CN103421118B - HTNV-Gn/Gc特异性CTL表位肽及其聚合物和应用 - Google Patents
HTNV-Gn/Gc特异性CTL表位肽及其聚合物和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103421118B CN103421118B CN201310297954.9A CN201310297954A CN103421118B CN 103421118 B CN103421118 B CN 103421118B CN 201310297954 A CN201310297954 A CN 201310297954A CN 103421118 B CN103421118 B CN 103421118B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- epitope peptide
- hla
- htnv
- peptide
- specific
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了HLA-A*02限制的HTNV-Gn/Gc特异性的CTL9肽表位及其应用,所述的CTL表位肽,其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1~3所示。本发明提供的HTNV-Gn/Gc特异性的CTL表位肽,是HLA-A*02分子限制性表位多肽,可诱导CD8+T细胞产生强烈的细胞免疫应答,分泌IFN-γ,且分泌IFN-γ的频率可用于指示HFRS患者病情严重程度,即分泌IFN-γ的频率越高,HFRS疾病病情越轻。因此,可应用于CTL表位肽疫苗的制备,或应用于诱导产生CTL表位肽特异性的细胞毒性T细胞,或应用于制备HLA-A*02/表位肽-复合物四聚体,在HFRS特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明属于汉滩病毒的防治技术领域,涉及HLA-A*02限制的HTNV-Gn/Gc特异性CTL表位肽及其应用。
背景技术
汉滩病毒(hantaan virus,HTNV)是布尼亚病毒科汉坦病毒属的原型,也是世界《禁止生物武器公约》议定书核查范围中的重要病原微生物之一。1976年李镐汪等首先分离出的HTNV76-118株是HTNV的代表株,也是在我国引起肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)的主要病原体之一。HFRS是一种以发热、出血和急性肾功能损害为特征的自然疫源性疾病,其发病机理尚不清楚。在各种病毒感染性出血热疾病中,HFRS目前是世界上分布最广,发病人数最多且危害极大的一种疾病。在我国,HFRS是仅次于病毒性肝炎的危害最大的病毒性传染病,按照《中华人民共和国传染病防治法》的规定为乙类传染病。鼠类为HTNV的自然宿主和主要传染源,传播方式多种多样,传播途径包括呼吸道、消化道、皮肤粘膜、媒介和垂直传播等多种方式。人群对HTNV有较普遍的易感性,在人口密集、带病毒鼠数量多的条件下容易出现爆发和流行。HFRS的主要临床表现包括发热、全身中毒症状、毛细血管损害及急性肾功能损伤,严重者通常出现低血压休克并容易在此阶段死亡。全球每年HFRS发病人数达10万例,死亡率在5%~15%左右,90%以上病例发生在我国。HFRS在我国分布广,发病率和病死率较高,并且新疫区仍不断出现,在广大农村、城镇和林区部分疫点还时有爆发,严重危害我国人民的生命和健康,威胁和影响工农业生产、经济开发、外贸及旅游事业的发展,是国家重点防治的传染病之一。
HTNV为单股负链RNA有包膜病毒,成熟的HTNV颗粒具有多形性,基因组位于病毒的核心部分,包括大(L)、中(M)、小(S)三个基因片段,其中L片段编码RNA聚合酶,M片段编码包膜糖蛋白n(glycoprotein,Gn)和Gc,S片段编码核蛋白(nucleocapsid protein,NP)。M基因片段全长3.6~3.7kb,仅包含一个有意义的长开放阅读框,编码包含Gn和Gc两个前体蛋白。其mRNA的蛋白质编码顺序为5’-Gn-Gc-3’,其中间部位有一个由5个氨基酸残基(WAASA)组成的共翻译切割位点,前体蛋白在细胞的内质网内切割并加工成为Gn和Gc两个蛋白。HTNV-Gn/Gc全长包含1135个氨基酸,未糖基化的Gn、Gc分子量分别为64kD和54kD。HTNV-Gn/Gc位于HTNV的囊膜表面,可刺激机体产生特异性的中和抗体,同时Gn/Gc还可诱导动物产生保护性细胞免疫应答,表明Gn/Gc上一定存在T细胞抗原位点,可诱导T细胞免疫应答。
