CN117535352B - 一种筛选具有pole抗原特异性t细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于免疫细胞技术领域，涉及一种筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法。所述的筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法，包括：将POLE突变型抗原肽与HLA‑1、B2M复合物形成POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体；TCR mRNA脂质体融合转染T细胞获得POLE突变抗原特异性T细胞；使用POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体分选POLE突变抗原特异性T细胞。本发明还提供了具有POLE抗原特异性T细胞在制备杀伤表达POLE抗原细胞的药物中的应用。所述的杀伤表达POLE抗原细胞的药物对表达POLE抗原的细胞具有杀伤作用。PD‑L1与所述的杀伤表达POLE抗原细胞的药物联用，具有特异性杀伤肿瘤细胞的作用。

Description

一种筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法
技术领域
本发明属于免疫细胞技术领域，涉及一种筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法。
背景技术
近年来，随着肿瘤微环境研究的不断深入。免疫治疗，特别是免疫检查点抑制剂已被应用于多种恶性肿瘤，而子宫内膜癌中的免疫治疗研究起步较晚，且大多数临床研究将目光集中于微卫星不稳定型内膜癌。
作为分子分型中另一类肿瘤突变负荷高、免疫原性好的肿瘤亚型，POLE突变型内膜癌患者却未能在免疫检查点阻滞剂单药临床试验中表现出明显的获益。POLE基因编码人类DNA聚合酶最大的催化亚基，其突变可造成基因组突变数量异常累积，因此可产生大量新生抗原。测序技术的发展可识别出候选肿瘤新抗原的多肽，因此合成个性化多肽，建立特异性T细胞应用于肿瘤的精准免疫治疗方式成为可能。POLE突变型内膜癌可产生大量新生抗原，提示可能对此种免疫治疗有较好的疗效。
TCR测序提示，这些POLE突变抗原特异性T细胞均呈现寡克隆TCR重排特性，可能是针对POLE突变抗原进行特异性识别的，因此如何筛选具有POLE抗原特异性T细胞显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法，对POLE突变抗原进行特异性识别。
为实现上述目的，本发明提供了一种筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法，所述的方法包括：
合成POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体：将POLE突变型抗原肽与HLA-1、B2M复合物形成POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体；
TCR mRNA脂质体融合转染T细胞获得POLE突变抗原特异性T细胞；
使用POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体分选POLE突变抗原特异性T细胞。
优选地，使用生物素化修饰结合荧光修饰的去亲和素，修饰POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体。
优选地，通过流式细胞仪筛选出POLE抗原特异性T细胞。
优选地，所述的合成POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体包括：
步骤S1：合成PLOE的突变表位多肽，多肽纯度不低于90％；
步骤S2：大肠杆菌表达的重组蛋白HLA-A*02:01和β2microglobulin(β2m)的重组表达，加入步骤S1中合成的PLOE的突变表位多肽进行折叠，形成MHC class I/多肽复合物单体；
步骤S3：经超滤浓缩后，通过分子排阻色谱法获得折叠后复合物单聚体，层析后与A280吸收峰所在溶液管中液体合并；
步骤S4：将复合单体中MHC-I重链的C端上的赖氨酸残基生物素化，将生物素化复合单聚体纯化获得单一吸收峰纯品，生物素化分子排阻色谱后与A280吸收峰所在溶液管中的溶液合并；
步骤S5：纯化后的生物素化单体与标记了荧光色素的链霉亲和素结合，形成四聚体。
优选地，所述的TCR mRNA脂质体融合转染T细胞获得POLE突变抗原特异性T细胞包括：
步骤S6：取含有PLOE的突变表位多肽的HLA-A1101突变阳性患者的外周血，制备PBMC；
步骤S7：使用淋巴细胞分离液与步骤S6制备的PBMC混合，然后在无菌条件转移到离心管中；
步骤S8：在步骤S7所获得的含有PBMC和淋巴细胞分离液的离心管中加入EDTA抗凝全血，在血液和淋巴细胞分离液(LSM)中形成一个明显的分层；
