CN101565455B - 禽流感h5n1病毒的ctl表位多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其应用。本发明提供的禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽，为如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与禽流感H5N1病毒的CTL表位相关的由序列1衍生的多肽。本发明还保护编码所述多肽的DNA。本发明所述的表位多肽可用于制备针对禽流感H5N1病毒的疫苗，也可用于制备检测H5N1病毒特异性T细胞的试剂盒。本发明具有重大价值。

Description

禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其应用。

背景技术

人禽流感H5N1病毒是一种来源于禽类的高致病性、高致死率的流感病毒亚型。1997年在香港首先爆发了人禽流感的感染，18人感染，其中6人死亡。到2003年，世界范围内又重新出现了人禽流感病例。从2003年底至今，已有408例感染，其中205例死亡。人禽流感的传播方式一般是从禽类传染给人，人和人之间的直接传染只是偶发现象。但是，一旦病毒通过突变或者与人流感病毒基因发生重排，就可能产生适应在人体复制和人与人直接传播的新毒株，导致流感大流行。虽然目前没有观察到H5N1病毒持续的人到人的传播，但是20世纪的3次流感大流行都起源于鸟类的流感病毒，其中1918-1919年流感大流行夺去了四千万人口的生命。据估计，下一次流感大流行造成的死亡数字将远高于此。因此，为应对流感大流行做准备是十分紧迫的任务。

机体的免疫系统是抵御病毒入侵的重要纺线，研制高效的疫苗，激发人体的保护性免疫反应是防治高致病性禽流感最重要的手段。机体的免疫系统有体液免疫和细胞免疫两个分支。体液免疫是由抗体介导的。流感病毒通过其血凝素(HA)糖蛋白结合细胞表面的唾液酸残基而粘附在宿主细胞表面，再通过内吞作用以及随后的病毒囊膜和宿主细胞膜的融合而进入细胞。病毒HA对于流感病毒致病力和病毒感染的宿主范围起着关键的作用，同时HA也是体液免疫的主要靶抗原。HA特异性抗体起着阻断病毒粘附的作用，从而抑制病毒感染细胞。

与体液免疫不同，细胞免疫是由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)所介导的。病毒感染细胞后，病毒蛋白质被细胞内的蛋白酶分解成多肽，被转运到内质网中，再被装载到主要组织相容性复合体(MHC)I类分子上。然后多肽-MHC复合物通过高尔基体被转运到细胞表面，再被CTL(CD8⁺T细胞)识别。CTL识别MHC分子提呈的病毒多肽后，分泌具有抗病毒活性的细胞因子，如IFN-γ和TNF-α，以及具有裂解细胞作用的穿孔素，从而杀伤被病毒感染的细胞，限制病毒的复制和传播，进而清除病毒。这些被CTL识别的病毒多肽就是相应的MHC限制性的CTL表位。细胞免疫虽然可能不能预防病毒感染细胞，但是可以通过清除被病毒感染的细胞防止流感病毒导致的严重疾病和死亡。

目前禽流感H5N1的检测方法包括病原学方法、血清学方法和核酸检测方法。

通过病毒的分离鉴定是禽流感的经典病原学方法。该方法检测结果准确可靠、灵敏(极少量病毒也可检出)，但操作程序繁杂、费用高、实验室要求高(国家规定必须在P3级实验室进行)、耗时费力、周期长(检测时间需1-3周)，大面积应用推广受到较大限制。

目前共有6种血清学检测技术，分别是：血凝抑制试验(HI)、微量中和试验(MNT)、免疫荧光技术(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、胶体金免疫层析分析(GICA)和蛋白免疫印迹(western blot)。这些方法都是利用抗原抗体之间的特异性反应，来确定病毒亚型或者某种亚型特异性抗体的滴度。血凝抑制试验和琼脂扩散实验操作简便快速，但灵敏度较低。微量中和试验虽然灵敏度高，但操作繁琐耗时。免疫荧光技术灵敏度高，但需要复杂昂贵的仪器设备，应用受到限制。酶联免疫吸附试验一般被认为是既简便快捷，又灵敏的方法，但是用于检测抗体时，对抗原制备的要求较高。在这6种检测技术中，血凝抑制试验和微量中和试验是实验室常规方法，其余4种对于常规流感甲1和甲3亚型已有完善的方法，但是用于H5抗原的检测还需改进和优化。对于胶体金免疫层析分析，日本、美国和我国有区别甲型流感、乙型流感和H5亚型的试剂盒，敏感度不够高。

