WO2018079287A1 - 変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼε - Google Patents

変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼε Download PDF

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浩 井筒
啓輔 兒玉
光隆 中田
俊文 若井
仁史 亀山
昌幸 永橋
能史 島田
寛 市川
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デンカ株式会社
国立大学法人新潟大学
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Definitions

  • the present invention relates to a mutant human DNA polymerase ⁇ .
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding a mutant human DNA polymerase ⁇ and a fragment thereof, and a method for determining whether a cancer is a hypermutated cancer.
  • Hypermutation There is a hypermutation type (Hypermutation or Hypermutated) as one of the gene mutation patterns of cancer. Hypermutated cancers are distinguished by a higher somatic mutation rate compared to other types. Further, it is known that there are cancers that exhibit high-frequency mutation characteristics such as gastric cancer, breast cancer, colon cancer, glioblastoma, and uterine cancer (Non-patent Document 1).
  • High-frequency mutant cancers often have the property of microsatellite instability indicating a deficiency or incompleteness of the mismatch repair mechanism during DNA replication. This is thought to be due to the fact that the genes of the mismatch repair enzymes MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH6, and PMS2 have been mutated or the expression of the MLH1 gene is suppressed by methylation.
  • Non-patent Document 2 DNA polymerase ⁇ has 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity as an error correction mechanism in addition to the activity of synthesizing DNA in the 5 ′ ⁇ 3 ′ direction, and an incorrect base is added to the DNA strand. Then, the base is removed by the 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity, and then DNA synthesis is resumed.
  • the association between the hypermutation type cancer and DNA polymerase ⁇ is considered to be caused by the fact that the error correction mechanism of DNA polymerase ⁇ does not work normally, and the exonuclease activity domain (amino acid sequence 87th to 426th amino acid sequence). ) Mutation and hypermutation are being investigated.
  • Non-Patent Documents 3 to 4 For example, mutations such as D275V, P286R, S297F, H342R, F367S, V411L, L424V, A426V, and S459F have been disclosed as mutations in amino acid residues of DNA polymerase ⁇ that cause high-frequency mutations (Non-Patent Documents 3 to 4). 7).
  • Non-patent Document 8 Anticancer agents applying such a principle have been put into practical use (for example, nivolumab and ipilimumab) (Non-Patent Documents 9 to 12). Furthermore, there are several other such immunosuppressive mechanisms, and it is expected that antitumor agents that block these immunosuppressive mechanisms will be developed and put to practical use in the future.
  • High-frequency mutant cancers have many cancer-specific antigens that are targets of the immune mechanism, and the effects of therapy that block the signal pathway of immunosuppression have been shown (Non-Patent Documents 13 to 14). Therefore, a biomarker that can discriminate that a cancer is a high-frequency variant is useful, for example, in selecting an appropriate treatment, determining a treatment policy, and the like.
  • An object of the present invention is to provide a new biomarker capable of discriminating hypermutation type cancer.
  • the present inventors have found a mutation in the 952nd amino acid residue in the DNA synthesis active domain (624th to 1145th amino acid sequence) of DNA polymerase ⁇ in hypermutation type cancer. So far, there has been known an association between hypermutation cancer and mutation of amino acid residues in the exonuclease activity domain of DNA polymerase ⁇ . On the other hand, the relationship between hypermutation cancer and amino acid residue mutation in the DNA synthesis active domain of DNA polymerase ⁇ has not been known so far. The present invention is based on this novel finding.
  • the present invention relates to a mutant human DNA polymerase ⁇ containing one or more amino acid mutations, in which the 952nd leucine residue of the amino acid sequence of human DNA polymerase ⁇ is another amino acid residue.
  • a mutant human DNA polymerase ⁇ comprising the mutation
  • mutant human DNA polymerase ⁇ according to the present invention is found in high-frequency mutant cancers, it is useful, for example, as a new biomarker for discriminating high-frequency mutant cancers.
  • the other amino acid residues may be amino acid residues other than leucine residues, but are preferably serine residues. By being a serine residue, the discrimination accuracy when discriminating a hypermutation type cancer is further increased.
  • the present invention also relates to a nucleic acid encoding the mutant according to the present invention.
  • the present invention also relates to a nucleic acid complementary to the nucleic acid encoding the mutant human DNA polymerase ⁇ according to the present invention.
  • These nucleic acids or complementary nucleic acids may be fragments containing a base sequence (codon sequence) encoding the other amino acid residue or a complementary sequence thereof.
  • the fragment is also a nucleic acid, and the base length thereof may be 20 to 300 bases, for example.
  • the present invention is also a method for determining whether a cancer is a hypermutation cancer in a human patient suffering from cancer, using a sample containing a component derived from cancer cells collected from the human patient.
  • the method of the present invention it is possible to determine whether or not the cancer is a hypermutated cancer in a human patient suffering from cancer.
  • the determination of the presence or absence of a mutation in the amino acid residue may include detection of a mutation in the base sequence encoding the 952nd amino acid residue in the amino acid sequence of human DNA polymerase ⁇ .
  • the amino acid residue mutation is preferably L952S. Thereby, discrimination accuracy becomes higher.
