CN113234129B - Hla-e限制性htnv结构蛋白特异性cd8+t细胞表位肽及其聚合物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了HLA‑E限制性HTNV结构蛋白特异性CD8+T细胞表位肽及其聚合物和应用,所述的CD8+T细胞表位肽,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1~4所示。本发明提供的HTNV‑NP或‑Gn/Gc特异性的CD8+T细胞表位肽,是HLA‑E*0103分子限制性表位多肽,可诱导CD8+T细胞产生强烈的细胞免疫应答,分泌IFN‑γ,且分泌IFN‑γ的频率可用于指示HFRS患者病情严重程度,即分泌IFN‑γ的频率越高,HFRS疾病病情越轻。因此,可应用于表位肽疫苗的制备,或应用于诱导产生CD8+T细胞表位肽特异性的细胞毒性T细胞(CTL),或应用于制备HLA‑E*0103/表位肽‑复合物四聚体,在HFRS特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于本发明属于汉滩病毒的防治技术领域,涉及HLA-E限制性HTNV 结构蛋白特异性CD8+T细胞表位肽及其聚合物和应用。
背景技术
汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)是布尼亚病毒目汉坦病毒科正汉坦病毒属(Hantavirus,HTV)的原型,也是引起急性发热性疾病肾综合征出血热(hemorrhagic feverwith renal syndrome,HFRS)的主要病原体之一。HFRS以发热、出血、渗出、低血压休克及肾功能严重损害为主要特征,是目前世界上分布最广、发病人数最多且危害极大的一种自然疫源性疾病,已成为全球关注的公共卫生问题之一。HFRS的主要临床表现包括发热、全身中毒症状、毛细血管损害及急性肾功能损伤,典型病例可有发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期五期经过,严重者通常出现低血压休克并容易在此阶段死亡。HFRS目前尚无特异性病原学治疗药物,临床治疗主要针对各期的病理生理变化进行综合性和预防性治疗,一般在感染早期对症治疗效果好,在晚期发现时病死率很高。尽管有关HFRS多种临床症状的病理生理学研究已有一些报道,但目前HFRS的发病机制仍不完全清楚。
1976年李镐汪等首先分离出的HTNV 76-118株是HTNV的代表株。HTNV 为单股负链RNA有包膜病毒,基因组包括L、M和S三个片段,分别编码RNA 聚合酶、糖蛋白(glycoprotein,分为Gn和Gc)以及核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)。因此NP和Gn/Gc均为HTNV的结构蛋白。其中,HTNV-NP包含 429个氨基酸,具有较强的免疫原性,其一级结构高度保守且存在多个抗原位点,能够诱导机体的体液免疫和细胞免疫应答。HTNV糖蛋白前体蛋白在细胞的内质网内切割并加工成为Gn和Gc两个成熟蛋白。HTNV-Gn/Gc全长包含1135个氨基酸,位于HTNV的囊膜表面,可刺激机体产生特异性的中和抗体,同时还可诱导动物产生保护性细胞免疫应答,提示Gn/Gc上同样存在着T细胞抗原表位,可诱导T细胞免疫应答。
CD8+T细胞(细胞毒性T细胞,cytotoxic T lymphocyte,CTL)是机体抗病毒感染免疫应答的主要效应细胞,病毒特异性CTL应答在彻底清除病毒、建立免疫记忆等方面发挥着重要作用。在病毒感染过程中,CD8+T细胞可通过TCR识别已被抗原提呈细胞(antigenpresenting cell,APC)处理并结合到主要组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex,MHC)-Ⅰ类分子上并表达于宿主细胞表面的病毒抗原,长度多为8-10个氨基酸,通过分泌颗粒酶和穿孔素杀伤靶细胞,或通过死亡受体-配体相互作用(如Fas-FasL)诱导靶细胞程序性死亡,从而清除已被病毒感染的细胞,限制病毒的复制和扩散,在机体细胞免疫系统抵御病毒感染过程中发挥着至关重要的作用。以往诸多研究均已经证实经典HLA-Ⅰ类分子限制性HTNV特异性CTL应答的效应功能在HFRS疾病发病及预后中发挥着重要的作用。而由非经典HLA分子限制的CD8+T细胞应答在病毒感染性疾病的发病中可能不仅发挥着抗病毒免疫保护作用,还具有重要的免疫调节功能。
