CN102399265B - Htnv-np 特异性的ctl 表位肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了HTNV-NP特异性的CTL表位肽及其应用，所述的CTL表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1～12所示。本发明提供的HTNV-NP特异性的CTL表位肽，尤其是其中HLA-I类分子限制性表位多肽，可诱导CD8⁺T细胞产生强烈的细胞免疫应答，分泌高水平IFN-γ。可应用于CTL表位肽疫苗的制备，或应用于诱导产生CTL表位肽特异性的细胞毒性T细胞，或应用于制备CTL表位肽致敏的抗原提呈细胞，在HFRS特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。

Description

HTNV-NP 特异性的CTL 表位肽及其应用

技术领域

本发明属于汉滩病毒的防治技术领域，涉及HTNV-NP特异性的的CTL表位肽及其应用，尤其是HLA-I类分子限制的CTL表位肽。 

背景技术

汉滩病毒(hantaan virus，HTNV)是《禁止生物武器公约》议定书核查范围的病原微生物中一种重要的病毒，属于布尼亚病毒科汉坦病毒属(Hantavirus，HTV)，是HTV的原型。HTV属病毒均为单股负链RNA有包膜病毒，基因组包括大(L)、中(M)、小(S)三个片段，其中L片段编码RNA聚合酶，M片段编码包膜糖蛋白1和2(glycoprotein 1，G1/Gn和glycoprotein 2，G2/Gc)，S片段编码核蛋白(nucleocapsid protein，NP)。1978年李镐汪等首先分离出的HTNV 76-118株是HTNV的代表株，也是在我国引起肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)的主要病原体之一。 

HFRS是一种以发热、出血和急性肾功能损害为特征的急性传染病，典型病例可有发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期五期经过，同时存在有大量轻型非典型病例，并可见多种非典型的特殊临床表现。人群对HTNV有较普遍的易感性，在人口密集，带病毒鼠数量多的条件下容易出现爆发和流行。全球每年HFRS发病人数达10万例，死亡率在2％～10％左右，90％以上病例发生在我国，已成为我国目前死亡人数最多的传染病之一。HFRS在我国分布广，发病率和病死率较高，并且新疫区仍不断出现，在广大农村、城镇和林区部分疫点还时有爆发，严重危害我国人民的生命和健康，威胁和影响工农业生产、经济开发、外贸及旅游事业的发展，是国家重点防治的传染病之一。 

HFRS是一种急性自限性疾病，但发病机理尚不清楚。在病毒感染过程 中，T细胞通过识别抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)-I类或II类分子与抗原肽表位形成的复合体，发挥清除病原体的效应。HTNV特异性CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞(细胞毒性T细胞，cytotoxic T lymphocyte，CTL)在清除病毒和HFRS的发病机制中均发挥重要作用。HTNV感染所诱导的特异性CTL识别与MHC-I类分子结合的内源性肽，长度多为8-10个氨基酸。 

在HTNV的三种结构蛋白中，NP的氨基酸序列最为保守，在HTV属各成员之间的同源性较高，且是在急性期引起强烈免疫应答的主要病毒抗原，因此对HTNV的细胞免疫研究主要集中在NP上。尽管细胞免疫应答在HFRS发生、发展和疾病的转归中起着重要作用，但迄今为止，对HTNV结构蛋白上的T细胞表位的研究只有零星报道。这种研究现状大大限制了人们对HTNV感染后适应性免疫应答规律及其与免疫保护或免疫损伤关系的认识，也限制了人们利用多肽疫苗对疾病进行治疗及控制的研究。 

合成肽疫苗是近年来出现的新型疫苗研究方向，合成肽能够直接与MHC分子结合，而不需要APC的加工处理，它与天然的内源性肽在激活免疫系统方面具有相同的效果，因此合成肽疫苗广泛应用于抗病毒免疫治疗。目前已有多种基于多肽表位的合成肽疫苗进入临床研究阶段或已上市。 

