CN113735947A - 新型冠状病毒s蛋白全蛋白组筛选的特异性t细胞表位肽p48及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新型冠状病毒S蛋白全蛋白组筛选的特异性T细胞表位肽P48及其应用，其氨基酸序列如SEQ No.48所示。本发明筛选出的T细胞表位肽经过了特异性验证，排除了健康人群中的交叉反应，可以作为检测新冠患者的特异性抗原。本发明将筛选出的特异性T细胞表位肽P48在更多的新型冠状病毒肺炎恢复期患者外周血单个核细胞样本中检测，获得其在CD4+T和CD8+T细胞中的阳性反应率分别为30.8％和23.1％。本发明还提供了能识别该表位肽的HLA等位基因型别。该表位肽有潜力作为新冠疫苗抗原成分之一，并可用于开发检测试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及新型冠状病毒刺突(spike,S)蛋白全蛋白组筛选的 特异性T细胞表位肽P48及其应用。
背景技术
在抗病毒免疫中，中和抗体可以阻止病毒入侵，与此同时，T细胞免疫应答在清除病毒 中的作用也同样不可忽视。CD4+T细胞有助于诱导记忆性B细胞成熟和抗体反应；CD8+T细 胞协助病毒的清除，并且记忆性CD8+T细胞可以提供长期保护作用，有效预防继发性感染。 严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)与 SARS-CoV-2同属于β冠状病毒属，两者所致疾病的临床症状、疾病转归，以及病毒本身的 传播规律都具有一定的相似性。对SARS康复患者免疫状态的长期监测发现，康复者体内的 中和抗体和IgG在两年内持续存在，2-3年后抗体逐渐消失，6年后检测不到记忆性B细胞反 应，但特异性T细胞应答甚至在17年后还能被检测到。这些结果表明相比抗体，T细胞免疫 记忆更加持久，在抵抗冠状病毒感染中可能发挥着更加持久的作用。因此，在新冠病毒疫苗 设计及保护效果评价中，除了中和抗体，还应关注疫苗诱导的特异性T细胞免疫应答。
在COVID-19恢复期患者体内，除了能够检测到病毒特异性抗体，也检测到了强烈的T 细胞应答。T细胞表面的受体分子通过识别被降解为短肽的T细胞表位肽从而诱导机体产生 免疫应答，另外，已有研究表明，面对出现的新冠变异株，大多数T细胞仍然能够保持良好 的识别能力。就长远保护效果来看，T细胞免疫发挥了更加重要的作用。
表位又称抗原决定簇，它是与T、B细胞抗原受体及抗体特异性结合的基本结构单位。 为了开发具有长期保护效果且能保护变异毒株的疫苗，同时监测评估疫苗接种人群的保护效 果，需要鉴定出人T细胞能够识别的病毒特异性T细胞表位肽。
目前，关于SARS-CoV-2 T细胞表位肽的报道已有很多，但大多仅基于生物信息学软件 预测，仅有部分表位肽真正被COVID-19患者T细胞所验证，并且这些T细胞表位肽也未经 过特异性检测。由于在未暴露人群中也检测到了由SARS-CoV-2引起的T细胞应答(非特异 性交叉反应)，这些交叉反应可能来源于机体之前感染的普通冠状病毒或其他的病原体，它 们的存在给后期免疫评估带来了一定程度的干扰。因此，对筛选出的T细胞表位肽在未暴露 人群中进行交叉反应检测进而确定T细胞表位肽的特异性是非常有必要的。并且，人体的人 类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)等位基因与个体的免疫应答水平相关，T细胞 受体依赖HLA分子识别不同的抗原肽并激活下游免疫应答。人群中HLA分子存在的遗传多 态性使人群对抗原识别存在巨大的多样性。因此，对某T细胞表位肽需要提供能识别该表位 肽的HLA等位基因，以预测该表位肽能覆盖的阳性应答人群范围，对表位肽的应用提供重要 的人群范围的参考。
中国专利ZL202010306192.4通过获取2019-nCov(MN908947.3)、SARS中国分离株(DQ182595.1)、MERS利雅得分离株(KF600612.1)和1997年美国普通冠状病毒分离株(KF530099.1)的spike(S)、membrane(M)和nucleocapsid(N)蛋白序列，以Clustal Omega进行序列对比，选取和SARS、MERS和普通冠状病毒序列不一致的表位进行后续鉴定。筛选 获得的T细胞表位肽被COVID-19患者T细胞所验证，但没有与未暴露人群进行交叉反应检 测排除非特异性干扰。
