为A及B的检体中分别检测出已作为引起高频突变型癌症的突变而为人所知的V411L及P286R。另外，图1中示为C的检体(存在错配修复基因的突变)不存在人DNA聚合酶ε基因的突变。

Claims (12)

1.突变型人DNA聚合酶ε，其包含1个以上氨基酸残基突变，其中，
所述氨基酸残基突变包含人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位的亮氨酸残基变为其他氨基酸残基的突变。
2.如权利要求1所述的突变型人DNA聚合酶ε，其中，所述其他氨基酸残基为丝氨酸残基。
3.核酸，其编码权利要求1或2所述的突变型人DNA聚合酶ε。
4.核酸，其与编码权利要求1或2所述的突变型人DNA聚合酶ε的核酸互补。
5.权利要求3所述的核酸的片段，所述片段包含编码所述其他氨基酸残基的碱基序列。
6.权利要求4所述的核酸的片段，所述片段包含编码所述其他氨基酸残基的碱基序列的互补序列。
7.如权利要求5或6所述的片段，所述片段是20～300个碱基长度的核酸。
8.在患有癌症的人患者中判别癌症是否为高频突变型癌症的方法，
所述方法包括下述步骤：使用从所述人患者采集的含有来自癌细胞的成分的样品，确定来自所述癌细胞的人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位氨基酸残基是否存在突变；
所述氨基酸残基存在突变则表示所述癌症为高频突变型癌症。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述氨基酸残基是否存在突变的确定包括：对编码人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位氨基酸残基的碱基序列的突变进行检测。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中，所述氨基酸残基的突变为L952S。
11.如权利要求8～10中任一项所述的方法，其中，所述癌症为大肠癌或直肠癌。
12.对高频突变型癌症的罹患情况进行诊断的方法，
所述方法包括下述步骤：使用从人检体采集的含有来自细胞的成分的样品，对来自细胞的人DNA聚合酶ε的氨基酸序列的第952位氨基酸残基的突变进行检测；
所述氨基酸残基存在突变的情况下，诊断为人检体罹患高频突变型癌症。
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