HLA-E是HLA-Ⅰ类非经典Ⅰb基因中的成员之一,也是目前研究较为清楚的非常保守的非经典HLA-Ⅰ类分子,小鼠Qa-1为人HLA-E的同源分子。HLA- E限制性CD8+T细胞已被发现具有双重免疫效应和调节作用,是维持机体免疫稳态的重要机制之一。HLA-E分子与经典HLA-Ⅰ类分子结构相似,由重链(α链) 和β2微球蛋白(β2microglobulin,β2m)组成,重链胞外区远膜端α1和α2结构域构成抗原结合槽。HLA-E分子在体内表达非常广泛,尤以静息的T细胞上表达最高,但由于缺乏适当的内源肽与之结合,致使HLA-E在细胞表面表达不稳定。HLA-E具有以下独特的特征:1)有限的多态性,目前已报道17个HLA-E等位基因编码两个功能性的HLA-E分子,主要呈现HLA-ER(E*0101)和HLA- EG(E*0103)二态性,二者仅在第107位氨基酸存在差异,即E*0101为精氨酸而 E*0103为甘氨酸。2)结合的肽段包括来自大多数经典HLA-Ⅰ类分子和HLA-G 先导序列中3~11位形成的9肽、自身成熟蛋白分子以及包括细菌、病毒在内的外源性肽段,并且结合肽段多数有赖于抗原处理相关转运蛋白(TAP)。3)HLA-E分子结合肽段氨基酸序列相对保守,提呈肽段大多为8~10个氨基酸基本序列高度保守的[V(M/T)APRT(V/L)(L/I/V)L]。4)HLA-E分子结合槽均参与9肽的结合,其中P2、P7和P9有很强的锚定作用。
目前发现HLA-E*0101和HLA-E*0103两种等位基因在中国汉族人群中频率相近,HLA-E*0103约占58.95%,而HLA-E*0101约占41.05%。已有研究表明, HLA-E*0103在正常细胞表面的表达水平高于HLA-E*0101,且两种等位基因提呈的表位肽常常相同或相似。HLA-E/肽复合物可结合细胞表面两类不同受体,一类是NK细胞上的主要受体CD94/NKG2家族,另一类是主要表达于CD8+T细胞上的αβTCR。HLA-E可结合提呈自身或病原体来源的肽段给抗原特异性CD8+T 细胞表面的αβTCR识别,介导CD8+T细胞分泌IFN-γ以及杀伤活性,在适应性免疫应答中发挥重要作用。HLA-E限制性CD8+T细胞在感染性疾病、肿瘤以及自身免疫性疾病的发病和进展中均发挥着重要作用。在多种病毒或细菌感染性疾病中均发现HLA-E可提呈病原体来源的肽段给CD8+TCR特异性识别,从而特异性活化适应性免疫应答,CD8+T细胞通过HLA-E参与抗感染免疫保护应答,影响病毒感染进程,诱导HLA-E限制性CD8+T细胞应答可作为病毒感染疾病治疗和新型疫苗制备的新靶点。
合成肽疫苗是近年来出现的新型疫苗研究方向,合成肽能够直接与MHC分子结合,而不需要APC的加工处理,它与天然的内源性肽在激活免疫系统方面具有相同的效果,因此合成肽疫苗广泛应用于抗病毒免疫治疗。目前已有多种基于多肽表位的合成肽疫苗进入临床研究阶段或已上市。建立在表位鉴定基础之上的CD8+T细胞表位肽疫苗,由于人工合成多肽不包含病原生物的无关成分,只诱导特异性CTL应答,因此安全、稳定、毒副作用少,且研制周期大大缩短。更重要的是,基于CD8+T细胞表位研发的多个表位组合,还可设计针对一种或多种病原体的多价表位肽疫苗。然而,目前HFRS疫苗均为灭活的全病毒疫苗,这些疫苗在接种后均可刺激机体产生中和抗体,从而预防HFRS的发生和流行,但是病毒灭活疫苗刺激机体产生的中和抗体滴度往往不高,诱导产生细胞免疫应答的作用相对较弱,需要进一步探索更为有效的新型疫苗。因此CD8+T细胞表位合成肽疫苗已成为防治HTNV感染研究的一个新策略,而对HTNV特异的CD8+T细胞表位进行鉴定即成为研究的关键。
迄今为止,对HTNV结构蛋白上CD8+T细胞表位的研究,大多局限于经典 HLA-Ⅰ类分子限制的HTNV特异性CD8+T细胞表位。有关HTNV结构蛋白上非经典HLA-E分子限制性T细胞表位的鉴定尚无研究报道。这种研究现状大大限制了人们利用多肽疫苗对疾病进行治疗及控制的研究,因此迫切需要研发能够覆盖广泛人群的可用于预防和治疗HTNV感染的安全性高且特异性强的表位肽疫苗,基于HLA-E有限多态性的特点,因此获得由HLA-E限制的HTNVCD8+T 细胞表位肽对于设计针对中国人群更为特异有效的多肽疫苗具有更高的参考价值。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种由HLA-E*0103 限制的HTNV结构蛋白特异性的CD8+T细胞表位肽及其应用,所提供的表位肽可诱导CD8+T细胞产生强烈的细胞免疫应答,分泌高水平IFN-γ,可应用于HTNV 多肽疫苗的制备。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案予以实现:
本发明公开了一类HLA-E*0103限制性HTNV结构蛋白特异性CD8+T细胞表位肽,所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1~4中任意所示。
优选地,如SEQ ID NO:1~4中所示的任意一个表位肽与HLA-E*0103分子结合并递呈后,能够诱导CD8+T细胞产生细胞免疫应答。
本发明还公开了上述的HLA-E*0103限制性HTNV结构蛋白特异性CD8+T 细胞表位肽在制备抗汉滩病毒表位肽疫苗中的应用。
优选地,所述的表位肽疫苗为能够诱导产生CD8+T细胞表位肽特异性的细胞毒性T细胞的表位肽疫苗。