建立在CTL表位鉴定基础之上的CTL表位肽疫苗，由于人工合成多肽不包含病原生物的无关成分，只诱导特异性CTL应答，因此安全、稳定、毒副作用少，且研制周期大大缩短。更重要的是，基于CTL表位研发的多个CTL表位组合，还可设计针对一种或多种病原体的多价CTL表位肽疫苗。因此CTL表位合成肽疫苗已成为防治HTNV感染研究的一个新策略，而对HTNV特异的CTL表位进行鉴定即成为研究的关键。 

由于HTNV感染引起的HFRS有较高的发病率和死亡率，但迄今为止仍无特异的预防和治疗方法。因此迫切需要研发可用于预防和治疗HTNV感染 的安全性高且特异性高的表位肽疫苗。 

发明内容

本发明解决的问题在于提供HTNV-NP特异性的CTL表位肽及其应用，所提供的表位肽可诱导CD8⁺T细胞产生强烈的细胞免疫应答，分泌高水平IFN-γ，可应用于HTNV多肽疫苗或CTL表位肽疫苗的制备。 

本发明是通过以下技术方案来实现： 

HTNV-NP特异性的CTL表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1～12所示。 

所述的HTNV-NP特异性的CTL表位肽中，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12所示的表位肽与HLA-I类分子结合并递呈后，可诱导CD8⁺T细胞产生细胞免疫应答。 

所述的HLA-I类分子限制性表位多肽应用于CTL表位肽疫苗的制备，或应用于诱导产生CTL表位肽特异性的细胞毒性T细胞，或应用于制备CTL表位肽致敏的抗原提呈细胞。 

一种HTNV-NP特异性的CTL表位肽致敏的抗原提呈细胞，是将CTL表位肽与包含其相匹配HLA-I类分子的抗原提呈细胞，在含20％体积分数FCS的RPMI 1640培养液中共同孵育，37℃过夜，洗涤去除游离的CTL表位肽，获得CTL表位肽致敏的抗原提呈细胞； 

所述的CTL表位肽相与其相匹配HLA-I类分子分别为： 

SEQ ID NO：1所示的CTL表位肽与HLA-A*02分子相匹配； 

SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示的CTL表位肽均与HLA-B*35分子相匹配； 

SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12所示的CTL表位肽均与HLA-A*33分子相匹配； 

SEQ ID NO：6所示的CTL表位肽与HLA-A*11分子相匹配； 

SEQ ID NO：11所示的CTL表位肽与HLA-B*07分子相匹配。 

所述的抗原提呈细胞为用B95-8细胞系培养上清转换外周血单个核细胞获得的B淋巴母细胞系； 

所述的转换为：调整外周血单个核细胞密度为5×10⁵/ml，加入等体积B95-8细胞系培养上清，培养3～4周，每周添加含体积分数20％FCS的RPMI1640，直至形态学观察确认转化成功。 

所述的外周血单个核细胞为预先在液氮中，在转化前复苏。 

与现有技术相比，本发明的有益效果在于： 

本发明提供的HTNV-NP特异性的CTL表位肽，尤其是其中HLA-I类分子限制性表位多肽，可诱导CD8⁺T细胞产生强烈的细胞免疫应答，分泌高水平IFN-γ。 

由于HLA高度多态性，因此系统鉴定出的HTNV-NP上的T细胞表位和我国汉族常见HLA等位基因限制的CTL表位，可应用于CTL表位肽疫苗的制备，或应用于诱导产生CTL表位肽特异性的细胞毒性T细胞，或应用于制备CTL表位肽致敏的抗原提呈细胞，在HFRS特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。 