步骤S9：离心后沉淀红细胞和多形核白细胞，同时在LSM上形成一层单核淋巴细胞，吸出淋巴细胞层上方2-3mm的血浆，吸取淋巴细胞层以及它下面一半的LSM层，并转移到另外一个离心管；加入等体积的平衡盐缓冲液至离心管内的淋巴细胞层中，离心；
步骤S10：清洗细胞，使用培养基重悬T细胞后接种于细胞培养容器，培养过夜后将悬浮细胞分离至单独培养皿继续培养；向贴壁细胞中加入IL4、PLOE的突变表位多肽、GM-CSF后继续培养，后续每隔1日加入PLOE的突变表位多肽，添加3-10次；
步骤S11：3天后，加入步骤10中重悬培养的T细胞，培养至少20天，收集所有细胞，离心后重悬为浓度为(0.5-3)x106个细胞/ml，在细胞悬液中加入四聚体，避光孵育。
优选地，所述的使用POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体分选POLE突变抗原特异性T细胞包括：在待分选细胞样品中加入CD8抗体，孵育、离心、去掉上清液；然后将细胞重悬，通过流式分析平台检测待分选细胞样品，出现POLE四聚体和CD8+双阳细胞后，使用BDFACSMelodyTM流式细胞分选仪分选双阳细胞(参见图6)。
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。人类的MHC被称为HLA(human leukocyteantigen，HLA)，即人白细胞抗原；小鼠MHC则被称为H-2。HLA位于人的6号染色体短臂上，H-2位于小鼠的17号染色体上。
MHC可以分为经典MHC与非经典MHC两类，经典MHC包括MHC I、MHC II、MHC III基因，分别编码MHC I分子、MHC II分子、MHC III分子。其中，MHC class I(MHC I)：位于一般细胞表面上，可以提供一般细胞内的一些状况，比如该细胞遭受病毒感染，则将病毒外膜碎片之氨基酸链(peptide)透过MHC提示在细胞外侧，可以供杀手CD8+T细胞等辨识，以进行扑杀。
外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。
LSM(lymphocyte separation medium)是人淋巴细胞分离液,可以从人外周血、脐带血、小鼠全血等分离单个核细胞(淋巴细胞)。
T细胞抗原受体(TCR)是可以赋予个体几乎是无限的抗原识别和应答能力的胚系基因，能够保证个体在多变环境中能和外来抗原(病原体)发生有效的免疫应答。
本发明还提供了一种具有POLE抗原特异性T细胞，所述的具有POLE抗原特异性T细胞通过上述方法制备获得。
优选地，所述的POLE突变型抗原肽的序列选自以下中的一个或者多个：
YLPVGSHNL(SEQ ID NO 1)；
SYLPVSHNL(SEQ ID NO 2)；或者，
LAFDIETTK(SEQ ID NO 3)。
本发明提供了具有POLE抗原特异性T细胞在制备杀伤表达POLE抗原细胞的药物中的应用。
优选地，所述的杀伤表达POLE抗原细胞的药物对表达POLE抗原的细胞具有杀伤作用。
优选地，具有POLE抗原特异性T细胞可以与其他具有细胞杀伤作用的物质联用，构成药物组合物。例如，PD-L1与所述的杀伤表达POLE抗原细胞的药物联用，作为抑制表达POLE抗原的细胞的药物组合物。在本发明的一个优选例中，该药物组合物具有特异性杀伤肿瘤细胞的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的每一幅附图针对本申请的部分实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1展示POLE突变在EC中具有免疫原性。
其中，A，C,D为野生型和突变型TMB评分，CD3；CD8；B为野生型和突变型淋巴细胞浸润组织涂片；E为PD-L1在野生型和突变型表达分布的组织涂片；F为野生型和突变型PDL1评分。分析发现POLE突变阳性患者的TMB评分高于野生型患者,而PDL1表达分布未明显高于野生型患者，CD8+T淋巴细胞浸润含量未明显高于野生型患者，但是Treg细胞含量明显低于野生型患者。Treg细胞是T细胞中的免疫抑制型细胞，该含量在POLE突变中较低预示POLE突变具有的免疫原性可以激活T细胞杀伤效应。因此，POLE突变在EC中具有免疫原性。
图2展示EC中存在新生抗原。
其中，A为收集样本的CD8+记忆T细胞Charoentong评分；B为CD8平均评分；C为P286和V411L突变位点的变异分析；D为突变位点的新生抗原肽及HLA分子预测，A/B通过两种评分，证明该位点淋巴细胞浸润性高，C/D进一步表明P286R位点存在新生抗原肽的可能。POLE高频突变确认EC中存在新生抗原。
图3展示针对POLEP286R抗原的特异性T细胞。
其中，A为pole突变患者的突变位点展示；B为四聚体合成及特异性T细胞分选的流程示意图；C为特异性T细胞的分选结果。本图表明，获得了针对POLEP286R抗原的特异性T细胞。
图4是筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法示意图。
图5是T细胞POLE P286R对类器官杀伤性能比较。