在病毒感染过程中,T细胞通过识别抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅰ类或Ⅱ类分子与抗原肽表位形成的复合体,发挥清除病原体的效应。CD8+T细胞(细胞毒性T细胞,cytotoxic T lymphocyte,CTL)是抗病毒免疫的主要效应细胞,CD8+T细胞可通过TCR识别已被处理并结合到MHC-Ⅰ类分子上并表达于宿主细胞表面的病毒抗原,长度多为8-10个氨基酸,通过分泌颗粒酶和穿孔素杀伤靶细胞,或通过受体配体相互作用(如Fas-FasL)诱导靶细胞程序性死亡,从而清除已被病毒感染的细胞,限制病毒的复制和扩散。尽管细胞免疫应答在HFRS发生、发展和疾病的转归中起着重要作用,但迄今为止,对HTNV-Gn/Gc上的T细胞表位的研究只有零星报道。这种研究现状大大限制了人们对HTNV感染后适应性免疫应答规律及其与免疫保护或免疫损伤关系的认识,也限制了人们利用多肽疫苗对疾病进行治疗及控制的研究。
近年来,随着人们对MHC分子晶体结构的解析,以及对表位肽与MHC分子结合特性和抗原提呈途径不断深入研究,借助生物信息学方法运用MHC结合多肽表位的软件可实现T细胞抗原表位的预测。目前用于表位预测的方法主要有基于抗原肽与MHC分子结合特性的预测方法和针对抗原加工处理过程的表位预测方法。最为常用的是Parker等在1994年提出的BIMAS程序和Rammensee等在1997年提出的SYFPEITHI。这两种预测软件均是基于量化矩阵法,假设抗原肽的每一个氨基酸残基相互独立并以一定的结合力影响肽与MHC分子的结合,通过对大量MHC结合肽的统计学分析,得到与某一MHC分子特异结合多肽的统计学信息,进而对抗原肽进行预测。由于中国人群中HLA-A*02在HLA-I类分子中的频率最高,因此获得由HLA-A*02限制的HTNV CTL表位肽对于设计我国人群更为特异的有效的多肽疫苗具有更高的参考价值。
目前我国生产的HFRS疫苗均为灭活的全病毒疫苗,这些疫苗在接种后均可刺激机体产生中和抗体,从而预防HFRS的发生和流行,但是病毒灭活疫苗刺激机体产生的中和抗体滴度往往不高,诱导产生细胞免疫应答的作用相对较弱,因此需要进一步探索更为有效的新型疫苗。合成肽疫苗是近年来出现的新型疫苗研究方向,合成肽能够直接与MHC分子结合,而不需要APC的加工处理,它与天然的内源性肽在激活免疫系统方面具有相同的效果,因此合成肽疫苗广泛应用于抗病毒免疫治疗。目前已有多种基于多肽表位的合成肽疫苗进入临床研究阶段或已上市。
建立在CTL表位鉴定基础之上的CTL表位肽疫苗,由于人工合成多肽不包含病原生物的无关成分,只诱导特异性CTL应答,因此安全、稳定、毒副作用少,且研制周期大大缩短。更重要的是,基于CTL表位研发的多个CTL表位组合,还可设计针对一种或多种病原体的多价CTL表位肽疫苗。因此CTL表位合成肽疫苗已成为防治HTNV感染研究的一个新策略,而对HTNV特异的CTL表位进行鉴定即成为研究的关键。
由于HTNV感染引起的HFRS有较高的发病率和死亡率,但迄今为止仍无特异的预防和治疗方法。因此迫切需要研发针对中国人群的可用于预防和治疗HTNV感染的安全性高且特异性高的表位肽疫苗。
发明内容
本发明解决的问题在于提供由HLA-A*02限制的HTNV-Gn/Gc特异性的CTL表位肽及其应用,所提供的表位肽可诱导CD8+T细胞产生强烈的细胞免疫应答,分泌高水平IFN-γ,可应用于HTNV多肽疫苗的制备。
本发明是通过以下技术方案来实现:
一种HTNV-Gn/Gc特异性的HLA-A*02/表位肽-复合物四聚体,是由四个HLA-A*02/表位肽-复合物单体与一个亲和素分子结合所构成的四聚体;