  • the cancer may be colorectal cancer or rectal cancer. If the cancer is colorectal cancer or rectal cancer, it can be discriminated with higher certainty whether or not the cancer is a highly mutated cancer.
  • the present invention is also a method for diagnosing morbidity of a hypermutated cancer, wherein the amino acid sequence of human DNA polymerase ⁇ derived from cells using a sample containing cell-derived components collected from a human specimen A method for detecting a mutation in the 952nd amino acid residue, and diagnosing that a human specimen suffers from a high-mutation cancer when the amino acid residue is mutated To do.
  • a new biomarker capable of discriminating hypermutation cancer is provided.
  • Hypermutated or hypermutated cancers are cancers that have a higher mutation rate of cancer-specific mutations than normal cancers.
  • the mutation rate is the number of mutations accompanied by changes in amino acid residues per 10 6 bases (hereinafter also referred to as “Mb”).
  • Hypermutated cancer is judged by comparing the mutation rate with normal cancer. The mutation rate varies depending on the number and type of genes to be examined, and also varies depending on the type of cancer.
  • Human DNA polymerase ⁇ is a DNA replication enzyme, and wild type DNA polymerase ⁇ has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the DNA synthesis active domain of human DNA polymerase ⁇ corresponds to the 624th to 1145th positions of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the exonuclease active domain is the 87th to 158th amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It corresponds to the 426th.
  • amino acid residue mutation means that a specific amino acid residue in an amino acid sequence of a protein is an amino acid residue different from the amino acid residue in the corresponding wild-type amino acid sequence.
  • the amino acid residue mutation may be any of amino acid residue substitution, deletion, or insertion.
  • the 952nd amino acid residue of the amino acid sequence of wild-type human DNA polymerase ⁇ represented by SEQ ID NO: 1 is leucine, and it is assumed that there is a mutation when this is an amino acid residue other than leucine.
  • the mutant human DNA polymerase ⁇ includes a mutation of one or more amino acid residues, and the mutation of the amino acid residue is that at least the 952nd leucine residue of the amino acid sequence of human DNA polymerase ⁇ Includes mutations that result in other amino acid residues.
  • the other amino acid residues are not particularly limited as long as they are amino acid residues other than leucine residues.
  • serine residues methionine residues, valine residues, tryptophan residues, or phenylalanine. It may be a residue.
  • the mutant human DNA polymerase ⁇ preferably includes a mutation in which at least the 952nd leucine residue of the amino acid sequence of human DNA polymerase ⁇ is substituted with another amino acid residue, and at least human DNA polymerase More preferably, it contains a mutation (L952S) in which the 952nd leucine residue of the amino acid sequence of ⁇ is substituted with a serine residue.
  • the mutant human DNA polymerase ⁇ may include only the L952S mutation (SEQ ID NO: 2), and further includes one or more amino acid residue mutations in addition to the L952S mutation. May be.
  • amino acid residue mutations that can be included in addition to the L952S mutation include mutations such as D275V, P286R, S297F, H342R, F367S, V411L, L424V, A426V, and S459F.
  • the mutant human DNA polymerase ⁇ may be obtained by extraction and purification from human cancer cells having the same, and after obtaining a nucleic acid encoding the mutant human DNA polymerase ⁇ by chemical synthesis or the like. Alternatively, it may be expressed by an appropriate protein expression system.
  • the nucleic acid is a nucleic acid encoding the above-described mutant human DNA polymerase ⁇ (hereinafter also referred to as “nucleic acid 1”).
  • the nucleic acid 1 may be a nucleic acid having a genomic DNA sequence including an intron or a nucleic acid having an mRNA sequence.
  • the genomic DNA sequence of the wild type human DNA polymerase ⁇ gene is NCBI accession number NG — 033840.
  • the mRNA sequence of wild-type human DNA polymerase ⁇ is NCBI accession number L09561.
  • the nucleic acid according to another embodiment is a nucleic acid having a base sequence complementary to the nucleic acid 1 (hereinafter also referred to as “nucleic acid 2”).
  • the nucleic acid may be a fragment of nucleic acid 1, and the fragment is a nucleotide sequence (codon sequence) encoding the 952nd other amino acid residue of the amino acid sequence of the mutant human DNA polymerase ⁇ described above.
  • nucleic acid 3 the nucleic acid related to this fragment is also referred to as “nucleic acid 3”.
  • the nucleic acid may be a fragment of nucleic acid 2, which is a base sequence (codon) encoding the 952nd other amino acid residue of the amino acid sequence of mutant human DNA polymerase ⁇ described above. (Hereinafter, the nucleic acid according to this fragment is also referred to as “nucleic acid 4”).
  • Nucleic acids 1 to 4 can be used as biomarkers for discriminating hypermutation cancers. That is, for example, by detecting a mutation in the base sequence in nucleic acid 1 to nucleic acid 4, a mutation in the amino acid residue of mutant human DNA polymerase ⁇ can be detected.
  • the nucleic acids 1 to 4 may have a cDNA type base sequence in which introns are removed from the genomic DNA sequence.
  • mutation of the base sequence means at least one of the bases in the base sequence so that the amino acid residue encoded by the base sequence is different from the amino acid residue encoded by the corresponding wild-type base sequence. It means that the part is substituted with another base (also referred to as “missense mutation”).
