CN114751965A - 一种新型冠状病毒t细胞抗原表位肽及其在制备疫苗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽及其在制备疫苗中的应用，所述新型冠状病毒T细胞抗原表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1～9任一所示。并利用其制备得到了pMHC复合物单聚体，进一步制备得到pMHC复合物多聚体，其可以用于新型冠状病毒疫苗接种者和感染康复者外周血内抗原特异性T细胞的检测，并用于体外的T细胞活化实验，这些新型冠状病毒T细胞抗原表位肽可以用于制备针对各种新型冠状病毒突变株的通用疫苗、新型冠状病毒相关的免疫检测以及广谱治疗性药物研发中，值得深入研究和大力推广。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种新型冠状病毒T细胞表位多肽及其在制备疫苗中的应用。
背景技术
目前来说，疫苗接种仍然是我们最好、也是目前唯一的工具来控制疫情的蔓延。然而，随着新冠肺炎疫情在全球广泛扩散，诸如英国变异株、南非变异株、德尔塔变异株及奥密克戎变异株等新冠肺炎病毒变体不断出现。其中，不少新冠肺炎病毒变体可以通过免疫逃逸进而继续感染已经接种过新冠疫苗人群，这对当前新冠防控提出了巨大挑战。通过疫苗免疫建立有效的群体免疫屏障是我国乃至全世界防控新冠疫情的核心手段。
鉴于当前新冠变体及其免疫逃逸株的不断出现，为将来开发通用型新冠疫苗和广谱治疗药物提供了契机。通用疫苗是一类选择即使病毒抗原发生变异后仍能有效保护免疫人群特性的广谱疫苗。因此，开发出在新冠肺炎病毒发生各类变异后，依旧能够给疫苗免疫人群提供有效免疫保护的通用疫苗以及广谱治疗性药物迫在眉睫。
根据对新型冠状病毒同源性较高的SARS等冠状病毒的研究显示，T细胞免疫应答在病毒感染后机体抗病毒防御以及机体免疫病理损伤过程中发挥了重要的作用，尤其是CD8+ T细胞，其抗原特异性免疫活性11年后依然存在，说明了CD8+ T细胞免疫应答在抗冠状病毒免疫防御中的重要作用及其在疫苗研发中的重要地位。CD8+ T细胞免疫应答的第一步就是T细胞通过其表面的抗原识别受体特异性识别被病毒感染的细胞所递呈的抗原表位肽。因此，抗原表位肽是T细胞特异性识别病毒、发挥免疫保护作用的重要关键分子，是免疫检测、免疫治疗和疫苗研发的关键靶向分子。
CD8+ T细胞通过T细胞受体(TCR)识别pMHC活化，杀灭病毒感染细胞、清除病毒，从而发挥抗病毒的细胞免疫作用。因此，鉴定可以有效活化T细胞抗原表位肽，在病毒抗原发生变异后仍能诱导有效T细胞免疫保护，是开发新冠通用型疫苗和广谱治疗性药物的关键之一。
免疫逃逸是免疫抑制病原体通过其结构和非结构产物，拮抗、阻断和抑制机体的免疫应答。新型冠状病毒因为经常地持续性地发生突变，产生了大量的变异株，严重的威胁了疫苗的免疫屏障效果。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术目前在新型冠状病毒领域尚没有开发一种用于新型冠状病毒通用疫苗的T细胞抗原表位肽及其应用相关的不足，提供一种新型冠状病毒T 细胞抗原表位肽及其在制备疫苗中的应用，本发明的T细胞抗原表位肽，得到的变异株抗原表位肽相对于原始病毒株抗原表位肽活化CD8T的细胞能力并不会减弱，甚至更强；其可以和HLA-A2重链和HLA-A2轻链β2m蛋白组装成pMHC复合物；或直接负荷到抗原递呈细胞，能活化T细胞，有效诱导T细胞免疫，避免突变株的免疫逃逸，并在新冠疫苗接种者和康复者中均可检测到特异性的CD8+T细胞，可用于新型冠状病毒通用疫苗研发、制备和药物研发、临床治疗。
本发明的第一个目的是提供一种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽。
本发明的第二个目的是提供一种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽的编码基因。
本发明的第三个目的是提供一种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽组合物。
本发明的第四个目的是提供一种pMHC复合物。
本发明的第五个目的是提供一种抗原肽-抗原递呈细胞复合物。
本发明的第六个目的是提供所述的抗原表位肽、新型冠状病毒T细胞抗原表位肽的编码基因、所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽组合物、所述的pMHC复合物、和所述的抗原肽-抗原递呈细胞复合物中的一种或几种在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。
本发明的第七个目的是提供所述的抗原表位肽、新型冠状病毒T细胞抗原表位肽的编码基因、所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽组合物、所述的pMHC复合物、和所述的抗原肽-抗原递呈细胞复合物中的一种或几种在制备新型冠状病毒药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