所述的HLA-A*02/表位肽-复合物单体是将C端连接有被活化的生物素分子的HLA-A*02分子重链与β2微球蛋白在体外组装,再结合氨基酸序列如SEQ ID NO:1~3所示的表位肽中的一种,而形成HLA-A*02/表位肽-复合物单体。
所述的亲和素上还标记了荧光素PE。
所述的HLA-A*02/表位肽-复合物四聚体能够与相应TCR特异性结合。
所述的CTL表位肽是由HLA-A*02限制的,包括氨基酸序列如SEQ IDNO:1~3所示的表位肽。
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的表位肽与HLA-A*02分子结合并递呈后,能够诱导CD8+T细胞产生细胞免疫应答。
所述的HTNV-Gn/Gc特异性的CTL表位肽在制备抗汉滩病毒的CTL表位肽疫苗中的应用。
所述的HTNV-Gn/Gc特异性的CTL表位肽在诱导产生CTL表位肽特异性的细胞毒性T细胞中的应用。
所述的HTNV-Gn/Gc特异性的HLA-A*02/表位肽-复合物四聚体在检测HTNV-Gn/Gc表位肽特异性T细胞的频率中的应用。
将荧光素标记的HLA-A*02/表位肽-复合物四聚体与CTL细胞结合后,通过流式细胞仪检测,分辨HTNV-Gn/Gc表位肽特异性T细胞的频率。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
本发明提供的由HLA-A*02分子限制性表位多肽,通过表位预测软件、T2细胞系结合、ELISPOT实验筛选得到HTNV-Gn/Gc表位肽,具有很高的特异性,可诱导CD8+T细胞产生强烈的细胞免疫应答,分泌IFN-γ,且分泌IFN-γ的频率高低可用于指示HFRS疾病病情的轻重程度,即分泌IFN-γ的频率越高,HFRS疾病病情越轻。
本发明提供的由HLA-A*02分子限制性表位多肽,能够应用于CTL表位肽疫苗的制备,或应用于诱导产生CTL表位肽特异性的细胞毒性T细胞,或应用于制备HLA-A*02/表位肽-复合物四聚体。
由于HLA-A*02分子是中国人群中频率最高的HLA-I类分子,因此获得由HLA-A*02限制的HTNV CTL表位肽应用于CTL表位肽疫苗的制备,或应用于诱导产生CTL表位肽特异性的细胞毒性T细胞,或应用于制备HLA-A*02/表位肽-复合物四聚体,对于设计我国人群更为特异的有效的多肽疫苗具有更高的参考价值,在HFRS特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
附图说明
图1为T2细胞结合试验筛选HLA-A*02高亲和力HTNV-Gn/Gc CTL9肽表位结果图;
图2为HLA/肽-四聚体染色检测HFRS患者外周血中HLA-A*02限制的HTNV-Gn/Gc表位特异性CTL频率结果图(以A145号HFRS病人检测结果为例);
图3为不同病情HLA-A*02阳性HFRS患者外周血中HTNV-Gn/Gc9肽表位特异性CD8+T细胞应答水平的比较结果图。
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
本发明首先应用表位预测软件SYFPEITHI和BIMAS对HTNV76-118株Gn/Gc序列中可能的由HLA-A*02限制的CD8+T细胞9肽表位进行预测,利用T2细胞系结合试验对预测得到的HTNV-Gn/Gc9肽筛选,得到HLA-A*02高亲和力的HTNV-Gn/Gc CD8+T细胞9肽表位。进一步应用ELISPOT实验对HTNV-Gn/Gc9肽表位进行鉴定。应用HLA/肽-四聚体染色技术在HLA-A*02阳性HFRS患者中对HTNV-Gn/Gc9肽表位的特异性CTL频率进行检测,对HLA-A*02限制的HTNV-Gn/Gc表位特异性CTL应答在HFRS中所发挥的作用进行分析。下面对本发明作详细的说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
1.软件预测HLA-A*0201限制的HTNV-Gn/Gc CTL9肽表位
HTNV(病毒株76-118)的Gn/Gc由1135个氨基酸残基组成,可以由NCBI网站的蛋白质数据库获得其具体的蛋白序列(P08668.1)。分别采用在线预测软件BIMAS(http://bimas.dcrt.nih.gov/)和SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/)对HTNV76-118株Gn/Gc HLA-A*0201限制的CD8+T细胞表位进行了预测。