Pole突变特异性T细胞与突变的类器官及无突变的类器官都具有杀伤作用：突变的T细胞与是否突变的类器官共培养时均在显微镜下观察到细胞膜不连续完整，核质外露的情况。加入PDL1后杀伤效果增强：在相同的处理时间下，未加入PDL1的类器官细胞(肿瘤细胞)仍可见完整细胞膜的肿瘤细胞，加入PDL1后可见细胞膜破裂细胞增多，且核质外露及细胞分解程度较前增高。
非特异性T细胞对类器官都无杀伤作用：非特异性T细胞与类器官共培养，类器官细胞周围淋巴细胞富集，但类器官细胞膜完整，无核质外露，考虑无杀伤作用。
图6是流式细胞分选特异性T细胞的实验结果图。
具体实施方式
本发明合成POLE突变/野生型抗原肽，体外合成HLA-1和B2M复合物，使用生物素化修饰结合荧光修饰的去亲和素，合成POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体，TCR测序获得TCR主克隆，主克隆TCR mRNA脂质体融合转染T细胞，获得POLE突变抗原特异性T细胞，最后通过POLE突变抗原MHC四聚体流式分选T细胞，筛选出POLE抗原特异性T细胞。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例提供了筛选具有POLE抗原特异性T细胞的一种优选方法，包括如下步骤：
步骤S1：合成PLOE P286R突变的表位多肽(金斯瑞公司合成)，多肽纯度为95％。
步骤S2：大肠杆菌表达的重组蛋白HLA-A*02:01和β2microglobulin(β2m)中重组表达，加入S1中合成突变肽段进行折叠，形成MHC class I/多肽复合物单体。
步骤S3：经超滤浓缩后，通过分子排阻色谱法，使用avant层析系统(Cytiva公司)获得折叠后复合物单聚体，使用HiLoad Superdex 75pg(Cytiva公司)层析后合并A280吸收峰所在溶液管。
步骤S4：利用BirA酶将复合单体中MHC class I heavy chain的C端上的赖氨酸残基生物素化，将生物素化复合单聚体再次使用avant层析系统(Cytiva公司)经过HiLoad Superdex 75pg(Cytiva公司)纯化获得单一吸收峰纯品，生物素化分子排阻色谱后合并A280吸收峰所在溶液管。
步骤S5：纯化后的生物素化单体与标记了PE荧光色素的链霉亲和素(Bioleng公司)结合，形成四聚体，从而完成MHC Tetramer的制备。
步骤S6：取4ml POLE P286R HLA-A1101突变阳性患者的外周血，制备PBMC。
步骤S7：轻轻颠倒瓶子使淋巴细胞分离液LSM(翌圣生物公司)充分混合后在无菌条件转移3mL LSM到15mL离心管中。
步骤S8：用4mLPBS混合4Ml EDTA抗凝全血，小心将稀释血液加入含有3mL LSM(室温)的15mL离心管中，在血液和LSM中形成一个明显的分层。
步骤S9：室温下400×g离心15-30min，离心可以沉淀红细胞和多形核白细胞，同时可以在LSM上形成一层单核淋巴细胞，吸出淋巴细胞层上方2-3mm的血浆，吸取淋巴细胞层以及它下面一半的LSM层，并转移到另外一个离心管。加入等体积的平衡盐缓冲液至离心管内的淋巴细胞层中，室温400×g离心10min。
步骤S10：再用PBS缓冲液清洗细胞，最后20ml 10％FBS的RPMI1640培养基重悬细胞后接种于75cm2细胞培养瓶，37℃ 5％CO2培养箱中培养，过夜后，将悬浮细胞分离至单独培养皿继续培养。向贴壁细胞中加入IL42ng(Sigma)、POLE P286R突变肽10ng、GM-CSF 2ng(Sigma)后，继续培养1天，后续每隔1日加入10ng POLE P286R突变肽,共添加5次。
步骤S11：3天后，加入步骤10中悬浮培养的T细胞，培养至21天时，收集所有细胞，2400rpm室温离心20min，而后用无血清RPMI 1640重悬，浓度为1x106个细胞/ml，取400ul细胞悬液，在细胞悬液中加入四聚体2ug(16ul)，室温避光孵育30min(最长不超过4h)。
步骤S12：加入CD8抗体，4℃下孵育20分钟，后加入10X PBS100ul重悬细胞，室温400x g离心5分钟，3.小心地去掉上清液，将细胞置于200μL 0.1％BSA/1xPBS中再次重悬后，通过CytoFLEX流式分析平台检测抗原肽特异性T细胞数量，出现POLE四聚体和CD8+双阳细胞后，使用BD FACSMelodyTM流式细胞分选仪分选双阳细胞，分选后细胞加入5倍体积TRizol，-80℃保存。
实施例2
我们征得患者同意后收集了两名子宫内膜癌患者术后的子宫内膜组织，其中一名患者的肿瘤组织不具有POLE突变，作为对照组，另外一名患者则为具有实施例1列举的POLEP286R突变的患者，作为实验组。
进行类器官培养，免疫荧光检测报告证实类器官状态良好(图5)。我们将两组类器官分别与特异性T细胞(对POLEP286R突变患者的外周血T细胞进行扩增)和非特异性T细胞(无POLE突变的患者外周血T细胞)进行共培养，并加入PD-L1抑制剂观察肿瘤杀伤效应。
