KR101990953B1 - 암 유발 유전자 이상을 분석하는 방법 - Google Patents

암 유발 유전자 이상을 분석하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암 유발 유전자의 이상을 검출하는 방법, 암 유발 유전자의 이상을 분석하기 위한 조성물 및 키트에 관한 것으로, 구체적으로는 생물학적 시료로부터 분리된 DNA에서 암 돌연변이, 메틸화 이상 타겟 영역을 다중 동시 전-증폭(multiplexed simultaneous pre-amplification)하고, 변이체마다 개별 융해곡선을 분석함으로써 혈액을 이용한 최소-침습의 암 유발 유전자의 이상을 분석하는 방법, 다중 동시 전-증폭을 통해 융해곡선을 분석하여 암 유발 유전자의 이상을 분석하기 위한 조성물 및 키트에 관한 것이다.

Description

암 유발 유전자 이상을 분석하는 방법 {Method for Analyzing Aberrations of Cancer-Risk Genes}
본 발명은 암 유발 유전자의 이상을 검출하는 방법, 암 유발 유전자의 이상을 분석하기 위한 조성물 및 키트에 관한 것으로, 구체적으로는 생물학적 시료로부터 분리된 DNA에서 암 돌연변이, 메틸화 이상 타겟 영역을 다중 동시 전-증폭(multiplexed simultaneous pre-amplification)하고, 변이체마다 개별 융해곡선을 분석함으로써 혈액을 이용한 최소-침습의 암 유발 유전자의 이상을 분석하는 방법, 다중 동시 전-증폭을 통해 융해곡선을 분석하여 암 유발 유전자의 이상을 분석하기 위한 조성물 및 키트에 관한 것이다.
현재까지 암 확진은 세포, 조직을 채취하는 조직생검을 골드 스탠다드로 인정하고 있다. 그러나 내시경이나 미세침을 이용하는 침습적 방법은 환자와 의사 모두에게 위험부담이 있으며, 종양 발생 위치나 크기, 환자의 상태에 따라 시행할 수 없는 경우도 존재한다. 또한 동일한 종양조직 내 암세포 간의 유전자 발현, 변이의 차이에 의한 이질성(intra-tumor heterogeneity)으로 어느 부위를 생검했는지에 따라 분석결과가 달라질 수 있다.
가장 큰 단점은 0.5 ~ 1.0 cm 크기로 암 종괴가 성장된 이후에야 확진이 가능한 경우가 다수이며, 이 단계는 영상의학으로 감별이 어려운 미세전이의 위험성이 상존하는 단계이다. 이러한 침습적 암 진단법의 한계를 극복할 수 있는 액상생검(또는 체액생검) 기술이 발전하면서 혈액 내 순환 종양세포, 비-세포 DNA, 엑소좀 등에 포함된 종양 유래 바이오마커의 분자수준 분석을 통해 암 발생, 치료효과 모니터링, 예후평가, 치료약물 선택 등 암 진단 및 치료에 기여하고 있다.
그러나, 액상생검의 기술적 난제는 분석지표들의 혈액 내 숫자, 농도가 매우 낮아서 분석민감도와 재현성이 주요한 이슈가 되고 있다. 순환 종양세포는 암 환자의 혈액 7.5 mL에 평균 5개를 기준으로 생존율 예후를 평가하듯이 그 숫자가 혈액 내 미량으로 존재한다(Molecular oncology 10(2016) 395-407).
비-세포 DNA는 종양세포의 괴사, 세포사멸에 의해 원발 병소에서 유리되거나 종양이 능동적으로 분비하는 DNA로 정상세포 사멸에서 유래하는 DNA와 종양 DNA를 고-민감도로 감별해야 하는 분석 이슈와 길이(180 염기쌍 이하의 단편)와 반감기(냉장온도에서 평균 10시간)가 짧다는 제약이 있다(Cell 164(2016) 57-68).
액상생검의 분석민감도와 재현성을 개선한 디지털 PCR(Proc. Natl. Acad. Sci. 96(1999) 9236-9241), BEAMing 분석법(Nat. Methods 3(2006) 95-97), Unique identifier(UID)를 이용한 딥 시퀀싱(PLoS ONE 11(2016) e0146638) 등 다수의 분석방법이 개발되고 있으나, 혈장에 극미량(<1%) 포함되어 있는 종양 유래 DNA의 돌연변이와 메틸화 변이를 신속하며, 고-민감도로 분석할 수 있는 기술이 요구된다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 생물학적 시료로부터 분리된 DNA에서 암 돌연변이, 메틸화 이상 타겟 영역을 다중 동시 전-증폭하고, 변이체마다 개별 융해곡선을 분석함으로써 DNA의 돌연변이와 메틸화 변이를 동시에 높은 민감도로 분석할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 DNA의 돌연변이와 메틸화 변이를 동시에 검출하는 암 유발 유전자의 이상을 분석하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 DNA의 돌연변이와 메틸화 변이를 동시에 검출하는 암 유발 유전자의 이상을 분석하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 DNA의 돌연변이와 메틸화 변이를 동시에 검출하는 암 유발 유전자의 이상을 분석하기 위한 키트를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 생물학적 시료로부터 분리된 DNA와 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 다중 동시 전-증폭(multiplexed simultaneous pre-amplification)시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계와 동시 또는 순차적으로 생물학적 시료로부터 분리된 DNA와 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 다중 동시 전-증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (a) 단계 및 (b) 단계의 증폭 산물에 대한 융해곡선을 분석하는 단계를 포함하는 암 유발 유전자의 이상을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 생물학적 시료로부터 분리된 DNA와 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 다중 동시 전-증폭(multiplexed simultaneous pre-amplification)시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계와 동시 또는 순차적으로 생물학적 시료로부터 분리된 DNA와 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 다중 동시 전-증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (a) 단계 및 (b) 단계의 증폭 산물에 대한 융해곡선을 분석하는 단계를 포함하는 고형암 또는 산발성 고형암의 검출 또는 진단방법, 또는 고형암의 검출 또는 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, i) 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드; ii) 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브; 및 iii) 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 다중 동시 전-증폭을 통해 융해곡선을 분석하여 암 유발 유전자 이상을 분석하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, i) 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드; ii) 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브; 및 iii) 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 다중 동시 전-증폭을 통해 융해곡선을 분석하여 고형암 또는 산발성 고형암을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, i) 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드; ii) 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브; 및 iii) 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 다중 동시 전-증폭을 통해 융해곡선을 분석하여 암 유발 유전자 이상을 분석하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 더욱이, i) 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드; ii) 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브; 및 iii) 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 다중 동시 전-증폭을 통해 융해곡선을 분석하여 고형암 또는 산발성 고형암을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 암 유발 유전자 이상 또는 이에 의해 유발되는 고형암 또는 산발성 고형암의 발생위험도를 영상의학검사에서 검출가능한 크기(<1.0 cm)이하 초기단계에서도 판별할 수 있고, 암 치료과정 중, 혈액으로부터 암 돌연변이, 메틸화 변이 검출여부를 제시함으로 최소-침습의 치료효과 모니터링, 예후평가 지표로 활용될 수 있으며, 특히 메틸화 변이는 식이, 생활습관, 환경인자에 따라 가역적으로 변화하는 후성유전학 지표로서 전암병변(대장,위 용종 등)이 검출된 암 고위험군의 혈액을 통한 최소-침습의 반복검사가 용이한 예방의학 표지자로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라, 혈액 내 순환 종양세포 또는 병변 유래 비-세포 DNA를 포집 및 순수분리하고, 이로부터 주요 암 돌연변이, 메틸화 변이 분석 대상 유전자 영역을 다중 동시 전-증폭(multiplexed simultaneous pre-amplification)을 통해 수득하고 이후 변이체 마다 개별 융해곡선 분석을 수행함으로써 신속하며 고-민감도로 혈액을 이용한 암 유발 유전자 이상 검출하는 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 대장암, 대장용종, 비종양군의 혈액으로부터 순수분리한 순환 종양세포 또는 병변 유래 비-세포 DNA를 이용하여 다중 동시 전-증폭을 통해 13종 암 돌연변이체를 확보한 뒤, 고-민감도 융해곡선 분석을 통해 BRAF c.1799 T>A 체세포 돌연변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다. 파란색 융해곡선은 BRAF 야생 유전형 증폭을 억제하는 PNA 프로브가 첨가되지 않는 결과이며, PNA 프로브를 0.2 - 1.0 uM 농도범위로 첨가하였을 때 BRAF 돌연변이 검출민감도가 향상되는 추세를 초록색 융해곡선을 통해 확인할 수 있다.