BIMAS预测是以预测肽/HLA复合物的1/2解离时间即T1/2为基础而建立的,一般默认T1/2≥100min。而SYFPEITHI的预测原理则是建立在已发表的结合肽基础之上,根据肽段序列中的氨基酸是锚定残基、辅助锚定残基或是优先氨基酸而赋予不同的分值,对结合有负作用的氨基酸则赋予负分值。选择MHC分子为HLA-A*0201,同时选择9个氨基酸肽段作为预测条件,输入HTNV(病毒株76-118)的Gn/Gc氨基酸序列,进行运算。
预测得到由中国汉族人群最常见HLA等位基因HLA-A*0201限制的HTNV-Gn/Gc9肽CTL表位。综合两个软件的预测结果,依次选择其中分值最高的34条9肽进行合成(表1)。
表1软件预测并合成HLA-A*0201限制的的34条HTNV-Gn/Gc9肽
2.对预测得到的HTNV-Gn/Gc9肽进行合成
根据软件预测HLA-A*0201限制的HTNV76-118株-Gn/Gc CTL表位结果,委托上海强耀生物技术公司合成HTNV-Gn/Gc9肽34条,每条9肽合成10mg,经RP-HPLC测定纯度均>90%。多肽干粉可于-20℃长期保存。使用前将所有9肽均先用20ul无菌二甲基亚砜(DMSO)溶解,待完全溶解后再加入无菌PBS配制成终浓度为1mM的溶液,分装后可-70℃冻存备用。
3.T2细胞系结合试验筛选HLA-A*02高亲和力HTNV-Gn/Gc CTL9肽
T2细胞为T-B杂交瘤细胞系,其表面HLA-A*02分子为阳性表达,但由于T2细胞为TAP分子缺陷细胞系,因此不能加工内源性抗原,仅可以提呈外源性抗原肽。但是在无外源性抗原肽存在的条件下,其细胞表面HLA-A*02分子表达极不稳定且容易很快降解,当抗原肽与之结合后,其表面HLA-A*02分子表达明显增强,并且抗原肽与HLA-A*02分子的亲合力越高,T2细胞表面的HLA-A*02分子的表达水平就越高。因此,T2细胞系表面HLA-A*02分子表达水平的增加可以直观的反应抗原肽与HLA-A*02分子的亲合力。具体如下:
T2细胞系复苏后,20%FCS RPMI1640常规培养至对数生长期,使用无血清培养基RPMI1640调整细胞密度为2~4×105/ml,加入无菌24孔细胞培养板中,每孔0.5ml即约2×105个细胞;向实验孔中分别加入HTNV-Gn/Gc合成9肽,使9肽终浓度达到50μM,同时加入β2-m,终浓度为2.5μg/ml;同时设置空白对照,即设置不加9肽仅加入T2细胞系和β2m的对照孔;设置阳性对照,即加入已鉴定出的HLA-A*02限制的HTNV-NP9肽CTL表位肽;37℃5%CO2培养18h;RPMI1640清洗细胞1次,离心后加入PE标记的小鼠抗人HLA-A*02,15μl/支,4℃孵育45min;FCM洗液洗涤1次,流式细胞仪检测;计算FI值,以FI值>1判定为高亲和力表位,计算公式如下:FI=(实验孔的PE平均荧光强度-空白对照孔PE平均荧光强度)/空白对照孔PE平均荧光强度
阳性对照肽即HTNV-NP CTL表位aa129-aa137与T2细胞系结合后的FI值大于2,待检测HTNV-Gn/Gc9肽中有3条FI值大于1,因此结合能力最强的这3条HTNV-Gn/Gc9肽为HLA-A*02高亲合力表位(图1,表2)。
图1显示为T2细胞结合试验筛选HLA-A*02限制的HTNV-Gn/GcCTL9肽表位的流式细胞术柱状结果图,其中红色线条即同型对照,表示未加载肽段的T2细胞表面表达HLA-A*02分子的荧光强度,蓝色线条表示阳性对照,即加载了已知HTNV-NP CTL9肽表位后T2细胞表面表达HLA-A*02分子的荧光强度,橘色线条即实验肽,表示加载了预测得到的HTNV-Gn/GcCTL9肽后T2细胞表面表达HLA-A*02分子的荧光强度。因此实验肽的峰值较同型对照峰值右移越多,表明该条肽与HLA-A*02分子结合的亲和力越高,越有可能是HLA-A*02限制的HTNV-Gn/Gc CTL9肽表位。
表2T2细胞结合试验筛选HLA-A*02高亲和力HTNV-Gn/Gc9肽表位
FI:荧光指数.