本发明还公开了一种HTNV结构蛋白特异性的HLA-E*0103/表位肽-复合物四聚体,由四个HLA-E*0103/表位肽-复合物单体与一个亲和素分子结合构成;
其中,所述的HLA-E*0103/表位肽-复合物单体是由表位肽与复合物单体结合而成;
所述表位肽为权利要求1所述的表位肽;
所述复合物单体是由C端连接有被活化的生物素分子的HLA-E*0103分子重链与β2微球蛋白在体外组装而成的结构。
优选地,所述亲和素分子上标记有荧光素PE。
优选地,该四聚体能够与相应TCR特异性结合。
本发明还公开了上述的HTNV结构蛋白特异性的HLA-E*0103/表位肽-复合物四聚体在制备检测HTNV-NP或Gn/Gc表位肽特异性CD8+T细胞的频率的药物试剂中的应用。
优选地,将荧光素标记的HLA-E*0103/表位肽-复合物四聚体与CD8+T细胞结合后,通过流式细胞仪检测,分辨HTNV-NP或Gn/Gc表位肽特异性CTL的频率。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供的由HLA-E限制的HTNV结构蛋白特异性的CD8+T细胞表位肽,通过表位预测软件、HLA-E*0103转染K562细胞系结合试验、ELISPOT实验筛选得到HTNV-NP或-Gn/Gc表位肽,并通过实验证实其具有高度特异性,可诱导特异性CTL产生强烈的细胞免疫应答,分泌IFN-γ,且分泌IFN-γ的频率高低可用于指示HFRS疾病病情的轻重程度,即分泌IFN-γ的频率越高,HFRS疾病病情越轻。由于HLA-E是在人群中普遍存在的等位基因位点,基于其非常有限的多态性,其编码的HLA-E分子能够覆盖广泛的中国汉族人群,其中HLA- E*0103表达频率略高于HLA-E*0101,且两种等位基因往往可提呈相同或相似的表位肽。因此,本发明获得的由HLA-E*0103限制的HTNV CD8+T细胞表位肽,应用于表位肽疫苗的制备,或应用于诱导产生表位肽特异性的CTL应答,或应用于制备HLA-E/表位肽-复合物四聚体,对于设计中国人群更为特异的有效的多肽疫苗具有更高的参考价值,在HFRS特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
进一步,本发明提供的由HLA-E*0103分子限制性CD8+T细胞表位多肽,能够应用于表位肽疫苗的制备,或应用于诱导产生表位肽特异性的细胞毒性T细胞 (CTL)。
本发明还公开了由HLA-E*0103分子限制性CD8+T细胞表位多肽应用于制备HLA-E*0103/表位肽-复合物四聚体,且制备的四聚体能够应用于制备检测 HTNV-NP或Gn/Gc表位肽特异性CD8+T细胞的频率的试剂中。
附图说明
图1为HLA-E*0103转染K562细胞结合试验筛选HLA-E*0103高亲和力 HTNV结构蛋白CD8+T细胞9肽表位结果图;
图2为ELISPOT检测HFRS患者外周血中HLA-E*0103高亲和力HTNV 9 肽特异性CD8+T细胞分泌IFN-γ的频率代表结果图(以P1975号HFRS病人检测结果为例);
图3为HLA-E*0103限制性HTNV表位特异性CD8+T细胞应答分泌IFN-γ频率在不同病情患者中的比较结果图;其中,(a)为ILLKALYML;(b)为 YLRQRQVA;(c)为SLVWPVLTL;(d)MMKSCLIAL;
图4为HLA-E*0103/多肽-四聚体染色检测HFRS患者外周血中HLA-E*0103 限制的HTNV表位特异性CTL频率结果代表图(以P1944号HFRS病人检测结果为例);
图5为不同病情HFRS患者外周血中HLA-E*0103限制性HTNV 9肽表位特异性CTL应答频率的比较结果图;其中,(a)为ILLKALYML;(b)为YLRQRQVA; (c)为SLVWPVLTL;(d)MMKSCLIAL。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是,本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象,而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换,以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外,术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含,例如,包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述:
本发明首先应用表位预测软件NetMHCpan version 4.1对HTNV 76-118株NP 和Gn/Gc序列中可能由HLA-E*0103限制的CD8+T细胞9肽表位进行预测,利用HLA-E*0103转染K562细胞系结合试验对预测得到的HTNV结构蛋白9肽进行筛选,获得HLA-E*0103高亲和力的HTNV-NP和Gn/Gc CD8+T细胞9肽表位。
进一步应用ELISPOT实验对HLA-E*0103限制性HTNV-NP和Gn/Gc 9肽表位进行鉴定。应用HLA-E/肽-四聚体染色技术在HFRS患者外周血中对HLA- E*0103限制性HTNV 9肽表位的特异性CTL频率进行检测,对HLA-E*0103限制性表位特异性CTL应答在HFRS中所发挥的作用进行分析。
下面对本发明作详细的说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
1、软件预测HLA-E*0103限制的HTNV-NP和Gn/Gc CD8+T细胞9肽表位
HTNV(病毒株76-118)的NP和Gn/Gc分别由429个和1135个氨基酸残基组成,可以由NCBI网站的蛋白质数据库获得其具体的NP氨基酸序列(Access No.M14626)和Gn/Gc氨基酸序列(Access No.P08668.1)。采用在线预测软件 NetMHCpan Server version 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)对 HTNV 76-118株NP和Gn/Gc HLA-E*0103限制的CD8+T细胞表位进行预测。
NetMHCpan 4.1Server软件基于人工神经网络模型(artificial neuralnetworks, ANNs)与已知序列的MHC分子的结合对肽段进行预测,根据自然筛选配体以及结合亲和力数据获得训练肽序列,该方法由85万多个定量结合亲和力(BA)和质谱洗脱配体(EL)肽组合而成,BA数据和EL数据分别由201个MHC分子和289个MHC分子构成,覆盖了包括人类(HLA-A、B、C、E)、小鼠(H-2) 和灵长类等的MHC分子。NetMHCpan 4.1Server具备两个特点:肽段成为自然配体的似然率和预测获得的亲和力。通过上传全长抗原蛋白序列可获得对任何自定义MHCⅠ类分子及任何长度的肽段进行预测。因此,选择种属/基因座为HLA- E,选择等位基因为HLA-E*0103,选择肽段长度为9个氨基酸,默认强结合阈值为前0.5%排名,弱结合阈值为前2%排名,分别输入HTNV(病毒株76-118)的 NP和Gn/Gc氨基酸序列,进行运算。
预测得到由中国汉族人群HLA等位基因HLA-E*0103限制的HTNV-NP和 Gn/Gc 9肽CD8+T细胞表位肽段。综合软件预测结果及HLA-E 9肽表位常用第 2、第9位锚定氨基酸规律,依次选择其中预测亲和力较高的20条9肽(表1)。同时结合文献报道选择阳性对照和阴性对照肽段(表2)。
表1 HLA-E*0103限制性HTNV-NP和Gn/Gc 9肽表位预测
注:SB:强结合肽(前0.5%排序);WB:弱结合肽(前2.0%排序)
表2 HLA-E限制性HTNV 9肽的阳性对照及阴性对照9肽
2、对预测得到的HTNV-NP和Gn/Gc 9肽进行合成
根据软件预测HLA-E*0103限制的HTNV 76-118株NP和Gn/Gc CD8+T细胞表位结果,委托南京杰肽生物技术公司合成HTNV-NP和Gn/Gc 9肽20条,对照9肽3条,每条9肽合成10mg,经RP-HPLC测定纯度均>90%。多肽干粉可于-80℃长期保存。使用前将所有9肽均先用20μL无菌二甲基亚砜(DMSO)溶解,待完全溶解后再加入无菌PBS配制成终浓度为1mM的溶液,分装后可-80℃冻存备用。
3、HLA-E*0103/K562稳转细胞结合试验筛选HLA-E*0103高亲和力HTNV- NP和Gn/Gc CD8+T细胞9肽
3.1慢病毒转染构建HLA-E*0103/K562稳转细胞
K562细胞为人慢性髓原白血病细胞系,它的一个显著特点是不表达HLA-Ⅰ类抗原分子,因此在HLA-Ⅰ类分子尤其是HLA-E分子的体外表达和功能研究中被广泛使用。采用慢病毒转染将HLA-E*0103分子转入K562细胞,以期实现 HLA-E*0103分子在细胞表面稳定表达,用于筛选HLA-E*0103高亲和力HTNV- NP和Gn/Gc 9肽。首先制备过表达慢病毒克隆并采用Real-time PCR检测目的基因HLA-E*0103在K562细胞中mRNA的表达丰度,目的基因上游引物序列 GAGAGGAGCAGAGATACAC,下游引物序列TCCAGAGACCACAGATCC。定量PCR结果显示HLA-E*0103基因在K562细胞中的表达丰度较对照组高约7 倍,提示慢病毒转染HLA-E*0103在K562细胞表面稳定表达。进一步构建混合克隆稳定株,培养生长状态良好的目的细胞,根据慢病毒感染预实验结果,感染 72h后,于荧光显微镜下观察GFP表达情况,随后使用适当浓度的嘌呤霉素 (puromycin)筛选至少48h,当细胞荧光效率达到100%或再无细胞出现死亡时,将puromycin浓度至少减半,继续扩大培养细胞,同时收集细胞进行qPCR鉴定,并将鉴定结果正常的细胞冻存保种,混合克隆稳定株则构建完成。应用FCM检测转染后K562细胞表面HLA-E*0103分子表达情况,具体如下:2×105K562细胞或HLA-E*0103转染的K562细胞,经FCM洗液洗涤后加入PE荧光标记的小鼠抗人HLA-E mAb(3D12),同时设置同型对照管,4℃孵育30min,FCM洗液洗涤离心后,震荡混匀加入300μLFCM固定液,流式细胞仪检测。结果显示对照组K562细胞基本未表达HLA-E*0103分子,而HLA-E*0103过表达慢病毒组 K562细胞表面HLA-E*0103分子表达明显升高,构建的HLA-E*0103/K562稳转细胞可作为抗原提呈细胞,为下一步筛选HLA-E*0103限制性HTNV结构蛋白9 肽表位提供有力工具。
3.2HLA-E*0103/K562稳转细胞结合试验筛选获得4条HLA-E*0103高亲和力结合HTNV 9肽
HLA-E分子在细胞表面表达不仅具有TAP依赖的特点,而且受到与之结合的肽段的调节,当这些肽段与HLA-E分子的抗原结合凹槽结合时,HLA-E就可以获得高水平的细胞表面表达,反之则不表达或低表达。基于外源性多肽与HLA- E*0103/K562稳转细胞表面HLA-E*0103分子的结合可使其表面HLA-E*0103表达量增加,两者结合越稳固,则HLA-E*0103的表达量越多。因此,HLA- E*0103/K562稳转细胞表面HLA-E*0103分子表达水平的增加可以直观的反应抗原肽与HLA-E*0103分子的亲合力。具体如下:
HLA-E*0103/K562稳转细胞系复苏后,20%FCS Iscove’s改良Dulbecco’s (IMDM)培养基加2μg/mL puromycin常规培养,至对数生长期,转移至26℃ 5%CO2培养过夜,诱导HLA-E表达。使用无血清培养基RPMI 1640调整细胞密度为4×105/ml,加入无菌24孔细胞培养板中,每孔0.5ml即约2×105个细胞;向实验孔中分别加入HTNV-NP或Gn/Gc合成候选9肽,使9肽终浓度达到50μM,同时加入β2m,终浓度为2.5μg/mL;同时设置空白对照,即不加9肽仅加入HLA- E*0103/K562稳转细胞和β2m的对照孔;设置阳性对照,即加入已知的HLA-E 限制性HLA-A2或Cw3先导序列9肽(表2);设置阴性对照,即加入文献报道的非HLA-E限制性9肽MAGE-1(表2);26℃5%CO2培养18h;RPMI 1640 清洗细胞1次,离心后加入PE标记的小鼠抗人HLA-E mAb(3D12),15μl/支, 4℃孵育45min;FCM洗液洗涤1次,流式细胞仪检测;计算FI值,以FI值>1 判定为高亲和力表位,计算公式如下:
FI=(实验孔的PE平均荧光强度-空白对照孔PE平均荧光强度)/空白对照孔PE平均荧光强度
结果显示阳性对照肽即HLA-A2先导序列9肽(VMAPRTLVL)或HLA-Cw3 先导序列9肽(VMAPRTLIL)与HLA-E*0103/K562稳转细胞结合后的FI值大于3,阴性对照肽即MAGE-1(EADPTGHSY)与HLA-E*0103/K562稳转细胞结合后的FI值小于1,待检测20条候选HTNV 9肽中HTNV-NP上ILLKALYML 和YLRQRQVAL,HTNV-Gn/Gc上SLVWPVLTL和MMKSCLIAL检测结果FI值大于1,因此这4条9肽可判定为HLA-E*0103高亲和力结合肽(图1,表3)。
图1显示为HLA-E*0103/K562稳转细胞结合试验筛选HLA-E*0103高亲和力HTNV-NP或Gn/Gc CD8+T细胞9肽表位的流式细胞术检测柱状结果图,其中每幅图中从上至下四个柱状线条依次表示同型对照、未加载肽段、加载实验肽段和加载阳性对照肽段HLA-Cw3先导序列9肽(VMAPRTLIL)后HLA- E*0103/K562稳转细胞表面表达HLA-E*0103分子的荧光强度。因此实验肽的峰值较同型对照峰值右移越多,表明该条肽与HLA-E*0103分子结合的亲和力越高,越有可能是HLA-E*0103限制的HTNV CD8+T细胞9肽表位。
表3 HLA-E*0103/K562细胞结合试验筛选HLA-E*0103分子高亲和力HTNV 9肽表位
*FI:荧光指数,FI=(加载特定肽的平均PE荧光指数-未加载肽的平均PE荧光指数)/(未加载肽的平均PE荧光指数)。FI≥1为高亲和力表位肽。SB:强结合肽(前0.5%排序);WB:弱结合肽(前2.0%排序)。
4、固相酶联免疫斑点实验(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT) 方法鉴定HLA-E*0103限制性HTNV-NP和Gn/Gc CD8+T细胞9肽表位
4.1从HFRS患者外周血中分离外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)
根据中国肾综合征出血热临床诊断标准(血清抗HTNV IgM抗体和临床症状),无菌采集HFRS患者不同病情(轻型、中型、重型和危重型)、不同病期(发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期)的外周血并加入肝素钠抗凝 (50U/ml),对采集的标本分别进行编号分组。进一步将采集的外周血用等量无血清RPMI 1640培养液稀释混匀,用弯头吸管将稀释后的抗凝血缓缓叠加在淋巴细胞分离液上(在50mL离心管里预先加入10ml淋巴细胞分离液,购自天津灏洋生物公司),2000rmp去刹车离心20min,小心吸取两层界面处的白色云雾层,用5倍体积的RPMI 1640洗涤,1500rpm离心10min,再洗涤2次,获得HFRS 患者外周血中分离的PBMC;直接用于后续实验使用或用冻存液(90%FCS, 10%DMSO)重悬细胞,液氮冻存备用。
4.2筛选HLA-E*0103阳性的HFRS患者
将分离得到的HFRS患者PBMCs标本进行DNA提取,对HFRS患者HLA- E基因进行四位数测序分型,筛选HLA-E*0103阳性的HFRS患者。
4.3ELISPOT方法鉴定能够刺激HFRS患者CTL产生特异性应答(分泌IFN- γ)的HLA-E*0103限制性HTNV-NP或Gn/Gc CD8+T细胞9肽表位
4.3.1采用免疫磁珠(Dynal公司)阳性分选法分选不同病情HFRS患者PBMC 中的CD8+T细胞,具体方法为:取CD8 Dynabeads 25μL重悬并洗涤,取1×107 HFRS患者PBMC重悬后加入CD8 Dynabeads,混匀器上4℃孵育20min;磁架上静置弃上清,洗涤结合细胞的CD8Dynabeads 3次;重悬后加入10μl Detachabeads,混匀器上室温孵育45min;磁架上静置、洗涤并收取上清,离心后用10%FCS RPMI 1640培养基重悬,即为细胞表面无磁珠无抗体的CD8+T细胞。
4.3.2HLA-E*0103/K562稳转细胞加载HLA-E*0103高亲和力结合的HTNV 候选9肽,具体负载方法为:HLA-E*0103/K562稳转细胞在含10%FCS和2μ g/ml puromycin的IMDM培养基中培养,于26℃培养过夜,加入相应HLA-E*0103 高亲和力HTNV候选9肽(终浓度50μM),26℃培养16h后,再于37℃培养2h 以稳定肽段依赖的HLA-E*0103分子表达,洗涤去除多余肽段后计数。
4.3.3采用商品化IFN-γELISPOT(达科为公司)对候选HTNV 9肽表位诱导 CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力进行测定,利用IFN-γ作为检测目标检测鉴定得到的HLA-E*0103限制的HTNV-NP或Gn/Gc 9肽对HFRS患者CD8+T细胞的特异性刺激作用,具体方法为:无菌去离子水清洗鼠抗人IFN-γmAb(1-D1K,15ug/ml) 预包被ELISPOT板,10%FCS的RPMI 1640封闭2h;每孔加入5×104个CD8+T 细胞,同时加入预加载过HTNV候选9肽的HLA-E*0103/K562稳转细胞(5×104/ 孔)共培养24h;同时设置阳性和阴性对照,阳性对照孔加入PHA(终浓度10ug/ml),阴性对照孔加入CD8+T细胞和未加载9肽的HLA-E*0103/K562稳转细胞;PBS 清洗后每孔加入稀释的ALP-7-B6-1检测抗体100μl;清洗后每孔加入BCIP/NBT 显色液100ul,室温避光显色0.5h;自来水冲洗板子,自然晾干。应用CTL公司 ELISPOT读数仪计数IFN-γ斑点形成细胞数。根据文献报道,阳性应答定义标准为每孔斑点数≥50SFCs/106效应细胞,且斑点数至少为阴性对照孔斑点数的3倍以上,阳性应答候选肽则可判定为HLA-E*0103限制性CD8+T细胞特异性HTNV 9肽表位。按照如下公式计算标准化为SFCs/106细胞:
SFC/106细胞=[(阳性实验孔斑点数-阴性对照孔斑点数)/每孔加入的效应细胞总数]×106
ELISPOT结果显示,经软件预测并经HLA-E*0103/K562稳转细胞筛选得到的HLA-E*0103高亲和力HTNV-NP或Gn/Gc 9肽CD8+T细胞表位均可在不同程度上刺激HLA-E*0103阳性HFRS患者CTL产生IFN-γ,SFC/106细胞分别为 7067(SEQ ID NO:1ILLKALYML),7833(SEQID NO:2YLRQRQVAL),7617 (SEQ ID NO:3SLVWPVLTL)和8133(SEQ ID NO:4MMKSCLIAL)(图2),图2显示为ELISPOT检测HFRS患者外周血中HLA-E*0103高亲和力HTNV 9 肽特异性CTL分泌IFN-γ的频率。以P1975号HFRS患者的检测结果为例。图中从左至右每孔依次代表SEQ IDNO:1ILLKALYML肽段刺激孔、SEQ ID NO: 2YLRQRQVAL肽段刺激孔、SEQ ID NO:3SLVWPVLTL肽段刺激孔以及SEQ ID NO:4MMKSCLIAL肽段刺激孔、PHA刺激阳性对照孔以及未刺激空白对照孔。每孔斑点数越多,说明该HTNV 9肽表位在HFRS患者中诱导的CTL应答越强烈。因此,确定4条9肽均为HLA-E*0103限制的HTNV-NP或Gn/Gc 9肽 CD8+T细胞表位。
同时,对10例轻型/中型及11例重型/危重型患者急性期外周血中表位特异性CD8+T细胞分泌IFN-γ的频率进行统计学分析,发现HLA-E*0103限制性表位特异性CD8+T细胞分泌IFN-γ频率在轻型/中型患者中高于重型/危重型患者 (P<0.05)(图3)。图3显示为统计学比较不同病情HFRS患者急性期外周血中 HLA-E*0103限制性HTNV 9肽表位特异的CTL分泌IFN-γ的频率。根据临床资料,将HFRS患者分为轻型/中型(Mild/Moderate)和重型/危重型(Severe/Critical) 两组(横坐标),分别比较HFRS患者急性期外周血中4个HTNV 9肽表位特异的 CTL分泌IFN-γ的频率(SFC/106细胞,纵坐标)。结果显示4个9肽表位特异的CTL分泌IFN-γ的频率均在轻型/中型患者中明显高于重型/危重型患者 (P<0.05)。
5.HLA-E*0103/表位肽-四聚体染色检测HFRS患者外周血中HTNV-NP或 Gn/Gc 9肽表位特异性CTL频率
5.1根据表位鉴定结果以及锚定氨基酸序列,委托江苏南通表源生物技术公司构建HLA-E*0103/表位肽-四聚体复合物,对4个HLA-E*0103限制的HTNV 9 肽表位分别进行HLA-E*0103/表位肽-四聚体的合成。通过单体鉴定并做四聚体 PE标记。结果显示,4个多肽与MHC I类分子亲和力的排序为: MMKSCLIAL>SLVWPVLTL>ILLKALYML>YLRQRQVAL。生物素化MHC单体与链霉亲和素的结合率>80%。
5.2应用HLA-E*0103/表位肽-四聚体染色方法检测HFRS患者外周血HLA- E*0103限制性HTNV-NP或Gn/Gc 9肽表位特异性CTL频率,具体如下:取 HFRS患者或正常人PBMCs 2×106个/支,FCM洗液洗涤1次,1,000rpm离心5 min,弃上清,涡旋混匀;4℃取出HLA-E*0103/表位肽-四聚体,低温离心14,000g 离心5min,使用时取上清,避免使用沉淀引起非特异染色。每支实验管加入HLA- E*0103/表位肽-四聚体-PE 2μL,室温避光孵育10min。FCM洗液洗涤2次,1,000 rpm离心5min,弃上清,涡旋混匀,向实验管分别加入小鼠抗人CD8-PerCP-Cy5.5 和CD3-FITC mAb,涡旋混匀。同时设置同型对照管,取PBMC 2×105个,FCM 洗液洗涤后加入小鼠IgG1-PE,-PerCP-Cy5.5及-FITC各5μl;冰上避光孵育30 min;FCM洗液洗涤2次,离心后涡旋混匀。加入300μl FCM固定液混匀,流式细胞仪检测,收集至少5×105events。
HLA-E*0103/表位肽-四聚体染色结果显示4条HTNV-Gn/Gc 9肽表位特异的 CTL均可在HFRS患者PBMC中检测到(图4),图4为HLA-E*0103/表位肽-四聚体染色检测HLA-E*0103限制性HTNV 9肽表位特异性CD8+T细胞在HFRS 患者外周血中的频率结果图,以P1944号HFRS患者的检测结果为例。应用 NovoExpress1.4.1软件在SSC和FSC散点图上设门圈出PBMC细胞群,再设门圈出CD3阳性细胞群,最后设门分析CD8+(横坐标)四聚体+(纵坐标)双阳性的细胞群比例,即为HFRS患者外周血中HLA-E*0103限制的HTNV-NP或Gn/Gc 9肽表位特异的CTL频率。频率越高,说明该HTNV 9肽表位在HFRS患者中诱导的CTL应答越强烈。
HFRS患者急性期PBMC中4条HTNV-Gn/Gc 9肽表位特异性CTL频率范围分别为:0.1995±0.02857(SEQ ID NO:1ILLKALYML)、0.2570±0.04284(SEQ ID NO:2YLRQRQVAL)、0.4729±0.1177(SEQ ID NO:3SLVWPVLTL)和0.3468±0.05607(SEQ ID NO:4MMKSCLIAL)。而且HLA-E*0103分子限制性 HTNV-Gn/Gc 9肽表位特异的CTL在HFRS患者PBMC中的频率高低可用于指示HFRS疾病病情的轻重程度,即急性期HTNV-Gn/Gc 9肽表位特异性CTL频率越高,HFRS疾病病情越轻(图5)。图5为统计学比较不同病情HFRS患者急性期外周血中HLA-E*0103限制性HTNV-NP或Gn/Gc 9肽表位特异的CTL频率。四聚体染色分别比较急性期HFRS患者轻型/中型(Mild/Moderate)和重型/ 危重型(Severe/Critical),以及正常对照(NormalControl)三组(横坐标)外周血中 4个HTNV 9肽表位特异的CTL频率(纵坐标)。结果显示4个9肽表位特异的 CTL频率均在轻型/中型患者中明显高于重型/危重型患者(P<0.05),提示鉴定得到的HLA-E*0103限制的HTNV-NP或Gn/Gc 9肽表位特异性CTL应答可能在 HFRS疾病过程中发挥着免疫保护作用。
由于HLA-E分子多态性非常有限,是在人群中普遍存在的HLA等位基因位点,因此鉴定出由HLA-E限制的HTNV结构蛋白CD8+T细胞表位,不仅在揭示HFRS发病机理方面具有重要的理论意义,而且可以为设计我国人群更为特异的有效的新型HTNV多肽疫苗提供可靠的实验依据,为制订新的临床治疗策略提供重要的理论依据,在HFRS特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
以上内容仅为说明本发明的技术思想,不能以此限定本发明的保护范围,凡是按照本发明提出的技术思想,在技术方案基础上所做的任何改动,均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 中国人民解放军空军军医大学
<120> HTNV结构蛋白特异性CD8+T细胞表位肽及其聚合物和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Leu Leu Lys Ala Leu Tyr Met Leu
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Tyr Leu Arg Gln Arg Gln Val Ala Leu
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ser Leu Val Trp Pro Val Leu Thr Leu
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Met Lys Ser Cys Leu Ile Ala Leu
1 5
Claims (4)
1.HLA-E*0103限制性HTNV结构蛋白特异性CD8+T细胞表位肽在制备诱导CD8+T细胞产生细胞免疫应答的试剂中的应用,其特征在于,所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,该表位肽与HLA-E*0103分子结合并递呈后,能够诱导CD8+T细胞产生细胞免疫应答。
2.一种HTNV结构蛋白特异性的HLA-E*0103/表位肽-复合物四聚体在制备检测HTNV-NP或Gn/Gc表位肽特异性CD8+T细胞的频率的药物试剂中的应用,其特征在于,所述的HTNV结构蛋白特异性的HLA-E*0103/表位肽-复合物四聚体由四个HLA-E*0103/表位肽-复合物单体与一个亲和素分子结合构成;
其中,所述的HLA-E*0103/表位肽-复合物单体是由表位肽与复合物单体结合而成;
所述表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;
所述复合物单体是由C端连接有被活化的生物素分子的HLA-E*0103分子重链与β2微球蛋白在体外组装而成的结构。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,将荧光素标记的HLA-E*0103/表位肽-复合物四聚体与CD8+T细胞结合后,通过流式细胞仪检测,分辨HTNV-NP或Gn/Gc表位肽特异性CTL的频率。
4.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述亲和素分子上标记有荧光素PE。
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Patent Citations (1)
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---|---|---|---|---|
CN110548136A (zh) * | 2018-05-30 | 2019-12-10 | 王美亮 | 汉坦病毒长肽疫苗 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
"CD8low CD100 T Cells Identify a Novel CD8 T Cell Subset Associated with Viral Control during Human Hantaan Virus Infection";Bei Liu等;《Journal of Virology》;20150916;第89卷(第23期);第11834-11844页 * |
"汉滩病毒核蛋白T细胞表位的鉴定";王美亮;《中国知网博士电子期刊》;20061215;第22-23、38、52-53页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113234129A (zh) | 2021-08-10 |
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