도 3은 대장암, 대장용종, 비종양군의 혈액으로부터 순환 종양세포 또는 병변 유래 비-세포 DNA를 순수분리하고 다중 동시 전-증폭을 통해 13종 암 돌연변이체를 확보한 뒤, 고-민감도 융해곡선 분석을 통해 PIK3CA c.1633 G>A 체세포 돌연변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다. 파란색 융해곡선은 PIK3CA 야생 유전형 증폭을 억제하는 PNA 프로브가 첨가되지 않는 결과이며, PNA 프로브를 0.2 - 1.0 uM 농도범위로 첨가하였을 때 PIK3CA 돌연변이 검출민감도가 향상되는 추세를 노란색 또는 초록색 융해곡선을 통해 확인할 수 있다.
도 4는 대장암, 대장용종, 비종양군의 혈액 내 순환 종양세포 또는 병변 유래 비-세포 DNA를 추출하고, 바이설파이트 변환을 수행한 뒤, 다중 동시 전-증폭을 통해 MGMT를 포함하는 8종 메틸화 변이체를 준비하고 고-해상도 메틸화 융해곡선 분석을 통해 MGMT 메틸화 수준(%) 정량분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 메틸화 융해곡선의 피크 용적을 계산하여 해당 유전자의 메틸화 수준(%)을 높은 유의성(R2=0.9732)으로 판별할 수 있음을 확인할 수 있다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 다중 동시 전-증폭에 이은 고-민감도 융해곡선 분석을 통한 암 돌연변이 분석능을 나타낸 것이다. BRAF, PIK3CA 돌연변이 분석에 있어 분석 가능한 돌연변이 대립유전자 빈도는 공히 0.01%이었다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, (a) 생물학적 시료로부터 분리된 DNA와 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 다중 동시 전-증폭(multiplexed simultaneous pre-amplification)시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계와 동시 또는 순차적으로 생물학적 시료로부터 분리된 DNA와 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 다중 동시 전-증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (a) 단계 및 (b) 단계의 증폭 산물에 대한 융해곡선을 분석하는 단계를 포함하는 암 유발 유전자의 이상을 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 궁극적으로 암 또는 암의 예후 진단을 위해 사용할 수 있고, 이에 상기 생물학적 시료는 예를 들어 암 환자 또는 암으로 의심되는 환자에서 수득한 액상 생검일 수 있다. 상기 DNA는 혈액 또는 혈장 내 순환 종양세포 또는 병변 유래 비-세포 DNA일 수 있으며, 비-세포 DNA의 검출 및 분리를 위해 액상 생검 예를 들어, 암 환자 또는 암으로 의심되는 환자에서 혈액, 혈청 또는 혈장을 수득할 수 있다.
암 환자의 암 조직내 비정상적인 세포들로부터 세포사멸 (apoptosis) 및/또는 세포괴사 (necrosis) 등의 과정에 의해 조각난 DNA들이 혈류 내로 흘러나와 혈청 (serum)이나 혈장 (plasma)내에 종양세포 유리 비-세포 DNA 상태로 존재하고, 혈류 내 비-세포 DNA 농도가 정상인에 비해 증가된 상태로 존재하는 경우가 빈번하다고 알려져 있다.
상기 비-세포 DNA의 분리는 공지의 방법을 통해 시판 중인 키트를 이용하여 제조사의 지시에 따라 분리될 수 있으며, 예를 들어 Qiagen의 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit를 사용하여 액상 생검으로부터 비-세포 DNA를 분리할 수 있다. 혈액, 혈청 또는 혈장 등에서 비-세포 DNA를 분리하는 것은 키트를 사용하는 경우 쉽게 수행될 수 있고, 페놀-클로로폼 추출이 필요하지 않으며, 핵산이 QIAamp Mini column에 특이적으로 결합되는 반면, 불순물은 통과한다. 2가 양이온 및 단백질과 같은 PCR 저해제를 3회의 세척 단계에서 완전히 제거할 수 있으며, 순수 핵산이 키트 중 제공되는 버퍼에 용출될 수 있다.
또한, 예를 들어 Clontech의 NucleoSpin Kit를 사용할 수 있다. 키트 "NucleoSpin Plasma XS"는 인간 EDTA 혈액 혈장에서 50bp 보다 큰 단편화 DNA를 분리할 있다. 이를 통해 단지 5-20μL 정도만 용출되도록 할 수 있으므로, 이를 통해 매우 농축된 DNA를 수득할 수 있다.
혈액 내 순환 종양세포 또는 병변 유래 비-세포 DNA의 길이 분포는 다양하다. 염색질 구조의 기본 단위인 뉴클레오좀은 히스톤 옥타머로 구성되는데, 약 147 염기쌍이 히스톤 옥타머를 감싸고, 여기에 링커 DNA 길이를 합한 162 - 167 염기쌍 내외 길이가 다수를 차지한다. 종양이 있는 경우 100 염기쌍 이하의 길이가 증가되어 있는 경우가 많다. 이에, 본 발명은 혈액 내 순환 종양세포 또는 병변 유래 비-세포 DNA 특이적인 암 돌연변이, 메틸화 변이를 고-민감도로 검출, 분석이 용이하도록 유전자 증폭 앰플리콘의 크기를 167 염기쌍 이하로, 보다 바람직하게 100 염기쌍 이하로 고안하였다. 또한, 전-증폭 단계에서 다중 동시 증폭 전략을 통해 미량의 DNA 농도만으로도 다수의 돌연변이 및 메틸화 변이 분석이 용이하도록 고안하였다.
종래 암 세포주 DNA를 바이설파이트 변환한 뒤, 돌연변이와 메틸화 분석 대상 유전자를 증폭해서 시퀀싱 분석함으로써, 암 유발 유전자 이상을 분석하는 방법을 사용하였으나, 메틸화 분석을 위해 수행하는 바이설파이트 변환된 DNA로 돌연변이 분석까지 진행하므로, 분석 위양성, 위음성 오류가 발생할 가능성이 비교적 높은 단점이 존재하였다.
또한, 돌연변이와 메틸화 분석 대상 유전자 영역을 개별로 증폭하되, 증폭단계에서 돌연변이, 메틸화 유무를 별도로 구분하지 않고, 메틸화 분석 시료의 경우, 바이설파이트 변환을 추가로 수행하고, 단일 가닥으로 변성시킨 다음 거대자기저항(giant magnetoresistive) 바이오센서에 결합시켜 야생형, 변이형 간의 융해온도 차이에 따른 자기저항 비율 차이로 돌연변이와 메틸화 유무를 판별함으로써 암 유발 유전자 이상을 분석하는 방법도 고려되었으나, 야생 유전형의 증폭을 억제하지 않기에 PCR 증폭 바이어스 (비편향증폭: bias)에 따른 돌연변이 검출 민감도가 높지 않으며, 시료의 메틸화 유무는 알 수 있으나 임상적으로 유의한 메틸화 수준(%) 분석은 추가로 파이로시퀀싱을 수행해야 하는 한계가 있었다.
이에, 본 발명은 암 특이적 돌연변이 및 메틸화 변이를 고-민감도로 검출할 수 있는 암 유발 유전자의 이상을 분석하는 방법에 관한 것이다. 이러한 본 발명에 따른 방법은 도 1에 도시되어 있다. 도 1에 따르면, 암 돌연변이, 메틸화 변이 분석 대상 앰플리콘들을 다중 동시 전-증폭을 통해 수득하고 증폭용 올리고, 주형 DNA, 반응액 성분들을 제거한 다음, 야생 유전형의 증폭을 억제하기 위해 PNA 또는 LNA 프로브를 사용하는 고-민감도 돌연변이 융해곡선 분석과 고-해상도 융해곡선을 통해 메틸화 변이를 정량분석하는 단계; 및 분석결과들을 통해 돌연변이 유무, 메틸화 수준 정량치(%)를 결정하는 혈액 내 암 돌연변이, 메틸화 변이 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따라, 인간표준게놈(GRCh37/hg19) 염기서열을 기준으로 각 유전자의 시작부터 종료시점까지의 전체 영역 중 특정한 하나 이상의 돌연변이 및 메틸화 이상을 분석할 수 있다.
하나의 실시예에서, 상기 암 특이적 돌연변이는 예를 들어, GNAS(NCBI Gene ID: 2778, 서열번호 89), SMAD4(NCBI Gene ID: 4089, 서열번호 90), KIT(NCBI Gene ID: 3815, 서열번호 91), BRAF(NCBI Gene ID: 673, 서열번호 92), NRAS(NCBI Gene ID: 4893, 서열번호 93), PIK3CA(NCBI Gene ID: 5290, 서열번호 94 또는 95), PTEN(NCBI Gene ID: 5728, 서열번호 96 또는 97), KRAS(NCBI Gene ID: 3845, 서열번호 98), P53(NCBI Gene ID: 7157, 서열번호 99, 100, 101, 102, 103 또는 104) 및 EGFR (NCBI Gene ID: 1956, 서열번호 105 또는 106)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자의 돌연변이일 수 있다.