实验结果证实，T细胞POL EP286R对类器官POLE P286R和非突变类器官有杀伤作用，且加入PD-L1后，杀伤效果增强。非突变T细胞对类器官POLE P286R和非突变类器官都没有杀伤作用。实验结果充分证明了该位点POLE突变产生新生抗原肽的可能，并发现针对该抗原产生的T细胞具有特异性的杀伤肿瘤效应(图5)。这一发现将对POLEP286R突变的子宫内膜癌人群提供新的个体化治疗策略。
在本发明的描述中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个引用结构”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。需要说明的是，在本文中，诸如“第一”、“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。
以上所述的实施例仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可以不通过创造性劳动即能够联想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以本申请中权利要求的保护范围为准。

Claims (6)

1.一种筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述的方法包括：
合成POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体：将POLE突变型抗原肽与HLA-1、B2M复合物形成POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体；
获得POLE突变抗原特异性T细胞；和
使用POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体分选POLE突变抗原特异性T细胞；
所述的POLE突变抗原肽的序列为LAFDIETTK；
所述的获得POLE突变抗原特异性T细胞包括：
取含有POLE突变抗原肽的HLA-A1101突变阳性患者的外周血，制备PBMC；
轻轻颠倒瓶子使淋巴细胞分离液LSM充分混合后在无菌条件转移3mL LSM到15mL离心管中；
用4mLPBS混合4Ml EDTA抗凝全血，将稀释血液加入含有3mL LSM的15mL离心管中，在血液和LSM中形成一个明显的分层；
室温下400×g离心15-30min，离心沉淀红细胞和多形核白细胞，同时在LSM上形成一层单核淋巴细胞，吸出淋巴细胞层上方2-3mm的血浆，吸取淋巴细胞层以及它下面一半的LSM层，并转移到另外一个离心管；加入等体积的平衡盐缓冲液至离心管内的淋巴细胞层中，室温400×g离心10min；
清洗细胞，使用培养基重悬T细胞后接种于细胞培养容器，培养过夜后将悬浮细胞分离至单独培养皿继续培养；向贴壁细胞中加入IL4、POLE突变抗原肽、GM-CSF后继续培养，后续每隔1日加入POLE突变抗原肽，添加3-10次；
3天后，加入步骤10中重悬培养的T细胞，培养至少20天，收集所有细胞，离心后重悬为浓度为(0.5-3)x106个细胞/ml，在细胞悬液中加入四聚体，避光孵育。
2.根据权利要求1所述的筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，通过流式细胞仪筛选出POLE抗原特异性T细胞。
3.根据权利要求1所述的筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述的合成POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体包括：
步骤S1：合成POLE突变抗原肽，多肽纯度不低于90％；
步骤S2：大肠杆菌表达的重组蛋白HLA-A*02:01和β2microglobulin的重组表达，加入步骤S1中合成的POLE突变抗原肽进行折叠，形成MHC class I/多肽复合物单体；
步骤S3：经超滤浓缩后，通过分子排阻色谱法获得折叠后复合物单聚体，层析后与A280吸收峰所在溶液管中液体合并；
步骤S4：将复合单体中MHC-I重链的C端上的赖氨酸残基生物素化，将生物素化复合单聚体纯化获得单一吸收峰纯品，生物素化分子排阻色谱后与A280吸收峰所在溶液管中的溶液合并；
步骤S5：纯化后的生物素化单体与标记了荧光色素的链霉亲和素结合，形成四聚体。
4.根据权利要求1所述的筛选具有POLE抗原特异性T细胞的方法，其特征在于，所述的使用POLE突变抗原肽MHC复合物四聚体分选POLE突变抗原特异性T细胞包括：在待分选细胞样品中加入CD8抗体，孵育、离心、去掉上清液；然后将细胞重悬，通过流式分析平台检测待分选细胞样品，出现POLE四聚体和CD8+双阳细胞后，使用BD FACSMelodyTM流式细胞分选仪分选双阳细胞。
5.一种具有POLE抗原特异性T细胞，其特征在于，所述的具有POLE抗原特异性T细胞通过权利要求1-4中任意一种方法制备获得。
6.权利要求5所述的具有POLE抗原特异性T细胞的应用，其特征在于，具有POLE抗原特异性T细胞在制备治疗POLE突变型子宫内膜癌的药物中的应用。
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