cFI=(加载肽特定肽的平均PE荧光指数-未加载肽肽的平均PE荧光指数)/
(未加载肽肽的平均PE荧光指数).FI≥1为高亲和力表位肽
4.固相酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)方法鉴定HTNV-Gn/Gc CTL9肽表位
4.1从HFRS患者外周血中分离外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cell,PBMC)
根据我国肾综合征出血热临床诊断标准(血清抗HTNV IgM抗体和临床症状),无菌采集HFRS患者不同病情(轻型、中型、重型和危重型)、不同病期(发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期)的外周血并加入肝素钠抗凝(50U/ml),对不同的采集情况进行编号。然后将采集的外周血用等量无血清RPMI1640培养液稀释混匀,用弯头吸管将已稀释的抗凝血缓缓叠加在淋巴细胞分离液上(在50ml离心管里预先加入10ml淋巴细胞分离液,购自天津灏洋生物公司),2000rmp去刹车离心20min,小心吸取两层界面处得白色云雾层,用5倍体积的RPMI1640洗涤,1500rpm离心10min,再洗涤2次,获得HFRS患者外周血中分离的PBMC;直接用于后续使用或用冻存液(90%FCS,10%DMSO)重悬细胞,液氮冻存备用。
4.2流式细胞术(Flow cytometry,FCM)筛选HLA-A*02阳性的HFRS患者
复苏HFRS患者PBMC,每支实验管取细胞5×105个,FCM洗液洗涤后加入正常羊血清1μl室温封闭10min;分别加入小鼠抗人HLA-A*02-PE(10μl/支),同时设置对照管即加入小鼠IgG1-PE(10μl/支)作为检测HLA-A*02的同型对照;4℃孵育30min,FCM洗液洗涤2次,1,000rpm离心5min,HLA-A*02实验管震荡混匀后加入300μl FCM固定液即可上机检测;
4.3ELISPOT方法鉴定能够刺激HFRS患者PBMC产生特异性应答(分泌IFN-γ)的HTNV-Gn/Gc CTL9肽表位
采用商品化IFN-γELISPOT试剂盒(购自Mabtech公司)鉴定HTNV-Gn/Gc CTL9肽表位能否刺激PBMC分泌IFN-γ,按照说明书进行操作如下:
从4℃取出商品化预包被ELISPOT板,无菌去离子水清洗3遍;加入10%FCS的RPMI1640,200μl/孔,37℃封闭2h;除去封闭液,每孔加入2×105个HLA-A*02阳性HFRS患者PBMCs,并加入经T2细胞系结合实验筛选得到的HLA-A*02高亲和力HTNV-Gn/Gc CTL9肽(终浓度10uM),37℃孵育18~24h;同时设阳性和阴性对照,阳性对照孔加入PHA(终浓度10ug/ml)或抗CD3mAb(终浓度10ug/ml),阴性对照孔仅加入PBMCs;PBS清洗6次,每孔加入1:200稀释的ALP-7-B6-1检测抗体50μl,室温孵育2h;PBS清洗6次,每孔加入BCIP/NBT显色液100ul,室温避光显色1h;自来水冲洗板子,自然晾干。
应用CTL公司ELISPOT读数仪计数IFN-γ斑点形成细胞数。根据文献报道,阳性应答定义标准为每孔斑点数≥50SFCs/106效应细胞,且斑点数至少为阴性对照孔斑点数的3倍以上。按照如下公式计算标准化为SFCs/106细胞:
SFC/106细胞=[(阳性实验孔斑点数-阴性对照孔斑点数)/每孔加入的效应细胞总数]×106
应用FCM和HLA-A*02特异性抗体可在HFRS患者中特异而敏感的筛选出HLA-A*02阳性的患者,频率约35%,与文献报道数据一致。ELISPOT结果显示经软件预测并经T2细胞筛选得到的HLA-A*02高亲和力HTNV-Gn/Gc9肽CTL表位均可在不同程度上刺激HLA-A*02阳性HFRS患者PBMC产生IFN-γ,SFC/106细胞分别为230(SEQ ID NO:1VLIEGKCFV),310(SEQ ID NO:2FLLVLESIL)和330(SEQ ID NO:3LIWTGMIDL),而不能够刺激HLA-A*02阴性的HFRS患者PBMC产生IFN-γ(SFC/106细胞小于50),因此确定3条9肽均为HLA-A*02限制的HTNV-Gn/Gc9肽CTL表位。
而且HLA-A*02分子限制性表位多肽诱导CD8+T细胞分泌IFN-γ的频率高低可用于指示HFRS疾病病情的轻重程度,即分泌IFN-γ的频率越高,HFRS疾病病情越轻。
5.HLA/肽-四聚体染色检测HTNV-Gn/Gc9肽表位特异的CTL频率
HTNV-Gn/Gc特异性的HLA-A*02/表位肽-复合物四聚体,是由四个HLA-A*02/表位肽-复合物单体与一个亲和素分子结合所构成的四聚体;
而所述的HLA-A*02/表位肽-复合物单体是将C端连接有被活化的生物素分子的HLA-A*02分子重链与β2微球蛋白在体外组装,再结合氨基酸序列如SEQ ID NO:1~3所示的表位肽中的一种,而形成HLA-A*02/表位肽-复合物单体。