  • nucleic acids 1 to 4 can be used as probes for detecting mutations in the base sequence, for example, by cloning into an appropriate cloning vector.
  • the base lengths of the nucleic acid 3 and the nucleic acid 4 are not particularly limited.
  • the base length of the nucleic acid 3 and the nucleic acid 4 is 20 from the viewpoint of more efficiently detecting the mutation of the base sequence in the next-generation sequencer.
  • the length is preferably from 300 to 300 bases, more preferably from 50 to 250 bases, even more preferably from 70 to 200 bases, and even more preferably from 100 to 200 bases.
  • nucleic acid 3 and the nucleic acid 4 are, for example, at least 7 consecutive amino acids including the above-mentioned “other amino acid residues” from the viewpoint of more efficiently detecting a nucleotide sequence mutation in a next-generation sequencer.
  • a nucleic acid encoding a residue is preferable, and a nucleic acid encoding at least 10 consecutive amino acid residues including “another amino acid residue” is more preferable.
  • the discrimination method is a method for discriminating whether a cancer is a hypermutation type cancer in a human patient suffering from cancer, and a sample containing a component derived from a cancer cell collected from a human patient.
  • a sample containing a cancer cell-derived component is one of the cancer cell itself, the nucleus of the cancer cell, the cytoplasm of the cancer cell, the protein derived from the cancer cell, the peptide derived from the cancer cell, and the nucleic acid derived from the cancer cell.
  • Samples containing components derived from cancer cells include, for example, cancer excised tissue specimens, biopsy specimens, ascites infiltrating cancer cells, blood circulating cancer cells, serum, plasma, blood, feces, urine, sputum, cerebrospinal fluid, intrathoracic fluid Nipple aspirate fluid, lymph fluid, cell culture fluid, and other tissues and fluids collected from patients.
  • a sample containing a cancer cell-derived component is a cancer excised tissue specimen, biopsy specimen, ascites infiltrating cancer cell, blood circulating cancer cell, serum, or It is preferably plasma, more preferably a cancer excised tissue specimen or a biopsy specimen.
  • these specimens are subjected to freezing, alcohol fixation, formalin fixation, paraffin embedding, or a combination of these treatments. May be.
  • the mutation at the 952nd amino acid residue in the amino acid sequence of human DNA polymerase ⁇ was that the leucine residue was changed to a serine residue, methionine residue, valine residue, tryptophan residue, or phenylalanine residue. It's okay.
  • the mutation of the amino acid residue is such mutation, it can be discriminated with higher certainty than the hypermutation type cancer.
  • the mutation is a mutation in which a leucine residue is replaced with a serine residue (L952S), it is possible to discriminate a highly-mutated cancer with even higher certainty.
  • Detection of amino acid residue mutations can be performed by known methods.
  • the detection of the mutation may include, for example, detection of a mutation in the base sequence encoding the 952nd amino acid residue of the amino acid sequence of human DNA polymerase ⁇ .
  • the detection of the mutation of the base sequence can be performed by a known method.
  • DNA sequencing for example, sequencing by a next-generation sequencer
  • polymerase chain reaction for example, polymerase chain reaction
  • allele-specific amplification hybridization with an allele-specific probe
  • mismatch cleavage analysis single strand
  • You may perform by a higher-order structure polymorphism, denaturation gradient gel electrophoresis, or temperature gradient gel electrophoresis.
  • the cancer is a hypermutation cancer.
  • Skin cancer, ovarian cancer, gallbladder cancer, head and neck cancer testicular tumor, adrenal cancer, oral cancer, bone soft tissue tumor, brain tumor, malignant melanoma, osteosarcoma, chondrosarcoma, rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma, leukemia
  • Examples include malignant lymphoma and multiple myeloma.
  • the cancer is colorectal cancer or rectal cancer, it is possible to discriminate the highly mutated cancer with higher certainty.
  • the diagnostic method according to the present embodiment is a method for diagnosing morbidity of a hypermutated cancer, and a human DNA polymerase derived from a cell using a sample containing a cell-derived component collected from a human specimen a step of detecting a mutation in the 952nd amino acid residue of the amino acid sequence of ⁇ , and diagnosing that the human specimen is suffering from a hypermutated cancer when the amino acid residue is mutated Is the way.
  • a sample containing a cell-derived component is a sample containing one or more of the cell itself, cell nucleus, cell cytoplasm, cell-derived protein, cell-derived peptide, and cell-derived nucleic acid. That means.
  • Samples containing cell-derived components include, for example, biopsy specimens, serum, plasma, blood, stool, urine, sputum, cerebrospinal fluid, intrathoracic fluid, nipple aspirate fluid, lymph fluid, cell culture fluid, and collected from humans Other tissues and fluids produced. From the viewpoint of discriminating the hypermutated cancer with higher certainty, the sample containing cell-derived components may be a biopsy specimen, serum, or plasma.
  • the biopsy specimen may be subjected to freezing, alcohol fixation, formalin fixation, paraffin embedding, or a combination of these treatments.
  • sample preparation A cancer excised specimen of formalin-fixed paraffin-embedded specimen of 201 colorectal cancer patients was prepared, and this was sliced into two sections having a thickness of 20 ⁇ m. A sample in which two prepared sections were attached to a slide glass was used as a sample for DNA extraction.