禽流感病毒的核酸检测技术包括反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时定量PCR(RTQ-PCR)。该方法不但可鉴定样品中病毒的型及亚型，还可结合基因序列分析推测病毒的致病力高低。其灵敏度高，较病毒分离法快速、特异性也高，是公认的能够在较短时间做出准确诊断的方法。但其成本较高，试验过程复杂，对实验环境、仪器设备、操作人员等要求高，同时干扰因素多，会出现假阴性或假阳性现象，诊断时不能作为唯一的判定依据。

除了病原学和血清学等指标对禽流感进行检测和监测外，特异性的T细胞也可以作为一项监测指标。监测禽流感病毒特异性的T细胞，可以了解人群免疫状态，评价疫苗的免疫效果，也为制定合理的免疫规划提供依据。近年来T细胞检测技术有了很大发展。

首先，酶联免疫斑点技术(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)是可以从单细胞水平检测分泌细胞因子的T细胞的一种细胞免疫学检测技术。利用ELISPOT检测分泌IFN-γ的CTL是常用的评价细胞免疫水平的方法，其原理是将IFN-γ的单抗包被在贴有PVDF膜的96孔板上，再将经过免疫原性表位多肽刺激过的T细胞加入微孔内培养，其分泌的IFN-γ与包被抗体结合。将细胞和未结合成分洗去后，加入酶标记IFN-γ检测单抗，与被捕获的IFN-γ结合。加入底物后，可在有IFN-γ的位置产生有色斑点，每个斑点代表一个分泌IFN-γ的细胞。用计算机成像分析系统记数斑点数，就可以确定样品中分泌IFN-γ的CTL的数量。ELISPOT技术敏感性高，由于细胞附近的细胞因子浓度高，分泌100个细胞因子的细胞也能被发现，足以检测到1/10⁵个IFN-γ分泌细胞。并且因为使用了识别细胞因子或抗体的两个不同表位的两种单克隆抗体，ELISPOT技术有着高度的特异性。

其次，MHC I类分子四聚体(Tetramer)技术是另一种近年来发展起来的CTL检测技术。该技术是一种可直接对抗原特异性CTL进行标记和检测的新方法。该技术利用1个分子的荧光素标记的链霉亲合素与4个分子的生物素化的MHC-表位多肽连接成四聚体复合物，显著增加了其与T细胞受体(T cell receptor，TCR)的亲和力，因而使CTL的测定敏感性大为提高。Tetramer技术不仅可定性检测T细胞群中MHC-肽特异性T细胞，还可定量测定其百分率。该技术的特点是快速、敏感和结果特异，较ELISPOT技术更为精确。

利用ELISPOT和Tetramer技术检测特异性CTL的基础，是已知相应的CTL表位多肽。对于禽流感H5N1病毒来说，如果确定了其不同于其他流感病毒亚型的特异性的CTL表位，就可以对其相应的特异性的CTL进行定性定量分析。但是由于没有H5N1病毒特异性的T细胞表位，针对H5N1禽流感病毒的T细胞检测技术至今没有建立。

发明内容

本发明的目的是提供一种禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其应用。

本发明提供的禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽，为如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与禽流感H5N1病毒的CTL表位相关的由序列1衍生的多肽。

为了使(a)中的多肽便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的多肽可人工合成，也可先合成其编码DNA，再进行生物表达得到。上述(b)中的多肽的DNA可通过将序列表中序列3自5′端第1至30位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述多肽具体可如序列表的序列1所示(RI-10)(GENBANK ACCESSIONGNO.AAZ16277中自氮末端第205-214位氨基酸残基)或序列表的序列2所示(KI-10)(GENBANK ACCESSIONG NO.ABD28180中自氮末端第205-214位氨基酸残基)。

编码所述多肽的DNA分子也属于本发明的保护范围。

所述DNA分子可为如下1)或2)或3)：

1)其编码序列是序列表中序列3所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能多肽的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

所述DNA分子具体可如序列表的序列3所示(RI-10)或序列表的序列4所示(KI-10)。

含有所述DNA分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明还保护如下物质中的至少一种在制备禽流感病毒疫苗中的应用：所述的多肽，所述的DNA分子，所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述禽流感病毒具体可为H5型禽流感病毒，如H5N1禽流感病毒。