在制备时,将HLA-A*02分子重链与β2微球蛋白(β2m)在体外组装(主要通过MHC重链及轻链蛋白的表达与纯化以及MHC/肽-单体复性及纯化来实现),结合特定的HTNV-Gn/Gc CTL表位肽,形成一个能够与相应TCR特异性结合的HLA-A*02/表位肽-复合物单体,其中重链的C端含有1个被活化的生物素分子。再将4个单体与1个亲和素分子结合,从而形成四聚体。由于亲和素上标记了荧光素PE,因此这种荧光素标记的四聚体可与其HTNV-Gn/Gc表位肽特异的CTL发生特异性结合,通过流式细胞仪即可检测HTNV-Gn/Gc表位肽特异性T细胞的频率,用于特异性CTL频率的研究。
具体的,HLA/肽-四聚体委托北京旷博生物技术公司定制。
利用IFN-γ作为检测目标检测鉴定得到的HLA-A*02限制的HTNV-Gn/Gc9肽对HFRS患者T细胞的特异性刺激作用,具体如下:
取HLA-A*02阳性的HFRS患者或正常人PBMCs,每支实验管3×106~5×106个,FCM洗液洗涤1次,1,000rpm离心5min,弃上清,涡旋混匀;4℃取出HLA/肽-四聚体,低温离心14,000g离心5min,使用时取上清,避免使用沉淀引起非特异染色。每支实验管加入HLA/肽-四聚体-PE10μl,室温避光孵育10min。同时设置无关HLA/肽-四聚体对照;设置同型对照管,取PBMC5×105个,FCM洗液洗涤后加入小鼠IgG1-PE,-PerCP-Cy5.5及-APC各5μl;FCM洗液洗涤2次,1,000rpm离心5min,弃上清,涡旋混匀,向实验管加入小鼠抗人CD8-PerCP-Cy5.5和CD3-APC,涡旋混匀。冰上避光孵育20min;FCM洗液洗涤2次,1,000rpm离心5min,弃上清,涡旋混匀。加入300μl FCM固定液混匀,流式细胞仪检测,收集至少5×105events。
HLA/9肽-四聚体染色结果显示3条HTNV-Gn/Gc9肽表位特异的CTL均可在HFRS患者PBMC中检测到,且特异性CTL频率范围分别为:95%可信区间0.126-0.317(SEQ ID NO:1VLIEGKCFV),0.124-0.297(SEQ ID NO:2FLLVLESIL)和0.252-0.343(SEQ ID NO:3LIWTGMIDL)。
图2为HLA/9肽-四聚体染色的结果图,以A145号中型HFRS患者的检测结果为例。应用Flowjo软件在SSC和FSC散点图上设门圈出PBMC细胞群,再设门圈出CD3阳性细胞群,最后设门分析CD8+(横坐标)四聚体+(纵坐标)双阳性的细胞群比例,即为HFRS患者外周血中HLA-A*02限制的HTNV-Gn/Gc9肽表位特异的CTL频率。频率越高,说明该HTNV-Gn/Gc9肽表位在HFRS患者中诱导的CTL应答越强烈。
图3为统计学比较HLA-A*02阳性的不同病情HFRS患者外周血中HTNV-Gn/Gc9肽表位特异的CTL频率。根据临床资料,将HFRS患者分为轻型/中型(Mild/Moderate)和重型/危重型(Severe/Critical)两组(横坐标),分别比较HFRS患者外周血中3个Gn/Gc9肽表位特异的CTL频率(纵坐标)。结果显示3个9肽表位特异的CTL频率均在轻型/中型患者中明显高于重型/危重型患者(P<0.05),提示鉴定得到的HLA-A*02限制的HTNV-Gn/Gc9肽表位特异性CTL应答可能在HFRS疾病过程中发挥着免疫保护作用。
由于HLA-A*02是在中国人群中频率最高的HLA-I类分子,因此鉴定出的由HLA-A*02限制的HTNV-Gn/Gc上的CTL表位,不仅在揭示HFRS发病机理方面具有重要的理论意义,而且可以为设计我国人群更为特异的有效的新型HTNV多肽疫苗提供可靠的实验依据,为制订新的临床治疗策略提供重要的理论依据,在HFRS特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。
Claims (9)
1.一种HTNV-Gn/Gc特异性的HLA-A*02/表位肽-复合物四聚体,其特征在于,是由四个HLA-A*02/表位肽-复合物单体与一个亲和素分子结合所构成的四聚体;
所述的HLA-A*02/表位肽-复合物单体是将C端连接有被活化的生物素分子的HLA-A*02分子重链与β2微球蛋白组装,再结合氨基酸序列如SEQ.ID.NO:1~3所示的表位肽中的一种,而形成HLA-A*02/表位肽-复合物单体。
2.如权利要求1所述的HTNV-Gn/Gc特异性的HLA-A*02/表位肽-复合物四聚体,其特征在于,所述的亲和素上还标记了荧光素PE。
3.如权利要求1所述的HTNV-Gn/Gc特异性的HLA-A*02/表位肽-复合物四聚体,其特征在于,所述的HLA-A*02/表位肽-复合物四聚体能够与相应TCR特异性结合。
4.HTNV-Gn/Gc特异性的CTL表位肽,其特征在于,所述的CTL表位肽是由HLA-A*02限制的,为氨基酸序列如SEQ.ID.NO:1、SEQ.ID.NO:2或SEQ.ID.NO:3所示的表位肽。