이에 따라, 상기 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 서열번호 36으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 단계 (a)에서 암 특이적 돌연변이 증폭의 민감도를 높이기 위해 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA (Peptide nucleic acid) 또는 LNA (Locked nucleic acid) 프로브를 추가로 혼합하여 암 유발 유전자 이상을 분석할 수 있다.
PNA는 화학적인 방법으로 합성되고 자연계에서는 발견되지 않는다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 겹가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 겹가닥은 DNA/DNA 겹가닥보다, PNA/RNA 겹가닥은 DNA/RNA 겹가닥보다 안정하다. PNA의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고, 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산 염기(nucleobase)는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(Nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 또한 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA 겹가닥의 안정성은 염 농도에 영향을 받지 않는다. 이러한 성질 때문에 PNA는 상보적인 핵산 염기 서열을 천연 핵산보다 더 잘 인식할 수 있어서 진단 또는 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용될 수 있다.
LNA는 변형된 RNA 뉴클레오타이드로, 리보즈 모이티(ribose moiety)의 2'산소 원자와 4'탄소 원자가 결합된 형태로 변형되어 있다. LNA는 DNA 또는 RNA와 혼합된 형태로 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 구성할 수 있으며, 봉쇄형 핵산의 봉쇄형 리보즈 형태(locked ribose conformation)는 염기 간 스태킹(stacking) 및 백본의 프리-조직화(pre-organization)를 증진시킴으로써 올리고뉴클레오타이드의 혼성화(hybridization) 성능을 증가시킨다. LNA를 함유하는 뉴클레오타이드는 짧은 길이의 RNA 또는 DNA 표적 검출에 용이하며, 핵산분해효소에 대해 높은 저항성을 가지므로 생체 내외(in vivo/in vitro) 용도로 용이하다.
상기 유전자의 야생형의 PNA 또는 LNA 프로브는 예를 들어, 서열번호 53 내지 서열번호 88로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
포유류 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G, T 외에 5번째 염기가 존재하며, 이는 시토신 환의 5번째 탄소에 메틸기가 붙은 5-메틸시토신(5-mC)이다. 5-mC는 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. CpG의 C는 대부분이 메틸기가 붙어서 메틸화되어 있다. 이러한 CpG의 메틸화는 알루(alu)나 전이인자(transposon)와 같이 게놈내에 반복되는 염기서열(repetitive sequence)이 발현되지 못하도록 억제하며, 포유류 세포에서 유전자외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위이다.
혈류 내 비-세포 DNA에도 메틸화된 DNA가 함께 존재할 수 있음이 알려져 있으며, 이러한 비정상적DNA메틸화 존재는 암 진단의 표적으로 활용될 수 있다.
하나의 실시예에서, 본 발명에서 메틸화 변이는 CDKN2A(NCBI Gene ID: 1029, 서열번호 107), MGMT(NCBI Gene ID: 4255, 서열번호 108), ESR2(NCBI Gene ID: 2100, 서열번호 109), GSTP1(NCBI Gene ID: 2950, 서열번호 110), DAPK(NCBI Gene ID: 1612, 서열번호 111), CDH13(NCBI Gene ID: 1012, 서열번호 112), RUNX3(NCBI Gene ID: 864, 서열번호 113), SFRP1(NCBI Gene ID: 6422, 서열번호 114)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에서 메틸화 수준(%)이 과메틸화 또는 저메틸화된 것일 수 있으며, 메틸화 수준(%)을 고-처리량 융해곡선을 통해 정량분석할 수 있다.
상기 메틸화 변이는 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA를 다르게 변형시키는 시약 예를 들어, 바이설파이트, 하이드로젠 설파이트 또는 다이설파이트를 생물학적 시료로부터 분리된 DNA에 처리하는 과정을 포함하여 검출될 수 있다. 상기 시약은 적어도 하나의 사이토신 염기를 우라실 또는 혼성화 과정에서 사이토신과 상이한 것으로 검출되는 다른 염기로 변환되도록 할 수 있다.
상기 시약의 처리에 따라 서열번호 116의 CDKN2A, 서열번호 117의 MGMT, 서열번호 115의 ESR2, 서열번호 118의 GSTP1, 서열번호 119의 DAPK, 서열번호 120의 CDH13, 또는 서열번호 121의 RUNX3, 서열번호 122의 SFRP1의 유전자는 서열번호 124의 CDKN2A, 서열번호 125의 MGMT, 서열번호 123의 ESR2, 서열번호 126의 GSTP1, 서열번호 127의 DAPK, 서열번호 128의 CDH13, 또는 서열번호 129의 RUNX3, 서열번호 130의 SFRP1의 사이토신과 상이한 것으로 검출되는 다른 염기로 변환될 수 있다.
상기 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 37 내지 서열번호 52로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에서 "다중 동시 전-증폭"에서 "다중 동시"는 다수의 서로 상이한 다양한 주형 유전자를 하나의 반응기 또는 챔버 내에서 한꺼번에 증폭시킬 수 있음을 의미하며, 1회의 실험으로 다양한 분석대상 핵산에 대한 증폭이 가능하고, 정략분석이 용이하게 된다. "전-증폭"은 한번의 러닝으로 수천개의 반응을 수행할 수 있는 고-처리 증폭 (high-throughput amplification)을 위해 고농축 샘플을 얻을 수 있는 증폭 방법으로, 증폭 반응에서 충분하지 못한 카피 수의 타겟 핵산을 확보하기 위한 방법일 수 있다. 혈액 내 비-세포 DNA 농도는 평균 10ng/mL 이하로 매우 낮은 수준으로 존재한다(일반인 기준). 더욱이, 이 낮은 농도에서도 암 유발 유전자 이상은 더욱 희소하게 존재한다. 통상적으로는 비-세포 DNA를 수득한 후, 분석 유전자 n수대로 나누어 분석하기에 위음성 결과 가능성이 상존하나, 전-증폭 1회 반응으로 2차 개별 분석할 앰플리콘들을 미리 다중 증폭함으로써 매우 낮은 비-세포DNA 농도를 갖는 시료에서도 고-민감도 분석이 가능하다. 다중 동시 전-증폭을 효과적으로 구현하기 위해서는 상호 간섭을 배제한 최적의 올리고 조합을 선별해야하고 PCR 반응조성과 증폭조건도 수많은 반복실험을 통해 실험적으로 검증해야 한다.
상기 증폭은 예를 들어, PCR, 실시간 PCR(real-time PCR) 또는 실시간 역전사-PCR(real-time reverse transcription-PCR; 실시간 RT-PCR), 메틸화 특이 PCR (methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR (real time methylation specific PCR) 등에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
암 돌연변이, 메틸화 변이 분석 대상 앰플리콘들을 다중 동시 전-증폭을 통해 수득한 이후, 증폭용 올리고뉴클레오티드, 주형 DNA, 반응액 성분들을 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
이후, 증폭 산물에 대한 융해곡선 분석을 통해 암 유발 유전자 이상을 확인할 수 있다. 예를 들어, 융해온도 곡선값은 분당 4 내지 5℃의 간격으로 증폭 산물을 60 ℃ 내지 95 ℃가 되도록 가열하여 형광 신호에 의한 융해 온도 곡선 수치를 분석함으로써, 중폭된 암 유발 유전자 이상을 확인할 수 있다.
본 발명에 따르면, 야생 유전형의 증폭을 억제하기 위해 PNA 또는 LNA 프로브를 사용하는 고-민감도 돌연변이 융해곡선 분석과 고-해상도 융해곡선을 통해 메틸화 변이를 정량분석 함으로써, 분석 결과들을 통해 결실, 치환 또는 삽입와 같은 돌연변이 유무, 메틸화 수준 정량치(%)를 결정할 수 있으며, 대조군 또는 표준곡선과의 비교를 통해 용종군, 종양군을 감별할 수 있다.