  • a 4 ⁇ m-thick section was prepared, and the prepared section attached to a slide glass was used as a sample for microscopic observation.
  • DNA extraction Samples for microscopic observation were stained with hematoxylin eosin. The sample after staining was observed with a microscope, and a site containing many cancer cells in the section was identified. From the sample for DNA extraction, the site specified by the sample for microscopic observation was shaved with a razor, and DNA was extracted from the shaved site. DNA extraction was performed using BiOstic (registered trademark) FFPE Tissue DNA Isolation Kit (trade name).
  • FIG. 1 is a graph plotting the mutation rate (number of mutations per 1 Mb) for each specimen.
  • the horizontal axis in FIG. 1 plots the samples so that they are arranged from left to right in descending order of mutation rate.
  • many mutations were detected in 17 specimens, and these specimens were considered to be high-frequency mutants.
  • 4 samples samples indicated by A to D in FIG. 1 had significantly higher mutation rates than others.
  • the mismatch repair gene mutation was not present in the specimens indicated by A, B, and D.
  • the sequence of the human DNA polymerase ⁇ gene was further analyzed for these four specimens.
  • one sample shows a mutation that causes cancer of the high frequency mutation type so far.
  • L952S which is not known to be, was detected.
  • V411L and P286R which are already known as mutations that cause hypermutation cancer, were detected from the specimens indicated by A and B, respectively.
  • the specimen indicated by C had no mutation in the human DNA polymerase ⁇ gene.

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Abstract

本発明は、１つ以上のアミノ酸残基の変異を含む変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεであって、アミノ酸残基の変異が、ヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のロイシン残基が他のアミノ酸残基になる変異を含む、変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεを提供する。かかる方法によれば、高頻度変異型の癌を判別できる新たなバイオマーカーが提供される。

Description

変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼε
　本発明は、変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεに関する。本発明はまた変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεをコードする核酸及びその断片、癌が高頻度変異型の癌であるか判別する方法にも関する。
　癌の遺伝子変異のパターンの一つに、高頻度変異型（Ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ又はＨｙｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ）がある。高頻度変異型の癌は、体細胞変異率が他の型に比べて高いことで区別される。そして、胃癌、乳癌、大腸癌、膠芽腫、子宮癌などで、高頻度変異型の特徴を示す癌があることが知られている（非特許文献１）。
　高頻度変異型の癌は、ＤＮＡ複製時のミスマッチ修復機構の欠損又は不完全さを示すマイクロサテライト不安定性の性質を有する場合が多い。これは、ミスマッチ修復酵素であるＭＬＨ１、ＭＬＨ３、ＭＳＨ２、ＭＳＨ３、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２の遺伝子が変異を起こしていたり、ＭＬＨ１遺伝子の発現がメチル化によって抑制されていたりすることによるものと考えられている。
　また、ＤＮＡ複製酵素であるＤＮＡポリメラーゼεの変異によって、特に高い頻度で体細胞変異を引き起こし、高頻度変異型となることも知られている（非特許文献２）。ＤＮＡポリメラーゼεは、ＤＮＡを５’→３’方向にＤＮＡを合成する活性に加えて、エラー訂正機構として３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しており、誤った塩基がＤＮＡ鎖に付加されると、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性により当該塩基が除去され、その後ＤＮＡ合成が再開される。そのため、高頻度変異型の癌とＤＮＡポリメラーゼεとの関連は、ＤＮＡポリメラーゼεのエラー訂正機構が正常に働かなくなったことに起因すると考えられ、エキソヌクレアーゼ活性ドメイン（アミノ酸配列第８７番目～第４２６番目）の変異と高頻度変異型との関連が調べられている。