附图说明

图1为T细胞阳性15肽表位在HTNV-NP上的分布示意图； 

图2为T细胞阳性15肽表位在HTNV-NP序列中的分布示意图； 

图3-1～3-3分别为15肽诱导3例HFRS患者的PBMC NO.40、NO.1、NO.28产生的T细胞应答的结果图； 

图4为EB病毒转化的B淋巴母细胞的放大示意图(倒置显微镜，200×)； 

图4-1～4-8分别为8个HTNV-NP CTL 9肽表位的HLA-I类分子限制性 的示意图。 

具体实施方式

本发明首先通过合成覆盖HTNV 76-118株NP区全长的部分重叠15肽，利用ELISPOT及磁珠分离技术，系统鉴定出NP上的CD4⁺和CD8⁺T细胞15肽表位，结合生物信息学SYFPEITHI、ANN、BIMAS等T细胞表位预测软件预测，选择合成多条可能诱导机体产生CTL效应的9肽。应用ELISPOT技术对其免疫原性进行评估，鉴定出可诱导CD8⁺T细胞应答的CTL 9肽表位。用EB病毒(EB virus，EBV)转化HFRS患者PBMC，建立EBV转化的B-LCL，以加载相应9肽的HLA-I类等位基因全部或部分匹配的B-LCL为抗原提呈细胞，以磁珠分离的CD8⁺T细胞作为效应细胞，应用ELISPOT确定CTL 9肽表位的HLA限制性。下面对本发明作详细的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。 

1、HTNV-NP特异性的CTL表位肽的克隆及筛选 

IFN-γELISPOT方法筛选HTNV-NP特异性T细胞阳性15肽表位 

首先分离HFRS患者静脉抗凝血中的PBMC(Peripheral blood mononuclear cell，外周血单个核细胞)，抗原肽先分成10个混合肽组，每组包含7条15肽，将PBMC与合成的NP15肽孵育，筛选出可刺激患者PBMC分泌IFN-γ的阳性混合肽组。进一步确定该混合肽组中能诱导T细胞应答的单个15肽后，采用免疫磁珠分离PBMC中的CD8⁺或CD4⁺T细胞，以特定单个阳性15肽加载CD8^-PBMC(去除CD8⁺T细胞含CD4⁺T细胞)或CD4 ^-PBMC(去除CD4⁺T细胞含CD8⁺T细胞)作为APC，刺激CD8⁺或CD4⁺T细胞，ELISPOT确定该15肽是CD4⁺T细胞15肽表位还是CD8⁺T细胞表位的15肽。 

1.1从HFRS患者外周血中分离PBMC(外周血单核细胞) 

根据我国肾综合征出血热临床诊断标准(血清抗HTNV IgM抗体和临床 症状)，无菌采集HFRS患者不同病情(轻型、中型、重型和危重型)、不同病期(发热期、低血压休克期、少尿期、多尿期和恢复期)的外周血并加入肝素钠抗凝(50U/ml)，对不同的采集情况进行编号(共采集52例)。然后将采集的外周血用等量无血清RPMI 1640稀释混匀，用弯头吸管将已稀释的抗凝血缓缓叠加在淋巴细胞分离液上(在50ml离心管里预先加入10ml淋巴细胞分离液，购自天津灏洋生物公司)，2000rmp去刹车离心20min，小心吸取两层界面处得白色云雾层，用5倍体积的RPMI 1640洗涤，1500rpm离心10min，再洗涤2次，获得HFRS患者外周血中分离的PBMC(外周血单核细胞)；直接用于后续使用或用冻存液(90％FCS，10％DMSO)重悬细胞，液氮冻存备用。 

1.2ELISPOT(固相酶联免疫斑点技术)筛选能够刺激HFRS患者PBMC产生特异性应答(分泌IFN-γ)的HTNV-NP阳性15肽 

HTNV(病毒株76-118)的NP由429个氨基酸残基组成，可以由NCBI网站的蛋白质数据库(P05133)获得其具体的蛋白序列。从N端开始，依次合成部分重叠肽，每条肽长度为15个氨基酸残基，相邻两条肽重叠9个氨基酸残基，共合成70条15肽，从N端开始将15肽依次命名为NP1～NP70。具体委托西安联美生物公司合成。所有合成肽均经RP-HPLC测定，纯度在50％以上。 