암 특이적 돌연변이를 증폭한 앰플리콘에 대한 고-민감도 융해곡선은 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브를 표적 앰플리콘과 혼성화하고 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 수득될 수 있다. 상기 PNA 또는 LNA 프로브와 앰플리콘이 결합하는 염기서열 부위의 염기변이 위치와 변이염기 수에 따라 융해곡선이 변화할 수 있으며, 프로브가 표적 앰플리콘의 염기서열과 완전히 혼성화(perfect match)를 이루어 예상된 융해온도(Tm) 값을 보이며, 염기서열 차이가 있는 표적 앰플리콘과는 불완전 혼성화(mismatch)를 이루어 예상보다 낮은 융해온도(Tm) 값을 보일 수 있다.
상기 표적 앰플리콘은 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프로브와 어닐링 또는 혼성화될 수 있고, '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미하고, 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
혼성화에 따라 형광 신호가 발생할 수 있으며, 온도 상승에 따라 프로브의 적정 융해 온도에서 빠르게 융해되어 형광 신호가 나타나며, 온도 변화에 따른 형광 신호로부터 수득된 융해곡선을 분석하여 돌연변이를 검출할 수 있다.
상기 메틸화 변이를 증폭한 앰플리콘에 대한 고-해상도 융해곡선은 예를 들어 서열번호 37 내지 서열번호 52로 구성된 군에서 선택된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드로 증폭된 앰플리콘을 95℃ 가열하여 이중나선을 단일가닥으로 해리시키고, 이후 다시 재혼성화시킨 뒤, 95℃까지 1초당 0.02℃씩 온도를 증가시키면서 혼성화 산물들의 Tm(℃)에 따라 수득될 수 있다. 이 때, 메틸화율을 달리한 표준 융해 곡선을 이용하여, 메틸화도를 정량할 수 있다. 예를 들어, 바이설파이트 처리를 통해 모든 비메틸화된 C(사이토신들)(0% 표준)은 T(티민)으로 전환되고, 모든 메틸화된 시토신들 (100% 표준)은 전환되지 않은 채로 잔류하는데, 표준 융해 곡선의 시료들을 100%, 75%, 50%, 25%, 10%, 5% 및 0%로 메틸화할 수 있다. 이 때, 이러한 표준 융해 곡선을 기준으로 고메틸화 또는 저메틸화 정도(%)를 정량할 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 앞서 언급한 GNAS(NCBI Gene ID: 2778), SMAD4(NCBI Gene ID: 4089), KIT(NCBI Gene ID: 3815), BRAF(NCBI Gene ID: 673), NRAS(NCBI Gene ID: 4893), PIK3CA(NCBI Gene ID: 5290), PTEN(NCBI Gene ID: 5728), KRAS(NCBI Gene ID: 3845), P53(NCBI Gene ID: 7157) 또는 EGFR (NCBI Gene ID: 1956)의 돌연변이, 또는 CDKN2A(NCBI Gene ID: 1029), MGMT(NCBI Gene ID: 4255), ESR2(NCBI Gene ID: 2100), GSTP1(NCBI Gene ID: 2950), DAPK(NCBI Gene ID: 1612), CDH13(NCBI Gene ID: 1012), RUNX3(NCBI Gene ID: 864), SFRP1(NCBI Gene ID: 6422)의 메틸화 이상에 의해 유발되는 것일 수 있으며, 예를 들어 고형암 또는 산발성 고형암일 수 있다.
상기 고형암 또는 산발성 고형암은 대장암, 위암, 췌장암, 폐암, 담낭암, 유방암, 간암, 혈액암, 갑상선암, 방광암, 림프종, 난소암, 자궁내막암, 뇌종양, 식도암, 신경교종으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 GNAS(NCBI Gene ID: 2778, 서열번호 89), SMAD4(NCBI Gene ID: 4089, 서열번호 90), KIT(NCBI Gene ID: 3815, 서열번호 91), BRAF(NCBI Gene ID: 673, 서열번호 92), NRAS(NCBI Gene ID: 4893, 서열번호 93), PIK3CA(NCBI Gene ID: 5290, 서열번호 94 또는 95), PTEN(NCBI Gene ID: 5728, 서열번호 96 또는 97), KRAS(NCBI Gene ID: 3845, 서열번호 98), P53(NCBI Gene ID: 7157, 서열번호 99, 100, 101, 102, 103 또는 104) 및 EGFR (NCBI Gene ID: 1956, 서열번호 105 또는 106)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에서 돌연변이가 검출되는 경우 고형암 또는 산발성 고형암의 발생 위험도가 높거나 발생한 것으로 판정될 수 있거나, 암 치료과정 중 혈액으로부터 치료 효과 모니터링, 환자의 예후평가의 지표로 사용할 수 있다.
또한, CDKN2A(NCBI Gene ID: 1029, 서열번호 107), MGMT(NCBI Gene ID: 4255, 서열번호 108), ESR2(NCBI Gene ID: 2100, 서열번호 109), GSTP1(NCBI Gene ID: 2950, 서열번호 110), DAPK(NCBI Gene ID: 1612, 서열번호 111), CDH13(NCBI Gene ID: 1012, 서열번호 112), RUNX3(NCBI Gene ID: 864, 서열번호 113), SFRP1(NCBI Gene ID: 6422, 서열번호 114)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에서 메틸화 수준(%)이 정상 대조군과 비교하여 과메틸화 및/또는 저메틸화되어 있을 경우, 고형암 또는 산발성 고형암의 발생 위험도가 높거나 발생한 것으로 판정될 수 있거나, 암 치료과정 중 혈액으로부터 치료 효과 모니터링, 환자의 예후평가의 지표로 사용할 수 있다.
이를 바탕으로, 본 발명은 (a) 생물학적 시료로부터 분리된 DNA와 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 다중 동시 전-증폭(multiplexed simultaneous pre-amplification)시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계와 동시 또는 순차적으로 생물학적 시료로부터 분리된 DNA와 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 다중 동시 전-증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 (a) 단계 및 (b) 단계의 증폭 산물에 대한 융해곡선을 분석하는 단계를 포함하는 고형암 또는 산발성 고형암의 검출 또는 진단방법, 또는 검출 또는 진단에 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
상기 검출방법을 통해 수득된 결과는 암 발생 위험도를 판단하거나, 치료효과 모니터링, 환자의 예후평가를 위한 지표로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, i) 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드; ii) 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브; 및 iii) 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 다중 동시 전-증폭을 통해 융해곡선을 분석하여 암 유발 유전자 이상을 분석하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, i) 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드; ii) 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브; 및 iii) 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 다중 동시 전-증폭을 통해 융해곡선을 분석하여 고형암 또는 산발성 고형암을 검출 또는 진단하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이, i) 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드; ii) 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브; 및 iii) 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 다중 동시 전-증폭을 통해 융해곡선을 분석하여 암 유발 유전자 이상을 분석하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이, i) 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드; ii) 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브; 및 iii) 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 다중 동시 전-증폭을 통해 융해곡선을 분석하여 고형암 또는 산발성 고형암을 검출 또는 진단하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물 및 키트 각각과 관련된 구성에 대한 설명은 방법을 수행함에 있어서 설명된 구성에서와 동일하게 적용될 수 있다.
상기 키트에서 다양한 버퍼 및 시약을 포함할 수 있으며, 특정 반응을 위해 사용되는 시약, 버퍼 또는 반응물의 최적량은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 키트에 포함되는 각 구성은 별도의 포장 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 대장암, 대장용종, 비종양(정상)군의 혈액으로부터 비-세포 DNA, 조직검체로부터 게놈성 DNA 순수 분리
소화기내과 및 병리과 전문의가 대장암군, 대장용종군 및 비종양(정상)군 각 24명, 총72명을 대장내시경 검사와 세포·조직 병리검사를 토대로 분류하였다. 대장암군은 대장내시경 검사에서 선종으로 의심되는 병변이 관찰되고 조직검사에서 선종으로 진단받은 자로 다른 장기에서 암으로 진단받거나 치료중인 환자는 제외하였다. 대장용종군은 대장내시경에서 크기 1 cm이상의 용종이 관찰된 자로 조직검사에서 용종에 이형성이나 종양이 있는 것으로 확인된 자는 제외하였다. 비종양군은 대장내시경 검사에서 정상소견 또는 과민성 대장 증후군이 확인된 자로 1년 이내 암으로 진단 받거나, 항암치료 과거력 또는 치료중인 자는 제외하였다. 본 연구용 임상시험은 고려대학교구로병원 의학연구심의위원회의 심의(승인번호 MD17051, 2017.10.25.)를 득한 후에 연구동의서를 구득하고 임상 조직시료 및 혈액시료를 채취하여 동 병원의 인체유래물은행에 선 기탁되었다. 이후 미염색 파라핀 포매 조직 슬라이드는 연구대상군별 평균 10장씩 총 707장을, 혈장 시료는 연구대상군별 평균 5개 튜브(1 ml/튜브)씩 총 351 튜브를, 그리고 혈액연층 시료는 1개 튜브(0.5 - 1.0 ml)씩 총 72 튜브를 분양받았다(승인번호 KU Guro Gene Bank 2018-005). 혈장시료로부터 종양 유래 DNA를 순수분리하기 위해 우선, 16,000 x g, 5분 냉장원심분리하여 혈구세포 침천여부를 확인한 뒤, QIAamp circulating nucleic acid 키트(퀴아젠, Cat.No 55114)를 제조사의 매뉴얼에 따라 순수분리하였다. 그리고 미염색 파라핀 포매 조직 슬라이드의 병변 또는 정상부위로부터 게놈성 DNA를 순수분리하기 위해 Pinpoint slide DNA isolation system 키트(자이모리서치, Cat.No D3001)를 제조사 프로토콜에 따라 수행하였다. 순수분리한 종양 유래 DNA 및 게놈성 DNA 농도는 Quantus 플루오로미터 장비와 QuantiFluor dsDNA 시스템 시약(프로메가, Cat.No E2670)을 사용하여 정량하였다. 비종양군의 비-세포 DNA 농도는 평균 7.2±2.3 ng/ml이었고 대장용종군과 대장암군의 종양 유래 DNA 농도는 평균 18.3±12.1 ng/ml, 평균 23.7±17.4 ng/ml이었다.