　例えば、高頻度変異型を引き起こすＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸残基の変異として、Ｄ２７５Ｖ、Ｐ２８６Ｒ、Ｓ２９７Ｆ、Ｈ３４２Ｒ、Ｆ３６７Ｓ、Ｖ４１１Ｌ、Ｌ４２４Ｖ、Ａ４２６Ｖ、Ｓ４５９Ｆなどの変異が開示されている（非特許文献３～７）。
　近年、がん免疫逃避機構が解明され、この機構を標的とする新しいがん免疫治療が、臨床に応用されるようになった。当該機構として、イムノチェックポイント経路ともいわれるＰＤ－１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ　ｃｅｌｌ　Ｄｅａｔｈ－１）／ＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－１　Ｌｉｇａｎｄ１）経路がある。免疫抑制補助シグナルを伝達するＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１経路をブロックすることで、Ｔ細胞の免疫抑制が解除され、Ｔ細胞が活性化し癌特異的抗原を発現している腫瘍の抑制が起こる（特許文献１）。また、ＣＴＬＡ－４も活性化Ｔ細胞に発現し、抗原提示細胞のＣＤ２８リガンドが結合するとＴ細胞の活性化が抑制されるため、この経路をブロックすることでもＴ細胞の免疫抑制を解除し、腫瘍抑制を引き起こすことが可能である（非特許文献８）。このような原理を応用した抗癌剤が実用化されている（例えば、ニボルマブ、イピリムマブ）（非特許文献９～１２）。さらに、このような免疫抑制性の機構は他にも複数存在し、将来それらの免疫抑制機構をブロックする抗腫瘍剤が開発、実用化されていくと期待される。
　高頻度変異型の癌は、免疫機構のターゲットとなる癌特異的な抗原を多く持っており、免疫抑制のシグナル経路をブロックする療法の効果が示されている（非特許文献１３～１４）。そのため、癌が高頻度変異型であることを判別できるバイオマーカーは、例えば、適切な治療の選択、治療方針の決定等において有用である。
特許第４４０９４３０号公報
Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２０１４年，１４巻（１２号），ｐｐ．７８６～８００ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０１３年，２３０巻，ｐｐ．１４８～１５３ Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，２０１５年，２５巻（７号），ｐｐ．１１８７－１１９３ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，２０１３年，２３０巻，ｐｐ．１４８－１５３ Ｃａｎｃｅｒ，２０１５年，１２１巻（３号），ｐｐ．３８６－３９４ Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，２０１５年，２１巻（１４号），ｐｐ．３３４７－３３５５ Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１１年，１９巻，ｐｐ．３２０－３２５ 日呼吸誌，２０１４年，３巻（１号），ｐｐ．４３－４９ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００７年，１９巻（７号），ｐｐ．８１３－８２４ Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．　Ｒｅｓ．，２０１４年，２巻（９号），ｐｐ．８４６－８５６ Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１０年，３６３巻（８号），ｐｐ．７１１－７２３ Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｌｌ，２０１５年，２７巻（４号），ｐｐ．４３９－４４９ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５年，３４８巻（６２３０号），ｐｐ．　１２４－１２８ Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５年，３７２巻（２６号），ｐｐ．２５０９－２５２０
　本発明は、高頻度変異型の癌を判別できる新たなバイオマーカーを提供することを目的とする。
　本発明者らは、高頻度変異型の癌において、ＤＮＡポリメラーゼεのＤＮＡ合成活性ドメイン（アミノ酸配列の第６２４番目～第１１４５番目）における第９５２番目のアミノ酸残基の変異を見出した。これまでに高頻度変異型の癌とＤＮＡポリメラーゼεのエキソヌクレアーゼ活性ドメインにおけるアミノ酸残基の変異との関連が知られている。一方、高頻度変異型の癌とＤＮＡポリメラーゼεのＤＮＡ合成活性ドメインにおけるアミノ酸残基の変異との関連はこれまでに知られていなかった。本発明は、この新規な知見に基づくものである。
　本発明は、１つ以上のアミノ酸突然変異を含む変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεであって、当該アミノ酸突然変異が、ヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のロイシン残基が他のアミノ酸残基になる変異を含む、変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεを提供する。
　本発明に係る変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεは、高頻度変異型の癌で見出されることから、例えば、高頻度変異型の癌を判別する新たなバイオマーカーとして有用である。
　上記他のアミノ酸残基は、ロイシン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、セリン残基であることが好ましい。セリン残基であることにより、高頻度変異型の癌を判別する際の判別精度がより高くなる。
　本発明は、本発明に係る変異型をコードする核酸にも関する。本発明はまた、本発明に係る変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεをコードする核酸に相補的な核酸にも関する。これらの核酸又は相補的な核酸は、上記他のアミノ酸残基をコードする塩基配列（コドン配列）又はその相補配列を含む、断片であってもよい。当該断片も核酸であり、その塩基長は、例えば、２０～３００塩基長であってよい。
　本発明はまた、癌を患っているヒト患者において、癌が高頻度変異型の癌であるか判別する方法であって、上記ヒト患者から採取された癌細胞由来の成分を含むサンプルを用いて、上記癌細胞に由来するヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のアミノ酸残基の変異の有無を決定する工程を有し、当該アミノ酸残基が変異していることが、上記癌が高頻度変異型の癌であることを示す、方法を提供する。
　本発明に係る方法によれば、癌を患っているヒト患者において、癌が高頻度変異型の癌であるか否かを判別することができる。
　本発明に係る方法は、上記アミノ酸残基の変異の有無の決定が、ヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のアミノ酸残基をコードする塩基配列の変異の検出を含んでいてもよい。
　本発明に係る方法において、上記アミノ酸残基の変異がＬ９５２Ｓであることが好ましい。これにより、判別精度がより高くなる。
　本発明に係る方法において、上記癌は、大腸癌又は直腸癌であってもよい。癌が大腸癌又は直腸癌であると、癌が高頻度変異型の癌であるか否かをより高い確実性で判別することができる。
　本発明はまた、高頻度変異型の癌への罹患を診断する方法であって、ヒト検体から採取された細胞由来の成分を含むサンプルを用いて、細胞に由来するヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のアミノ酸残基の変異を検出する工程を有し、当該アミノ酸残基が変異している場合、ヒト検体が高頻度変異型の癌に罹患していると診断する、方法を提供する。
　本発明によれば、高頻度変異型の癌を判別できる新たなバイオマーカーが提供される。
実施例の結果を示すグラフである。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
〔高頻度変異型の癌〕
　高頻度変異型（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ又はｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｅｄ）の癌は、通常の癌と比べて、癌特異的変異の変異率が高い癌である。ここで、変異率とは、１０６塩基（以下、「Ｍｂ」ともいう）当たりのアミノ酸残基の変化を伴う変異の数である。高頻度変異型の癌は、通常の癌との変異率の比較によって判断される。変異率は調べる遺伝子の数や種類によって異なり、また、癌の種類によっても異なるが、変異率が相対的に通常の癌より高い場合、高頻度変異型の癌であると判断される。
〔ヒトＤＮＡポリメラーゼε〕
　ヒトＤＮＡポリメラーゼεは、ＤＮＡ複製酵素であり、野生型ＤＮＡポリメラーゼεは配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する。ヒトＤＮＡポリメラーゼεのＤＮＡ合成活性ドメインは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第６２４番目～第１１４５番目に該当し、エキソヌクレアーゼ活性ドメインは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第８７番目～第４２６番目に該当する。
　本明細書において、アミノ酸残基の変異とは、タンパク質のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸残基が、対応する野生型のアミノ酸配列中のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基になっていることを意味する。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸残基の置換、欠失又は挿入のいずれであってもよい。例えば、配列番号１で示される野生型ヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のアミノ酸残基はロイシンであるが、これがロイシン以外のアミノ酸残基になっている場合に変異があるとする。
　本実施形態に係る変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεは、１つ以上のアミノ酸残基の変異を含み、当該アミノ酸残基の変異は、少なくともヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のロイシン残基が他のアミノ酸残基になる変異を含む。
　ここで、他のアミノ酸残基は、ロイシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限されるものではないが、例えば、セリン残基、メチオニン残基、バリン残基、トリプトファン残基、又はフェニルアラニン残基であってよい。
　本実施形態に係る変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεは、少なくともヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のロイシン残基が他のアミノ酸残基に置換された変異を含むことが好ましく、少なくともヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のロイシン残基がセリン残基に置換された変異（Ｌ９５２Ｓ）を含むことがより好ましい。これにより、高頻度変異型の癌を判別するためのバイオマーカーとして用いた場合の判別精度がより高くなる。
　本実施形態に係る変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεは、Ｌ９５２Ｓの変異のみを含むものであってもよく（配列番号２）、Ｌ９５２Ｓの変異の他にさらに１つ以上のアミノ酸残基の変異を含んでいてもよい。
　Ｌ９５２Ｓの変異の他に含むことができるアミノ酸残基の変異としては、例えば、Ｄ２７５Ｖ、Ｐ２８６Ｒ、Ｓ２９７Ｆ、Ｈ３４２Ｒ、Ｆ３６７Ｓ、Ｖ４１１Ｌ、Ｌ４２４Ｖ、Ａ４２６Ｖ、Ｓ４５９Ｆなどの変異が挙げられる。
　本実施形態に係る変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεは、それを有するヒト癌細胞から抽出及び精製して得てもよく、また当該変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεをコードする核酸を化学合成等により得た後、適切なタンパク質発現系で発現させて得てもよい。
〔核酸〕
　一実施形態に係る核酸は、上述の変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεをコードする核酸（以下、「核酸１」ともいう。）である。核酸１は、イントロンを含むゲノムＤＮＡ配列を有する核酸であってもよく、ｍＲＮＡ配列を有する核酸であってもよい。なお、野生型ヒトＤＮＡポリメラーゼε遺伝子のゲノムＤＮＡ配列はＮＣＢＩアクセッション番号ＮＧ＿０３３８４０である。また、野生型ヒトＤＮＡポリメラーゼεのｍＲＮＡ配列はＮＣＢＩアクセッション番号Ｌ０９５６１である。
　他の実施形態に係る核酸は、核酸１に相補的な塩基配列を有する核酸（以下、「核酸２」ともいう。）である。
　一実施形態において、核酸は、核酸１の断片であってよく、当該断片は、上述の変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目の他のアミノ酸残基をコードする塩基配列（コドン配列）を含む（以下、この断片に係る核酸を「核酸３」ともいう。）。
　更なる実施形態において、核酸は、核酸２の断片であってよく、当該断片は、上述の変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目の他のアミノ酸残基をコードする塩基配列（コドン配列）の相補配列を含む（以下、この断片に係る核酸を「核酸４」ともいう。）。
　核酸１～核酸４は、高頻度変異型の癌を判別するためのバイオマーカーとして利用できる。すなわち、例えば、核酸１～核酸４における塩基配列の変異を検出することで、変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸残基の変異を検出することができる。核酸１～核酸４は、ゲノムＤＮＡ配列からイントロンが除去されたｃＤＮＡ型の塩基配列を有するものであってもよい。
　本明細書における「塩基配列の変異」は、該塩基配列がコードするアミノ酸残基が、対応する野生型の塩基配列がコードするアミノ酸残基とは異なるように、塩基配列中の塩基の少なくとも一部が他の塩基に置換されていることを意味する（「ミスセンス変異」ともいう。）。
　また、核酸１～核酸４は、例えば、適切なクローニングベクターにクローニングすることで、塩基配列の変異を検出するためのプローブとして利用することもできる。
　核酸３及び核酸４（断片）の塩基長に特に制限はないが、例えば、次世代シークエンサーにおける塩基配列の変異の検出がより効率よく行えるという観点から、核酸３及び核酸４の塩基長は、２０～３００塩基長であることが好ましく、５０～２５０塩基長であることがより好ましく、７０～２００塩基長であることが更に好ましく、１００～２００塩基長であることが更により好ましい。
　また、核酸３及び核酸４（断片）は、例えば、次世代シークエンサーにおける塩基配列の変異の検出がより効率よく行えるという観点から、上述した「他のアミノ酸残基」を含む連続した少なくとも７つのアミノ酸残基をコードする核酸であることが好ましく、「他のアミノ酸残基」を含む連続した少なくとも１０のアミノ酸残基をコードする核酸であることがより好ましい。
〔癌が高頻度変異型の癌であるか判別する方法〕
　本実施形態に係る判別方法は、癌を患っているヒト患者において、癌が高頻度変異型の癌であるか判別する方法であって、ヒト患者から採取された癌細胞由来の成分を含むサンプルを用いて、癌細胞に由来するヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のアミノ酸残基の変異の有無を決定する工程を有し、当該アミノ酸残基が変異していることが、癌が高頻度変異型の癌であることを示す、方法である。
　癌細胞由来の成分を含むサンプルとは、癌細胞そのもの、癌細胞の核、癌細胞の細胞質、癌細胞に由来するタンパク質、癌細胞に由来するペプチド、及び、癌細胞に由来する核酸のうち一つ以上を含むサンプルのことをいう。癌細胞由来の成分を含むサンプルとしては、例えば、癌切除組織検体、生検検体、腹水浸潤癌細胞、血液循環癌細胞、血清、血漿、血液、糞便、尿、痰、髄液、胸腔内液、乳頭吸引液、リンパ液、細胞培養液、並びに、患者から採取されたその他の組織及び液体が挙げられる。高頻度変異型の癌を、より高い確実性で判別する観点から、癌細胞由来の成分を含むサンプルは、癌切除組織検体、生検検体、腹水浸潤癌細胞、血液循環癌細胞、血清、又は血漿であることが好ましく、癌切除組織検体又は生検検体であることがより好ましい。また、癌細胞由来の成分を含むサンプルが癌切除組織検体又は生検検体である場合、これらの検体は、凍結、アルコール固定、ホルマリン固定、パラフィン包埋、又は、これらの処理を組み合わせた処理がされていてもよい。
　ヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のアミノ酸残基の変異は、ロイシン残基が、セリン残基、メチオニン残基、バリン残基、トリプトファン残基、又はフェニルアラニン残基になったものであってよい。アミノ酸残基の変異がこれらの変異である場合、高頻度変異型の癌より高い確実性で判別することができる。中でも、変異が、ロイシン残基からセリン残基に置換された変異（Ｌ９５２Ｓ）である場合、高頻度変異型の癌をより一層高い確実性で判別することができる。
　アミノ酸残基の変異の検出は、公知の方法により行うことができる。変異の検出は、例えば、ヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のアミノ酸残基をコードする塩基配列の変異の検出を含んでいてもよい。
　塩基配列の変異の検出は、公知の方法により行うことができる。塩基配列の変異の検出は、例えば、ＤＮＡシーケンシング（例えば、次世代シークエンサーによるシークエンシング）、ポリメラーゼ連鎖反応、対立遺伝子特異的増幅、対立遺伝子特異的プローブでのハイブリダイゼーション、ミスマッチ切断解析、単鎖高次構造多型、変性勾配ゲル電気泳動、又は、温度勾配ゲル電気泳動により行ってもよい。これらの技術は、単独で使用してもよく、複数の技術を組み合わせて使用してもよい。
　癌細胞のヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のアミノ酸残基に変異がある場合、当該癌は、高頻度変異型の癌であると判別することができる。
　本実施形態に係る発明を利用可能な癌としては、例えば、大腸癌、直腸癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、甲状腺癌、子宮癌、腎臓癌、すい臓がん、舌癌、前立腺癌、肺癌、皮膚癌、卵巣癌、胆嚢癌、頭頸部癌、精巣腫瘍、副腎癌、口腔癌、骨軟部腫瘍、脳腫瘍、悪性黒色腫、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、白血病、悪性リンパ腫、及び、多発性骨髄腫が挙げられる。これらの中でも、癌が大腸癌又は直腸癌である場合、高頻度変異型の癌をより高い確実性で判別することができる。
〔高頻度変異型の癌への罹患を診断する方法〕