本发明还保护一种禽流感病毒疫苗，它的活性成份为如下物质中的至少一种：所述的多肽，所述的DNA分子，所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述禽流感病毒具体可为H5型禽流感病毒，如H5N1禽流感病毒。

本发明同时保护如下物质中的至少一种在制备禽流感病毒特异性T细胞检测试剂盒中的应用：所述的多肽，所述的DNA分子，所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述禽流感病毒具体可为H5型禽流感病毒，如H5N1禽流感病毒。

本发明同时保护一种禽流感病毒特异性T细胞检测试剂盒，它含有如下物质中的至少一种：所述的多肽，所述的DNA分子，所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述禽流感病毒具体可为H5型禽流感病毒，如H5N1禽流感病毒。

本专利的保护范围也包括对RI-10，KI-10的氨基酸序列以及相应的基因序列进行增删或突变所得到的用于相同目的的序列。

人类白细胞抗原(HLA)是人类的主要组织相容性复合体(MHC)分子。HLA-A*0201是世界人口表达最广泛的一个HLA的等位基因，HLA-A*0201阳性的个体占世界人口的50％。经过refolding结合实验和T2细胞结合实验，证实了所述的表位多肽(RI-10和KI-10)与HLA-A*0201分子具有较高亲和力，并且在HLA-A*0201/K^b转基因小鼠中具有很强的免疫原性，能诱导很强的CTL反应。RI-10和KI-10还被证实能在康复期的禽流感患者外周血单个核细胞中诱导CTL反应。H5N1特异性T细胞表位的鉴定，使得H5N1病毒特异性T检测能够以高度的特异性和灵敏度进行，这样就可以作为一项诊断指标，也可以为检测人群对特定病原体免疫状态、制定合理的免疫规划提供依据。

本发明所提供的表位多肽：一方面，可以用作在HLA-A*0201阳性个体中激发对禽流感H5N1病毒具有保护作用的细胞免疫的疫苗；另一方面，可以用作在HLA-A*0201阳性个体中检测禽流感H5N1病毒特异性CTL反应的诊断试剂。本发明提供表位多肽为开发相应的疫苗、相应的检测试剂和诊断方法奠定了基础。

附图说明

图1为多肽与HLA-A*0201分子以及β2m分子构成复合物的refolding实验结果。

图2为多肽与T2细胞表面的HLA-A2分子结合能力的实验结果。

图3为经带有H5HA基因的痘苗病毒载体免疫的HLA-A*0201/K^b转基因小鼠脾细胞中的多肽的特异性CTL反应的实验结果。

图4为多肽免疫HLA-A*0201/K^b转基因小鼠后用ELISPOT方法检测CTL反应的实验结果。

图5为多肽免疫HLA-A*0201/K^b转基因小鼠后用tetramer染色的方法检测CTL反应的实验结果。

图6为检测RI-10和KI-10禽流感病毒感染病人康复期血样的PBMC中的CTL反应的实验结果。

图7为RI-10/KI-10与HLA-A*0201分子以及β2m分子复合物的晶体结构；A：RI-10-HLA-A*0201；B：KI-10-HLA-A*0201；C：A和B的叠加图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

RI-10多肽如序列表的序列1所示。KI-10多肽如序列表的序列2所示。

以下实施例中的多肽均委托北京中科亚光生物科技有限公司合成，经过HPLC和质谱分析进行鉴定，纯度＞95％。

实施例1、用refolding实验检测多肽与HLA-A*0201分子的结合能力

在refolding实验中，如果多肽能与HLA-A*0201分子结合，那么多肽、HLA-A*0201和β2m就能形成稳定的多肽-MHC-β2m三元复合物，在分子筛层析图谱中出现多肽-重链-轻链复合物峰。

一、HLA-A*0201重链胞外区包涵体的制备

1、重组质粒I的构建

将编码HLA-A*0201重链胞外区的DNA(GENBANK ACCESSION NO.AY365426自5′末端第73-897位核苷酸)导入pET-28(a)，得到重组质粒I。

