CN103257236B - Hla-a24限制性结核分支杆菌特异性ctl细胞表位肽的应用 - Google Patents
Hla-a24限制性结核分支杆菌特异性ctl细胞表位肽的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种HLA-A24限制性结核分支杆菌特异性CTL细胞表位肽在制备诊断或检测结核病的药物中的应用，其中所述肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：1-9所示的任一氨基酸序列。本发明提供的HLA-A24限制性结核分支杆菌特异性CTL细胞表位肽是一种新的、自然递呈的HLA-A24限制性CTL表位，使靶细胞致敏，被结核感染的HLA-A24病人的CTL细胞识别，而不被HLA-A24阴性的病人和HLA-A24阳性的健康对照识别。因此，该多肽是所有HLA-A24阳性结核感染者特异性免疫治疗的合适靶分子，可以用于制备诊断或检测HLA-A24阳性结核病的药物或用于制备治疗结核病的疫苗。
Description
技术领域
本发明涉及结核病多肽治疗及检测，尤其涉及HLA-A24限制性结核分支杆菌特异性CTL细胞表位肽的应用。
背景技术
CD8T细胞是机体抵抗侵入胞内病原微生物的重要防线。通过细胞表面表达的T细胞受体识别抗原体多肽与感染细胞主要组织相容性分子复合体，从而识别并清除感染细胞。使用抗CD8抗体去除CD8T细胞，可导致机体对结核的易感染性显著提高，结核菌数大量增多，表明CD8T细胞在控制结核感染中重要作用。鉴于CD8T细胞的重要作用，刺激机体产生抗感染特异性CD8T细胞的策略，成为结核疫苗的重要策略之一。
这种策略的前提是鉴定出病原体蛋白中与主要组织相容性复合物I类分子结合的多肽：提呈至细胞表面、与T细胞表面受体结合、刺激T细胞增殖活化的抗原肽，即T细胞表位。上百种不同的MHC分子，使得T细胞表位的技术复杂化，同时有上百种不同的MHC分子，使得T细胞表位的发现与鉴定成为开发重大传染病疫苗的瓶颈，尤其与中国人广泛存在的白细胞抗原I类分子相符的T细胞抗原，寥寥无几。以中国人高发的HBV为例，目前仅鉴定出44个T细胞表位，且绝大多数为HLA-A2限制的T细胞表位。
结核菌几种重要的保护性抗原有：由RD区基因编码的结核分支杆菌早期分泌性抗原性靶ESAT-6、结核杆菌培养滤液蛋白CFP-10及Ag85蛋白等。ESAT-6家族主要包括ESAT-6，CFP-10和TB10.4，相对分子质量(Mr)约为6-10kDa。ESAT-6是一种存在于结核杆菌早期培养滤液(STCF)中的低Mr蛋白，它的基因由RD1区编码，基因全长288bp，编码95个氨基酸。ESAT-6仅存在于致病性分枝杆菌中，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分枝杆菌及某些非典型分枝杆菌(如堪萨斯分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌和海水分枝杆菌)，而不存在于卡介苗(BCG)及其它非致病性分枝杆菌中。ESAT-6蛋白有多个T、B细胞表位，能被不同遗传背景的实验动物识别。CFP-10位于ESAT-6上游，研究发现两者可能以复合体形式发挥作用。Ag85是MTB培养早期滤液中的一种分泌蛋白，具有分枝菌酸转移酶的活性，可与细胞表面纤连蛋白(fibronectin，FN)结合，是MTB的FN受体，在分枝杆菌粘附细胞的过程中起重要作用。
很多研究将结核菌重要的保护性抗原，尤其是ESAT-6应用于结核的诊断中，虽然取得满意的结果，但还是存在局限性，主要是蛋白上存在其它致病性分枝杆菌的抗原位点影响其特异性。另外，有研究认为，选择多肽位点而不用全长蛋白或重叠多肽进行诊断可以有效区分活动性结核感染及潜伏性感染。
近年来，国外在结核分支杆菌主要保护性抗原上已经陆续鉴定出一些T细胞表位。ESAT-6上有两个CD8+T细胞表位，位于第82～90位氨基酸和第69～76位氨基酸。CFP10的71-85位氨基酸片段至少包含两段CD8+T细胞表位，一段为HLA-A02识别，另一段为HLA-B35所识别。另有研究发现CFP10的85-94位氨基酸片段为HLA-B14限制性，CFP10的2-11位氨基酸片段为HLA-B44限制性。中国人群的HLA基因型与国外人群有显著差异，虽然A2也占到首位，但HLA-A24、A30、A11是中国人群特异性白细胞抗原。HLA-A24是世界上分布最广的人白细胞抗原之一，特别是在亚洲人群中。然而，结核感染中HLA-A24特异性CD8细胞表位的鉴定还非常少。中国人群T细胞抗原表位的鉴定与筛选，已成为开发结核疫苗的瓶颈。
保护性T细胞表位的筛选和评价体系可用于急需解决的重大传染病发病转归机制、免疫保护机制、新型预防和治疗疫苗的研发、以及疫苗效果的评价。从结核杆菌的保护性抗原中筛选及鉴定一段(或几段)特异的表位，使其能被特异性MHC-I类分子识别，不仅在研究宿主抗结核的免疫学机制，而且在结核病的诊断和疫苗研制中都有着重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种能刺激γ-干扰素分泌的HLA-A24限制性结核分支杆菌特异性CTL细胞表位肽在制备诊断或检测HLA-A24阳性结核病人的药物或在制备治疗结核病的疫苗的应用。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种HLA-A24限制性结核分支杆菌特异性CTL细胞表位肽在制备诊断或检测结核病的药物中的应用，其中所述肽的氨基酸序列选自SEQ IDNO：1-9所示的任一氨基酸序列。
进一步地，所述肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
HLA-A24限制性结核分支杆菌特异性CTL细胞表位肽在制备治疗结核病的药物中的应用。
进一步地，所述药物为疫苗。
本发明的优点及有益效果：
本发明提供的HLA-A24限制性结核分支杆菌特异性CTL细胞表位肽(QWNFAGIEAA)是一个新的，自然递呈的HLA-A24限制性CTL表位，使靶细胞致敏，被HLA-A24阳性结核病人的CTL细胞识别，而不被HLA-A24阴性的结核病人和HLA-A24阳性的健康对照识别。因此，该多肽是所有HLA-A24阳性结核感染者特异性免疫治疗的合适靶分子，可以用于制备诊断或检测HLA-A24阳性结核病人的药物或用于制备治疗结核病的疫苗。
附图说明
图1A-图1D为hβ2m-A24在转染细胞表面的表达，其中图1A为蛋白印迹分析hβ2m-A24在各种转染细胞表面的表达；图1B为流式荧光检测β2m-A24在瞬时转染的K41细胞表面的表达；图1C为流式荧光检测β2m-A24在RMA-S/hβ2m-A24细胞系表面的表达；图1D为流式荧光检测不同温度下β2m-A24在RMA-S/hβ2m-A24细胞系表面的表达；
图2为HLA-A24限制性肽与RMA-S/hβ2m-A24细胞表面HLA-A24分子的结合结果；
图3为刺激HLA-A24阳性结核病人的IFN-γ分泌能力示意图；
图4为一次典型的ELISPOT实验的结果；
图5为HLA-A24重链和β2m轻链与各种多肽的体外共折叠实验结果；
图6A-图6C为用四聚体检测HLA-A24阳性结核患者P5特异性的CTL细胞的比例，其中图6A为HLA-A24阴性的结核病人；图6B为HLA-A24阳性健康对照者；图6C为HLA-A24阳性结核病人。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、材料与方法
细胞系和质粒转染
K41细胞系为小鼠纤维母细胞。K42细胞为抗原递呈分子钙网蛋白(calreticulin，CRT)缺陷细胞系；RMA是起源于C57BL/6(H-2b)小鼠的病毒诱发的白血病细胞系，RMA-S细胞为TAP-2位点突变的TAP缺陷的小鼠淋巴瘤细胞系(Attaya等1992)。用构建好的含zeocine抗药基因的hβ2m-A24质粒电转染RMA-S细胞或K42细胞。通过zeocine筛选，抗药基因就被筛选出来。蛋白印迹法和流式细胞鉴定hβ2m-A24在被转染细胞表面的表达。RMA-S/hβ2m-A24细胞和K42/hβ2m-A24细胞用含10％胎牛血清(Hyclone)和100微克每毫升zeocine的RPMI 1640培养，T2细胞(Cerundolo等1990)用含10％胎牛血清(Hyclone)的RPMI 1640培养，培养条件为含5％CO2的37℃培养箱。
抗体
W6/32是一个仅与β2m连接时识别HLA-A，-B和-C的构象依赖的鼠单克隆抗体(Barnstable et al.，1978；Brodsky and Parham，1982)，L369是识别人β2m的鼠单克隆抗体(北京表源生物技术公司提供)。
蛋白印迹分析
PBS洗细胞，用裂解缓冲液裂解后按文献(Flutter et al.，2007)做后续的免疫印迹实验。鼠抗人beta 2-m单克隆抗体L369为一抗，HRP结合的羊抗鼠抗体为二抗(购自Santa Cruz生物技术公司)。
流式细胞检测
W6/32为一抗，加入细胞悬液，在4度染色30分钟。抗鼠Ig-FITC加入细胞悬液作为二抗，4度继续孵育30分钟。样本分析用GuavaEasycyte(Guava Technologies)，分析软件FlowJo(Tree star，Ashland OR)。
结果如图1A-图1D所示。其中图1A：蛋白印迹分析hβ2m-A24在各种转染细胞表面的表达，其中：
(1)未转染的K41细胞；(2)瞬时转染的K41细胞；(3)建立的RMA-S/hβ2m-A24细胞系；(4)建立的K42/hβ2m-A24细胞系。
图1B：流式荧光检测β2m-A24在瞬时转染的K41细胞表面的表达。
图1C：流式荧光检测β2m-A24在RMA-S/hβ2m-A24细胞系表面的表达。
图1D：流式荧光检测不同温度下β2m-A24在RMA-S/hβ2m-A24细胞系表面的表达。
为确认hβ2m-A24是否被正确表达，用β2m-A24编码质粒瞬时转染鼠纤维细胞K41，并且用Western blot评估β2m-A24蛋白产物。β2m-A24表达蛋白能够在瞬时转染的K41细胞上检测到，而未转染的K41细胞检测不到(图1)。用hβ2m-A24表达质粒分别转染TAP-缺陷细胞RMA-S和抗原递呈分子钙网蛋白(calreticulin，CRT)缺陷细胞K42，然后通过Zeocin筛选，分别建立表达hβ2m-A24的两种细胞系。β2m-A24蛋白产物通过Western blot来鉴定。对转染后的RMA-S和K42细胞hβ2m-A24的克隆表达均进行了鉴定(图1A)。用western blot鉴定了瞬时转染表达β2m-A24蛋白的K41转染细胞，并用流式细胞术对表面表达进行了进一步评估。瞬时表达hβ2m-A24的K41细胞用W6/32染色后峰明显偏移；RMA-S/hβ2m-A24细胞系表达的hβ2m-A24，其峰值偏移没有瞬时转染的K41细胞明显(图1B和图1C)；K42/hβ2m-A24细胞系表面没有检测到hβ2m-A24表达。将RMA-S/hβ2m-A24细胞分别在37℃和26℃孵育过夜后用流式检测表面hβ2m-A24表达。在26℃孵育的细胞其分子表达明显高于在37℃孵育的细胞(图1D)。因此，细胞在26℃孵育时表面β2m-A24表达更稳定。
计算机软件(在www.immuneepitope.org网站上，根据提示进入页面，首页上点击T cell epitope prediction，然后进入MHC-I predictions，输入序列。预测方法为IEDB推荐的方法)，选择需要预测的HLA等位基因，预测表位。通过该网站预测了与HLA-A24连接的肽，HLA-A24共筛选出9个肽，编号1-9(5个九聚体肽和4个十聚体肽，其氨基酸序列依次如SEQID NO：1-9所示)。候选肽由SBS Genetech(Beijing，China)合成。粉末状肽溶解于5％二甲亚砜(Sigma，St.Louis，MO，USA)然后用0.9％NaCl稀释到储存浓度10mg/mL。
结合实验
通过稳定性分析判断HLA-A24与肽的结合(Takamiya et al.，1994)。简而言之，RMA-S-hβ2m-A24细胞在26℃孵育18h。2×105个细胞溶于含20％FCS的50μlPBS(PBS-FCS)中，加入50μl肽溶液(100μM)，在26℃孵育1h后再在37℃孵育3h。HLA表达分析如前所述。HLA-A24限制序列CMV pp65(SEQ ID NO：10)作为阳性对照。所有肽均用两份平行样做三次以上独立实验。
结果如图2所示，结合能力以MFI的增加表示。图2：HLA-A24限制性肽与RMA-S/hβ2m-A24细胞的结合结果。
要解决空载MHCI类分子内在不稳定问题，可以降低孵育温度，也可以加入合适的肽(Ljunggren et al.，1990)。因此，肽的作用是可更好地维持HLA分子构象完整。利用以统计为基础的计算机程序法则(前面所述的网站及网站推荐方法)，从结核菌ESAT-6和CFP-10分泌蛋白选择9-mer到10-mer的肽序列。通过HLA-A24稳定分析测试九个肽编号1-9(5个九聚体肽和4个十聚体肽，其氨基酸序列依次如SEQ ID NO：1-9所示))与HLA-A24分子的结合能力。按照图2所示，肽结合细胞表面HLA-A24使得RMA-S/hβ2m-A24细胞的MFI增加。多肽的MFI比大于1.5表明高亲和力结合，MFI比1.25--1.5是中等程度亲和力结合(Gricks等，2001)。结果显示，九个肽中有两个(序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：8所示)为高亲和力，有三个(序列如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示)为中等程度亲和力结合(共占55.6％)。上述五个有结合能力的多肽中三个(序列如SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：8所示)都是来自ESAT-6。作为阳性对照，CMV-A24肽pp65MFI比率为1.85。
预测的HLA-A24限制性肽结合密切程度和当前获得的数据研究结果见表1。计算机预测结合密切程度用IC50值表示。通常，多肽结合密切IC50＜50nM，中等结合IC50在50到500nM之间，弱结合IC50在500至5000nM之间。而那些＞5000nM被认为没有结合能力。在评价预测HLA-A24限制肽时，IC50＜500nM的四个肽中，三个肽的(序列如SEQID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5所示)稳定性实验显示出了较高或中等结合能力，MFI比(＞1.25)；IC50在500到5000nM之间的五个肽中，有三个肽的(序列如SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示)稳定性实验显示出弱或无结合力(MFI比＜1.25)(如表1所示)。
以上试验结果用下表表示
表1所预测HLA-A24限制性多肽表位一览表
ELISPOT实验
研究对象：7个结核病人，2个健康者(结核病人来自南京胸科医院和南京六合人民医院。健康对照来自健康献血员)。结核诊断是根据卫生部的标准：(1)2次痰涂片抗酸杆菌染色阳性或痰培养分枝杆菌阳性，胸片显示有肺结核特征性病灶。(2)涂片或培养2次以上阴性，胸部×线片示活动性肺结核征象，咳嗽、咳痰、血痰或咯血、胸闷、气短、胸痛、疲乏。1-4号病人为HLA-A24阳性，5-7号病人为HLA-A24阴性。两个健康对照均为HLA-A24阳性，没有结核病史，也没有与结核感染者的接触史。所有的研究对象HIV阴性。结核病人中4个女性，3名男性。每个病人取15ml血，用Ficoll-Conray密度梯度分离PBMC。所有的PBMC在液氮里冷冻保存。
ELISPOT实验：将10μg/ml抗IFN-γ单克隆抗体，加100μl/孔于PVDF膜铺底的96孔灭菌板4℃过夜，第二天吸去包被液后，加5％FCS的PRMI 1640培养基100μl，37℃封闭1小时，准备PBMC(2×105细胞/100μl/孔)，加入2个复孔，候选HLA-A24特异性多肽作为刺激物(10μg/ml)，PHA(5μg/ml)和结核刺激物(北京表源生物技术公司提供)作为阳性对照刺激物，分别加入上述细胞复孔。5％CO2，37℃培养过夜。弃去培养基，PBS洗3～5次，加入2μg/ml生物素化的抗人IFN-γ孵育2小时，PBS洗3～5次，加入链亲和素标记的碱性磷酸酶孵育30min；PBS洗3～5次，用底物BCIP/NBT显色，显微镜下观察显色反应，显色后及时终止反应；计数每孔中的斑点数目，计算每2×105个细胞中IFN-γ分泌细胞数量(SFC)。一般而言，阴性孔的SFC小于5个，此时如果孔的点数比阴性孔多6个或以上，则视为阳性。如果阴性孔有6个或以上点数，则比阴性孔的平均点数多2倍以上视为阳性。
检测8个候选多肽P1-P6以及P8-P9(序列如SEQ ID NO：1-6以及SEQID NO：8-9所示)刺激4个HLA-A24阳性结核病人、3个HLA-A24阴性结核病人、2个HLA-A24阳性健康对照的IFN-γ分泌的能力。
结果如图3所示，与阴性对照组(不加肽)相比，P5显著刺激HLA-A24阳性结核病人的IFN-γ分泌能力(40.6±17.8vs 10.7±3.7SFC/2×105PBMCs，p＜0.05)。其它肽刺激细胞时，未观察到刺激IFN-γ分泌的现象，除了P8肽(20.1±17.9vs 10.7±3.7SFC/2×105PBMCs)。然而，P8肽刺激组和阴性对照组之间没有统计学显著性差异。P5肽刺激的HLA-A24阴性结核病人以及HLA-A24阳性健康对照者均未观察到明显IFN-γ分泌的现象，其分泌IFN-γ的细胞数与阴性对照组相似。图4为一次典型的ELISPOT实验的结果。P：植物血凝素PHA，作为一个阳性对照；S：Epigen公司提供的结核刺激物，作为另一个阳性对照；N：阴性对照，不加任何刺激物；B：空白。
HLA分型
(1)基因组DNA的提取所有研究对象均取外周全血0.5-1.0ml(EDTA抗凝)加入2ml试管，加入1ml冷ELB A(4℃)，室温振摇5分钟。4000转离心1分钟。完全去除上清后加1ml冷ELB B(4℃)，混匀。4000转离心1分钟。仔细去除上清。加400ul LB到细胞团中，混匀(细胞团必须完全溶解)。把膜加200ul BB并混匀样品，将溶液转移到膜柱里，室温孵育1分钟，8000转离心2分钟。去除滤出液，把膜柱放回使用的管内，加入600ul WB，8000转离心1分钟。去除滤出液，把膜柱放回使用的管内，5000转离心5分钟。将膜柱放入1.5ml试管内，加入200ul预热至60℃的DEB，室温孵育1分钟。5000转离心1分钟。滤出液即DNA。测定DNA含量及纯度。4℃保存2周，或-20℃保存备用。
(2)PCR-SSP反应SSP试剂盒应用德国PROTRANS公司的HLA-A位点基因分型试剂，操作过程：从4度冰箱中取出HLA-A反应板，加50ulDNA样品(50-100ng/μl)到主混合液(PROTRANS HLA-A*Buffer D 70ul，Buffer Y 140ul，Tag酶1.6ul)，并充分混匀。在反应板的孔内，每孔加入10ul含有DNA样品的主混合液。仔细用密封条(试剂盒内配备)密封试剂板。放入PCR仪扩增，开始扩增。扩增程序：94℃，2min以下10个循环(94℃10s，65℃1min)，以下20个循环(94℃10s，61℃50s，72℃30s)，4℃保存。取PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳。放置紫外灯下观察结果；照相；用20090122 version of SCORE Virtual Sequencing software分析判断结果。
分型的结果：1-4号病人为HLA-A24阳性，5-7号病人为HLA-A24阴性。两个健康对照均为HLA-A24。
细胞因子
重组人IL-2和重组人IL-7(R&D Systems)。
在体外用特定的肽培养产IFN-γ的CTL细胞
从2个HLA-A24阳性病人和1个HLA-A24的结核病人、1个HLA-A24的结核病人血液中分离PBMC(用Ficoll-Conray密度梯度分离PBMC)。结核病人在发病1个月内取样。PBMC(2×106细胞/ml)与P5多肽(10μM)在含10％胎牛血清、20ng/ml重组人IL-7、20单位/ml重组人IL-2的1ml培养基里，共培养。每3天换50％的培养基，保持IL-2终浓度为20单位/ml。在第10天，收获细胞，检测IFN-γ释放的ELISPOT实验，研究多肽特异性CD8阳性T细胞的生成。
共折叠实验
将候选多肽与HLA-A24(序列如SEQ ID NO：12所示)和轻链β2m(序列如SEQ ID NO：13所示)共折叠。准备1升折叠缓冲液(400mM L-左旋精氨酸，100mM Tris，2mM EDTA)，向冷却的折叠缓冲液中加还原型谷胱甘肽至终浓度为5mM；再加氧化型谷胱甘肽至终浓度为0.5mM；加PMSF至终浓度为0.2mM。按照终浓度分别为1μM，2μM，30mg/L，计算需加入的重链，轻链，肽的量。分别将重链，轻链各加入5.0ml注射缓冲液(3M盐酸胍，10mM乙酸钠，10mM EDTA)，在室温下分别吸入两支5.0ml注射器。依据肽的氨基酸序列不同，可将其稀释于500μl双蒸水或DMSO。
将折叠缓冲液以高速进行磁力搅拌。将抗原肽加入反应体系。然后急速将重链(1μM)和轻链注入反应体系，将折叠反应体系置10℃过夜。12h后将重链(1μM)注入反应体系，并重置于10℃。8h后将重链(终浓度为3μM)注入反应体系，并重置于10℃过夜。
结果如图5所示，HLA-A24重链和轻链与各种多肽的共折叠实验结果。共折叠复合物由快速蛋白液相色谱Superdex G200gel凝胶过滤(GEHealthcare Bio-Sciences AB)。
为了检测候选多肽与HLA-A24分子的结合能力，本申请体外进行了肽诱导的HLA-A2401重链和轻链稳定性实验。在8个(序列如SEQ ID NO：1-6以及SEQ ID NO：7-8所示)候选多肽中，4个(序列如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：6所示)与HLA-A24重链和轻链有共折叠能力，序列如SEQ ID NO：4所示的多肽的亲和性最强。其中序列如SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的多肽有较弱的共折叠能力。
四聚体制备及染色
将含有BirA酶生物素化位点的多肽序列BSP(序列如SEQ ID NO：11所示)连接到HLA-A24重链的胞外区COOH端。在原核表达系统中表达。重组HLA-A24重链与人β2m轻链在共折叠缓冲液中折叠。复合物用空间排阻色谱过滤，然后加入BirA酶生物素化。将生物素化的HLA-A24-多肽复合物与PE标记的链酶亲和素以摩尔比4∶1装配成四聚体。细胞用PE标记的四聚体复合物37℃染色20分钟，用PBS洗涤一次，然后用FITC标记的抗-CD8染色。用流式细胞仪分析CD8和四聚体双阳性细胞数。
制备HLA-A24/P5的四聚体，确定P5(序列如SEQ ID NO：5所示)CTL细胞的存在。HLA-A24阳性健康对照者、HLA-A24阳性的结核病人、HLA-A24阴性的结核病人的新鲜PBMC，分别用HLA-A2401/P5的四聚体染色。P5特异性的CTL细胞的比例用流式细胞仪检测。HLA-A24阳性结核病人的P5特异性CD8阳性细胞比例是对照组的3倍(如图6所示)。
图6显示用四聚体检测HLA-A24阳性结核患者P5特异性的CTL细胞的比例。其中图6A为HLA-A24阴性的结核病人；图6B为HLA-A24阳性健康对照者；图6C为HLA-A24阳性结核病人。HLA-A24/P5的四聚体与抗CD8抗体进行细胞染色。结果显示CD3+CD8+淋巴细胞中四聚体阳性细胞的比例。
混合淋巴细胞培养的多肽特异性ELISPOT实验
PBMC在20单位/ml重组IL-2、20ng/ml重组IL-7、P5多肽存在的情况下，诱导PBMC增殖10天。P5诱导下IFN-γ的释放由ELISPOT实验检测。P5显著刺激所有HLA-A24阳性结核病人CTL释放IFN-γ。
表2从结核感染病人的PBMC培养物中诱导P5特异性CTL细胞
其中a：不可计数
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
Claims (3)
1.一种HLA-A24限制性结核分支杆菌特异性CTL细胞表位肽在制备诊断或检测结核病的药物中的应用，其中所述肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示。
2.权利要求1所述的HLA-A24限制性结核分支杆菌特异性CTL细胞表位肽在制备治疗结核病的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗。
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| 结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定;吴传勇等;《第二军医大学学报》;20070430;第28卷(第4期);349-354 * |
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