T2-A2是一种通过重组基因工程技术表达人MHC-I类分子HLA-A2的抗原递呈细胞系。只有有效的抗原表位肽才能被其递呈，从而在其细胞表面形成稳定的pMHC复合物，因此可以作为刺激T细胞的人工抗原递呈细胞。
T细胞抗原表位肽单独无法工作，必须以pMHC复合物或抗原肽-抗原递呈细胞复合物的方式进行T细胞活化。本发明利用MHC的单体和鉴定出的新型冠状病毒T细胞表位进行联合复性，制备了pMHC复合物。将鉴定出的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽负荷在抗原递呈细胞表面(T2-A2细胞)，制备了抗原肽-抗原递呈细胞复合物，然后用制备好的pMHC复合物去标记T细胞，发现其抗原表位肽可以有效活化健康人外周血中T细胞，并且相对于原始病毒株的抗原表位肽，变异株能增加T细胞的活化能力，也可以有效杀伤携带新型冠状病毒抗原的靶细胞。该T细胞抗原表位肽组装成的带有PE荧光通道的pMHC复合物，可以在新冠疫苗接种者和康复者中均可检测到。证明新发现的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽能有效诱导T细胞免疫，避免突变株的免疫逃逸，可以作为通用型疫苗或应用于免疫治疗等。
因此本发明要求一种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽，其氨基酸序列如SEQ IDNO:1～9任一所示。
SEQ ID NO:1：VTWFHAIHV，
SEQ ID NO:2：VTWFHAISG，
SEQ ID NO:3：FKLKDCVMYA，
SEQ ID NO:4：FKLKECVMYA，
SEQ ID NO:5：YHDVRVVLDFI，
SEQ ID NO:6：YHDVRVVLI，
SEQ ID NO:7：ASLPFGWLI，
SEQ ID NO:8：ASLLFGWLI，
SEQ ID NO:9：VTWFHVIHV。
一种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽的编码基因，所述编码基因编码所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽。
一种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽组合物，含有氨基酸序列如SEQ ID NO：1～9所示的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽中的任意几条。
一种pMHC复合物，含有所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽或所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽组合物。
优选地，所述pMHC复合物的制备方法为HLA-A2重链、HLA-A2轻链β2m和所述新型冠状病毒T细胞抗原表位肽复性得到。
一种抗原肽-抗原递呈细胞复合物，表面有所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽或所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽组合物的抗原递呈细胞。
优选地，所述抗原递呈细胞为T2-A2细胞。
更优选地，T2-A2细胞是T2细胞过表达HLA-A2。
所述的抗原表位肽、新型冠状病毒T细胞抗原表位肽的编码基因、所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽组合物、所述的pMHC复合物、和所述的抗原肽-抗原递呈细胞复合物中的一种或几种在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。
所述的抗原表位肽、新型冠状病毒T细胞抗原表位肽的编码基因、所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽组合物、所述的pMHC复合物、和所述的抗原肽-抗原递呈细胞复合物中的一种或几种在制备新型冠状病毒药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明发现了9种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽，制备成带有PE荧光通道的pMHC复合物后可以用于新型冠状病毒疫苗接种者和感染康复者外周血内抗原特异性T细胞的检测，并用于体外的T细胞活化实验，这些新型冠状病毒T细胞抗原表位肽可以用于制备针对各种新型冠状病毒突变株的通用疫苗、新型冠状病毒相关的免疫检测以及广谱治疗性药物。
这些新型冠状病毒T细胞抗原表位肽制备成带有PE荧光通道的pMHC复合物，或直接负荷到抗原递呈细胞，从而活化T细胞，可用于新型冠状病毒疫苗研发、制备和药物研发、临床治疗，可应用于：
1)新冠疫苗的研发和制备：新型冠状病毒发生变异后，该多个T细胞表位能诱导机体产生免疫应答生成抗原特异性T细胞。故该T细胞表位是新型冠状病毒通用疫苗的候选抗原表位肽。
2)检测是否具有抵抗新型冠状病毒感染的细胞免疫功能：待检者体内检测到新型冠状病毒抗原特异性T细胞，代表机体已经产生了T细胞免疫功能，根据该抗原表位肽制备成荧光通道的pMHC复合物标记的抗原特异性CD8T的比例，可以评价机体T细胞免疫功能强弱及对新型冠状病毒感染可能性。
3)评估疫苗接种后的效果：接种者体内检测到新型冠状病毒抗原特异性T细胞，代表机体已经产生了T细胞免疫功能，根据其比例，可以评估机体再次感染新型冠状病毒可能性。
4)监测病情：可用于对密切接触者、医学观察者、疑似和确诊患者的病情变化监测。
5)预后判断：如果机体不能产生T细胞免疫应答，或抗原特异性T细胞比例持续减少，则预示预后不佳。
附图说明
图1为新型冠状病毒T细胞33种抗原表位肽的T2-A2抗原提呈的鉴定和抗原肽形成pMHC复合物的检测；A：33种新型冠状病毒抗原多肽的T2-A2抗原提呈的鉴定实验； B为三次实验重复小结，为A的统计图；C为33种抗原肽形成pMHC复合物的检测，ELISA 法筛选33种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽，用紫外敏感肽/MHC复合物和上述的33种肽进行肽交换分析，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。
图2为新型冠状病毒T细胞10种抗原表位肽的T2-A2抗原提呈的鉴定和抗原肽形成pMHC复合物的检测；A：10种新型冠状病毒抗原多肽的T2-A2抗原提呈的鉴定实验； B为三次实验重复小结，为A的统计图；C为10种抗原肽形成pMHC复合物的检测，ELISA 法筛选10种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽，用紫外敏感肽/MHC复合物和上述的10种肽进行肽交换分析，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。
图3为新型冠状病毒T细胞28种抗原表位肽的T2-A2抗原提呈的鉴定和抗原肽形成pMHC复合物的检测；A：28种新型冠状病毒抗原多肽的T2-A2抗原提呈的鉴定实验； B为三次实验重复小结，为A的统计图；C为28种抗原肽形成pMHC复合物的检测，ELISA 法筛选28种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽，用紫外敏感肽/MHC复合物和上述的28种肽进行肽交换分析，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。
图4为新型冠状病毒T细胞6种抗原表位肽的T2-A2抗原提呈的鉴定和抗原肽形成pMHC复合物的检测；A：6种新型冠状病毒抗原多肽的T2-A2抗原提呈的鉴定实验；B 为三次实验重复小结，为A的统计图；C为6种抗原肽形成pMHC复合物的检测，ELISA 法筛选6种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽，用紫外敏感肽/MHC复合物和上述的6种肽进行肽交换分析，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。
图5为新型冠状病毒T细胞30种抗原表位肽的T2-A2抗原提呈的鉴定和抗原肽形成pMHC复合物的检测；A：30种新型冠状病毒抗原多肽的T2-A2抗原提呈的鉴定实验； B为三次实验重复小结，为A的统计图；C为30种抗原肽形成pMHC复合物的检测，ELISA 法筛选30种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽，用紫外敏感肽/MHC复合物和上述的30种肽进行肽交换分析，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。
图6为新型冠状病毒T细胞32种抗原表位肽的T2-A2抗原提呈的鉴定和抗原肽形成pMHC复合物的检测；A：32种新型冠状病毒抗原多肽的T2-A2抗原提呈的鉴定实验； B为三次实验重复小结，为A的统计图；C为32种抗原肽形成pMHC复合物的检测，ELISA 法筛选32种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽，用紫外敏感肽/MHC复合物和上述的32种肽进行肽交换分析，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。
图7为新型冠状病毒T细胞22种抗原表位肽的T2-A2抗原提呈的鉴定和抗原肽形成pMHC复合物的检测；A：22种新型冠状病毒抗原多肽的T2-A2抗原提呈的鉴定实验； B为三次实验重复小结，为A的统计图；C为22种抗原肽形成pMHC复合物的检测，ELISA 法筛选22种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽，用紫外敏感肽/MHC复合物和上述的22种肽进行肽交换分析，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。
图8为新型冠状病毒T细胞6种抗原表位肽的T2-A2抗原提呈的鉴定和抗原肽形成pMHC复合物的检测；A：6种新型冠状病毒抗原多肽的T2-A2抗原提呈的鉴定实验；B 为三次实验重复小结，为A的统计图；C为6种抗原肽形成pMHC复合物的检测，ELISA 法筛选6种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽，用紫外敏感肽/MHC复合物和上述的6种肽进行肽交换分析，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。
图9为pMHC复合物组装后的纯化结果；A：pMHC复合物组装后的DEAE cellulose 离子交换柱纯化结果；B：pMHC复合物组装后的分子筛(GE Superdex75pg)纯化结果。
图10评价167种抗原肽对CD8+T细胞的活化。抗原肽刺激7天后诱导特异性CD8+T 细胞生成，NC：Negative-ctrl(T2-A2不含肽与CD8+T细胞共培养)为阴性对照，PC： Positive-ctrl(甲型流感M1肽GILGFVFTL)为阳性对照，流式细胞仪检测上述抗原肽活化的健康志愿者的外周血内抗原特异性CD8+T细胞。
图11为评价167种抗原肽对CD8+T细胞的活化的结果汇总；A：结果汇总显示这些突变后的表位形成的带有荧光通道的pMHC复合物可以检测到抗原特异性CD8+T，与原始病毒株的T细胞抗原表位肽相比，变异毒株的对应的T细胞抗原表位肽特异性活化 CD8+T细胞的比例不变或者升高；B：结果汇总显示这些新型冠状病毒变异病毒株的T细胞抗原表位肽与对应的原始病毒株的T细胞抗原表位肽形成的带有荧光通道的pMHC复合物均可以检测到抗原特异性CD8+T，与原始病毒株的T细胞抗原表位肽相比，变异毒株的对应的T细胞抗原表位肽特异性活化CD8+T细胞的比例下降；C：结果汇总显示这些新型冠状病毒变异病毒株的T细胞抗原表位肽与对应的原始病毒株的T细胞抗原表位肽形成的带有荧光通道的pMHC复合物均可以检测到抗原特异性CD8+T，与原始病毒株的T细胞抗原表位肽相比，变异毒株的对应的T细胞抗原表位肽特异性活化CD8+T细胞的比例升高或者下降。
图12评价167种抗原肽对CD8+T细胞毒性作用；A(上行)：抗原肽诱导特异性CD8+T细胞介导的细胞的杀伤作用，CFSE标记的T2-A2细胞为存活靶细胞；Day 0-ctrl：刺激前染色；T2-A2-ctrl(T2-A2不含肽与CD8+T细胞共培养)；Neg-ctrl(EB病毒IVTDFSVIK)；Pos-ctrl(甲型流感M1肽GILGFVFTL)为阳性对照；B(左边)：结果汇总显示上述抗原肽可杀伤靶细胞(T2-A2细胞)；A(下行)：特异性CD8+T细胞介导的靶细胞的凋亡， T2-A2-ctrl(T2-A2不含肽与CD8+T细胞共培养)；Neg-ctrl(EB病毒IVTDFSVIK)， Pos-ctrl(甲型流感M1肽GILGFVFTL)，流式细胞仪检测标记有CFSE和凋亡标记物Annexin V-APC的T2-A2细胞的凋亡比例；B(右边)：结果汇总显示上述抗原肽可诱导靶细胞(T2-A2细胞)凋亡；C(上行)：特异性CD8+T细胞IFN-γ+的释放。T2-A2-ctrl (T2-A2不含肽与CD8+T细胞共培养)，Neg-ctrl(EB病毒IVTDFSVIK)，Pos-ctrl(甲型流感M1肽GILGFVFTL)。流式细胞仪检测标记有CD8+IFN-γ+比例；D(左边)：结果汇总显示上述抗原肽可诱导CD8+T释放IFN-γ+；C(下行)：特异性CD8+T细胞GZMB+的释放。T2-A2-ctrl(T2-A2不含肽与CD8+T细胞共培养)，Neg-ctrl(EB病毒IVTDFSVIK)， Pos-ctrl(甲型流感M1肽GILGFVFTL)；流式细胞仪检测标记有CD8+GZMB+比例；D (右边)：结果汇总显示上述抗原肽可诱导CD8+T释放GZMB+。
图13评估新冠康复者后14天和疫苗接种第二针后7天体内特异性CD8+T细胞的比例；A流式细胞术检测HLA-A2+COVID-19康复患者上述9种(T细胞活化时，新型冠状病毒变异病毒株的T细胞抗原表位肽与对应的原始病毒株的T细胞抗原表位肽相比，产生的特异性的CD8+T细胞比例升高或者不变)肽的特异性CD8+T细胞；B：结果汇总显示所制备的10种带有荧光通道的pMHC复合物可以检测新型冠状病毒感染康复者体内的记忆性CD8+T细胞；C流式细胞术检测疫苗接种第二针后7天HLA-A2+志愿者上述9种(T 细胞活化时，新型冠状病毒变异病毒株的T细胞抗原表位肽与对应的原始病毒株的T细胞抗原表位肽相比，产生的特异性的CD8+比例升高或者不变)肽的特异性CD8+T细胞；D：结果汇总显示所制备的9种带有荧光通道的pMHC复合物可以检测疫苗接种体内的记忆性CD8+ T细胞。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1新型冠状病毒HLA-A2限制性抗原表位肽的预测
一、实验方法
利用“MHC I Binding”工具(http://tools.iedb.org/mhci)对SARS-CoV-2原始病毒株(NC_045512.2)spike(S)、membrane(M)、nucleocapsid(N)、Envelope(E)和ORF 蛋白序列进行了CD8 T细胞表位预测。使用的预测方法是IEDB Recommended 2.22 (NetMHCpanEL)，MHC等位基因选择为HLA-A*02:01，这是中国人群中最常见的一类HLA基因型。
对所有含有与B.1.1.7(Alpha型突变株)(ID＝1)、B.1.351(Beta型突变株)(ID＝2),P.1 (Gamma型突变株)(ID＝3)、P.2(ID＝4),P.3(ID＝5)、B.1.429(Epsilon型突变株)(ID＝6)、 B.1.526.1(Lota型突变株)(ID＝7)、B.1.526.2(ID＝8),B.1.618(ID＝9),B.1.617.1(ID＝10)、 B.1.617.2(Delta型突变株)(ID＝11)、B.1.617.3(ID＝12)和B.1.1.529(Omicron型突变株) (ID＝13)这些新型冠状病毒变异病毒株的T细胞抗原表位肽与对应的原始病毒株的T细胞抗原表位肽进行研究。从GISAID数据库中提取每个表位的变异序列(GISAID.org网站)，以便进一步分析。
二、实验结果
筛选出167种高效特异的候选T细胞抗原表位肽。其信息如表1所示。
表1 新型冠状病毒T细胞167种抗原表位肽：
实施例2新型冠状病毒HLA-A2限制性抗原表位肽的鉴定
一、实验方法
人工合成实施例1预测得到的候选T细胞抗原表位肽，配置成浓度为20μM。取对数生长状态T2-A2细胞，种植到96孔板，每孔105个，分布设置空白孔、阴性对照肽(EB 病毒，IVTDFSVIK)、阳性对照肽(甲型流感M1多肽，GILGFVFTL)和各合成候选T 细胞抗原表位肽，每组3个复孔，终体积200μL。37℃孵育4小时后离心洗涤两次，以FITC anti-human HLA-A2(β2m)抗体标记，4℃避光孵育30分钟后，以流式细胞仪检测。实验共进行3次。
二、实验结果
结果如图1到图8的A和B所示，结果显示，167种抗原多肽均可以被抗原递呈细胞有效递呈信息给T细胞，说明这些肽是T细胞抗原表位肽。
实施例3抗原多肽形成pMHC复合物的检测
一、实验方法
ELISA法检测实施例2中筛选得到的167种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽。
在室温下，用100μL的0.5μg mL-1链霉亲和素在96个U形板上孵育16～18小时，用洗涤缓冲液洗涤3次，并在室温下用稀释缓冲液(0.5M Tris pH 8.0，1M NaCl，1％BSA， 0.2％吐温20)封闭30分钟。光敏肽(KILGFVFJV)与MHC((BioLegend,Cat#280003,US)) 形成的pMHC复合物设为HLA空白对照，甲型流感M1肽(M58-66 GILGFVFTL)设为阳性对照，EB病毒肽(IVTDFSVIK)设为阴性对照。然后，分别添加用365nm三用紫外线分析仪(Qilin Bell，Cat#1903274)置换好的20μL实施例1中的167种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽的稀释液(400μM)和20μL Flex-TTM单体(200μg/mL)的稀释液 100μL到96孔板，并在温度为37℃的细胞培养箱里孵育1小时。使用洗涤缓冲液洗涤三次后，添加100μL稀释HRP结合抗体(BioLegend,Cat#280303,US)，并在37℃下继续孵育1小时，然后洗涤。添加100μL底物溶液(10.34mL去离子水，1.2mL 0.1M柠檬酸一水合物/柠檬酸三钠二水合物，pH 4.0，240μL 40mM ABTS，120μL过氧化氢溶液)，并在室温避光孵育8min。使用50μL终止溶液(2％w/v草酸二水合物)终止反应。在30分钟内，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。
二、实验结果
结果如图1到图8的C所示，结果显示167种抗原多肽均可以形成pMHC复合物。
实施例4抗原表位肽的pMHC复合物单体的制备
一、实验方法
将HLA-A2重链、HLA-A2轻链β2m和实施例1中表1中167种抗原表位肽分别按照1：2：10的摩尔比逐步滴加至复性溶液(5M尿素、0.4M精氨酸、100mM Tris、3.7mM 胱胺、6.3mM半胱胺和2mM EDTA)中进行复性，得到抗原表位肽的pMHC复合物单体。
pMHC复合物单体经过DEAE离子交换柱进一步纯化，以0.5M NaCl洗脱，并根据OD280nm紫外吸收峰收集蛋白。随后经DEAE离子交换柱纯化后的蛋白根据分子量大小，通过Superdex 75pg分子筛纯化，以PBS洗脱，并根据OD280 nm紫外吸收峰收集不同分子量蛋白。
二、实验结果
经过纯化后，得到抗原表位肽的pMHC复合物单体(图9)。
实施例5新型冠状病毒HLA-A2限制性抗原表位肽活化T细胞
一、实验方法
T2细胞通过表达HLA-A2分子(T2-A2)来活化T细胞。分离健康志愿者的外周静脉血中的单个核淋巴细胞(PBMCs)，并进一步分离CD8+ T细胞。将T2-A2细胞用CFSE 标记，用20μg/mL丝裂霉素处理20分钟后，分别用实施例1中167种不同抗原肽孵育。
具体做法为：
将0.5×106CD8+T细胞与不同抗原表位肽负荷的0.5×106T2-A2细胞共培养，并用1μg/mL抗人CD28抗体和50IU/mL IL-2共刺激。每隔两天补充50IU/mL IL-2和20μM抗原表位肽。
将实施例4得到的30μL抗原表位肽的pMHC复合物单体与3.3μL PE链霉亲和素(BioLegend Cat#405203，US)在96孔板中混合，并在4℃避光孵育30分钟后，再加入 2.4μL封闭溶液(1.6μL 50mM生物素(Thermo Fisher，Cat#B20656，US))和198.4μL PBS以停止反应，并在4～8℃下培养过夜，即可得到带有PE荧光通道的pMHC复合物。
培养7天后计算T2-A2的存活数目百分比、用带有PE荧光通道的pMHC复合物标记特异性CD8+T细胞比例和T2-A2细胞上的凋亡标记物Annexin V-APC百分比，检测特异性CD8+T细胞释放IFN-γ和GZMB的情况。
二、实验结果
结果如图10和11所示，实施例2中筛选得到的167种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽均能够活化T细胞。
其中，对于B.1.1.7突变株的T细胞抗原表位肽VTWFHAISG(SEQ ID NO:2)，其对应原始病毒株的T细胞抗原表位肽VTWFHAIHV(SEQ ID NO:1)，活化CD8+T的细胞能力突变前后相对稳定。
而对于P.3突变株的T细胞抗原表位肽FKLKECVMYA(SEQ ID NO:4)，其对应原始病毒株的T细胞抗原表位肽FKLKDCVMYA(SEQ ID NO:3)；对于B.1.526.1突变株的T细胞抗原表位肽YHDVRVVLI(SEQ ID NO:6)，其对应原始病毒株的T细胞抗原表位肽YHDVRVVLDFI(SEQID NO:5)；对于B.1.526.2突变株的T细胞抗原表位肽 ASLLFGWLI(SEQ ID NO:8)，其对应原始病毒株的T细胞抗原表位肽ASLPFGWLI(SEQ ID NO:7)；对于B.1.1.529突变株的T细胞抗原表位肽VTWFHVIHV(SEQ ID NO:9)，其对应原始病毒株的T细胞抗原表位肽VTWFHAIHV(SEQID NO:1)，以上原始病毒株的T细胞抗原表位肽与突变株的T细胞抗原表位肽相比，突变株的T细胞抗原表位肽活化CD8+T的细胞能力增强。
同时以上肽活化的特异性CD8+T可以杀伤靶细胞，并且特异性的CD8+T细胞释放IFN-γ和GZMB(如图12所示)。
实施例6新型冠状病毒HLA-A2限制性抗原表位肽活化T细胞
一、实验方法
分离新型冠状病毒原始病毒株(NC_045512.2)感染康复者14天和接种北京科兴灭活疫苗第二针后7天志愿者外周静脉血中的PBMCs，并鉴定其HLA亚型，HLA-A2阳性 PBMCs样品进一步用实施例5中带有PE荧光通道的pMHC复合物和CD8-PerCP抗体进行染色，然后进行流式上机检测。
二、实验结果
结果如图13所示，结果显示，氨基酸序列如SEQ ID NO:1～9所示的9种抗原表位肽的带有荧光通道的pMHC复合物可以识别新型冠状病毒感染康复者和疫苗接种者体内产生的抗原特异性CD8+T细胞。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种新冠病毒T细胞抗原表位肽及其在制备疫苗中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Thr Trp Phe His Ala Ile Ser Gly
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Phe Lys Leu Lys Asp Cys Val Met Tyr Ala
1 5 10
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<212> PRT
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<400> 4
Phe Lys Leu Lys Glu Cys Val Met Tyr Ala
1 5 10
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Val Thr Trp Phe His Val Ile His Val
1 5
Claims (10)
1.一种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1～9任一所示。
2.一种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽的编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽。
3.一种新型冠状病毒T细胞抗原表位肽组合物，其特征在于，含有氨基酸序列如SEQ IDNO：1～9所示的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽中的任意几条。
4.一种pMHC复合物，其特征在于，含有权利要求1所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽中或权利要求3所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽组合物。
5.根据权利要求4所述的pMHC复合物，其特征在于，所述pMHC复合物的制备方法为HLA-A2重链、HLA-A2轻链β2m和权利要求1所述新型冠状病毒T细胞抗原表位肽复性得到。
6.一种抗原肽-抗原递呈细胞复合物，其特征在于，表面有权利要求1所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽或权利要求3所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽组合物的抗原递呈细胞。
7.根据权利要求6所述的抗原肽-抗原递呈细胞复合物，其特征在于，所述抗原递呈细胞为T2-A2细胞。
8.根据权利要求7所述的抗原肽-抗原递呈细胞复合物，其特征在于，T2-A2细胞是T2细胞过表达HLA-A2。
9.权利要求1所述的抗原表位肽、权利要求2所述新型冠状病毒T细胞抗原表位肽的编码基因、权利要求3所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽组合物、权利要求4或5所述的pMHC复合物、和权利要求6所述的抗原肽-抗原递呈细胞复合物中的一种或几种在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。
10.权利要求1所述的抗原表位肽、权利要求2所述新型冠状病毒T细胞抗原表位肽的编码基因、权利要求3所述的新型冠状病毒T细胞抗原表位肽组合物、权利要求4或5所述的pMHC复合物、和权利要求6所述的抗原肽-抗原递呈细胞复合物中的一种或几种在制备新型冠状病毒药物中的应用。
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Inventor after: Chen Guobing Inventor after: Xiao Chanchan Inventor after: Luo Junhong Inventor after: Wang Pengcheng Inventor after: Gao Lijuan Inventor after: Ren Zhiyao Inventor before: Chen Guobing Inventor before: Xiao Chanchan Inventor before: Luo Junhong Inventor before: Wang Pengcheng Inventor before: Gao Lijuan |
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Inventor after: Chen Guobing Inventor after: Xiao Chanchan Inventor after: Ren Zhiyao Inventor after: Luo Junhong Inventor after: Wang Pengcheng Inventor after: Gao Lijuan Inventor before: Chen Guobing Inventor before: Xiao Chanchan Inventor before: Luo Junhong Inventor before: Wang Pengcheng Inventor before: Gao Lijuan Inventor before: Ren Zhiyao |
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| GR01 | Patent grant | ||
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