5.如权利要求4所述的HTNV-Gn/Gc特异性的CTL表位肽,其特征在于,SEQ.ID.NO:1、SEQ.ID.NO:2或SEQ.ID.NO:3所示的表位肽与HLA-A*02分子结合并递呈后,能够诱导CD8+T细胞产生细胞免疫应答。
6.权利要求4所述的HTNV-Gn/Gc特异性的CTL表位肽在制备抗汉滩病毒的CTL表位肽疫苗中的应用。
7.权利要求4所述的HTNV-Gn/Gc特异性的CTL表位肽在制备诱导产生CTL表位肽特异性的细胞毒性T细胞药物试剂中的应用。
8.权利要求2所述的HTNV-Gn/Gc特异性的HLA-A*02/表位肽-复合物四聚体在制备检测HTNV-Gn/Gc表位肽特异性T细胞频率的药物试剂中的应用。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,将荧光素标记的HLA-A*02/表位肽-复合物四聚体与CTL细胞结合后,通过流式细胞仪检测,分辨HTNV-Gn/Gc表位肽特异性T细胞的频率。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310297954.9A CN103421118B (zh) | 2013-07-16 | 2013-07-16 | HTNV-Gn/Gc特异性CTL表位肽及其聚合物和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310297954.9A CN103421118B (zh) | 2013-07-16 | 2013-07-16 | HTNV-Gn/Gc特异性CTL表位肽及其聚合物和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103421118A CN103421118A (zh) | 2013-12-04 |
CN103421118B true CN103421118B (zh) | 2015-03-25 |
Family
ID=49646531
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310297954.9A Active CN103421118B (zh) | 2013-07-16 | 2013-07-16 | HTNV-Gn/Gc特异性CTL表位肽及其聚合物和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103421118B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MA45491A (fr) * | 2016-06-27 | 2019-05-01 | Juno Therapeutics Inc | Épitopes à restriction cmh-e, molécules de liaison et procédés et utilisations associés |
CN106046125B (zh) * | 2016-06-30 | 2020-04-24 | 中国人民解放军第四军医大学 | Htnv gp上的ctl表位肽及其筛选方法和应用 |
CN107141355B (zh) * | 2017-05-31 | 2021-05-14 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种htnv抗原表位线性串联多肽及表位肽-复合物四聚体和应用 |
CN110548136A (zh) * | 2018-05-30 | 2019-12-10 | 王美亮 | 汉坦病毒长肽疫苗 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102399265B (zh) * | 2011-10-28 | 2014-06-25 | 中国人民解放军第四军医大学 | Htnv-np 特异性的ctl 表位肽及其应用 |
CN102731623B (zh) * | 2012-06-08 | 2013-09-18 | 中国人民解放军第四军医大学 | 鼠源性单克隆抗体3d8识别的汉滩病毒糖蛋白中和表位肽及应用 |
-
2013
- 2013-07-16 CN CN201310297954.9A patent/CN103421118B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103421118A (zh) | 2013-12-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kirtipal et al. | From SARS to SARS-CoV-2, insights on structure, pathogenicity and immunity aspects of pandemic human coronaviruses | |
Tscharke et al. | Poxvirus CD8+ T-cell determinants and cross-reactivity in BALB/c mice | |