中国专利ZL202010287172.7利用IEDB资源Class I Immunogenicity工具预测了SARS-Cov-2 N蛋白(NBCI accession numer:YP-009724397.2)的T细胞表位，该工具分析了600个具有免疫原性、181个不具有免疫原性的9mer肽，总结出两个特征：第一，富含苯丙 氨酸、异亮氨酸、色氨酸的肽段免疫原性强，而富含丝氨酸、赖氨酸、蛋氨酸的肽段免疫原 性弱。第二，9mer肽中第4-6个氨基酸在肽段的免疫原性中起重要作用。将蛋白序列分解成 系列9mer肽，彼此相邻的9mer肽具有8mer重叠。并且将9mer肽的第一个、第二个氨基酸 和C末端氨基酸遮盖。然后计算每个9mer肽的得分，选出分值最高的4个9mer肽，进行表 位肽功能验证。但并未经COVID-19患者T细胞验证。
并且，尚未有新冠病毒S蛋白全蛋白组筛选得到特异性T细胞表位肽的报道。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供新型冠状病毒S蛋白全蛋白组筛选的 特异性T细胞表位肽P48，该T细胞表位肽被COVID-19恢复期患者T细胞所验证，在未暴露人群中进行了交叉反应检测，进而确定了该T细胞表位肽的特异性，并提供了能识别该表位肽的人HLA等位基因信息。
本发明提供的新型冠状病毒S蛋白全蛋白组筛选的特异性T细胞表位肽，其氨基酸序列 如SEQ No.48所示:EIYQAGSTPCNGVEG。
本发明还提供所述特异性T细胞表位肽在制备新型冠状病毒感染者筛查检测试剂中的应 用。
本发明所述特异性T细胞表位肽还为评估新型冠状病毒疫苗免疫保护持久力提供检测抗 原。
本发明所述特异性T细胞表位肽还为检测病毒变异株诱导的免疫应答评价提供检测抗 原。
本发明所述特异性T细胞表位肽还为检测新冠患者特异性T细胞免疫应答水平提供检测 抗原。
本发明所述特异性T细胞表位肽还为体外诱导特异性T细胞提供抗原。
本发明还提供一种核酸，其编码上述的特异性T细胞表位肽。
所述核酸序列为SEQ No.128所示：gaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggt。
本发明还提供一种重组载体，其包含上述核酸。
本发明还提供一种宿主细胞，其包含上述重组载体。
本发明还提供一种疫苗，其包含上述表位肽、上述核酸、上述重组载体或上述表位肽的 呈递细胞，其中之一。
本发明还提供一种检测新冠病毒特异性T细胞比例的方法，其特征在于，用上述表位肽 与受试者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)共培养，刺激T细胞 产生应答，同时设置阴性对照(培养基刺激)，用流式细胞术测定产生细胞因子(IFN-γ，IL-2， TNF-α等)和/或具有细胞功能状态活化标志(如CD69等)的T细胞比例，扣除阴性对照值， 以此获得表位肽P48诱导产生的新冠特异性T细胞占总T细胞的比例。
本发明还提供一种针对新冠病毒感染的主动免疫疗法剂，其包含上述特异性T细胞表位 肽。
S蛋白在新冠病毒入侵过程中发挥着关键作用，并且也是T细胞响应的突出靶点。本发 明利用COVID-19恢复期患者PBMC样本，从S蛋白重叠肽段库中筛选出能够被恢复期患者 T细胞识别的表位肽P48，再进一步在未暴露者PBMC样本中检测其非特异交叉反应以确定 其特异性。将其在更多的恢复期患者PBMC样本中检测获得其人群阳性反应率。进一步鉴定 了能够识别表位肽P48的COVID-19恢复期患者HLA等位基因，并根据这些信息预测得到T细胞表位肽P48在北亚及全球范围内的阳性应答人群覆盖率。
本发明的有益效果在于：
1.本发明筛选出的T细胞表位肽经过了特异性验证，排除了健康人群中的交叉反应，可 以作为检测新冠患者的特异性候选抗原。
2.本发明将筛选出的特异性阳性T细胞表位肽在更多的COVID-19恢复期患者PBMC样 本中检测，获得P48在CD4+T和CD8+T细胞中的阳性反应率分别为30.8％和23.1％。根据得到的特异性T细胞表位肽在人群中的免疫学检测信息，表位肽P48有潜力作为新冠疫苗抗原成分之一，将其联合使用从而优化出较好的免疫刺激效果。