　本実施形態に係る診断方法は、高頻度変異型の癌への罹患を診断する方法であって、ヒト検体から採取された細胞由来の成分を含むサンプルを用いて、細胞に由来するヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のアミノ酸残基の変異を検出する工程を有し、当該アミノ酸残基が変異している場合、ヒト検体が高頻度変異型の癌に罹患していると診断する、方法である。
　細胞由来の成分を含むサンプルとは、細胞そのもの、細胞の核、細胞の細胞質、細胞に由来するタンパク質、細胞に由来するペプチド、及び、細胞に由来する核酸のうち、一つ以上を含むサンプルのことをいう。細胞由来の成分を含むサンプルとしては、例えば、生検検体、血清、血漿、血液、糞便、尿、痰、髄液、胸腔内液、乳頭吸引液、リンパ液、細胞培養液、並びに、ヒトから採取されたその他の組織及び液体が挙げられる。高頻度変異型の癌を、より高い確実性で判別する観点から、細胞由来の成分を含むサンプルは、生検検体、血清、又は血漿であってよい。細胞由来の成分を含むサンプルが生検検体である場合、生検検体は、凍結、アルコール固定、ホルマリン固定、パラフィン包埋、又は、これらの処理を組み合わせた処理がされていてもよい。
　上記診断方法において、アミノ酸残基の変異及びその検出、並びに、当該診断方法を利用可能な癌等については、上記で述べたものと同様であってよい。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により限定されるものではない。
（サンプル調製）
　大腸癌患者２０１症例の癌切除検体ホルマリン固定パラフィン包埋検体を作製し、これを薄切して厚さ２０μｍの切片を２つ作製した。作製した２つの切片をスライドガラスに貼付したものをＤＮＡ抽出用のサンプルとして用いた。
　ＤＮＡ抽出用のサンプルとは別に、厚さ４μｍの切片を作製し、作製した切片をスライドガラスに貼付したものを顕微鏡観察用のサンプルとした。
（ＤＮＡ抽出）
　顕微鏡観察用のサンプルをヘマトキシリンエオジンで染色した。染色後のサンプルを、顕微鏡で観察して切片中の癌細胞を多く含む部位を特定した。ＤＮＡ抽出用のサンプルから、顕微鏡観察用のサンプルで特定した部位を剃刀で削り取り、削り取った部位からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの抽出は、ＢｉＯｓｔｉｃ（登録商標）　ＦＦＰＥ　Ｔｉｓｓｕｅ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（商品名）を用いて行った。
（配列分析）
　大腸癌患者２０１症例の癌切除検体ホルマリン固定パラフィン包埋検体から抽出したＤＮＡを用いて４１５遺伝子の癌特異的変異（アミノ酸残基の変異を伴う変異）を次世代シーケンサー（ＭｉＳｅｑシーケンサー，イルミナ社）により分析した。図１に分析結果を示した。
　図１は、各検体毎に変異率（１Ｍｂ当たりの変異数）をプロットしたグラフである。図１の横軸は、変異率の高い順に左から右に並ぶように検体をプロットしている。図１に示されるように、１７検体で多くの変異が検出され、これらの検体は高頻度変異型であると考えられた。１７検体のうち、４検体（図１中、Ａ～Ｄで示した検体）の変異率は他より顕著に高かった。そして、図１中、Ａ，Ｂ及びＤで示した検体からはミスマッチ修復遺伝子の変異は存在していなかった。この原因を探るため、これらの４検体については、さらにヒトＤＮＡポリメラーゼε遺伝子の配列を分析した。
　変異率が顕著に高かった４検体のヒトＤＮＡポリメラーゼε遺伝子の配列を分析した結果、１検体（図１中、Ｄで示した検体）からは、これまでに高頻度変異型の癌を引き起こす変異であることが知られていないＬ９５２Ｓが検出された。なお、図１中、Ａ及びＢで示した検体からは、それぞれ高頻度変異型の癌を引き起こす変異としてすでに知られているＶ４１１Ｌ及びＰ２８６Ｒが検出された。また、図１中、Ｃで示した検体（ミスマッチ修復遺伝子の変異あり）は、ヒトＤＮＡポリメラーゼε遺伝子の変異はなかった。

Claims (12)

  1. 　１つ以上のアミノ酸残基の変異を含む変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεであって、
    　前記アミノ酸残基の変異が、ヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のロイシン残基が他のアミノ酸残基になる変異を含む、変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼε。
  2. 　前記他のアミノ酸残基が、セリン残基である、請求項１に記載の変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼε。
  3. 　請求項１又は２に記載の変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεをコードする核酸。
  4. 　請求項１又は２に記載の変異型ヒトＤＮＡポリメラーゼεをコードする核酸に相補的な核酸。
  5. 　前記他のアミノ酸残基をコードする塩基配列を含む、請求項３に記載の核酸の断片。
  6. 　前記他のアミノ酸残基をコードする塩基配列の相補配列を含む、請求項４に記載の核酸の断片。
  7. 　２０～３００塩基長の核酸である、請求項５又は６に記載の断片。
  8. 　癌を患っているヒト患者において、癌が高頻度変異型の癌であるか判別する方法であって、
    　前記ヒト患者から採取された癌細胞由来の成分を含むサンプルを用いて、前記癌細胞に由来するヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のアミノ酸残基の変異の有無を決定する工程を有し、
    　前記アミノ酸残基が変異していることが、前記癌が高頻度変異型の癌であることを示す、方法。
  9. 　前記アミノ酸残基の変異の有無の決定が、ヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のアミノ酸残基をコードする塩基配列の変異の検出を含む、請求項８に記載の方法。
  10. 　前記アミノ酸残基の変異がＬ９５２Ｓである、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 　前記癌が、大腸癌又は直腸癌である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　高頻度変異型の癌への罹患を診断する方法であって、
    　ヒト検体から採取された細胞由来の成分を含むサンプルを用いて、細胞に由来するヒトＤＮＡポリメラーゼεのアミノ酸配列の第９５２番目のアミノ酸残基の変異を検出する工程を有し、前記アミノ酸残基が変異している場合、ヒト検体が高頻度変異型の癌に罹患していると診断する、方法。
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