2、HLA-A*0201重链胞外区包涵体的制备

将转染了重组质粒I的大肠杆菌BL21(NEB公司，Cat.No.C2566H)的单克隆菌种接种于少量培养基中，在37℃摇床上过夜。再将过夜培养物接种于2L培养基中，在37℃摇至OD600为0.6-0.8时，加入1mM IPTG(终浓度为1mM)，诱导4h后收获细菌。用PBS重悬菌体，加入1mM DTT，超声破碎后离心，沉淀为包涵体。将包涵体用含有Triton的洗涤缓冲液(50mM Tris HCl，0.5％Triton X-100，100mM NaCl，1mM NaEDTA，1mM DTT)洗两次，用不含有Triton的洗涤缓冲液洗一次，再加入尿素缓冲液(25mM MES[SIGMA M-3023]，8M urea[Baker 4204-05]，10mM NaEDTA，0.1mM DTT)溶解，分装后在-80℃保存。

二、人β2微球蛋白轻链包涵体的制备

1、重组质粒II的构建

将编码人β2微球蛋白的DNA(GENBANK ACCESSION NO.NM_004048自5′末端第121-417位核苷酸)导入pET-28(a)，得到重组质粒II。

2、人β2微球蛋白轻链包涵体的制备

用重组质粒II代替重组质粒I，其它同步骤一的2。

三、refolding实验

1、多肽RI-10

Refolding体系：向Refolding缓冲液(100mM Tris-HCl，400mM L-arginine-HCL，2mM NaEDTA，0.5mM oxidized glutathione，5mM reduced glutathione)中按1∶1∶3的摩尔比加入HLA-A*0201重链胞外区包涵体、RI-10和人β2微球蛋白轻链包涵体。HLA-A*0201重链胞外区包涵体和人β2微球蛋白轻链包涵体配成注入缓冲液，逐滴加入，RI-10溶解在100-200μl二甲亚砜中之后再加入。

将Refolding体系放置在4℃搅拌48-36h后浓缩，进行分子筛层析。

RI-10的分子筛图谱见图1。在洗脱体积为15ml处出现的峰代表RI-10-MHC-β2m三元复合物，结果表明，RI-10与HLA-A*0201分子有较好的亲和力。

2、多肽KI-10

用多肽KI-10多肽代替RI-10，实验方法同步骤1。

KI-10的分子筛图谱与RI-10的分子筛图谱一致，KI-10与HLA-A*0201分子有较好的亲和力。

实施例2、用T2细胞结合实验检测多肽与T2细胞表面的HLA-A2分子的结合能力

T2细胞是HLA-A*0201阳性，TAP分子缺陷的细胞株。该细胞不能加工内源性的抗原，但是可以递呈外源性的抗原肽。在无抗原肽存在的情况下，其细胞表面HLA-A2分子的表达处于低水平，一旦有合适的外源性抗原肽与T2细胞表面的HLA-A2分子结合，其细胞表面HLA-A2的表达强度将大大提高。

一、多肽RI-10

T2细胞(ATCC，Cat.No.CRL-1992)培养于含有10％胎牛血清(FBS，Gibico)的RPMI-1640(补加5.9％HEPES，0.307％谷氨酸，0.11％丙酮酸钠，2％碳酸氢钠，50u/ml青霉素，50u/ml链霉素)中，培养箱温度为37℃，含5％CO₂。取对数生长期的细胞，用无血清的培养基洗2次后，将细胞调至2×10⁵/ml，接种于24孔板中，加入RI-10(终浓度为50μM)。在37℃和5％CO₂的条件下培养18h后，收获细胞，用PBS洗2次，加入FITC标记的anti-HLA-A2单克隆抗体BB7.2(Serotech，Cat.No.P10892)，在冰上孵育20min后，用含0.5％BSA的PBS洗2次，流式细胞仪测定样品的荧光强度。用相同体积无菌水代替RI-10，作为阴性对照。

RI-10的结果见图2。结果表明：RI-10能使T2细胞表面的HLA-A2分子表达水平提高，进一步在细胞水平证实了RI-10可以与HLA-A2分子结合。

二、多肽KI-10

用多肽KI-10多肽代替RI-10，实验方法同步骤一。

结果表明：KI-10与RI-10具有同样的效果。

实施例3、用ELISPOT分析检测多肽诱导经带有H5HA基因的pcDNA3.1(+)载体免疫的HLA-A*0201/K^b转基因小鼠的脾细胞产生特异性CTL反应的能力

HLA-A*0201/K^b转基因小鼠：购自上海第二军医大学。

重组质粒III(插入青海湖H5N1病毒H5HA的pcDNA3.1(+)载体)的制备：设计上游引物(5′-GCTAGCCATGGAGAAAATAGTGCTT-3′)和下游引物(5′-AATGCAAATTCTGCATTGTAAAAGCTT-3′)扩增H5HA的基因(GENBANK ACCESSIONGNO.AAZ16277)，用Nhe I和HindIII双酶切，同时将pcDNA3.1(+)载体(Invitrogen，Catalog nos.V790-20)用Nhe I和HindIII双酶切，将酶切产物置于18℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α(TAKARA，Cat.No.D9057)。经克隆筛选、测序鉴定后备用。

一、多肽RI-10

取雌性的HLA-A*0201/K^b转基因小鼠，用重组质粒III进行免疫。免疫的途径为肌肉注射，免疫的剂量为每次3.0×10⁶pfu。免疫分三次进行，两次免疫之间的间隔为4周。用PBS代替重组质粒III，采用相同方法免疫雌性的HLA-A*0201/K^b转基因小鼠，作为对照。在最后一次免疫后的第10天，分离小鼠脾细胞，用ELISPOT(UCTech产品，产品目录编号CT317-PB5)分析检测多肽特异性的CTL反应。ELISPOT分析中，脾细胞的培养孔中加入终浓度为20μM的RI-10(或相同体积的无菌水)和终浓度为20u/ml的rmIL-2。

ELISPOT分析的具体步骤：用70％的乙醇润湿96孔板底部的PVDF膜。然后用100μl/孔的去离子水洗涤2次，再加入50μl/孔用PBS稀释好的anti-IFN-γ包被抗体，4℃包被过夜。次日倾倒包被液，用无菌PBS洗涤3次。最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。加入200μl/孔稀释好的封闭液，37℃封闭1h。倾倒封闭液，加入2×10⁵/孔的细胞和终浓度为20μM的RI-10(或相同体积的无菌水)，在37℃和5％CO₂的条件下培养24小时。倾倒孔内的细胞及培养基，加入200μl/孔冰冷的去离子水，4℃冰浴10min。每孔加入200μl PBST，浸泡3-5min后扣出洗涤液，重复5次。最后一次，在吸水纸上扣干。每孔加入100μL稀释好的生物素标记anti-IFN-γ检测抗体，37℃孵育1h。每孔加入200μl PBST，浸泡3-5mins后扣出洗涤液，重复5次。最后一次，在吸水纸上扣干。每孔加入100μl稀释好的酶标亲和素，37℃孵育1小时。每孔加入200μl PBST，浸泡3-5mins后扣出洗涤液，重复5次。最后一次，在吸水纸上扣干。每孔加入100μL的显色液，室温静置15-45min(在20-25℃)，避光。待斑点生长到适合的大小之后，以去离子水洗涤2遍，终止显色过程。将ELISPOT板置于Biosys Bioreader自动读板仪内，调节好合适的参数，计数斑点。

结果见图3。结果表明：用编码H5HA的痘苗病毒载体免疫的转基因小鼠的脾细胞产生了显著的CTL反应，而用PBS免疫的转基因小鼠的脾细胞未产生CTL反应。在RI-10的刺激下，CTL的数目与无多肽刺激时相比显著增加，这表明RI-10有明显的免疫原性，能诱导产生CTL反应。

二、多肽KI-10

用多肽KI-10多肽代替RI-10，实验方法同步骤一。

结果表明：KI-10与RI-10具有同样的效果。

实施例4、用ELISPOT和tetramer染色的方法检测多肽免疫HLA-A*0201/K^b转基因小鼠后脾细胞中产生的CTL反应

一、多肽RI-10

取雌性的HLA-A*0201/K^b转基因小鼠，用50μg RI-10进行免疫，用小鼠gp96的N末端片段N333(22-355)(GENBANK ACCESSION NO.NM_011631中自氮末端第22-355位氨基酸残基)50μg作为佐剂，与氟式不完全佐剂(IFA)乳化后皮下多点注射。免疫分三次进行，两次之间的时间间隔为2周。在最后一次免疫后的第10天，分离小鼠脾细胞，在体外培养2周，细胞密度为2×10⁶/ml，培养孔加入多肽RI-10使其终浓度10μM，和终浓度为20u/ml的重组小鼠白介素-2(rmIL-2)，然后用IFN-γELISPOT法和tetramer染色检测多肽特异性CTLs反应。

用流感病毒的优势表位GL-9(序列为GILGFVFTL)代替RI-10，作为阳性对照，

1、ELISPOT法

实验方法同实施例3。

结果见图4。结果显示，RI-10诱导了明显的CTL反应。与阳性对照比较，RI-10诱导了比GL-9更强的CTL反应。这些结果表明，RI-10是具有强免疫原性的CTLs表位多肽。

2、tetramer染色

①tetramer的制备

HLA-A*0201/K^b分子是HLA-A*0201分子和小鼠K^b分子的杂合分子，编码DNA由HLA-A*0201分子的编码DNA(GENBANK ACCESSION NO.AY365426中自5’端第73-615位核苷酸)和K^b分子的编码DNA(GENBANK ACCESSION No.J00400中自5’端第349-630位核苷酸)拼合。HLA-A*0201/K^b分子的包涵体的制备方法与实施例1中所述的“HLA-A*0201重链胞外区包涵体的制备”方法相同。

β2M分子的编码DNA是GENBANK ACCESSION NO.NM_004048自5′末端第121-417位核苷酸。β2M分子的包涵体的制备方法与实施例1中所述“人β2微球蛋白轻链包涵体的制备”方法相同。

将C-末端带有生物素化位点标签(GSGGGLNDIFEAQKIEWHE)的HLA-A*0201/K^b分子的包涵体、β2M分子的包涵体与RI-10按1∶1∶3的摩尔比复性，得到RI-10-HLA-A2-β2M复合体。RI-10-HLA-A2-β2M复合体经分子筛和离子交换柱纯化，加入Bir A酶(Avidity，Denver，Co)和生物素，在室温反应过夜，进行生物素化。其后，再用分子筛纯化，收集复合体蛋白并测定蛋白浓度。加入取适量复合物蛋白，按1∶4的摩尔比在4℃分次加入PE标记的链霉亲和素，制得RI-10-HLA-A2tetramer。浓缩后用PBS洗3次，再浓缩至适当的体积备用。

用同样的方法制备GL-9-HLA-A2tetramer。

②tetramer染色

脾细胞在体外培养，在培养体系中加入RI-10(10μM)和IL-2(20u/ml)。2周后收获细胞用RI-10-HLA-A2 tetramer和FITC标记的anti-小鼠CD8单克隆抗体(BD，Cat.No.560469)对细胞进行双染色，或者用GL-9-HLA-A2 tetramer或再用流式细胞仪检测多肽特异性的CTL反应。

结果见图5。结果表明，RI-10诱导了强大的CTL反应，其特异性的CTL占脾细胞中CD8⁺细胞的20.6％。与阳性对照比较，RI-10诱导了比GL-9更强的CTL反应。这些结果提示，RI-10是具有强大免疫原性的CTLs表位多肽。

二、多肽KI-10

用多肽KI-10多肽代替RI-10，实验方法同步骤一。

结果表明：KI-10与RI-10具有同样的效果。

实施例5、用tetramer染色的方法检测多肽和禽流感病毒感染病人康复期血样的PBMC中的CTL反应

从HLA-A2病人分离到的H5N1病毒的HA序列(GENBANK ACCESSIONG NO.AAZ16277)的205位氨基酸(即相当于RI-10的第一位残基)，有的毒株是Arg(R)，有的毒株是Lys(K)。试验样本来源如下：两名HLA-A2阳性患者志愿者，编号分别为LXC(感染毒株HA序列的205位氨基酸为R)和HJR(感染毒株HA序列的205位氨基酸为K)。一名健康志愿者。一名HLA-A2^-康复者志愿者。

设置以下几组：

对四名志愿者的外周血单个核细胞(PBMCs)进行了CTL反应检测。用RI-10(或KI-10，或GL-9)在体外刺激刺激PBMCs两周后，收获细胞进行tetramer染色(方法同实施例4)。

结果见图6。在LXC的PBMCs中，RI-10特异性CTLs(即用RI-10-HLA-A2 tetramer染色时CD8⁺tetramer⁺的双阳性细胞)在CD8⁺细胞中的比例为1.5％，而用KI-10-HLA-A2的tetramer染色时CD8⁺tetramer⁺的双阳性细胞的比例为0.5％。在HJR的PBMCs中KI-10特异性CTLs(即用KI-10-HLA-A2 tetramer染色时CD8⁺tetramer⁺的双阳性细胞)在CD8⁺细胞中的比例为2.7％，而用RI-10-HLA-A2 tetramer染色时CD8⁺tetramer⁺的双阳性细胞的比例为1.8％。在健康志愿者的PBMCs中检测不到RI-10或KI-10特异性CTLs。而作为阳性对照的GL-9特异性CTLs在HLA-A2⁺的健康志愿者的PBMCs以及LXC、HJR和HLA-A2的CD8⁺细胞中的比例分别为1.1％、1.2％和0.2％。康复者志愿者血样的PBMCs中检测不到RI-10、KI-10和GL-9特异性CTLs。结果表明，RI-10/KI-10是H5特异性的HLA-A2限制性的CTL表位。而且，RI-10和KI-10两个多肽有交叉反应，也就是说RI-10特异性CTLs能识别KI-10，而KI-10特异性CTLs也能识别RI-10，只不过交叉识别比特异性识别弱一些。此外，RI-10和KI-10特异性CTLs反应均比在作为阳性对照的GL-9要强一些。

实施例6、多肽-HLA-A2m复合体的晶体结构研究

RI-10-HLA-A2-β2M复合体和KI-10-HLA-A2-β2M复合体的制备方法同实施例4。

晶体结构研究可以了解RI-10/KI-10被HLA-A*0201分子提呈机制的微观细节。晶体在16％PEG6000，25mM MES，pH 6.5的条件下生长。X-射线衍射数据经用HLA-A2复合体结构(PDB：1JF1)为搜索模板，经过分子置换法得到解析，RI-10-HLA-A2-β2m和KI-10-HLA-A2-β2m的分辨率分别为2.3

和2.2

经过结构精化，RI-10-HLA-A2-β2m复合物晶体的R_work和R_free分别达到20.2％和24.7％，而RI-10-HLA-A2-β2m复合物晶体的R_work和R_free分别达到19.2％和23.7％。

两个晶体结构的空间群均为P1，每个不对称单元中含有4个分子。晶体结构包括HLA-A2重链的1-275位残基，β2M的1-99位残基，和RI-10/KI-10多肽。整体结构与以前报道的多肽-HLA-A2复合物非常相似(Madden，D.R.，Garboczi，D.N.，Wiley，D.C.(1993)The antigenic identity of peptide-MHC complexes：a comparison of theconformations of five viral peptides presented by HLA-A2.Cell(Cambridge，Mass.)75：693-708)。

RI-10/KI-10多肽主链的构象符合典型的HLA-I类分子限制性多肽的特征：其第2位和第10位残基是锚定残基，其侧链向下插入HLA-A2的结合口袋。中间部分的残基侧链多向上指，是T细胞受体(TCR)识别的位点。在两个结构中，RI-10/KI-10多肽的N-端3个残基和C-端2个残基电子云密度很清晰，但两个多肽的中间部分，即第4到第8个残基，电子密度明显比多肽两端稀薄(图7A，7B)，这显示了这一部分具有柔性或灵活性。

将两个结构叠加起来可以看出，两个多肽的N-端3个残基和C-端2个残基重叠的很好，而中间部分主链和侧链都表现出较明显差异(见图7C)。两个多肽中间部分构想的差异可能就是柔性的反映，也是两个多肽诱导的CTL反应相互交叉而又有一定差别的原因。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>禽流感H5N1病毒的CTL表位多肽及其应用

<130>CGGNARY92292

<160>4

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

Arg Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile

1               5                   10

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Lys Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile

1               5                   10

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

aggctctatc aaaacccaac cacctatatt                30

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

aagctctatc aaaacccaac cacctatatt                30

Claims (7)

1.一种禽流感H5N1病毒的细胞毒性T淋巴细胞表位多肽，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽。

2.编码权利要求1所述多肽的DNA分子。

3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的编码序列如序列表中序列3所示。

4.如下物质中的至少一种在制备禽流感病毒疫苗中的应用：权利要求1所述的多肽，权利要求2或3所述的DNA分子。

5.一种禽流感病毒疫苗，它的活性成份为如下物质中的至少一种：权利要求1所述的多肽，权利要求2或3所述的DNA分子。

6.如下物质中的至少一种在制备禽流感病毒特异性T细胞检测试剂盒中的应用：权利要求1所述的多肽，权利要求2或3所述的DNA分子。

7.一种禽流感病毒特异性T细胞检测试剂盒，它含有如下物质中的至少一种：权利要求1所述的多肽，权利要求2或3所述的DNA分子。

Images