3.本发明根据对特异性T细胞表位肽P48产生阳性应答的恢复期患者HLA等位基因，预 测得到对P48呈IFN-γ+CD4+T细胞阳性应答人群的HLA等位基因在北亚及全球范围内的人 群覆盖率分别为97.26％和94.64％，对P48呈IFN-γ+CD8+T细胞阳性应答人群的HLA等位 基因在北亚及全球范围内的人群覆盖率分别为96.41％和79.95％，为以该表位肽来评估新冠 疫苗激发的T细胞免疫的适用人群覆盖范围提供了参考。
4.本发明根据表位肽的人群HLA等位基因信息，将表位肽呈递至对应人群的抗原递呈细 胞，激发T细胞免疫保护应答，有潜力作为一种主动免疫疗法剂。
附图说明
图1 T细胞内细胞因子IFN-γ检测的流式圈门策略；
图2阳性T细胞表位肽P48的筛选过程；
图3 COVID-19恢复期患者T细胞对表位肽P48的阳性反应率。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围。
实施例1 COVID-19恢复期患者及未暴露人群血液样本的收集
招募COVID-19出院患者在出院后两周内采集血液样本，立即分离PBMC于液氮保存。 所有COVID-19患者出院要求达到中国卫生健康委员会办公厅颁布的新型冠状病毒感染的肺 炎诊疗方案(第七版)中COVID-19患者出院标准。收集未暴露者(无SARS-CoV-2感染， 未接种新冠疫苗)的血液PBMC样本作为阴性对照。
实施例2 SARS-CoV-2Spike蛋白肽段库
按照SARS-CoV-2S蛋白的氨基酸序列(access number:YP_009724390.1)，设计肽段长 度为15-mers，两个连续肽段重叠5个氨基酸，最后共获得覆盖S蛋白全长的127条多肽(P1-P127)，多肽氨基酸序列见表1。将127条多肽按顺序排列为12(C1-C12)×11(R1-R11)的棋盘列表，见表2，得到23个肽段组。
表1 Spike蛋白肽段库的肽段序列
表2肽段棋盘列表
| 肽段组 | C1 | C2 | C3 | C4 | C5 | C6 | C7 | C8 | C9 | C10 | C11 | C12 |
| R1 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 | P6 | P7 | P8 | P9 | P10 | P11 | P12 |
| R2 | P13 | P14 | P15 | P16 | P17 | P18 | P19 | P20 | P21 | P22 | P23 | P24 |
| R3 | P25 | P26 | P27 | P28 | P29 | P30 | P31 | P32 | P33 | P34 | P35 | P36 |
| R4 | P37 | P38 | P39 | P40 | P41 | P42 | P43 | P44 | P45 | P46 | P47 | P48 |
| R5 | P49 | P50 | P51 | P52 | P53 | P54 | P55 | P56 | P57 | P58 | P59 | P60 |
| R6 | P61 | P62 | P63 | P64 | P65 | P66 | P67 | P68 | P69 | P70 | P71 | P72 |
| R7 | P73 | P74 | P75 | P76 | P77 | P78 | P79 | P80 | P81 | P82 | P83 | P84 |
| R8 | P85 | P86 | P87 | P88 | P89 | P90 | P91 | P92 | P93 | P94 | P95 | P96 |
| R9 | P97 | P98 | P99 | P100 | P101 | P102 | P103 | P104 | P105 | P106 | P107 | P108 |
| R10 | P109 | P110 | P111 | P112 | P113 | P114 | P115 | P116 | P117 | P118 | P119 | P120 |
| R11 | P121 | P122 | P123 | P124 | P125 | P126 | P127 |
实施例3分泌细胞因子IFN-γ的T细胞比例的检测
1×106个PBMC与待测肽段组(每条肽段终浓度为2.5μg/mL)或等体积培养基(不刺激 组)共同孵育20小时(37℃，5％CO2)，孵育结束前5小时加入高尔基体阻断剂。结束培 养后，按照试剂说明书对死细胞、细胞表面标志(CD3、CD4、CD69)及胞内细胞因子(IFN-γ) 染色，并用流式细胞仪(BD FACSCantoTMⅡ)检测，每个样本收集15-20万个淋巴细胞， 用软件Flowjo 10进行数据分析，流式圈门策略见图1。
实施4阳性T细胞表位肽的筛选
随机混合4名普通症COVID-19恢复期患者的PBMC作为测试样本，混合4名未暴露者的PBMC作为阴性对照样本。将23个肽段组分别与测试样本和对照样本共培养后用流式细胞术检测在CD4+T和CD8+T细胞中能够分泌IFN-γ的细胞比例。
当测试样本PBMC与肽段组共同孵育后产生的分泌IFN-γ的CD4+T或CD8+T细胞比例(扣除培养基刺激)>[对照样本PBMC与相应肽段组共同孵育后产生的分泌IFN-γ的CD4+T或CD8+T细胞比例(扣除培养基刺激)平均值+3×标准差]被认为是阳性应答。以此筛选到能引起T细胞阳性应答的肽段组。
测试样本中的CD8+T细胞对肽段组C12和R4呈阳性反应。将阳性反应肽段组在肽段列 表中进行交叉比较，找到能引起CD8+T阳性应答的肽段为P48，见图2。
实施例5阳性T细胞表位肽P48与未暴露人群样本的交叉反应的检测
对于T细胞表位肽P48在未暴露人群中交叉反应的检测，当未暴露者PBMC与表位肽共 同孵育后产生的分泌IFN-γ的CD4+T或CD8+T细胞比例(扣除培养基刺激)>(未暴露者PBMC与等量培养基孵育后产生的分泌IFN-γ的CD4+T或CD8+T细胞比例的平均值+2×标准差)被认为是交叉反应阳性应答。在被检测的17份健康人PBMC样本中未检测到表位肽P48引起的阳性IFN-γ+T细胞应答，表明筛选出的表位肽P48具有特异性。
实施例6特异性T细胞表位肽P48在COVID-19恢复期患者PBMC样本中的阳性反应率
将表位肽P48在更多的恢复期患者PBMC样本中进行流式检测，发现P48能够引起CD4+ IFN-γ+T和CD8+IFN-γ+T阳性应答，被测的26份样本中CD4+T和CD8+T细胞对表位肽P48的阳性反应率分别为30.8％和23.1％，见图3。
实施例7 T细胞表位肽序列在6种冠状病毒中的保守性分析
从NCBI获得6种冠状病毒S蛋白氨基酸序列，分别为spike protein of humancoronavirus 229E(GenBank:BAL45639.1),spike protein of human coronavirus NL63(GenBank: AFD98834.1),spike protein of human coronavirus OC43(GenBank:AAA03055.1),spike protein of human coronavirus HKU1(GenBank:BBA20983.1),spikeprotein of SARS coronavirus (GenBank:ABA02260.1)和spike protein of MERScoronavirus(NCBI Reference Sequence: YP_009047204.1)。通过IEDB网站(http://www.iedb.org/)Epitope Conservancy Analysis工具 对筛选出的阳性T细胞表位进行保守性分析，结果见表3。
表3特异性T细胞表位肽P48与6种冠状病毒S蛋白的序列保守性分析
a:spike protein of human coronavirus 229E(GenBank:BAL45639.1).
b:spike protein of human coronavirus NL63(GenBank:AFD98834.1).
c:spike protein of human coronavirus OC43(GenBank:AAA03055.1).
d:spike protein of human coronavirus HKU1(GenBank:BBA20983.1).
e:spike protein of SARS coronavirus(GenBank:ABA02260.1).
f:spike protein of MERS coronavirus(NCBI Reference Sequence:YP_009047204.1)
g:The red part represents different amino acids.
实施例8 HLA人群覆盖率
对表位肽P48呈阳性应答的全血样本取200μL提取基因组DNA，采用PCR-SBT法(polymerase chain reaction sequence-based typing,PCR-SBT)进行HLA等位基因鉴定，包括 HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1和HLA-DPB1，获得HLA等位基因信 息。根据HLA等位基因信息，使用IEDB网站(http://www.iedb.org/)Population Coverage 工具，预测得到这些等位基因在全球及北亚人群中的HLA覆盖率，见表4。
表4特异性T细胞表位肽P48阳性应答个体的HLA等位基因及其人群覆盖率
实施例9本发明特异性T细胞表位肽P48在制备新型冠状病毒感染者筛查检测试剂中的应 用
本发明特异性T细胞表位肽P48作为筛检试剂组成成分之一，用于辅助筛查新冠病毒感 染者，采用的方法是流式细胞术，样本是受试者外周血单个核细胞。具体的，所述表位肽P48 是作为刺激外周血单个核细胞中T淋巴细胞应答的刺激抗原，在具体使用时还可以混合其他 T细胞表位肽共同作为刺激抗原或单独使用P48。
所述筛检试剂包括人外周血单个核细胞分离液、1640培养基、胎牛血清、上述表位肽P48 和流式检测试剂，其中，P48表位肽可由公司合成，其余试剂可购买成品商业化试剂。流式 检测试剂包括：高尔基体阻断剂、PAM、Ionomycin、流式抗体(抗CD3、抗CD4、抗CD8、 抗IFN-γ单克隆荧光抗体等)。
抽取受试者外周血(抗凝)，利用密度梯度离心法(人外周血单个核细胞分离液)获得 外周血单个核细胞样本，用1640培养基清洗两遍，最后用含有10％胎牛血清的1640培养基 重悬细胞。设置检测孔、阳性孔、阴性孔，每孔加入1*106个细胞。检测孔：细胞样本与刺激抗原共同孵育20小时(37℃，5％CO2)，孵育结束前5小时加入高尔基体阻断剂；阳性 对照：细胞样本与PAM、Ionomycin混合液(PAM:50ng/mL；Ionomycin:500ng/mL)及高尔 基体阻断剂共同孵育5小时(37℃，5％CO2)作为阳性对照；阴性对照：细胞样本与等体积 培养基共同孵育20小时(37℃，5％CO2)，孵育结束前5小时加入高尔基体阻断剂。结束 培养后，按照试剂说明书进行细胞表面标志(CD3、CD4、CD8)及胞内细胞因子染色(IFN-γ 等)，用流式细胞仪检测分泌细胞因子(IFN-γ等)的CD4+T或CD8+T细胞比例，用软件 Flowjo 10进行数据分析。
当受试者检测孔产生的分泌IFN-γ的CD4+T或CD8+T细胞比例(扣除相应阴性孔)>[健 康人检测孔产生的分泌IFN-γ的CD4+T或CD8+T细胞比例(扣除相应阴性孔)平均值+3×标准差]被认为是阳性应答，认为该受试者可能感染新冠病毒。
可根据实际情况对细胞数量、检测抗原使用浓度及孵育时间进行优化，可纳入更多流式 检测指标(细胞表面标志或细胞因子)。
实施例10本发明特异性T细胞表位肽P48在评估新型冠状病毒疫苗免疫保护持久力中的应 用
本发明特异性T细胞表位肽P48作为试剂组成成分之一，用于评价新冠疫苗免疫保护持 久力，采用的方法是流式细胞术，样本是受试者外周血单个核细胞。具体的，所述表位肽P48 是作为刺激外周血单个核细胞中T淋巴细胞应答的刺激抗原，在具体使用时还可以混合其他 T细胞表位肽共同作为刺激抗原或单独使用P48。
所述试剂包括人外周血单个核细胞分离液、1640培养基、胎牛血清、上述表位肽P48和 流式检测试剂，其中，P48表位肽可由公司合成，其余试剂可购买成品商业化试剂。流式检 测试剂包括：高尔基体阻断剂、PAM、Ionomycin、流式抗体(抗CD3、抗CD4、抗CD8、 抗IFN-γ单克隆荧光抗体等)。
在新型冠状病毒疫苗诱导的免疫保护持久力监测中，评估T细胞免疫应答水平是其中的 重要组成部分。采集完成新冠疫苗(各类型新冠疫苗均可)接种后1个月、3个月、6个月， 12个月等的受试者外周血样本(抗凝)，分离获得外周血单个核细胞(人外周血单个核细胞 分离液)，用1640培养基清洗两遍，最后用含有10％胎牛血清的1640培养基重悬细胞。所 述表位肽P48作为刺激抗原成分之一，可以混合其他T细胞表位肽共同作为刺激抗原或单独 使用P48。采用实施例9中描述的流式检测方法和判断标准，检测并评价受试者针对新冠病 毒的特异性细胞免疫应答，如随着时间延长检测不到阳性应答，则表明疫苗免疫保护效果已 消失，由此可评价新冠疫苗免疫保护持久力。
可根据实际情况对细胞数量、检测抗原使用浓度及孵育时间进行优化，可纳入更多流式 检测指标(细胞表面标志或细胞因子)。
类似地，该项检测还可以应用于检测感染新冠病毒变异株的新冠患者和普通新冠患者的 细胞免疫应答，使用者可根据实际应用情况和相关专业知识进行优化。
实施例11本发明特异性T细胞表位肽P48在体外诱导特异性T细胞中的应用
试剂包括人外周血单个核细胞分离液、1640培养基、胎牛血清、诱导剂(抗人CD3、抗 人CD28、IL-2等)。
利用密度梯度离心法，以人外周血单个核细胞分离液从外周血中分离获得外周血单个核 细胞，1640培养基清洗两遍后，取1*106个细胞接种于24孔板中，与所述表位肽P48在培养 液(1640培养基，含有胎牛血清、抗人CD3、抗人CD28、IL-2等)中培养刺激(37℃，5％CO2)3天，半量更换培养基，3-4次后完成诱导。诱导完成后检测T细胞效应能力，例如通 过实施例9中描述的流式检测方法检测细胞活化或在特异性抗原刺激后分泌细胞因子的比例，收集获得具有效应功能的特异性T细胞。可进一步考虑将获得的特异性T细胞作为一种主动免疫疗法。
具体应用时应根据实际情况对细胞接种数量、抗原刺激浓度、抗体及细胞因子浓度及刺 激时间进行优化，当然也可采用类似的其他体外诱导方式进行实验。
实施例12本发明提供的一种包含上述表位肽的疫苗
根据本发明提供的抗原表位肽P48对应的核苷酸序列合成DNA片段，将其连接至原核 表达质粒，如PET系列表达质粒，并通过基因测序鉴定阳性表达质粒。将鉴定正确的阳性原 核表达质粒转入相应细菌(如大肠杆菌)进行原核表达和蛋白纯化，获得含有所述表位肽P48 的表位多肽。为了提高表位肽疫苗的免疫原性，将表位多肽与一定的载体(如脂质、热休克 蛋白等)连接获得表位肽疫苗。在接种该表位肽疫苗时，可直接使用或与佐剂(如弗氏佐剂、 氢氧化铝等)进一步混合后使用。鉴于所述表位肽P48可诱导针对新型冠状病毒的特异性T 细胞应答，它可作为多表位疫苗的抗原肽之一，相关专业人员可根据实际应用和相关专业知 识调整应用方案。
或者，其包含编码上述表位肽的核酸；
根据本发明提供的编码所述表位肽P48的核苷酸序列，利用基因工程技术，获得表达所 述表位肽的疫苗，根据载体不同，优化核苷酸序列进行抗原表达。
一种是：将所述表位肽的核苷酸序列插入质粒，筛选重组质粒获得DNA疫苗。
根据本发明抗原表位肽P48对应的核苷酸序列合成DNA片段，将其连接至真核表达质 粒，并通过基因测序鉴定。将鉴定正确的阳性真核表达质粒转染COS-7细胞，对转染后的细 胞提蛋白进行Western Blot实验，验证其能够在真核细胞中正常表达表位肽P48，获得编码表 达所述表位肽P48的DNA疫苗。
核酸疫苗制备过程中根据实际需求选择合适的真核表达质粒，也可以转染至其他真核细 胞进行蛋白表达的验证，转染技术可使用常见的电击法、脂质体转染等方法。
另一种是：利用同源重组或基因编辑技术将所述表位肽的核苷酸序列导入其他合适的疫 苗载体，例如李斯特菌载体、卡介苗、腺病毒载体等，获得重组疫苗。
以李斯特菌载体为例，选择李斯特菌基因组中合适的插入位点，根据本发明抗原表位肽 P48对应的核苷酸序列，并在其两端分别加入插入位点上、下游一段DNA序列作为同源臂， 进行基因合成获得完整的DNA片段，并将其连接至原核质粒。通过基因测序鉴定，将鉴定 正确的阳性重组质粒电转法导入李斯特菌内，连续传代培养使重组质粒与细菌基因组进行同 源重组，通过PCR和基因测序技术筛选鉴定所述表位肽P48基因序列成功整合至基因组的重 组李斯特菌。对重组李斯特菌提蛋白进行Western Blot实验，检测表位肽P48能够在李斯特 菌中正常表达，获得含有所述表位肽P48的重组李斯特菌疫苗。