<실시예 2> 암 돌연변이 및 메틸화 변이 분석용 올리고 및 프로브 고안
혈액 내 순환 종양세포 또는 병변 유래 비-세포 DNA의 길이 분포를 감안하여 암 돌연변이, 메틸화 변이를 고-민감도로 검출, 분석이 용이하도록 유전자 증폭 앰플리콘의 크기를 167 염기쌍 이하로, 보다 바람직하게 100 염기쌍 이하로 고안하였다. 인체 표준게놈서열은 GRCh37/hg19을 기준으로 삼았으며, 분석용 올리고는 프라이머 프리미어 6.0(프리미어바이오소프트, 미국) 또는 온라인 공개소프트웨어 Primer 3을 활용하여 고안하였고 표 1과 같다.
[표 1]
Figure 112018098536936-pat00001
Figure 112018098536936-pat00002
Figure 112018098536936-pat00003
실시예에 사용된 프로브는 펩티드 핵산(PNA), 잠김 핵산(LNA)으로서 야생 유전형의 증폭을 억제하여 돌연변이 분석의 민감도와 분해능을 향상시키기위해 활용되었다. 프로브 서열은 비콘 디자이너 7(프리미어바이오소프트, 미국) 또는 온라인 공개소프트웨어 Primer3을 활용하여 고안하였으며, 표 2와 같다.
[표 2]
Figure 112018098536936-pat00004
Figure 112018098536936-pat00005
상기 서열번호 71 내지 88에서 '+'기호 다음에 위치하는 염기가 LNA 염기임.
<실시예 3> DNA서열내 CpG 부위 바이설파이트 변환
농도범위 100 pg - 100 ng의 순수분리한 혈액 내 순환 종양세포 또는 병변 유래 비-세포 DNA를 20 μL 부피로 준비한 PCR 튜브에, EZ DNA Methylation-Lightning 키트(자이모리서치, Cat.No D5030)의 매뉴얼에 따라 제조된 바이설파이트 변환 용액 130 μL를 첨가하고 교반하였다. 이어서, PCR 장비(바이로-래드, T100 모델)에 위치시키고 98℃ 8분, 54℃ 60분 변환반응을 수행하였다. 이를 통해 비-메틸화 상태의 C 염기는 U염기로 변환되어 메틸화 상태의 C 염기와 감별이 가능해진다. 반응 종료 후, 자이모-스핀 IC 칼럼을 컬렉션 튜브에 장착하고 칼럼에 M-바인딩 버퍼 600 μL에 이어 변환된 DNA 용액을 첨가하고 위,아래로 뒤집어 10회 혼합하였다. 그리고 10,000 x g 30초간 원심분리하고 이어서 M-워시 버퍼 100 uL를 첨가하고 동일하게 원심분리하였다. 이후 L-탈설폰화 버퍼 200 μL를 첨가하고 상온 20분 정치한 후, 동일 조건으로 원심분리하고 M-워시 버퍼 200 μL를 첨가한 뒤 원심분리하였다. 용출액을 제거하고 13,000 x g 1분간 원심분리하고 상온 5분 건조시킨 뒤, M-용출 버퍼 50 μL를 첨가하여 바이설파이트 변환된 DNA를 최종 순수분리하였다.
<실시예 4> 암 돌연변이 및 메틸화 변이 다중 동시 전-증폭(multiplexed pre-amplification)
혈액 내 미량으로 존재하는 병변 유래 돌연변이와 메틸화 변이를 고-민감도로 분석하기 위해 다중 동시 증폭 전략으로 분석 대상 앰플리콘들을 증폭하였다. 암 돌연변이 다중 동시 전-증폭은 표 1 서열번호 1 내지 36의 증폭용 올리고 중 4개 이상을 선택하여 증폭할 수 있으며 본 실시예는 서열번호 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 27, 28, 31, 32, 33, 34, 35, 36 올리고를 포함하는 총 13종 다중 동시 전-증폭을 설명하며 세부과정은 다음과 같다. 실시예 1에서 순수분리한 병변 유래 비-세포 DNA(최소 5 ng 이상) 4.0 μL, PowerSYBR Green PCR 마스터 믹스(써모피셔, Cat.No 4367659) 10.0 μL, 상기 서열번호 26종에 해당하는 올리고 10 μM 농도를 포함하는 돌연변이 13종 올리고 믹스 0.33 μL, 탈이온 멸균수 5.67 μL를 혼합하여 반응액을 제조하고 실-시간 PCR 장비(써모피셔, AB 7500 FAST 모델)에 위치시킨 뒤, 95℃ 10분 1회, 95℃ 15초, 60℃ 60초 15회 증폭반응을 수행하였다.
또한, 올리고의 융해온도(Tm)를 조절함으로써 올리고 결합의 특이성을 증가시키기 위해 상기 2-단계 증폭과 달리 3-단계 증폭을 적용할 수 있다. 이를 위해 순수분리한 병변 유래 비-세포 DNA(최소 5 ng 이상) 4.0 μL, AmpliTaq Gold 360 마스터 믹스(써모피셔, Cat.No 4398881) 10.0 μL, 상기 서열번호 26종에 해당하는 올리고 10 μM each 농도를 포함하는 돌연변이 13종 올리고 믹스 0.33 μL, 360 GC 인핸서 2.0 μL, 탈이온 멸균수 3.67 μL를 혼합하여 반응액을 제조하고 실-시간 PCR 장비(써모피셔, AB 7500 FAST 모델)에 위치시킨 뒤, 95℃ 10분 1회, 95℃ 15초, 56℃ 15초, 72℃ 15초 1회, 95℃ 15초, 64℃ 15초, 72℃ 15초 14회 증폭반응을 수행하였다.
메틸화 변이 다중 동시 전-증폭은 표 1의 서열번호 37 내지 52의 증폭용 올리고 중 4개 이상을 선택하여 증폭할 수 있으며 본 실시예는 서열번호 37 내지 52 올리고를 포함하는 총 8종 다중 동시 전-증폭을 설명하며 세부과정은 다음과 같다. 실시예 1에서 순수분리한 병변 유래 비-세포 DNA(최소 5 ng 이상) 4.0 μL, QuantiTect 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스(퀴아젠, Cat.No 204543) 15.0 μL 그리고 서열번호 37 내지 38 올리고 농도 최종 10 μM, 서열번호 39 내지 40 올리고 농도 최종 4 μM, 서열번호 41 내지 42 올리고 농도 최종 12 μM, 서열번호 43 내지 44 올리고 농도 최종 13 μM, 서열번호 45 내지 46 올리고 농도 최종 11 μM, 서열번호 47 내지 48 올리고 농도 최종 9 μM, 서열번호 49 내지 50 올리고 농도 최종 7 μM 및 서열번호 51 내지 52 올리고 농도 최종 15 μM을 포함하는 메틸화 올리고 믹스 5.3 uL, 탈이온 멸균수 5.7 μL를 혼합하여 반응액을 제조하고 PCR 장비(바이오-래드, T100 모델)에 위치시킨 뒤, 95℃ 15분 1회, 95℃ 15초, 56℃ 15초, 72℃ 15초 1회, 95℃ 15초, 65℃ 15초, 72℃ 30초 14회 증폭반응을 수행하였다.