将70条多肽随机分成10组，采用商品化IFN-γELISPOT试剂盒(购自Mabtech公司)筛选可刺激PBMC分泌IFN-γ的阳性混合肽组，按照说明书进行操作如下： 

复苏冻存的HFRS患者PBMC，用10％FCS/RPMI 1640培养液培养20～24h。用15μg/ml鼠抗人IFN-γmAb 50μl(1-D1K)包被96孔PVDF滤膜板，4℃过夜。PBS洗6遍，用10％FCS/RPMI 1640培养液于37℃封闭1h后，每孔加入2×10⁵～5×10⁵个PBMC，依次加入10组混合肽(每种15肽的终浓度 为20μmol/L)。同时设阳性和阴性对照孔，阳性对照孔加入PHA(终浓度为10μg/ml)，阴性对照孔不加15肽和PHA。 

37℃、5％CO₂孵育14～18h后洗板，再加入1μg/ml生物素化鼠抗人IFN-γmAb 50μl(7-B6-1-Biotin)，室温孵育3h，洗板后加入碱性磷酸酶(ALP)-链霉亲和素50μl，室温孵育1～2h，洗板后加入BCIP/NBT显色液100μl，室温避光显色1h，自来水冲洗，晾干后，用ELISPOT读数仪测定斑点数，每孔斑点数≥5即为阳性孔。计算IFN-γ斑点形成细胞数即T细胞频率，以分泌IFN-γ的细胞数/10⁵PBMC表示。计算式为： 

T细胞频率＝[(阳性孔的斑点数-阴性对照孔的斑点数)/每孔PBMC总数]×10⁵

进一步，将筛选得到的阳性混合肽组中的每条肽依次利用商品化IFN-γELISPOT试剂盒进行鉴定，得到可刺激HFRS患者PBMC分泌IFN-γ的单个阳性15肽。具体实施方式与混合肽组筛选相同，区别在于每孔加入单个15肽(终浓度为20μmol/L)。 

1.3CD4⁺/CD8⁺T细胞的分离及单个阳性15肽CD4⁺/CD8⁺T细胞表位的鉴定 

首先应用EB病毒(EB virus，EBV)转化HFRS患者PBMC建立B淋巴母细胞系(B-LCL)，并对其表型进行鉴定，具体操作如下： 

用添加20％FCS的RPMI 1640培养B95-8细胞系(EBV高产株)，至对数生长时调整细胞密度为1×10⁶/ml，在CO₂培养箱中连续培养10天，中间不换液。至第10天收集培养上清，离心去除细胞，0.22μm过滤，分装后-80℃保存备用。 

调整患者PBMC细胞密度为5×10⁵/ml，加入等体积B95-8培养上清液，培养3～4周，每周加含20％FCS的RPMI 1640 0.5ml，形态学观察确认转化成功后，用CD19、CD20和HLA-DR mAb鉴定其为B细胞表型，冻存备用。 

在具体操作过程中，可先冻存HFRS患者PBMC，而后对PBMC进行EBV转化B淋巴母细胞的操作。经液氮冻存复苏后的PBMC，其EBV转化的成功率明显提高。 

流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测B-LCL膜表面CD19和HLA-DR的表达。采用直接免疫荧光染色法检测CD19表达情况。采用间接免疫荧光染色法检测膜表面HLA-DR表达情况。结果显示B-LCL可表达CD19和HLA-DR，证明所建系者为B细胞系。 

采用商品化CD4⁺/CD8⁺T细胞阳性分离试剂盒(购自Dynal公司)，按照说明书进行操作，分离HFRS患者PBMC中CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞，具体如下： 

取25μl即1×10⁷CD4磁珠(Dynabeads)，用1ml Buffer1(无Ca²⁺、Mg²⁺PBS w/0.1％BSA，2mM EDTA，pH7.4)重悬混匀，在磁架上静置1min，弃上清，去除游离抗体。复苏HFRS患者PBMC，用Buffer1调整细胞浓度为1×10⁷/ml，加入用Buffer1重悬并洗涤过的CD4 Dynabeads，2-8℃孵育20min。取出后在磁架上静置2min，与磁珠结合的沉淀即为CD4⁺T淋巴细胞。同时收集上清，上清中为含CD8⁺T淋巴细胞的CD4^-PBMC，用于进一步分离CD8⁺T细胞。 

用1ml Buffer1重悬磁珠结合的CD4⁺T淋巴细胞，在磁架上静置1min，弃上清，重复洗涤3次。然后再用100μl Buffer2(RPMI 1640/1％FCS)重悬磁珠结合的细胞，加入10μl CD4⁺T细胞分离磁珠(Detachabeads)，室温孵育45min，磁架上静置1min，吸取上清，用500μl Buffer2洗涤磁珠3次，收集所有上清，加入Buffer2至总体积为10ml，1200rpm×5min离心，去除Detachabeads，用20％FCS RPMI 1640培养基重悬培养，即为细胞表面无磁珠无抗体的CD4⁺T细胞。 

从上述操作中收集到含CD8⁺T淋巴细胞的CD4^-PBMC上清中分离 CD8⁺T细胞，采用商品化CD8⁺T细胞阳性分离试剂盒(购自Dynal公司)，具体操作与CD4⁺T细胞分离步骤相同，获得细胞表面无磁珠无抗体的CD8⁺T细胞。 

对磁珠分离获得的CD4⁺或CD8⁺T细胞进行免疫荧光染色和FCM分析，鉴定其纯度。调整细胞浓度为4×10⁶/ml，取50μl CD4⁺/CD8⁺T细胞悬液，加入藻红蛋白(Phycoerythrin，PE)标记的CD4或CD8单克隆抗体，同型对照组加入PE-IgG1，4℃孵育30min，用FACS洗涤液洗3次后，用适量FACS固定液固定，流式细胞仪分析。结果显示CD4⁺或CD8⁺T细胞的纯度均在95％以上。 

再次采用商品化IFN-γELISPOT试剂盒，按照说明书进行操作，对筛选得到的单个阳性15肽分别进行CD4⁺T细胞表位和CD8⁺T细胞表位的鉴定，具体操作如下： 

已建立的HFRS患者自身B-LCL做为抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)加载15肽：20％FCS RPMI 1640培养并调整B-LCL密度为5×10⁵/ml，根据待测15肽条数将B-LCL加入24孔板中，每孔1ml，再分别加入待检测单个阳性15肽，使其终浓度达20μmol/L，37℃加载过夜。取出后用不完全RPMI 1640洗涤2遍去除游离15肽，1200rpm×5min离心后，加入100μl 20％FCS RPMI 1640重悬混匀，待用。 

用15μg/ml鼠抗人IFN-γmAb 50μl(1-D1K)包被96孔PVDF滤膜板，4℃过夜。PBS洗6遍，用10％FCS/RPMI 1640培养液于37℃封闭1h后，每孔加入1×10⁴～5×10⁴个CD4⁺T细胞或CD8⁺T细胞，再加入15肽预加载过的B-LCL，每孔5×10⁴个，共同孵育过夜。同时设阳性和阴性对照孔，阳性孔加入PHA(终浓度为10μg/ml)，阴性孔不加肽和PHA。洗板后加入1μg/ml生物素化鼠抗人IFN-γmAb 50μl(7-B6-1-Biotin)，室温孵育3h，洗板后加入ALP-链霉亲和素50μl，室温孵育1～2h，洗板后加入BCIP/NBT显色液100μl， 室温避光显色1h，自来水冲洗，晾干后，用ELISPOT读数仪测定斑点数。每孔斑点数≥5即为阳性孔。计算IFN-γ斑点形成细胞数即T细胞频率，以分泌IFN-γ的细胞数/10⁵PBMC表示。计算式为： 

T细胞频率＝[(阳性孔的斑点数-阴性对照孔的斑点数)/每孔PBMC总数]×10⁵

在对HFRS患者分离出的PBMC与15肽的ELISPOT检测中，有18例患者分离的PBMC可对8组混合肽产生特异性应答，最终从15例产生应答的分离的PBMC中鉴定出23个HTNV-NP特异的T细胞表位，其在HTNV-NP上的分布如图1所示，其具体的序列和分布如图2所示。 

图1中的横坐标为合成的HTNV-NP15肽编号，纵坐标为其PBMC可对HTNV-NP15肽产生特异性细胞免疫应答的患者数，越多的人数的PBMC对对相应15肽产生免疫应答，表明该条15肽越有可能为HTNV-NP的优势表位。 

其中可刺激CD4⁺T细胞产生IFN-γ的单个阳性15肽7条(NP22、NP23、NP25、NP41、NP42、NP60、NP61)，刺激CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的单个阳性15肽为19条(NP11、NP20、NP22、NP24、NP28、NP29、NP30、NP33、NP35、NP36、NP37、NP41、NP42、NP43、NP46、NP47、NP58、NP60、NP70)，其中可同时刺激CD4⁺T和CD8⁺T细胞产生IFN-γ的15肽为4条(NP22、NP41、NP42、NP60)。 

具体的3例HFRS患者CD4⁺和/或CD8⁺T细胞对相应15肽的应答如图3所示：在NO.40患者的PBMC刺激反应中(图3-1)，NP30仅可刺激NO.40患者CD8⁺T细胞产生应答，NP22和NP36均可刺激NO.40患者的CD4⁺和CD8⁺T细胞产生IFN-γ，提示NP22和NP36中可能同时包含有CTL表位和CD4⁺T细胞表位；在NO.1患者的PBMC刺激反应中(图3-2)，NP21和NP22仅可刺激NO.1患者CD8⁺T细胞产生应答；而在NO.28患者的PBMC刺激 反应中(图3-3)，NP58和NP60均可刺激NO.28患者的CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞产生应答，提示NP58和NP60中可能同时包含有CTL表位和CD4⁺T细胞表位。 

2、HTNV-NP特异性9肽CTL表位的确定 

所筛选出的可诱导CD8⁺T细胞或同时诱导CD4⁺和CD8⁺T细胞分泌IFN-γ的15肽，需按此15肽序列合成7条9肽(即从N端开始第1到第7位的氨基酸残基分别作为起始氨基酸残基，分别计作该15肽下的第1～7条9肽)，进一步筛选出刺激CD8⁺T细胞的9肽表位。 

在具体操作时可以对每条阳性15肽进行筛选，而为减少合成肽数目，还可以采用生物信息学方法包括SYFPEITHI、ANN、BIMAS等对阳性15肽进行表位预测。采用javaNNS version1.1建立完全连接的前馈ANN模型，无、低、中和高亲和力9肽训练ANN的输出值分别为0.1、0.4、0.6和0.8，预测分值≥0.4表示该肽被预测为结合肽，若分值＜0.4则表示被预测为非结合肽。采用在线预测软件BIMAS预测肽-HLA复合物的1/2解离时间(T_1/2)，默认T_1/2≥100min。SYFPEITHI根据其每个位置上氨基酸残基是锚定氨基酸、辅助锚定氨基酸还是优先氨基酸赋予不同的分值，对结合有负作用的氨基酸为负值。结合三种预测方法结果人工合成9肽。所有合成肽均经RP-HPLC测定，纯度在80％以上。 

将合成的9肽先用适量DMSO溶解，再用PBS配成浓度为1mmol/L的溶液，分装后-70℃冻存备用。用ELISPOT方法，利用IFN-γ作为检测目标检测9肽对T细胞的特异性刺激，筛选出阳性的表位肽，具体的操作如前所述。每孔斑点数≥5即为阳性孔。计算IFN-γ斑点形成细胞数即CD8⁺T细胞频率，以分泌IFN-γ的细胞数/10⁵PBMC表示。计算式为： 

CD8⁺T细胞频率＝[(阳性孔的斑点数-阴性对照孔的斑点数)/每孔PBMC总数]×10⁵

结果共鉴定出12条CTL 9肽表位，如表1所示(其中在编号中，NP后的前两位代表15肽的编号，第三位代表9肽在15肽中的编号)。 

表1产生免疫应答的12条CTL 9肽表位的位置及序列 

编号	起始位置	氨基酸序列
			NP22-3	aa129-aa137	FVVPILLKA
NP22-4	aa130-aa138	VVPILLKAL
			NP22-5	aa131-aa139	VPILLKALY
NP28-5	aa167-aa175	DVNGIRKPK
			NP30-2	aa176-aa184	HLYVSLPNA
NP33-6	aa198-aa206	YRTAVCGLY
			NP36-4	aa214-aa222	QMISPVMSV
NP41-5	aa245-aa253	KLLPDTAAV
			NP41-6	aa246-aa254	LLPDTAAVS
NP42-1	aa247-aa255	LPDTAAVSL
			NP43-6	aa258-aa266	GPATNRDYL
NP47-1	aa277-aa285	ETKESKAIR

3、HTNV-NP特异性CTL 9肽表位HLA-I类分子限制性的确定 

主要包括HTNV特异性T细胞应答患者HLA基因分型，HTNV-NP表位特异性CD8⁺T细胞系的建立，以及HTNV-NP CD8⁺T细胞表位的HLA-I类分子等位基因限制性的鉴定。方法如下： 

3.1HTNV-NP特异性T细胞应答患者的HLA-I、II类位点的基因分型。 

进行T细胞应答患者的HLA-I、II类位点的基因分型，选择HLA等位基因位点部分匹配的一组B-LCL加载并提呈9肽表位，分析能刺激HFRS患 者的CD8⁺T细胞产生特异性免疫应答的9肽表位的HLA-I类分子等位基因限制性。 

委托北京市血液中心HLA分型实验室进行。采用PCR-SSP高分辨分型技术，用患者全血(2ml)或所建立的EBV转化的B细胞系(5×10⁶)进行HLA-I类(A、B、Cw)和II类(DR、DP、DQ)位点的基因分型。 

由于HLA高度多态性，因此系统鉴定出的HFRS患者中HTNV-NP上的T细胞表位和我国汉族常见HLA等位基因限制的CTL表位，不仅在揭示HFRS发病机理方面具有重要的理论意义，而且可以为设计新型HTNV多肽疫苗提供可靠的实验依据，为制订新的临床治疗策略提供重要的理论依据，在HFRS特异性免疫治疗领域中有着良好的开发应用前景。而我国西北地区汉族人群中HLA-A*02的基因频率最高，占29.41％，其次为A*11和A*24，频率分别为19.01％和16.14％。这些分子及其限制的表位肽可作为优先选择应用于疫苗设计。 

3.2HTNV-NP9肽表位特异性CD8⁺T细胞系的建立 

用免疫磁珠分离表位肽阳性反应患者PBMC中的CD8⁺T细胞，取部分CD8⁺T细胞，用PE-CD8 mAb或同型对照染色30min后，FCM分析其纯度，保证使其细胞纯度达到95％以上。将CD8^-PBMC(1×10⁶/孔，作为APC)与合成目的抗原9肽(终浓度为10μmol/L)孵育过夜，经⁶⁰Co照射(30Gy)后，加入磁珠分离的CD8⁺T细胞(5×10⁵/孔)，37℃，20％FCS RPMI 1640条件下共同培养，第2天加入重组IL-2(rhIL-2，终浓度为50U/mL)，每3天半量换液1次，并补加rhIL-2，建立短期培养的9肽表位特异性CD8⁺T细胞系，培养10天左右。 

以建立的短期培养的CD8⁺T细胞为效应细胞(5×10⁴/孔)，以加载过相应抗原9肽的患者自身B-LCL为APC(5×10⁴/孔)(具体加载方法同1.3中所描述)，用ELISPOT方法(具体操作同1.2中所描述)确定短期建系的CD8⁺T 细胞系为目的9肽表位抗原特异性T细胞系。 

3.3HTNV-NP CD8⁺T细胞9肽表位HLA-I类分子等位基因的限制性分析 

以短期培养的CD8⁺T细胞(5×10⁴/孔)系作为效应细胞，用加载了相应9肽的自身B-LCL或HLA部分相配的异源B-LCL作为APC(5×10⁴/孔)，应用ELISPOT方法确定CTL表位的HLA-I类分子等位基因限制性。 

如图4所示为建立的HFRS患者的B-LCL细胞系。一般在3-4周内即可建株。最快的在转化第3天即可出现小克隆，18天即可建株，最慢需2-3月才能建株，似有明显个体差异。B-LCL在培养瓶中成悬浮生长，一般2-3天传代一次，有明显的密度依赖性。 

图4所示为8个HTNV-NP CTL 9肽表位的HLA-I类分子限制性。其中NP22-3(FVVPILLKA)(图4-1)受HLA-A*02限制；NP22-5(VPILLKALY)(图4-2)、NP41-6(LLPDTAAVS)(图4-3)和NP42-1(LPDTAAVSL)(图4-4)受HLA-B*35的限制；NP28-5(DVNGIRKPK)(图4-5)和NP47-1(ETKESKAIR)(图4-6)受HLA-A*33的限制；NP43-6(GPATNRDYL)(图4-7)受HLA-B*07限制；NP33-6(YRTAVCGLY)(图4-8)受HLA-A*11限制。 

所鉴定的9肽CTL表位可诱导CD8⁺T细胞产生强烈的细胞免疫应答，而且鉴定其HLA等位基因限制性之后，就可以用与HLA等位基因限制位点相配的同种异体B-LCL作为APC加载相应的9肽CTL表位，制成CTL表位肽疫苗，刺激CD8⁺T细胞产生细胞免疫应答。应用于CTL表位肽疫苗的制备，或应用于诱导产生CTL表位肽特异性的细胞毒性T细胞，或应用于制备CTL表位肽致敏的抗原提呈细胞。 

Claims (4)

1.HTNV-NP特异性的CTL表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO：6所示，所述的表位肽与HLA-A*11分子结合并递呈后，可诱导CD8⁺T细胞产生细胞免疫应答。

2.权利要求1所述的HTNV-NP特异性的CTL表位肽应用于CTL表位肽疫苗的制备。

3.一种HTNV-NP特异性的CTL表位肽致敏的抗原提呈细胞，其特征在于，是将CTL表位肽与包含其相匹配HLA-Ⅰ类分子的抗原提呈细胞，在含20%体积分数FCS的RPMI1640培养液中共同孵育，37℃过夜，洗涤去除游离的CTL表位肽，获得CTL表位肽致敏的抗原提呈细胞；

所述的抗原提呈细胞为用B95-8细胞系培养上清转化外周血单个核细胞获得的B淋巴母细胞系；

所述的CTL表位肽与其相匹配HLA-Ⅰ类分子分别为：

SEQ ID NO：6所示的CTL表位肽与HLA-A*11分子相匹配。

4.如权利要求3所述的HTNV-NP特异性的CTL表位肽致敏的抗原提呈细胞，其特征在于，所述的转化为：调整外周血单个核细胞密度为5×10⁵/ml，加入等体积B95-8细胞系培养上清，培养3～4周，每周添加含体积分数20%FCS的RPMI1640，直至形态学观察确认转化成功；所述的外周血单个核细胞为预先在液氮中，在转化前复苏。

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