Schwartz et al. | Biology and pathogenesis of chikungunya virus | |
Anderson et al. | Prevalence and genetic characterization of Powassan virus strains infecting Ixodes scapularis in Connecticut | |
CN111548396B (zh) | 一种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 | |
Han et al. | Prevalence of tick‐borne encephalitis virus in Ixodes ricinus ticks in Finland | |
CN103421118B (zh) | HTNV-Gn/Gc特异性CTL表位肽及其聚合物和应用 | |
Ma et al. | Hantaan virus infection induces both Th1 and ThGranzyme B+ cell immune responses that associated with viral control and clinical outcome in humans | |
US20190389940A1 (en) | Construction and application of recombinant gene for chimeric antigen receptor for treating hiv infection | |
Pego et al. | Mayaro virus disease | |
CN114751965B (zh) | 一种新型冠状病毒t细胞抗原表位肽及其在制备疫苗中的应用 | |
Wahid et al. | Scoping review of Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHF) literature and implications of future research | |
CN101235085B (zh) | 抗西尼罗病毒膜蛋白e的单克隆抗体及其应用 | |
Jewett | The potential effect of novel coronavirus SARS-CoV-2 on NK cells; a perspective on potential therapeutic interventions | |
Li et al. | Identification of host cell binding peptide from an overlapping peptide library for inhibition of classical swine fever virus infection | |
Tomazatos et al. | Discovery and genetic characterization of a novel orthonairovirus in Ixodes ricinus ticks from Danube Delta | |
CN106867974A (zh) | 柯萨奇病毒a6型感染动物模型及其制备方法与应用 | |
CN114767847B (zh) | 新冠重组蛋白疫苗佐剂及其应用 | |
CN108117583B (zh) | 一种免疫增强剂及其应用 | |
Gaido et al. | Immunodominant T-cell epitopes in the VP1 capsid protein of rhinovirus species A and C | |
CN105567660A (zh) | 一种大肠杆菌重组表达结核分枝杆菌Rv2837c活性蛋白的方法及其应用 | |
Moulton et al. | Ectromelia virus inhibitor of complement enzymes protects intracellular mature virus and infected cells from mouse complement | |
CN102731617B (zh) | 汉滩病毒糖蛋白特异性t细胞表位肽及其应用 | |
CN107141355B (zh) | 一种htnv抗原表位线性串联多肽及表位肽-复合物四聚体和应用 | |
Xu et al. | Newcastle disease virus-like particles containing the Brucella BCSP31 protein induce dendritic cell activation and protect mice against virulent Brucella challenge |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |