KR102472521B1 - 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 하나 이상의 아미노산 잔기의 변이를 포함하는 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε으로서, 아미노산 잔기의 변이가, 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 류신 잔기가 다른 아미노산 잔기가 되는 변이를 포함하는, 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε을 제공한다. 이러한 방법에 의하면, 고빈도 변이형의 암을 판별할 수 있는 새로운 바이오마커가 제공된다.
Description
본 발명은, 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε에 관한 것이다. 본 발명은 또한 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε을 코딩하는 핵산 및 그의 단편, 암이 고빈도 변이형의 암인지 판별하는 방법에도 관한 것이다.
암의 유전자 변이의 패턴 중 하나로, 고빈도 변이형(Hypermutation 또는 Hypermutated)이 있다. 고빈도 변이형의 암은, 체세포 변이율이 다른 형에 비해 높은 것으로 구별된다. 그리고, 위암, 유방암, 대장암, 교아종, 자궁암 등, 고빈도 변이형의 특징을 나타내는 암이 있다는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1).
고빈도 변이형의 암은, DNA 복제시의 미스매치 수복 기구의 결손 또는 불완전함을 나타내는 마이크로 새틀라이트 불안정성의 성질을 갖는 경우가 많다. 이것은, 미스매치 수복 효소인 MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH6, PMS2의 유전자가 변이를 일으키고 있거나, MLH1 유전자의 발현이 메틸화에 의해 억제되어 있거나 함에 의한 것으로 생각되고 있다.
또한, DNA 복제 효소인 DNA 폴리메라아제 ε의 변이에 의해, 특히 높은 빈도로 체세포 변이를 야기하고, 고빈도 변이형이 된다는 것도 알려져 있다(비특허문헌 2). DNA 폴리메라아제 ε은, DNA를 5'→3' 방향으로 DNA를 합성하는 활성에 더하여, 에러 정정 기구로서 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖고 있으며, 잘못된 염기가 DNA쇄에 부가되면, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 당해 염기가 제거되고, 그 후 DNA 합성이 재개된다. 그 때문에, 고빈도 변이형의 암과 DNA 폴리메라아제 ε의 관련은, DNA 폴리메라아제 ε의 에러 정정 기구가 정상적으로 작용하지 않게 된 것에 기인한다고 생각되며, 엑소뉴클레아제 활성 도메인(아미노산 서열 제87번째 내지 제426번째)의 변이와 고빈도 변이형의 관련이 조사되고 있다.
예를 들어, 고빈도 변이형을 야기하는 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 잔기의 변이로서, D275V, P286R, S297F, H342R, F367S, V411L, L424V, A426V, S459F 등의 변이가 개시되어 있다(비특허문헌 3 내지 7).
최근 몇년간, 암 면역 도피 기구가 해명되어, 이 기구를 표적으로 하는 새로운 암 면역 치료가 임상에 응용되게 되었다. 당해 기구로서, 면역 체크포인트 경로라고도 불리는 PD-1(Programmed cell Death-1)/PD-L1(PD-1 Ligand1) 경로가 있다. 면역 제어 보조 시그널을 전달하는 PD-1/PD-L1 경로를 블록함으로써, T 세포의 면역 제어가 해제되고, T 세포가 활성화되어 암 특이적 항원을 발현하고 있는 종양의 억제가 일어난다(특허문헌 1). 또한, CTLA-4도 활성화 T 세포에 발현되고, 항원 제시 세포의 CD28 리간드가 결합하면 T 세포의 활성화가 억제되기 때문에, 이 경로를 블록함으로써도 T 세포의 면역 제어를 해제하고, 종양 억제를 야기하는 것이 가능하다(비특허문헌 8). 이러한 원리를 응용한 항암제가 실용화되어 있다(예를 들어, 니볼루맙, 이필리무맙)(비특허문헌 9 내지 12). 또한, 이러한 면역 제어성의 기구는 그 밖에도 복수 존재하며, 장래 이들 면역 제어 기구를 블록하는 항종양제가 개발, 실용화되어 갈 것으로 기대된다.
고빈도 변이형의 암은, 면역 기구의 타깃이 되는 암 특이적인 항원을 많이 갖고 있으며, 면역 제어의 시그널 경로를 블록하는 요법의 효과가 나타나 있다(비특허문헌 13 내지 14). 그 때문에, 암이 고빈도 변이형인 것을 판별할 수 있는 바이오마커는, 예를 들어 적절한 치료의 선택, 치료 방침의 결정 등에 있어서 유용하다.
Nat. Rev. Cancer, 2014년, 14권(12호), pp.786 내지 800
J. Pathol., 2013년, 230권, pp.148 내지 153
Int. J. Gynecol. Cancer, 2015년, 25권(7호), pp.1187-1193
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Clin. Cancer Res., 2015년, 21권(14호), pp.3347-3355
European Journal of Human Genetics, 2011년, 19권, pp.320-325
일본 호흡기 학회지, 2014년, 3권(1호), pp.43-49
International Immunology, 2007년, 19권(7호), pp.813-824
Cancer Immunol. Res., 2014년, 2권(9호), pp.846-856
The New England Journal of Medicine, 2010년, 363권(8호), pp.711-723
Cancer Cell, 2015년, 27권(4호), pp.439-449
Science, 2015년, 348권(6230호), pp.124-128
The New England Journal of Medicine, 2015년, 372권(26호), pp.2509-2520
본 발명은, 고빈도 변이형의 암을 판별할 수 있는 새로운 바이오마커를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은, 고빈도 변이형의 암에 있어서, DNA 폴리메라아제 ε의 DNA 합성 활성 도메인(아미노산 서열의 제624번째 내지 제1145번째)에 있어서의 제952번째의 아미노산 잔기의 변이를 알아내었다. 지금까지 고빈도 변이형의 암과 DNA 폴리메라아제 ε의 엑소뉴클레아제 활성 도메인에 있어서의 아미노산 잔기의 변이의 관련이 알려져 있다. 한편, 고빈도 변이형의 암과 DNA 폴리메라아제 ε의 DNA 합성 활성 도메인에 있어서의 아미노산 잔기의 변이의 관련은 지금까지 알려지지 않았다. 본 발명은, 이 신규 지견에 기초한 것이다.
본 발명은, 하나 이상의 아미노산 돌연 변이를 포함하는 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε으로서, 당해 아미노산 돌연 변이가, 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 류신 잔기가 다른 아미노산 잔기가 되는 변이를 포함하는, 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε을 제공한다.
본 발명에 관한 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε은, 고빈도 변이형의 암에서 발견된다는 점에서, 예를 들어 고빈도 변이형의 암을 판별하는 새로운 바이오마커로서 유용하다.
상기 다른 아미노산 잔기는, 류신 잔기 이외의 아미노산 잔기이면 되지만, 세린 잔기인 것이 바람직하다. 세린 잔기임으로써, 고빈도 변이형의 암을 판별할 때의 판별 정밀도가 보다 높아진다.
본 발명은, 본 발명에 관한 변이형을 코딩하는 핵산에도 관한 것이다. 본 발명은 또한, 본 발명에 관한 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε을 코딩하는 핵산에 상보적인 핵산에도 관한 것이다. 이들 핵산 또는 상보적인 핵산은, 상기 다른 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열(코돈 서열) 또는 그의 상보 서열을 포함하는, 단편이어도 된다. 당해 단편도 핵산이며, 그의 염기 길이는, 예를 들어 20 내지 300 염기 길이어도 된다.
본 발명은 또한, 암을 앓고 있는 인간 환자에 있어서, 암이 고빈도 변이형의 암인지 판별하는 방법으로서, 상기 인간 환자로부터 채취된 암 세포 유래의 성분을 포함하는 샘플을 사용하여, 상기 암 세포에서 유래하는 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 아미노산 잔기의 변이의 유무를 결정하는 공정을 갖고, 당해 아미노산 잔기가 변이되어 있는 것이, 상기 암이 고빈도 변이형의 암인 것을 나타내는, 방법을 제공한다.
본 발명에 관한 방법에 의하면, 암을 앓고 있는 인간 환자에 있어서, 암이 고빈도 변이형의 암인지 여부를 판별할 수 있다.
본 발명에 관한 방법은, 상기 아미노산 잔기의 변이의 유무의 결정이, 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열의 변이의 검출을 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 관한 방법에 있어서, 상기 아미노산 잔기의 변이가 L952S인 것이 바람직하다. 이에 의해, 판별 정밀도가 보다 높아진다.
본 발명에 관한 방법에 있어서, 상기 암은, 대장암 또는 직장암이어도 된다. 암이 대장암 또는 직장암이면, 암이 고빈도 변이형의 암인지 여부를 보다 높은 확실성으로 판별할 수 있다.
본 발명은 또한, 고빈도 변이형의 암으로의 이환을 진단하는 방법으로서, 인간 검체로부터 채취된 세포 유래의 성분을 포함하는 샘플을 사용하여, 세포에서 유래하는 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 아미노산 잔기의 변이를 검출하는 공정을 갖고, 당해 아미노산 잔기가 변이되어 있는 경우, 인간 검체가 고빈도 변이형의 암에 이환되어 있다고 진단하는, 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 고빈도 변이형의 암을 판별할 수 있는 새로운 바이오마커가 제공된다.
도 1은 실시예의 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대하여 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명은, 이하의 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
〔고빈도 변이형의 암〕
고빈도 변이형(hypermutation 또는 hypermutated)의 암은, 통상의 암과 비교하여, 암 특이적 변이의 변이율이 높은 암이다. 여기서, 변이율이란, 106 염기(이하, 「Mb」라고도 한다)당의 아미노산 잔기의 변화를 동반하는 변이의 수이다. 고빈도 변이형의 암은, 통상의 암과의 변이율의 비교에 의해 판단된다. 변이율은 조사하는 유전자의 수나 종류에 따라 상이하며, 또한 암의 종류에 따라서도 상이하지만, 변이율이 상대적으로 통상의 암보다 높은 경우, 고빈도 변이형의 암이라고 판단된다.
〔인간 DNA 폴리메라아제 ε〕
인간 DNA 폴리메라아제 ε은, DNA 복제 효소이며, 야생형 DNA 폴리메라아제 ε은 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 DNA 합성 활성 도메인은, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 제624번째 내지 제1145번째에 해당하고, 엑소뉴클레아제 활성 도메인은, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 제87번째 내지 제426번째에 해당한다.
본 명세서에 있어서 아미노산 잔기의 변이란, 단백질의 아미노산 서열 중의 특정한 아미노산 잔기가, 대응하는 야생형의 아미노산 서열 중의 아미노산 잔기와는 상이한 아미노산 잔기가 되어 있는 것을 의미한다. 아미노산 잔기의 변이는, 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 삽입 중 어느 것이어도 된다. 예를 들어, 서열 번호 1로 표시되는 야생형 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 아미노산 잔기는 류신이지만, 이것이 류신 이외의 아미노산 잔기가 되어 있는 경우에 변이가 있다고 한다.
본 실시 형태에 관한 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε은, 하나 이상의 아미노산 잔기의 변이를 포함하고, 당해 아미노산 잔기의 변이는, 적어도 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 류신 잔기가 다른 아미노산 잔기가 되는 변이를 포함한다.
여기서, 다른 아미노산 잔기는, 류신 잔기 이외의 아미노산 잔기이면 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어 세린 잔기, 메티오닌 잔기, 발린 잔기, 트립토판 잔기 또는 페닐알라닌 잔기여도 된다.
본 실시 형태에 관한 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε은, 적어도 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 류신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 변이를 포함하는 것이 바람직하고, 적어도 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 류신 잔기가 세린 잔기로 치환된 변이(L952S)를 포함하는 것이 보다 바람직하다. 이에 의해, 고빈도 변이형의 암을 판별하기 위한 바이오마커로서 사용한 경우의 판별 정밀도가 보다 높아진다.
본 실시 형태에 관한 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε은, L952S의 변이만을 포함하는 것이어도 되고(서열 번호 2), L952S의 변이 이외에 추가로 하나 이상의 아미노산 잔기의 변이를 포함하고 있어도 된다.
L952S의 변이 이외에 포함할 수 있는 아미노산 잔기의 변이로서는, 예를 들어 D275V, P286R, S297F, H342R, F367S, V411L, L424V, A426V, S459F 등의 변이를 들 수 있다.
본 실시 형태에 관한 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε은, 그것을 갖는 인간 암 세포로부터 추출 및 정제하여 얻어도 되고, 또한 당해 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε을 코딩하는 핵산을 화학 합성 등에 의해 얻은 후, 적절한 단백질 발현계에서 발현시켜 얻어도 된다.
〔핵산〕
일 실시 형태에 관한 핵산은, 상술한 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε을 코딩하는 핵산(이하, 「핵산 1」이라고도 한다.)이다. 핵산 1은, 인트론을 포함하는 게놈 DNA 서열을 갖는 핵산이어도 되고, mRNA 서열을 갖는 핵산이어도 된다. 또한, 야생형 인간 DNA 폴리메라아제 ε 유전자의 게놈 DNA 서열은 NCBI 수탁번호 NG_033840이다. 또한, 야생형 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 mRNA 서열은 NCBI 수탁번호 L09561이다.
다른 실시 형태에 관한 핵산은, 핵산 1에 상보적인 염기 서열을 갖는 핵산(이하, 「핵산 2」라고도 한다.)이다.
일 실시 형태에 있어서, 핵산은 핵산 1의 단편이어도 되고, 당해 단편은, 상술한 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 다른 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열(코돈 서열)을 포함한다(이하, 이 단편에 관한 핵산을 「핵산 3」이라고도 한다.).
가일층 실시 형태에 있어서, 핵산은 핵산 2의 단편이어도 되고, 당해 단편은, 상술한 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 다른 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열(코돈 서열)의 상보 서열을 포함한다(이하, 이 단편에 관한 핵산을 「핵산 4」라고도 한다.).
핵산 1 내지 핵산 4는, 고빈도 변이형의 암을 판별하기 위한 바이오마커로서 이용할 수 있다. 즉, 예를 들어 핵산 1 내지 핵산 4에 있어서의 염기 서열의 변이를 검출함으로써, 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 잔기의 변이를 검출할 수 있다. 핵산 1 내지 핵산 4는, 게놈 DNA 서열로부터 인트론이 제거된 cDNA형의 염기 서열을 갖는 것이어도 된다.
본 명세서에 있어서의 「염기 서열의 변이」는, 해당 염기 서열이 코딩하는 아미노산 잔기가, 대응하는 야생형의 염기 서열이 코딩하는 아미노산 잔기와는 상이하도록, 염기 서열 중의 염기의 적어도 일부가 다른 염기로 치환되어 있는 것을 의미한다(「미스센스 변이」라고도 한다.).
또한, 핵산 1 내지 핵산 4는, 예를 들어 적절한 클로닝 벡터에 클로닝함으로써, 염기 서열의 변이를 검출하기 위한 프로브로서 이용할 수도 있다.
핵산 3 및 핵산 4(단편)의 염기 길이에 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 차세대 시퀀서에 있어서의 염기 서열의 변이의 검출을 보다 효율적으로 행할 수 있다는 관점에서, 핵산 3 및 핵산 4의 염기 길이는 20 내지 300 염기 길이인 것이 바람직하고, 50 내지 250 염기 길이인 것이 보다 바람직하고, 70 내지 200 염기 길이인 것이 더욱 바람직하고, 100 내지 200 염기 길이인 것이 특히 바람직하다.
또한, 핵산 3 및 핵산 4(단편)는, 예를 들어 차세대 시퀀서에 있어서의 염기 서열의 변이의 검출을 보다 효율적으로 행할 수 있다는 관점에서, 상술한 「다른 아미노산 잔기」를 포함하는 연속된 적어도 7개의 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산인 것이 바람직하고, 「다른 아미노산 잔기」를 포함하는 연속된 적어도 10개의 아미노산 잔기를 코딩하는 핵산인 것이 보다 바람직하다.
〔암이 고빈도 변이형의 암인지 판별하는 방법〕
본 실시 형태에 관한 판별 방법은, 암을 앓고 있는 인간 환자에 있어서, 암이 고빈도 변이형의 암인지 판별하는 방법으로서, 인간 환자로부터 채취된 암 세포 유래의 성분을 포함하는 샘플을 사용하여, 암 세포에서 유래하는 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 아미노산 잔기의 변이의 유무를 결정하는 공정을 갖고, 당해 아미노산 잔기가 변이되어 있는 것이, 암이 고빈도 변이형의 암인 것을 나타내는, 방법이다.
암 세포 유래의 성분을 포함하는 샘플이란, 암 세포 그 자체, 암 세포의 핵, 암 세포의 세포질, 암 세포에서 유래하는 단백질, 암 세포에서 유래하는 펩티드 및 암 세포에서 유래하는 핵산 중 하나 이상을 포함하는 샘플을 말한다. 암 세포 유래의 성분을 포함하는 샘플로서는, 예를 들어 암 절제 조직 검체, 생검 검체, 복수 침윤 암 세포, 혈액 순환 암 세포, 혈청, 혈장, 혈액, 대변, 소변, 가래, 골수액, 흉강 내액, 유두 흡인액, 림프액, 세포 배양액, 그리고 환자로부터 채취된 그 밖의 조직 및 액체를 들 수 있다. 고빈도 변이형의 암을 보다 높은 확실성으로 판별하는 관점에서, 암 세포 유래의 성분을 포함하는 샘플은, 암 절제 조직 검체, 생검 검체, 복수 침윤 암 세포, 혈액 순환 암 세포, 혈청 또는 혈장인 것이 바람직하고, 암 절제 조직 검체 또는 생검 검체인 것이 보다 바람직하다. 또한, 암 세포 유래의 성분을 포함하는 샘플이 암 절제 조직 검체 또는 생검 검체인 경우, 이들 검체는 동결, 알코올 고정, 포르말린 고정, 파라핀 포매, 또는 이들의 처리를 조합한 처리가 되어 있어도 된다.
인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 아미노산 잔기의 변이는, 류신 잔기가 세린 잔기, 메티오닌 잔기, 발린 잔기, 트립토판 잔기 또는 페닐알라닌 잔기가 된 것이어도 된다. 아미노산 잔기의 변이가 이들의 변이인 경우, 고빈도 변이형의 암을 보다 높은 확실성으로 판별할 수 있다. 그 중에서도, 변이가, 류신 잔기로부터 세린 잔기로 치환된 변이(L952S)인 경우, 고빈도 변이형의 암을 한층 더 높은 확실성으로 판별할 수 있다.
아미노산 잔기의 변이의 검출은, 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 변이의 검출은, 예를 들어 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열의 변이의 검출을 포함하고 있어도 된다.
염기 서열의 변이의 검출은, 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 염기 서열의 변이의 검출은, 예를 들어 DNA 시퀀싱(예를 들어, 차세대 시퀀서에 의한 시퀀싱), 폴리메라아제 연쇄 반응, 대립 유전자 특이적 증폭, 대립 유전자 특이적 프로브에서의 하이브리다이제이션, 미스매치 절단 해석, 단쇄 고차 구조 다형, 변성 구배 겔 전기 영동, 또는 온도 구배 겔 전기 영동에 의해 행해도 된다. 이들 기술은 단독으로 사용해도 되고, 복수의 기술을 조합하여 사용해도 된다.
암 세포의 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 아미노산 잔기에 변이가 있는 경우, 당해 암은 고빈도 변이형의 암이라고 판별할 수 있다.
본 실시 형태에 관한 발명을 이용 가능한 암으로서는, 예를 들어 대장암, 직장암, 결장암, 위암, 간암, 갑상선암, 자궁암, 신장암, 췌장암, 설암, 전립선암, 폐암, 피부암, 난소암, 담낭암, 두경부암, 정소종양, 부신암, 구강암, 골연부종양, 뇌종양, 악성 흑색종, 골육종, 연골육종, 횡문근육종, 평활근육종, 백혈병, 악성 림프종 및 다발성 골수종을 들 수 있다. 이들 중에서도 암이 대장암 또는 직장암인 경우, 고빈도 변이형의 암을 보다 높은 확실성으로 판별할 수 있다.
〔고빈도 변이형의 암으로의 이환을 진단하는 방법〕
본 실시 형태에 관한 진단 방법은, 고빈도 변이형의 암으로의 이환을 진단하는 방법으로서, 인간 검체로부터 채취된 세포 유래의 성분을 포함하는 샘플을 사용하여, 세포에서 유래하는 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 아미노산 잔기의 변이를 검출하는 공정을 갖고, 당해 아미노산 잔기가 변이되어 있는 경우, 인간 검체가 고빈도 변이형의 암에 이환되어 있다고 진단하는, 방법이다.
세포 유래의 성분을 포함하는 샘플이란, 세포 그 자체, 세포의 핵, 세포의 세포질, 세포에서 유래하는 단백질, 세포에서 유래하는 펩티드 및 세포에서 유래하는 핵산 중, 하나 이상을 포함하는 샘플을 말한다. 세포 유래의 성분을 포함하는 샘플로서는, 예를 들어 생검 검체, 혈청, 혈장, 혈액, 대변, 소변, 가래, 골수액, 흉강 내액, 유두 흡인액, 림프액, 세포 배양액, 그리고 인간으로부터 채취된 그 밖의 조직 및 액체를 들 수 있다. 고빈도 변이형의 암을 보다 높은 확실성으로 판별하는 관점에서, 세포 유래의 성분을 포함하는 샘플은, 생검 검체, 혈청 또는 혈장이어도 된다. 세포 유래의 성분을 포함하는 샘플이 생검 검체인 경우, 생검 검체는 동결, 알코올 고정, 포르말린 고정, 파라핀 포매, 또는 이들의 처리를 조합한 처리가 되어 있어도 된다.
상기 진단 방법에 있어서, 아미노산 잔기의 변이 및 그의 검출, 그리고 당해 진단 방법을 이용 가능한 암 등에 대해서는, 상기에서 설명한 것과 마찬가지여도 된다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은, 이하의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
(샘플 제조)
대장암 환자 201 증례의 암 절제 검체 포르말린 고정 파라핀 포매 검체를 제작하고, 이것을 얇게 절단하여 두께 20㎛의 절편을 2개 제작하였다. 제작한 2개의 절편을 슬라이드 글래스에 부착한 것을 DNA 추출용의 샘플로서 사용하였다.
DNA 추출용의 샘플과는 별도로 두께 4㎛의 절편을 제작하고, 제작한 절편을 슬라이드 글래스에 부착한 것을 현미경 관찰용의 샘플로 하였다.
(DNA 추출)
현미경 관찰용의 샘플을 헤마톡실린에오신으로 염색하였다. 염색 후의 샘플을, 현미경으로 관찰하여 절편 중의 암 세포를 많이 포함하는 부위를 특정하였다. DNA 추출용의 샘플로부터, 현미경 관찰용의 샘플에서 특정한 부위를 면도기로 깍아내고, 깍아낸 부위로부터 DNA를 추출하였다. DNA의 추출은, BiOstic(등록 상표) FFPE Tissue DNA Isolation Kit(상품명)를 사용하여 행하였다.
(서열 분석)
대장암 환자 201 증례의 암 절제 검체 포르말린 고정 파라핀 포매 검체로부터 추출한 DNA를 사용하여 415 유전자의 암 특이적 변이(아미노산 잔기의 변이를 동반하는 변이)를 차세대 시퀀서(MiSeq 시퀀서, 일루미나사)에 의해 분석하였다. 도 1에 분석 결과를 나타내었다.
도 1은, 각 검체마다 변이율(1Mb당의 변이수)을 플롯한 그래프이다. 도 1의 횡축은, 변이율이 높은 순서대로 좌측으로부터 우측으로 늘어서도록 검체를 플롯하고 있다. 도 1에 도시된 바와 같이 17 검체에서 많은 변이가 검출되어, 이들 검체는 고빈도 변이형이라고 생각되었다. 17 검체 중, 4 검체(도 1 중, A 내지 D로 나타낸 검체)의 변이율은 다른 것보다 현저하게 높았다. 그리고, 도 1 중, A, B 및 D로 나타낸 검체로부터는 미스매치 수복 유전자의 변이는 존재하지 않았다. 이 원인을 찾기 위해, 이들 4 검체에 대해서는, 추가로 인간 DNA 폴리메라아제 ε 유전자의 서열을 분석하였다.
변이율이 현저하게 높았던 4 검체의 인간 DNA 폴리메라아제 ε 유전자의 서열을 분석한 결과, 1 검체(도 1 중, D로 나타낸 검체)로부터는, 지금까지 고빈도 변이형의 암을 일으키는 변이라는 것이 알려져 있지 않은 L952S가 검출되었다. 또한, 도 1 중, A 및 B로 나타낸 검체로부터는, 각각 고빈도 변이형의 암을 일으키는 변이로서 이미 알려져 있는 V411L 및 P286R이 검출되었다. 또한, 도 1 중, C로 나타낸 검체(미스매치 수복 유전자의 변이 있음)는, 인간 DNA 폴리메라아제 ε 유전자의 변이는 없었다.
SEQUENCE LISTING
<110> Denka Company Limited
Niigata University
<120> A mutated human DNA polymerase epsilon
<130> FP17-0638-00
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2286
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ser Leu Arg Ser Gly Gly Arg Arg Arg Ala Asp Pro Gly Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Ala Ser Arg Asp Asp Gly Ala Thr Ser Ser Val Ser Ala Leu
20 25 30
Lys Arg Leu Glu Arg Ser Gln Trp Thr Asp Lys Met Asp Leu Arg Phe
35 40 45
Gly Phe Glu Arg Leu Lys Glu Pro Gly Glu Lys Thr Gly Trp Leu Ile
50 55 60
Asn Met His Pro Thr Glu Ile Leu Asp Glu Asp Lys Arg Leu Gly Ser
65 70 75 80
Ala Val Asp Tyr Tyr Phe Ile Gln Asp Asp Gly Ser Arg Phe Lys Val
85 90 95
Ala Leu Pro Tyr Lys Pro Tyr Phe Tyr Ile Ala Thr Arg Lys Gly Cys
100 105 110
Glu Arg Glu Val Ser Ser Phe Leu Ser Lys Lys Phe Gln Gly Lys Ile
115 120 125
Ala Lys Val Glu Thr Val Pro Lys Glu Asp Leu Asp Leu Pro Asn His
130 135 140
Leu Val Gly Leu Lys Arg Asn Tyr Ile Arg Leu Ser Phe His Thr Val
145 150 155 160
Glu Asp Leu Val Lys Val Arg Lys Glu Ile Ser Pro Ala Val Lys Lys
165 170 175
Asn Arg Glu Gln Asp His Ala Ser Asp Ala Tyr Thr Ala Leu Leu Ser
180 185 190
Ser Val Leu Gln Arg Gly Gly Val Ile Thr Asp Glu Glu Glu Thr Ser
195 200 205
Lys Lys Ile Ala Asp Gln Leu Asp Asn Ile Val Asp Met Arg Glu Tyr
210 215 220
Asp Val Pro Tyr His Ile Arg Leu Ser Ile Asp Leu Lys Ile His Val
225 230 235 240
Ala His Trp Tyr Asn Val Arg Tyr Arg Gly Asn Ala Phe Pro Val Glu
245 250 255
Ile Thr Arg Arg Asp Asp Leu Val Glu Arg Pro Asp Pro Val Val Leu
260 265 270
Ala Phe Asp Ile Glu Thr Thr Lys Leu Pro Leu Lys Phe Pro Asp Ala
275 280 285
Glu Thr Asp Gln Ile Met Met Ile Ser Tyr Met Ile Asp Gly Gln Gly
290 295 300
Tyr Leu Ile Thr Asn Arg Glu Ile Val Ser Glu Asp Ile Glu Asp Phe
305 310 315 320
Glu Phe Thr Pro Lys Pro Glu Tyr Glu Gly Pro Phe Cys Val Phe Asn
325 330 335
Glu Pro Asp Glu Ala His Leu Ile Gln Arg Trp Phe Glu His Val Gln
340 345 350
Glu Thr Lys Pro Thr Ile Met Val Thr Tyr Asn Gly Asp Phe Phe Asp
355 360 365
Trp Pro Phe Val Glu Ala Arg Ala Ala Val His Gly Leu Ser Met Gln
370 375 380
Gln Glu Ile Gly Phe Gln Lys Asp Ser Gln Gly Glu Tyr Lys Ala Pro
385 390 395 400
Gln Cys Ile His Met Asp Cys Leu Arg Trp Val Lys Arg Asp Ser Tyr
405 410 415
Leu Pro Val Gly Ser His Asn Leu Lys Ala Ala Ala Lys Ala Lys Leu
420 425 430
Gly Tyr Asp Pro Val Glu Leu Asp Pro Glu Asp Met Cys Arg Met Ala
435 440 445
Thr Glu Gln Pro Gln Thr Leu Ala Thr Tyr Ser Val Ser Asp Ala Val
450 455 460
Ala Thr Tyr Tyr Leu Tyr Met Lys Tyr Val His Pro Phe Ile Phe Ala
465 470 475 480
Leu Cys Thr Ile Ile Pro Met Glu Pro Asp Glu Val Leu Arg Lys Gly
485 490 495
Ser Gly Thr Leu Cys Glu Ala Leu Leu Met Val Gln Ala Phe His Ala
500 505 510
Asn Ile Ile Phe Pro Asn Lys Gln Glu Gln Glu Phe Asn Lys Leu Thr
515 520 525
Asp Asp Gly His Val Leu Asp Ser Glu Thr Tyr Val Gly Gly His Val
530 535 540
Glu Ala Leu Glu Ser Gly Val Phe Arg Ser Asp Ile Pro Cys Arg Phe
545 550 555 560
Arg Met Asn Pro Ala Ala Phe Asp Phe Leu Leu Gln Arg Val Glu Lys
565 570 575
Thr Leu Arg His Ala Leu Glu Glu Glu Glu Lys Val Pro Val Glu Gln
580 585 590
Val Thr Asn Phe Glu Glu Val Cys Asp Glu Ile Lys Ser Lys Leu Ala
595 600 605
Ser Leu Lys Asp Val Pro Ser Arg Ile Glu Cys Pro Leu Ile Tyr His
610 615 620
Leu Asp Val Gly Ala Met Tyr Pro Asn Ile Ile Leu Thr Asn Arg Leu
625 630 635 640
Gln Pro Ser Ala Met Val Asp Glu Ala Thr Cys Ala Ala Cys Asp Phe
645 650 655
Asn Lys Pro Gly Ala Asn Cys Gln Arg Lys Met Ala Trp Gln Trp Arg
660 665 670
Gly Glu Phe Met Pro Ala Ser Arg Ser Glu Tyr His Arg Ile Gln His
675 680 685
Gln Leu Glu Ser Glu Lys Phe Pro Pro Leu Phe Pro Glu Gly Pro Ala
690 695 700
Arg Ala Phe His Glu Leu Ser Arg Glu Glu Gln Ala Lys Tyr Glu Lys
705 710 715 720
Arg Arg Leu Ala Asp Tyr Cys Arg Lys Ala Tyr Lys Lys Ile His Ile
725 730 735
Thr Lys Val Glu Glu Arg Leu Thr Thr Ile Cys Gln Arg Glu Asn Ser
740 745 750
Phe Tyr Val Asp Thr Val Arg Ala Phe Arg Asp Arg Arg Tyr Glu Phe
755 760 765
Lys Gly Leu His Lys Val Trp Lys Lys Lys Leu Ser Ala Ala Val Glu
770 775 780
Val Gly Asp Ala Ala Glu Val Lys Arg Cys Lys Asn Met Glu Val Leu
785 790 795 800
Tyr Asp Ser Leu Gln Leu Ala His Lys Cys Ile Leu Asn Ser Phe Tyr
805 810 815
Gly Tyr Val Met Arg Lys Gly Ala Arg Trp Tyr Ser Met Glu Met Ala
820 825 830
Gly Ile Val Cys Phe Thr Gly Ala Asn Ile Ile Thr Gln Ala Arg Glu
835 840 845
Leu Ile Glu Gln Ile Gly Arg Pro Leu Glu Leu Asp Thr Asp Gly Ile
850 855 860
Trp Cys Val Leu Pro Asn Ser Phe Pro Glu Asn Phe Val Phe Lys Thr
865 870 875 880
Thr Asn Val Lys Lys Pro Lys Val Thr Ile Ser Tyr Pro Gly Ala Met
885 890 895
Leu Asn Ile Met Val Lys Glu Gly Phe Thr Asn Asp Gln Tyr Gln Glu
900 905 910
Leu Ala Glu Pro Ser Ser Leu Thr Tyr Val Thr Arg Ser Glu Asn Ser
915 920 925
Ile Phe Phe Glu Val Asp Gly Pro Tyr Leu Ala Met Ile Leu Pro Ala
930 935 940
Ser Lys Glu Glu Gly Lys Lys Leu Lys Lys Arg Tyr Ala Val Phe Asn
945 950 955 960
Glu Asp Gly Ser Leu Ala Glu Leu Lys Gly Phe Glu Val Lys Arg Arg
965 970 975
Gly Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ile Phe Gln Ser Ser Val Phe Glu Ala
980 985 990
Phe Leu Lys Gly Ser Thr Leu Glu Glu Val Tyr Gly Ser Val Ala Lys
995 1000 1005
Val Ala Asp Tyr Trp Leu Asp Val Leu Tyr Ser Lys Ala Ala Asn
1010 1015 1020
Met Pro Asp Ser Glu Leu Phe Glu Leu Ile Ser Glu Asn Arg Ser
1025 1030 1035
Met Ser Arg Lys Leu Glu Asp Tyr Gly Glu Gln Lys Ser Thr Ser
1040 1045 1050
Ile Ser Thr Ala Lys Arg Leu Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gln Met
1055 1060 1065
Val Lys Asp Ala Gly Leu Ser Cys Arg Tyr Ile Ile Ser Arg Lys
1070 1075 1080
Pro Glu Gly Ser Pro Val Thr Glu Arg Ala Ile Pro Leu Ala Ile
1085 1090 1095
Phe Gln Ala Glu Pro Thr Val Arg Lys His Phe Leu Arg Lys Trp
1100 1105 1110
Leu Lys Ser Ser Ser Leu Gln Asp Phe Asp Ile Arg Ala Ile Leu
1115 1120 1125
Asp Trp Asp Tyr Tyr Ile Glu Arg Leu Gly Ser Ala Ile Gln Lys
1130 1135 1140
Ile Ile Thr Ile Pro Ala Ala Leu Gln Gln Val Lys Asn Pro Val
1145 1150 1155
Pro Arg Val Lys His Pro Asp Trp Leu His Lys Lys Leu Leu Glu
1160 1165 1170
Lys Asn Asp Val Tyr Lys Gln Lys Lys Ile Ser Glu Leu Phe Thr
1175 1180 1185
Leu Glu Gly Arg Arg Gln Val Thr Met Ala Glu Ala Ser Glu Asp
1190 1195 1200
Ser Pro Arg Pro Ser Ala Pro Asp Met Glu Asp Phe Gly Leu Val
1205 1210 1215
Lys Leu Pro His Pro Ala Ala Pro Val Thr Val Lys Arg Lys Arg
1220 1225 1230
Val Leu Trp Glu Ser Gln Glu Glu Ser Gln Asp Leu Thr Pro Thr
1235 1240 1245
Val Pro Trp Gln Glu Ile Leu Gly Gln Pro Pro Ala Leu Gly Thr
1250 1255 1260
Ser Gln Glu Glu Trp Leu Val Trp Leu Arg Phe His Lys Lys Lys
1265 1270 1275
Trp Gln Leu Gln Ala Arg Gln Arg Leu Ala Arg Arg Lys Arg Gln
1280 1285 1290
Arg Leu Glu Ser Ala Glu Gly Val Leu Arg Pro Gly Ala Ile Arg
1295 1300 1305
Asp Gly Pro Ala Thr Gly Leu Gly Ser Phe Leu Arg Arg Thr Ala
1310 1315 1320
Arg Ser Ile Leu Asp Leu Pro Trp Gln Ile Val Gln Ile Ser Glu
1325 1330 1335
Thr Ser Gln Ala Gly Leu Phe Arg Leu Trp Ala Leu Val Gly Ser
1340 1345 1350
Asp Leu His Cys Ile Arg Leu Ser Ile Pro Arg Val Phe Tyr Val
1355 1360 1365
Asn Gln Arg Val Ala Lys Ala Glu Glu Gly Ala Ser Tyr Arg Lys
1370 1375 1380
Val Asn Arg Val Leu Pro Arg Ser Asn Met Val Tyr Asn Leu Tyr
1385 1390 1395
Glu Tyr Ser Val Pro Glu Asp Met Tyr Gln Glu His Ile Asn Glu
1400 1405 1410
Ile Asn Ala Glu Leu Ser Ala Pro Asp Ile Glu Gly Val Tyr Glu
1415 1420 1425
Thr Gln Val Pro Leu Leu Phe Arg Ala Leu Val His Leu Gly Cys
1430 1435 1440
Val Cys Val Val Asn Lys Gln Leu Val Arg His Leu Ser Gly Trp
1445 1450 1455
Glu Ala Glu Thr Phe Ala Leu Glu His Leu Glu Met Arg Ser Leu
1460 1465 1470
Ala Gln Phe Ser Tyr Leu Glu Pro Gly Ser Ile Arg His Ile Tyr
1475 1480 1485
Leu Tyr His His Ala Gln Ala His Lys Ala Leu Phe Gly Ile Phe
1490 1495 1500
Ile Pro Ser Gln Arg Arg Ala Ser Val Phe Val Leu Asp Thr Val
1505 1510 1515
Arg Ser Asn Gln Met Pro Ser Leu Gly Ala Leu Tyr Ser Ala Glu
1520 1525 1530
His Gly Leu Leu Leu Glu Lys Val Gly Pro Glu Leu Leu Pro Pro
1535 1540 1545
Pro Lys His Thr Phe Glu Val Arg Ala Glu Thr Asp Leu Lys Thr
1550 1555 1560
Ile Cys Arg Ala Ile Gln Arg Phe Leu Leu Ala Tyr Lys Glu Glu
1565 1570 1575
Arg Arg Gly Pro Thr Leu Ile Ala Val Gln Ser Ser Trp Glu Leu
1580 1585 1590
Lys Arg Leu Ala Ser Glu Ile Pro Val Leu Glu Glu Phe Pro Leu
1595 1600 1605
Val Pro Ile Cys Val Ala Asp Lys Ile Asn Tyr Gly Val Leu Asp
1610 1615 1620
Trp Gln Arg His Gly Ala Arg Arg Met Ile Arg His Tyr Leu Asn
1625 1630 1635
Leu Asp Thr Cys Leu Ser Gln Ala Phe Glu Met Ser Arg Tyr Phe
1640 1645 1650
His Ile Pro Ile Gly Asn Leu Pro Glu Asp Ile Ser Thr Phe Gly
1655 1660 1665
Ser Asp Leu Phe Phe Ala Arg His Leu Gln Arg His Asn His Leu
1670 1675 1680
Leu Trp Leu Ser Pro Thr Ala Arg Pro Asp Leu Gly Gly Lys Glu
1685 1690 1695
Ala Asp Asp Asn Cys Leu Val Met Glu Phe Asp Asp Gln Ala Thr
1700 1705 1710
Val Glu Ile Asn Ser Ser Gly Cys Tyr Ser Thr Val Cys Val Glu
1715 1720 1725
Leu Asp Leu Gln Asn Leu Ala Val Asn Thr Ile Leu Gln Ser His
1730 1735 1740
His Val Asn Asp Met Glu Gly Ala Asp Ser Met Gly Ile Ser Phe
1745 1750 1755
Asp Val Ile Gln Gln Ala Ser Leu Glu Asp Met Ile Thr Gly Gly
1760 1765 1770
Gln Ala Ala Ser Ala Pro Ala Ser Tyr Asp Glu Thr Ala Leu Cys
1775 1780 1785
Ser Asn Thr Phe Arg Ile Leu Lys Ser Met Val Val Gly Trp Val
1790 1795 1800
Lys Glu Ile Thr Gln Tyr His Asn Ile Tyr Ala Asp Asn Gln Val
1805 1810 1815
Met His Phe Tyr Arg Trp Leu Arg Ser Pro Ser Ser Leu Leu His
1820 1825 1830
Asp Pro Ala Leu His Arg Thr Leu His Asn Met Met Lys Lys Leu
1835 1840 1845
Phe Leu Gln Leu Ile Ala Glu Phe Lys Arg Leu Gly Ser Ser Val
1850 1855 1860
Ile Tyr Ala Asn Phe Asn Arg Ile Ile Leu Cys Thr Lys Lys Arg
1865 1870 1875
Arg Val Glu Asp Ala Ile Ala Tyr Val Glu Tyr Ile Thr Ser Ser
1880 1885 1890
Ile His Ser Lys Glu Thr Phe His Ser Leu Thr Ile Ser Phe Ser
1895 1900 1905
Arg Cys Trp Glu Phe Leu Leu Trp Met Asp Pro Ser Asn Tyr Gly
1910 1915 1920
Gly Ile Lys Gly Lys Val Ser Ser Arg Ile His Cys Gly Leu Gln
1925 1930 1935
Asp Ser Gln Lys Ala Gly Gly Ala Glu Asp Glu Gln Glu Asn Glu
1940 1945 1950
Asp Asp Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu
1955 1960 1965
Glu Ser Asn Val Glu Asp Leu Leu Glu Asn Asn Trp Asn Ile Leu
1970 1975 1980
Gln Phe Leu Pro Gln Ala Ala Ser Cys Gln Asn Tyr Phe Leu Met
1985 1990 1995
Ile Val Ser Ala Tyr Ile Val Ala Val Tyr His Cys Met Lys Asp
2000 2005 2010
Gly Leu Arg Arg Ser Ala Pro Gly Ser Thr Pro Val Arg Arg Arg
2015 2020 2025
Gly Ala Ser Gln Leu Ser Gln Glu Ala Glu Gly Ala Val Gly Ala
2030 2035 2040
Leu Pro Gly Met Ile Thr Phe Ser Gln Asp Tyr Val Ala Asn Glu
2045 2050 2055
Leu Thr Gln Ser Phe Phe Thr Ile Thr Gln Lys Ile Gln Lys Lys
2060 2065 2070
Val Thr Gly Ser Arg Asn Ser Thr Glu Leu Ser Glu Met Phe Pro
2075 2080 2085
Val Leu Pro Gly Ser His Leu Leu Leu Asn Asn Pro Ala Leu Glu
2090 2095 2100
Phe Ile Lys Tyr Val Cys Lys Val Leu Ser Leu Asp Thr Asn Ile
2105 2110 2115
Thr Asn Gln Val Asn Lys Leu Asn Arg Asp Leu Leu Arg Leu Val
2120 2125 2130
Asp Val Gly Glu Phe Ser Glu Glu Ala Gln Phe Arg Asp Pro Cys
2135 2140 2145
Arg Ser Tyr Val Leu Pro Glu Val Ile Cys Arg Ser Cys Asn Phe
2150 2155 2160
Cys Arg Asp Leu Asp Leu Cys Lys Asp Ser Ser Phe Ser Glu Asp
2165 2170 2175
Gly Ala Val Leu Pro Gln Trp Leu Cys Ser Asn Cys Gln Ala Pro
2180 2185 2190
Tyr Asp Ser Ser Ala Ile Glu Met Thr Leu Val Glu Val Leu Gln
2195 2200 2205
Lys Lys Leu Met Ala Phe Thr Leu Gln Asp Leu Val Cys Leu Lys
2210 2215 2220
Cys Arg Gly Val Lys Glu Thr Ser Met Pro Val Tyr Cys Thr Cys
2225 2230 2235
Ala Gly Asp Phe Ala Leu Thr Ile His Thr Gln Val Phe Met Glu
2240 2245 2250
Gln Ile Gly Ile Phe Arg Asn Ile Ala Gln His Tyr Gly Met Ser
2255 2260 2265
Tyr Leu Leu Glu Thr Leu Glu Trp Leu Leu Gln Lys Asn Pro Gln
2270 2275 2280
Leu Gly His
2285
<210> 2
<211> 2286
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ser Leu Arg Ser Gly Gly Arg Arg Arg Ala Asp Pro Gly Ala Asp
1 5 10 15
Gly Glu Ala Ser Arg Asp Asp Gly Ala Thr Ser Ser Val Ser Ala Leu
20 25 30
Lys Arg Leu Glu Arg Ser Gln Trp Thr Asp Lys Met Asp Leu Arg Phe
35 40 45
Gly Phe Glu Arg Leu Lys Glu Pro Gly Glu Lys Thr Gly Trp Leu Ile
50 55 60
Asn Met His Pro Thr Glu Ile Leu Asp Glu Asp Lys Arg Leu Gly Ser
65 70 75 80
Ala Val Asp Tyr Tyr Phe Ile Gln Asp Asp Gly Ser Arg Phe Lys Val
85 90 95
Ala Leu Pro Tyr Lys Pro Tyr Phe Tyr Ile Ala Thr Arg Lys Gly Cys
100 105 110
Glu Arg Glu Val Ser Ser Phe Leu Ser Lys Lys Phe Gln Gly Lys Ile
115 120 125
Ala Lys Val Glu Thr Val Pro Lys Glu Asp Leu Asp Leu Pro Asn His
130 135 140
Leu Val Gly Leu Lys Arg Asn Tyr Ile Arg Leu Ser Phe His Thr Val
145 150 155 160
Glu Asp Leu Val Lys Val Arg Lys Glu Ile Ser Pro Ala Val Lys Lys
165 170 175
Asn Arg Glu Gln Asp His Ala Ser Asp Ala Tyr Thr Ala Leu Leu Ser
180 185 190
Ser Val Leu Gln Arg Gly Gly Val Ile Thr Asp Glu Glu Glu Thr Ser
195 200 205
Lys Lys Ile Ala Asp Gln Leu Asp Asn Ile Val Asp Met Arg Glu Tyr
210 215 220
Asp Val Pro Tyr His Ile Arg Leu Ser Ile Asp Leu Lys Ile His Val
225 230 235 240
Ala His Trp Tyr Asn Val Arg Tyr Arg Gly Asn Ala Phe Pro Val Glu
245 250 255
Ile Thr Arg Arg Asp Asp Leu Val Glu Arg Pro Asp Pro Val Val Leu
260 265 270
Ala Phe Asp Ile Glu Thr Thr Lys Leu Pro Leu Lys Phe Pro Asp Ala
275 280 285
Glu Thr Asp Gln Ile Met Met Ile Ser Tyr Met Ile Asp Gly Gln Gly
290 295 300
Tyr Leu Ile Thr Asn Arg Glu Ile Val Ser Glu Asp Ile Glu Asp Phe
305 310 315 320
Glu Phe Thr Pro Lys Pro Glu Tyr Glu Gly Pro Phe Cys Val Phe Asn
325 330 335
Glu Pro Asp Glu Ala His Leu Ile Gln Arg Trp Phe Glu His Val Gln
340 345 350
Glu Thr Lys Pro Thr Ile Met Val Thr Tyr Asn Gly Asp Phe Phe Asp
355 360 365
Trp Pro Phe Val Glu Ala Arg Ala Ala Val His Gly Leu Ser Met Gln
370 375 380
Gln Glu Ile Gly Phe Gln Lys Asp Ser Gln Gly Glu Tyr Lys Ala Pro
385 390 395 400
Gln Cys Ile His Met Asp Cys Leu Arg Trp Val Lys Arg Asp Ser Tyr
405 410 415
Leu Pro Val Gly Ser His Asn Leu Lys Ala Ala Ala Lys Ala Lys Leu
420 425 430
Gly Tyr Asp Pro Val Glu Leu Asp Pro Glu Asp Met Cys Arg Met Ala
435 440 445
Thr Glu Gln Pro Gln Thr Leu Ala Thr Tyr Ser Val Ser Asp Ala Val
450 455 460
Ala Thr Tyr Tyr Leu Tyr Met Lys Tyr Val His Pro Phe Ile Phe Ala
465 470 475 480
Leu Cys Thr Ile Ile Pro Met Glu Pro Asp Glu Val Leu Arg Lys Gly
485 490 495
Ser Gly Thr Leu Cys Glu Ala Leu Leu Met Val Gln Ala Phe His Ala
500 505 510
Asn Ile Ile Phe Pro Asn Lys Gln Glu Gln Glu Phe Asn Lys Leu Thr
515 520 525
Asp Asp Gly His Val Leu Asp Ser Glu Thr Tyr Val Gly Gly His Val
530 535 540
Glu Ala Leu Glu Ser Gly Val Phe Arg Ser Asp Ile Pro Cys Arg Phe
545 550 555 560
Arg Met Asn Pro Ala Ala Phe Asp Phe Leu Leu Gln Arg Val Glu Lys
565 570 575
Thr Leu Arg His Ala Leu Glu Glu Glu Glu Lys Val Pro Val Glu Gln
580 585 590
Val Thr Asn Phe Glu Glu Val Cys Asp Glu Ile Lys Ser Lys Leu Ala
595 600 605
Ser Leu Lys Asp Val Pro Ser Arg Ile Glu Cys Pro Leu Ile Tyr His
610 615 620
Leu Asp Val Gly Ala Met Tyr Pro Asn Ile Ile Leu Thr Asn Arg Leu
625 630 635 640
Gln Pro Ser Ala Met Val Asp Glu Ala Thr Cys Ala Ala Cys Asp Phe
645 650 655
Asn Lys Pro Gly Ala Asn Cys Gln Arg Lys Met Ala Trp Gln Trp Arg
660 665 670
Gly Glu Phe Met Pro Ala Ser Arg Ser Glu Tyr His Arg Ile Gln His
675 680 685
Gln Leu Glu Ser Glu Lys Phe Pro Pro Leu Phe Pro Glu Gly Pro Ala
690 695 700
Arg Ala Phe His Glu Leu Ser Arg Glu Glu Gln Ala Lys Tyr Glu Lys
705 710 715 720
Arg Arg Leu Ala Asp Tyr Cys Arg Lys Ala Tyr Lys Lys Ile His Ile
725 730 735
Thr Lys Val Glu Glu Arg Leu Thr Thr Ile Cys Gln Arg Glu Asn Ser
740 745 750
Phe Tyr Val Asp Thr Val Arg Ala Phe Arg Asp Arg Arg Tyr Glu Phe
755 760 765
Lys Gly Leu His Lys Val Trp Lys Lys Lys Leu Ser Ala Ala Val Glu
770 775 780
Val Gly Asp Ala Ala Glu Val Lys Arg Cys Lys Asn Met Glu Val Leu
785 790 795 800
Tyr Asp Ser Leu Gln Leu Ala His Lys Cys Ile Leu Asn Ser Phe Tyr
805 810 815
Gly Tyr Val Met Arg Lys Gly Ala Arg Trp Tyr Ser Met Glu Met Ala
820 825 830
Gly Ile Val Cys Phe Thr Gly Ala Asn Ile Ile Thr Gln Ala Arg Glu
835 840 845
Leu Ile Glu Gln Ile Gly Arg Pro Leu Glu Leu Asp Thr Asp Gly Ile
850 855 860
Trp Cys Val Leu Pro Asn Ser Phe Pro Glu Asn Phe Val Phe Lys Thr
865 870 875 880
Thr Asn Val Lys Lys Pro Lys Val Thr Ile Ser Tyr Pro Gly Ala Met
885 890 895
Leu Asn Ile Met Val Lys Glu Gly Phe Thr Asn Asp Gln Tyr Gln Glu
900 905 910
Leu Ala Glu Pro Ser Ser Leu Thr Tyr Val Thr Arg Ser Glu Asn Ser
915 920 925
Ile Phe Phe Glu Val Asp Gly Pro Tyr Leu Ala Met Ile Leu Pro Ala
930 935 940
Ser Lys Glu Glu Gly Lys Lys Ser Lys Lys Arg Tyr Ala Val Phe Asn
945 950 955 960
Glu Asp Gly Ser Leu Ala Glu Leu Lys Gly Phe Glu Val Lys Arg Arg
965 970 975
Gly Glu Leu Gln Leu Ile Lys Ile Phe Gln Ser Ser Val Phe Glu Ala
980 985 990
Phe Leu Lys Gly Ser Thr Leu Glu Glu Val Tyr Gly Ser Val Ala Lys
995 1000 1005
Val Ala Asp Tyr Trp Leu Asp Val Leu Tyr Ser Lys Ala Ala Asn
1010 1015 1020
Met Pro Asp Ser Glu Leu Phe Glu Leu Ile Ser Glu Asn Arg Ser
1025 1030 1035
Met Ser Arg Lys Leu Glu Asp Tyr Gly Glu Gln Lys Ser Thr Ser
1040 1045 1050
Ile Ser Thr Ala Lys Arg Leu Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gln Met
1055 1060 1065
Val Lys Asp Ala Gly Leu Ser Cys Arg Tyr Ile Ile Ser Arg Lys
1070 1075 1080
Pro Glu Gly Ser Pro Val Thr Glu Arg Ala Ile Pro Leu Ala Ile
1085 1090 1095
Phe Gln Ala Glu Pro Thr Val Arg Lys His Phe Leu Arg Lys Trp
1100 1105 1110
Leu Lys Ser Ser Ser Leu Gln Asp Phe Asp Ile Arg Ala Ile Leu
1115 1120 1125
Asp Trp Asp Tyr Tyr Ile Glu Arg Leu Gly Ser Ala Ile Gln Lys
1130 1135 1140
Ile Ile Thr Ile Pro Ala Ala Leu Gln Gln Val Lys Asn Pro Val
1145 1150 1155
Pro Arg Val Lys His Pro Asp Trp Leu His Lys Lys Leu Leu Glu
1160 1165 1170
Lys Asn Asp Val Tyr Lys Gln Lys Lys Ile Ser Glu Leu Phe Thr
1175 1180 1185
Leu Glu Gly Arg Arg Gln Val Thr Met Ala Glu Ala Ser Glu Asp
1190 1195 1200
Ser Pro Arg Pro Ser Ala Pro Asp Met Glu Asp Phe Gly Leu Val
1205 1210 1215
Lys Leu Pro His Pro Ala Ala Pro Val Thr Val Lys Arg Lys Arg
1220 1225 1230
Val Leu Trp Glu Ser Gln Glu Glu Ser Gln Asp Leu Thr Pro Thr
1235 1240 1245
Val Pro Trp Gln Glu Ile Leu Gly Gln Pro Pro Ala Leu Gly Thr
1250 1255 1260
Ser Gln Glu Glu Trp Leu Val Trp Leu Arg Phe His Lys Lys Lys
1265 1270 1275
Trp Gln Leu Gln Ala Arg Gln Arg Leu Ala Arg Arg Lys Arg Gln
1280 1285 1290
Arg Leu Glu Ser Ala Glu Gly Val Leu Arg Pro Gly Ala Ile Arg
1295 1300 1305
Asp Gly Pro Ala Thr Gly Leu Gly Ser Phe Leu Arg Arg Thr Ala
1310 1315 1320
Arg Ser Ile Leu Asp Leu Pro Trp Gln Ile Val Gln Ile Ser Glu
1325 1330 1335
Thr Ser Gln Ala Gly Leu Phe Arg Leu Trp Ala Leu Val Gly Ser
1340 1345 1350
Asp Leu His Cys Ile Arg Leu Ser Ile Pro Arg Val Phe Tyr Val
1355 1360 1365
Asn Gln Arg Val Ala Lys Ala Glu Glu Gly Ala Ser Tyr Arg Lys
1370 1375 1380
Val Asn Arg Val Leu Pro Arg Ser Asn Met Val Tyr Asn Leu Tyr
1385 1390 1395
Glu Tyr Ser Val Pro Glu Asp Met Tyr Gln Glu His Ile Asn Glu
1400 1405 1410
Ile Asn Ala Glu Leu Ser Ala Pro Asp Ile Glu Gly Val Tyr Glu
1415 1420 1425
Thr Gln Val Pro Leu Leu Phe Arg Ala Leu Val His Leu Gly Cys
1430 1435 1440
Val Cys Val Val Asn Lys Gln Leu Val Arg His Leu Ser Gly Trp
1445 1450 1455
Glu Ala Glu Thr Phe Ala Leu Glu His Leu Glu Met Arg Ser Leu
1460 1465 1470
Ala Gln Phe Ser Tyr Leu Glu Pro Gly Ser Ile Arg His Ile Tyr
1475 1480 1485
Leu Tyr His His Ala Gln Ala His Lys Ala Leu Phe Gly Ile Phe
1490 1495 1500
Ile Pro Ser Gln Arg Arg Ala Ser Val Phe Val Leu Asp Thr Val
1505 1510 1515
Arg Ser Asn Gln Met Pro Ser Leu Gly Ala Leu Tyr Ser Ala Glu
1520 1525 1530
His Gly Leu Leu Leu Glu Lys Val Gly Pro Glu Leu Leu Pro Pro
1535 1540 1545
Pro Lys His Thr Phe Glu Val Arg Ala Glu Thr Asp Leu Lys Thr
1550 1555 1560
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1565 1570 1575
Arg Arg Gly Pro Thr Leu Ile Ala Val Gln Ser Ser Trp Glu Leu
1580 1585 1590
Lys Arg Leu Ala Ser Glu Ile Pro Val Leu Glu Glu Phe Pro Leu
1595 1600 1605
Val Pro Ile Cys Val Ala Asp Lys Ile Asn Tyr Gly Val Leu Asp
1610 1615 1620
Trp Gln Arg His Gly Ala Arg Arg Met Ile Arg His Tyr Leu Asn
1625 1630 1635
Leu Asp Thr Cys Leu Ser Gln Ala Phe Glu Met Ser Arg Tyr Phe
1640 1645 1650
His Ile Pro Ile Gly Asn Leu Pro Glu Asp Ile Ser Thr Phe Gly
1655 1660 1665
Ser Asp Leu Phe Phe Ala Arg His Leu Gln Arg His Asn His Leu
1670 1675 1680
Leu Trp Leu Ser Pro Thr Ala Arg Pro Asp Leu Gly Gly Lys Glu
1685 1690 1695
Ala Asp Asp Asn Cys Leu Val Met Glu Phe Asp Asp Gln Ala Thr
1700 1705 1710
Val Glu Ile Asn Ser Ser Gly Cys Tyr Ser Thr Val Cys Val Glu
1715 1720 1725
Leu Asp Leu Gln Asn Leu Ala Val Asn Thr Ile Leu Gln Ser His
1730 1735 1740
His Val Asn Asp Met Glu Gly Ala Asp Ser Met Gly Ile Ser Phe
1745 1750 1755
Asp Val Ile Gln Gln Ala Ser Leu Glu Asp Met Ile Thr Gly Gly
1760 1765 1770
Gln Ala Ala Ser Ala Pro Ala Ser Tyr Asp Glu Thr Ala Leu Cys
1775 1780 1785
Ser Asn Thr Phe Arg Ile Leu Lys Ser Met Val Val Gly Trp Val
1790 1795 1800
Lys Glu Ile Thr Gln Tyr His Asn Ile Tyr Ala Asp Asn Gln Val
1805 1810 1815
Met His Phe Tyr Arg Trp Leu Arg Ser Pro Ser Ser Leu Leu His
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Asp Pro Ala Leu His Arg Thr Leu His Asn Met Met Lys Lys Leu
1835 1840 1845
Phe Leu Gln Leu Ile Ala Glu Phe Lys Arg Leu Gly Ser Ser Val
1850 1855 1860
Ile Tyr Ala Asn Phe Asn Arg Ile Ile Leu Cys Thr Lys Lys Arg
1865 1870 1875
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1880 1885 1890
Ile His Ser Lys Glu Thr Phe His Ser Leu Thr Ile Ser Phe Ser
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1910 1915 1920
Gly Ile Lys Gly Lys Val Ser Ser Arg Ile His Cys Gly Leu Gln
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Asp Ser Gln Lys Ala Gly Gly Ala Glu Asp Glu Gln Glu Asn Glu
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Asp Asp Glu Glu Glu Arg Asp Gly Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu
1955 1960 1965
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Gln Phe Leu Pro Gln Ala Ala Ser Cys Gln Asn Tyr Phe Leu Met
1985 1990 1995
Ile Val Ser Ala Tyr Ile Val Ala Val Tyr His Cys Met Lys Asp
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Gly Leu Arg Arg Ser Ala Pro Gly Ser Thr Pro Val Arg Arg Arg
2015 2020 2025
Gly Ala Ser Gln Leu Ser Gln Glu Ala Glu Gly Ala Val Gly Ala
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2180 2185 2190
Tyr Asp Ser Ser Ala Ile Glu Met Thr Leu Val Glu Val Leu Gln
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2225 2230 2235
Ala Gly Asp Phe Ala Leu Thr Ile His Thr Gln Val Phe Met Glu
2240 2245 2250
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2255 2260 2265
Tyr Leu Leu Glu Thr Leu Glu Trp Leu Leu Gln Lys Asn Pro Gln
2270 2275 2280
Leu Gly His
2285
Claims (12)
- 하나 이상의 아미노산 잔기의 변이를 포함하는 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε으로서,
상기 아미노산 잔기의 변이가, 서열 번호 1로 표시되는 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 류신 잔기가 다른 아미노산 잔기가 되는 변이를 포함하고, 상기 다른 아미노산 잔기는 세린 잔기, 메티오닌 잔기, 발린 잔기, 트립토판 잔기 또는 페닐알라닌 잔기인, 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε. - 제1항에 있어서, 상기 다른 아미노산 잔기가 세린 잔기인, 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε.
- 제1항 또는 제2항에 기재된 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε을 코딩하는 핵산.
- 제1항 또는 제2항에 기재된 변이형 인간 DNA 폴리메라아제 ε을 코딩하는 핵산에 상보적인 핵산.
- 상기 다른 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 20 내지 300 염기 길이의 핵산인, 제3항에 기재된 핵산의 단편.
- 상기 다른 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열의 상보 서열을 포함하는 20 내지 300 염기 길이의 핵산인, 제4항에 기재된 핵산의 단편.
- 암을 앓고 있는 인간 환자에 있어서, 암이 고빈도 변이형의 암인지 판별하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
상기 인간 환자로부터 채취된 암 세포 유래의 성분을 포함하는 샘플을 사용하여, 상기 암 세포에서 유래하는 서열 번호 1로 표시되는 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 아미노산 잔기의 세린 잔기, 메티오닌 잔기, 발린 잔기, 트립토판 잔기 또는 페닐알라닌 잔기로의 변이의 유무를 결정하는 공정을 갖고,
상기 아미노산 잔기가 변이되어 있는 것이, 상기 암이 고빈도 변이형의 암이라고 판별하기 위한 정보를 제공하는 방법. - 제7항에 있어서, 상기 아미노산 잔기의 변이의 유무의 결정이, 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 아미노산 잔기를 코딩하는 염기 서열의 변이의 검출을 포함하는, 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 아미노산 잔기의 변이가 L952S인, 방법.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 암이 대장암 또는 직장암인, 방법.
- 고빈도 변이형의 암으로의 이환을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
인간 검체로부터 채취된 세포 유래의 성분을 포함하는 샘플을 사용하여, 세포에서 유래하는 서열 번호 1로 표시되는 인간 DNA 폴리메라아제 ε의 아미노산 서열의 제952번째의 아미노산 잔기의 세린 잔기, 메티오닌 잔기, 발린 잔기, 트립토판 잔기 또는 페닐알라닌 잔기로의 변이를 검출하는 공정을 갖고, 상기 아미노산 잔기가 변이되어 있는 경우, 인간 검체가 고빈도 변이형의 암에 이환되어 있다고 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법. - 삭제
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