<실시예 5> 다중 동시 전-증폭 산물의 순수분리
실시예 4의 전-증폭 산물의 순수분리를 위해 QIAquick PCR 순수분리 키트(퀴아젠, Cat.No 28104)를 사용하였다. 증폭 산물 20 μL 당 5배 부피의 PB 버퍼를 PCR 튜브에 첨가하고 상온 5분간 간헐적으로 교반하였다. 폴리아데닐산 칼륨염(시그마 알드리치, Cat.No P9403) 5 μg을 첨가하고 혼합한 뒤, QIAquick 칼럼에 로딩하고 10,000 x g 30초 원심분리하였다. 750 μL PE 버퍼를 로딩하고 동일한 조건으로 1분 원심분리하고 3분간 공기 중에서 건조시킨 뒤, 20 - 60 μL 범위로 10 mM Tris·Cl(pH 8.5)를 로딩하고 13,000 x g 1분 원심분리하여 전-증폭 산물을 순수분리하였다. 정제된 증폭 산물의 농도는 Quantus 플루오로미터 장비와 QuantiFluor dsDNA 시스템 시약(프로메가, Cat.No E2670)을 사용하여 정량하였다.
<실시예 6> 고-민감도 융해곡선 분석을 통한 BRAF p.V600E(c.1799 T>A) 돌연변이 검출
대장암, 대장용종, 비종양(대조)군의 혈액 내 순환 종양세포 또는 병변 유래 비-세포 DNA를 추출(실시예 1 참조)하고 이로부터 다중 동시 전-증폭을 통해 BRAF를 포함하는 13종 암 돌연변이체를 1회 반응으로 준비(실시예 4 참조)한 뒤, 증폭산물만을 순수분리 하였다(실시예 5 참조). 순수분리한 증폭산물(최소 0.1 ng 이상) 2.0 μL, MeltDoctor HRM 마스터 믹스(써모피셔, Cat.No 4415440) 10.0 μL, 상기 서열번호 7 및 8 올리고 10 μM 농도를 포함하는 올리고 믹스 0.6 μL, BRAF 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 프로브(서열번호 56) 또는 LNA 프로브(서열번호 74)를 0.2 μM - 1.0 μM 그리고 탈이온 멸균수를 혼합하여 최종 반응액 20.0 μL를 제조하고 실-시간 PCR 장비(써모피셔, AB 7500 FAST 모델)에 위치시킨 뒤, 95℃ 10분 1회, 95℃ 15초, 75℃ 10초, 60℃ 60초 40회 증폭반응을 수행하였다. 이후, 연속적으로 수행하는 융해곡선 분석은 95℃ 10초 증폭산물 이중나선을 해리시키고, 60℃ 60초간 다시 재결합시킨 뒤, 60℃부터 95℃까지 1% 램핑속도로 온도를 상승시켜서 SYTO9 형광을 측정함으로써 고-민감도의 융해곡선 결과를 수득하였다. BRAF 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 프로브 농도에 따른 c.1799 T>A 헤테로 돌연변이 분석의 우수성은 도 2에 나타내었다.
< 실시예 7> 고-민감도 융해곡선 분석을 통한 PIK3CA p. E545K(c.1633 G>A ) 돌연변이 검출
실시예 1과 같이 대장암, 대장용종, 비종양(대조)군의 혈액 내 순환 종양세포 또는 병변 유래 비-세포 DNA를 추출하고 이로부터 다중 동시 전-증폭을 통해 PIK3CA를 포함하는 13종 암 돌연변이체를 1회 반응으로 준비(실시예 4 참조)한 뒤, 실시예 5와 같이 증폭산물만을 순수분리하였다. 순수 분리한 증폭산물(최소 0.1 ng 이상) 2.0 μL, MeltDoctor HRM 마스터 믹스(써모피셔, Cat. No 4415440) 10.0 μL, 상기 서열번호 11 및 12 올리고 10 μM each 농도를 포함하는 올리고 믹스 0.6 μL, PIK3CA 545번 코돈 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 프로브(서열번호 58) 또는 LNA 프로브(서열번호 76)를 0.2 μM -1.0 μM 그리고 탈이온 멸균수를 혼합하여 최종 반응액 20.0 uL를 제조하고 실-시간 PCR 장비(써모피셔, AB 7500 FAST 모델)에 위치시킨 뒤, 95℃ 10분 1회, 95℃ 15초, 75℃ 10초, 60℃ 60초 40회 증폭반응을 수행하였다. 이후, 연속적으로 수행하는 융해곡선 분석은 95℃ 10초 증폭산물 이중나선을 해리시키고, 60℃ 60초간 다시 재결합시킨 뒤, 60℃부터 95℃까지 1% 램핑속도로 온도를 상승시켜서 SYTO9 형광을 측정함으로써 고-민감도의 융해곡선 결과를 수득하였다. PIK3CA 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 프로브 농도에 따른 c.1633 G>A 헤테로 돌연변이 분석의 우수성은 도 3에 나타내었다.
<실시예 8> 고-해상도 융해곡선 분석을 통한 MGMT 메틸화 수준(%) 정량분석
대장암, 대장용종, 비종양(대조)군의 혈액 내 순환 종양세포 또는 병변 유래 비-세포 DNA를 추출(실시예 1 참조)하고, 바이설파이트 변환(실시예 3 참조)을 수행하였다. 이어서 다중 동시 전-증폭을 통해 MGMT를 포함하는 8종 메틸화 변이체를 1회 반응으로 준비(실시예 4 참조)한 뒤, 증폭산물만을 순수분리하였다(실시예 5 참조). 순수분리한 증폭산물(최소 0.5 ng 이상) 5.0 μL, LC480 HRM 마스터 믹스(로쉬, Cat.No 04 909 631 001) 10.0 μL, 표 1 서열번호 39 및 40 올리고 농도 각 10 μM을 포함하는 MGMT 올리고 믹스 0.4 μL(최종 0.2 μM), 그리고 25 mM 염화마그네슘 용액 2.8 μL(최종 3.5 mM)에 탈이온 멸균수를 혼합하여 최종 20.0 μL 부피로 고-해상도 융해곡선 반응액을 제조하고 PCR 장비(로쉬, LC480 모델)에 위치시킨 뒤, 95℃ 10분 1회, 95℃ 10초, 64℃ 20초, 72℃ 15초 40회 증폭반응을 수행하였다. 이후, 연속적으로 수행하는 메틸화 고-해상도 융해곡선 분석은 95℃ 10초(램핑속도 4.4℃/초) 증폭산물 이중나선을 해리시키고, 40℃까지 램핑속도 2.2℃/초로 반응온도를 낮춘 뒤, 65℃까지 램핑속도 4.4℃/초로 반응온도를 상승시키며 혼성화시켰다. 이후, 65℃부터 95℃까지 1℃ 상승구간마다 25번 형광측정하면서 매우 정밀한 고-해상도 융해곡선 데이터를 획득하였다. 메틸화 수준 표준곡선은 Cells-to-CpG 메틸화&비메틸화 게놈성DNA 컨트롤 키트(써모피셔, Cat.No 4445552)의 100% 메틸화 DNA와 0% 메틸화 DNA를 조합하여 분석에 사용하였다. MGMT 메틸화 수준(%) 정량분석의 예시를 도 4에 나타내었다.
<실시예 9> 고-민감도 융해곡선 분석을 통한 돌연변이 대립유전자 빈도 분석
본 발명의 일 실시예에 따른 암 돌연변이 분석에 있어서, 다중 동시 전-증폭에 이은 고-민감도 융해곡선 분석의 돌연변이 분석능을 확인하였다. 분석민감도 확인을 위해 사용할 야생 유전형 DNA 시료는 BRAF c.1799 T>A 및 PIK3CA c.1633 G>A 돌연변이가 검출되지 않는 MDA-MB-453 세포주(ATCC HTB-131)를 90%, 99%, 99.9%, 99.99%의 유전형 fraction%가 포함되도록 준비하였다. BRAF c.1799 T>A 돌연변이형 fraction%는 HT-29세포주(ATCC HTB-38) 게놈성 DNA가 각각 10%, 1%, 0.1%, 0.01%포함되도록 제조하였고, PIK3CA c.1633 G>A 돌연변이형 fraction%는 HT-1197세포주(ATCC CRL-1473) 게놈성 DNA가 각각 10%, 1%, 0.1%, 0.01%포함되도록 제조하였다. BRAF p.V600E 돌연변이 대립유전자 빈도의 고-민감도 융해곡선 분석은 실시예 6과 동일하며 BRAF 야생 유전형의 증폭을 억제하는 프로브(서열번호 56)의 최종농도는0.5 μM이었고, BRAF 돌연변이 대립유전자 빈도별(10%, 1%, 0.1%, 0.01%) 첨가한 DNA 최종 농도는 5 ng이었다. 그리고 PIK3CA p.E545K 돌연변이 대립유전자 빈도 분석의 경우, 실시예 7과 분석과정은 동일하며 PIK3CA 야생 유전형의 증폭을 억제하는 프로브(서열번호 58)의 최종농도는 0.3 uM이었다. 상기 BRAF, PIK3CA 돌연변이 분석에 있어 분석 가능한 돌연변이 대립유전자 빈도는 공히 0.01%이었으며 결과는 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다
<110> EROM co., Ltd <120> Method for Analyzing Aberrations of Cancer-Risk Genes <130> 214 <160> 130 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Sequence <400> 1 tgacctcaat tttgtttcag gacc 24 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Sequence <400> 2 gaagttgact ttgtccacct ggaac 25 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Sequence <400> 3 atttaaggtt ccttcaagct gcc 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Sequence <400> 4 ctctcaatgg cttctgtcct gtg 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Sequence <400> 5 atcctcctta ctcatggtcg gatc 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Sequence <400> 6 caggactgtc aagcagagaa tgg 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Sequence <400> 7 tcaaactgat gggacccact c 21 <210> 8 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tttttttttg 3060 tggttttagg atatttgttt aggaggttgg gcggaggtgg gtaggatgtg agaggtgggg 3120 agtattggtt gtgcgtggta ggatagaagt attgtaaagg gttttttagt cgtagtttag 3180 ttgtattgcg tttcgaggtg aagttttgtt tttgaatttt gtaaaatggg aaagtgggcg 3240 tttgtttaag ggttaggttg tatggatttt tatattagag ttttttggtt ttagaaaggt 3300 ttagaaaagg cgtaagggaa tttataaagg ttagtagtat gcggtatttt aattttttgt 3360 ttcggttttt gtggatgtag aaatttgttt tataaaatgt tttttattgg ttgtttttgt 3420 gagagtattg tttttattta atttgttata acggttagaa ttatatatta gagatatatt 3480 ggtaggttag gtagtttttt tggtgatttt attttatttt tttttgttgc ggtttttttt 3540 ggtttgtttt tattggaaaa atagttttta tttttttaaa atagttgttg attttttgta 3600 tttaaggggt ttttttatgt ttttttagga agtagttatg aatttattgt ttttgtagtt 3660 tttttttttt tgttttttgg ttatagttgg ttttaggtta gcgtgggagg tatttttggg 3720 tttttagtgt ttagtatttt gtagttttat tttagattat taattttttt tgattttgga 3780 gaggtaggga tagtaaataa attgtttttt ttattttatt ttttattttt tgataaaaag 3840 tgacggtagt cgtattgagt ttgtaaggtt taaagtgggt atagatagtt tgggttggta 3900 aaagtaggtt tttatttata aggttgcgtt aaagttgtat taggtaaata tattgatgta 3960 ggaagtacga ggaaaggaag acgttttgat atagtgttat tgtgagtttg ttagtagtgg 4020 gtattaattt tttgtgatat attgttatgt tgaggtgtga tatttgttgt atttatttga 4080 tgtaaaatta ttttagagtt ggcgagagga tggagttggg tggaaattgt tttgtattat 4140 cgtttgtttg gtgtttgttt ttaacgtata atttgtttgt atagtaaatt gttttttgta 4200 ttatttaatt 4210 <210> 130 <211> 4482 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized Sequence <400> 130 agcgggggta ttttagtttt gtagttttcg gagttagtgt cgcgcgttcg tcgtttcgcg 60 tttttttgtt cgtcgtattt tcgggagtcg gggcgtattt agttcgtagc gtcgtttttt 120 cgttcgcgtc gttttcgatc gtaggtcgag ggtcgttatt ggtcgggggg atcgggtagt 180 agtttgcggt cgcggagtcg ggtaacgttg gggattgcgt tttttgtttt cggaggtttt 240 tggaagtttg cggtaggacg cgcgcgggga ggcggcggag gtagtttcga cgtcgcggag 300 aatagggcgt agagtcggta tgggtatcgg gcgtagcgag gggggtcgtc gcggggtagt 360 tttgggcgtg ttgttggcgt tgggcgcggc gtttttggtc gtgggttcgg ttagcgagta 420 cgattacgtg agtttttagt cggatatcgg ttcgtattag agcgggcgtt tttatattaa 480 gttattttag tgcgtggata ttttcgcgga tttgcggttg tgttataacg tgggttataa 540 gaagatggtg ttgtttaatt tgttggagta cgagattatg gcggaggtga agtagtaggt 600 tagtagttgg gtgtttttgt ttaataagaa ttgttacgtc ggtatttagg tttttttttg 660 ttcgtttttc gcgttcgttt gtttggatcg gtttatttat tcgtgtcgtt ggttttgcga 720 ggtcgtgcgc gattcgtgcg agtcggttat gtagtttttc ggtttttatt ggttcgagat 780 gtttaagtgt gataagtttt tcgaggggga cgtttgtatc gttatgacgt cgtttaatgt 840 tatcgaagtt tttaagtttt aaggtataac ggtgtgtttt ttttgtgata acgagttgaa 900 atttgaggtt attattgaat atttttgtgt tagcgagttt gtattgagga tgaaaataaa 960 agaagtgaaa aaagaaaatg gcgataagaa gattgttttt aagaagaaga agtttttgaa 1020 gttggggttt attaagaaga aggatttgaa gaagtttgtg ttgtatttga agaatggggt 1080 tgattgtttt tgttattagt tggataattt tagttattat ttttttatta tgggtcgtaa 1140 ggtgaagagt tagtatttgt tgacggttat ttataagtgg gataagaaaa ataaggagtt 1200 taaaaatttt atgaagaaaa tgaaaaatta tgagtgtttt attttttagt tcgtgtttaa 1260 gtgatttttt cgggggtagg gtggggaggg agtttcgggt ggggtgggag cgggggggat 1320 agtgtttcgg gaattcggtg ggttatatat acgtattgcg tttgttagta gtggatattt 1380 aatttagtcg gtttgttttt gtagtatttt cgtttttttt tttttatagt tacgttttaa 1440 attttagggt agttatggtc gggtaaagta agggttattt agattaggaa ggtttttaag 1500 attcgtaatg tggagtagta gttattgtat aggaggaggt gataaattat ttttaatagt 1560 aatatagtta ttaaaatata aaaaggggga ttgggcggaa agtgagagtt agtagtaaaa 1620 attatatttt gtaatttgtt ggtgtggatt tattggttga tttatgtttt ttaattagaa 1680 aattttaatg attggtaagt tacgttgttt ttaggtttag agtagttttt ttttgtttgt 1740 tttaaatgga aatagattta tattatattt ataattaagg ttaagtttag aaagtgataa 1800 gtgtagggag gaaaagtgta agtttattat gtaatagtga tagtaaaggg attaggggag 1860 aggtattgtt ttttttgttt atagtttttt cgtgtgattg tttttgaatt tgaattagtt 1920 agttttagat gttttaaagt ttcggttttt atgagttcgg ggtatgattt gatttttaag 1980 atatgtggag gggtagtttg tgtttgtttt tgtgttagaa aaaggaaatt atagtgagtt 2040 tgagagagac ggcgattttc gggttgagaa ggtagtagtt tttaaaatat atagttaaaa 2100 aagaaataaa tgaaaaaaat tttagaatag tttagtaaat tgttagttag ggtgaattgt 2160 gaaattgggt gaagagttta cgattttaat tttatgtttt ttttttttta tatttttaaa 2220 agaataatga taaatattta tttatttttt aaggttttaa aatagtttat attgagtatt 2280 tgaaaggtgt gttagaataa ggttttttga ttcgttcgag gttgtttttt agaggagtag 2340 ttttttttag gtatttgtta agggaggcgg atttttttgg tagtgtagtt gtgtggtttt 2400 tttttttgaa gagttcgtgg ttgttttaga atttaatatt ttttagtaaa atttatagag 2460 tttttcgttt tttttttttt tgtaaagaaa tatttttttt gaatttgatt gtttatggat 2520 taaagaaatt tagaatagtt tgtttgtttt ttcgtatttt ttatatatat ttgttttatt 2580 tttgtagatg gaaagttgat atgggtgggg tgtttttatt tagcgagaga gtttaaaaag 2640 taaaatattt ttgtagtttt ttttaagtgt tttgagatat tttttaaagt ttttatgttt 2700 aattagcgat gtatataagt tagtttattt agataatttt attttttttg tttaatgtat 2760 aggaagtagt tttaaaaaaa atgtatatta attttttttt ttaaagtcgg atttttaatt 2820 ttttgtaata ttttgaggat atttatgatt gtttttttgg gttaatgttt atatttagtg 2880 aggatgttgt agtgaggttg taaagtggtt ttttgcggtt ttagtttgat tcggaggaaa 2940 ggatggtaga ttttgttaat ttttgaagat 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tagagttttg ggaggttttt ggtagaattt 3840 agttaaattt ttgaagaata tttgtagtta ttttagaaga tagtatggga ggtgaggatt 3900 ttaaaaatat tttattttta aaatattttg tgtaatattt ggtttttggt atttgtgggt 3960 tagtattaag ttttttttag ggtagaattt aattagagtt ttagtttgta tttggatgtg 4020 taaattatag taattttatt ttttaaattt aaaatttgtt ttttttatta gattttgagt 4080 aattggttgt tgtgttataa ttttatagat gtaggaggtt taggtgattt gtttgagtag 4140 agtattttag gtagtttgta gggaataata tattggtcgt tttgatttgt tgttagtaga 4200 tatataggat atggatgaaa ttttcgtttt ttttagtttt tttttgtagt attttttttt 4260 tagattttaa gttttttata aaagttttga atattgtgaa aatgttttat attttatttt 4320 atttgtgttg tttttttaat tgtattttat tagatgtttt gatgttatcg tttatgttaa 4380 tagtaatttt cgtacgtgtt tattttattt ttatgttttt ttagttatgt attaatattt 4440 atttgattaa aattatttaa ttaattaaaa aaaaaaaaaa aa 4482

Claims (16)

  1. (a) 생물학적 시료로부터 분리된 DNA와 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 다중 동시 전-증폭(multiplexed simultaneous pre-amplification)시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계와 동시 또는 순차적으로 생물학적 시료로부터 분리된 DNA와 CDKN2A(NCBI Gene ID: 1029, 서열번호 107), MGMT(NCBI Gene ID: 4255, 서열번호 108), ESR2(NCBI Gene ID: 2100, 서열번호 109), GSTP1(NCBI Gene ID: 2950, 서열번호 110), DAPK(NCBI Gene ID: 1612, 서열번호 111), CDH13(NCBI Gene ID: 1012, 서열번호 112), RUNX3(NCBI Gene ID: 864, 서열번호 113), SFRP1(NCBI Gene ID: 6422, 서열번호 114)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 다중 동시 전-증폭시키는 단계; 및
    (c) 상기 (a) 단계 및 (b) 단계의 증폭 산물에 대한 융해곡선을 분석하는 단계를 포함하는 암 유발 유전자의 이상을 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 DNA는 혈액 내 순환 종양세포 또는 병변 유래 비-세포 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 암 특이적 돌연변이 증폭의 민감도를 높이기 위해 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브를 추가로 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 암 특이적 돌연변이는 GNAS(NCBI Gene ID: 2778, 서열번호 89), SMAD4(NCBI Gene ID: 4089, 서열번호 90), KIT(NCBI Gene ID: 3815, 서열번호 91), BRAF(NCBI Gene ID: 673, 서열번호 92), NRAS(NCBI Gene ID: 4893, 서열번호 93), PIK3CA(NCBI Gene ID: 5290, 서열번호 94 또는 95), PTEN(NCBI Gene ID: 5728, 서열번호 96 또는 97), KRAS(NCBI Gene ID: 3845, 서열번호 98), P53(NCBI Gene ID: 7157, 서열번호 99, 100, 101, 102, 103 또는 104) 및 EGFR (NCBI Gene ID: 1956, 서열번호 105 또는 106)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 53 내지 서열번호 88로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1 내지 서열번호 36으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 메틸화 변이는 유전자의 메틸화 수준(%)을 고-처리량 융해곡선을 통해 정량분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 생물학적 시료로부터 분리된 DNA에 바이설파이트를 처리하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드는 서열번호 37 내지 서열번호 52로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 암 특이적 돌연변이를 증폭한 앰플리콘에 대한 융해곡선은 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브를 앰플리콘과 혼성화하고 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 메틸화 변이를 증폭한 앰플리콘에 대한 융해곡선은 서열번호 37 내지 서열번호 52로 구성된 군에서 선택된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드로 증폭된 앰플리콘을 재혼성화시킨 뒤, 온도를 변화시키면서 재혼성화 산물들을 융해시켜 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. (a) 생물학적 시료로부터 분리된 DNA와 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 다중 동시 전-증폭(multiplexed simultaneous pre-amplification)시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계와 동시 또는 순차적으로 생물학적 시료로부터 분리된 DNA와 CDKN2A(NCBI Gene ID: 1029, 서열번호 107), MGMT(NCBI Gene ID: 4255, 서열번호 108), ESR2(NCBI Gene ID: 2100, 서열번호 109), GSTP1(NCBI Gene ID: 2950, 서열번호 110), DAPK(NCBI Gene ID: 1612, 서열번호 111), CDH13(NCBI Gene ID: 1012, 서열번호 112), RUNX3(NCBI Gene ID: 864, 서열번호 113), SFRP1(NCBI Gene ID: 6422, 서열번호 114)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 혼합하여 다중 동시 전-증폭시키는 단계; 및
    (c) 상기 (a) 단계 및 (b) 단계의 증폭 산물에 대한 융해곡선을 분석하는 단계를 포함하는 고형암 또는 산발성 고형암의 검출 또는 진단에 정보를 제공하는 방법.
  13. i) 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드;
    ii) 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브; 및
    iii) CDKN2A(NCBI Gene ID: 1029, 서열번호 107), MGMT(NCBI Gene ID: 4255, 서열번호 108), ESR2(NCBI Gene ID: 2100, 서열번호 109), GSTP1(NCBI Gene ID: 2950, 서열번호 110), DAPK(NCBI Gene ID: 1612, 서열번호 111), CDH13(NCBI Gene ID: 1012, 서열번호 112), RUNX3(NCBI Gene ID: 864, 서열번호 113), SFRP1(NCBI Gene ID: 6422, 서열번호 114)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 다중 동시 전-증폭을 통해 융해곡선을 분석하여 암 유발 유전자 이상을 검출하기 위한 조성물.
  14. i) 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드;
    ii) 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브; 및
    iii) CDKN2A(NCBI Gene ID: 1029, 서열번호 107), MGMT(NCBI Gene ID: 4255, 서열번호 108), ESR2(NCBI Gene ID: 2100, 서열번호 109), GSTP1(NCBI Gene ID: 2950, 서열번호 110), DAPK(NCBI Gene ID: 1612, 서열번호 111), CDH13(NCBI Gene ID: 1012, 서열번호 112), RUNX3(NCBI Gene ID: 864, 서열번호 113), SFRP1(NCBI Gene ID: 6422, 서열번호 114)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 다중 동시 전-증폭을 통해 융해곡선을 분석하여 고형암 또는 산발성 고형암을 진단하기 위한 조성물.
  15. i) 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드;
    ii) 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브; 및
    iii) CDKN2A(NCBI Gene ID: 1029, 서열번호 107), MGMT(NCBI Gene ID: 4255, 서열번호 108), ESR2(NCBI Gene ID: 2100, 서열번호 109), GSTP1(NCBI Gene ID: 2950, 서열번호 110), DAPK(NCBI Gene ID: 1612, 서열번호 111), CDH13(NCBI Gene ID: 1012, 서열번호 112), RUNX3(NCBI Gene ID: 864, 서열번호 113), SFRP1(NCBI Gene ID: 6422, 서열번호 114)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 다중 동시 전-증폭을 통해 융해곡선을 분석하여 암 유발 유전자 이상을 검출하기 위한 키트.
  16. i) 암 특이적 돌연변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드;
    ii) 야생 유전형의 증폭을 억제하는 PNA 또는 LNA 프로브; 및
    iii) CDKN2A(NCBI Gene ID: 1029, 서열번호 107), MGMT(NCBI Gene ID: 4255, 서열번호 108), ESR2(NCBI Gene ID: 2100, 서열번호 109), GSTP1(NCBI Gene ID: 2950, 서열번호 110), DAPK(NCBI Gene ID: 1612, 서열번호 111), CDH13(NCBI Gene ID: 1012, 서열번호 112), RUNX3(NCBI Gene ID: 864, 서열번호 113), SFRP1(NCBI Gene ID: 6422, 서열번호 114)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 메틸화 변이를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 다중 동시 전-증폭을 통해 융해곡선을 분석하여 고형암 또는 산발성 고형암을 진단하기 위한 키트.

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