或者，其包含上述表位肽的递呈细胞。
抗原递呈细胞指机体内具有摄取、处理和传递抗原信息，诱发T、B细胞发生免疫应答 作用的细胞，主要包括巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cell,DC)等。在抗原递呈细胞表面 有能与表位肽特异性结合的HLA分子。
⑴从体内获取抗原递呈细胞，与所述表位肽P48在一定条件下体外共培养获得该表位肽 脉冲的特异抗原递呈细胞，并与佐剂混合制备疫苗。
以DC细胞为例，分离获得外周血样本中的外周血单个核细胞，清洗两遍后，用含有10％ 胎牛血清的1640培养基重悬细胞并接种于24孔板，在细胞培养箱中培养4小时，去除悬浮 细胞。获得的贴壁细胞加入培养基(1640培养基，含有胎牛血清GM-CSF、IL-4)，进行体外诱导DC细胞生成。3天后，在细胞培养基中加入所述表位肽P48，每3天换液(含有上述 细胞因子和刺激抗原)，第10天时收集细胞。获得负载所述特异性表位肽P48的成熟DC， 具有高效的抗原递呈能力。该DC使用时可与佐剂进行联合使用，如TLR激动剂，以增强免 疫应答效果。
实际应用时，根据抗原递呈细胞类型对表位肽诱导条件进行优化，以获得具有高效递呈 能力的递呈细胞。
⑵将编码表位肽的核酸通过基因导入抗原递呈细胞获得能呈递表位肽的细胞，并与佐剂 混合制备疫苗。
以DC为例，分离获得外周血样本中的外周血单个核细胞，清洗两遍后，用含有10％胎 牛血清的1640培养基重悬细胞并接种于24孔板，在细胞培养箱中培养4小时，去除悬浮细 胞。获得的贴壁细胞加入培养基(1640培养基，含有胎牛血清、GM-CSF、IL-4)，进行体 外诱导DC生成，3天后收集DC。如前所述，构建真核表达质粒，并转染至DC，Western Blot 实验检测表位肽P48能够在DC中正常表达，获得能够递呈表位肽P48的DC。将DC与佐剂 进行联合使用，如TLR激动剂，以增强免疫应答效果。
实施例13本发明提供的一种新冠病毒特异性T细胞比例定量检测方法
以表位肽刺激受试者的外周血单个核细胞，同时设置阴性对照(培养基刺激)，用流式 细胞术测定产生细胞因子(IFN-γ、IL-2、TNF-α等)和/或具有细胞功能状态活化标志(如CD69等)的T细胞比例，扣除阴性对照值，以此获得表位肽P48诱导产生的新冠特异性T细胞比例。
实施例14本发明提供的一种针对新冠病毒感染的主动免疫疗法剂
如实施例11所述，分离获得机体的外周血单个核细胞，将细胞与所述表位肽P48在培养 液(含有抗CD3、抗CD28、IL-2等)中进行体外刺激，诱导完成后检测T细胞效应能力，例如杀伤能力，收集获得具有效应功能的特异性T细胞。通过流式细胞术无菌分选出新冠特异性T细胞，将其作为效应T细胞对新冠患者进行主动免疫治疗。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施 例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进 行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求 范围当中。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学
<120> 新型冠状病毒S蛋白全蛋白组筛选的特异性T细胞表位肽P48及其应用
<130> 中国专利ZL202010306192.4
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<170> PatentIn version 3.5
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<211> 45
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 128
gaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggt 45
Claims (12)
1.一种新型冠状病毒S蛋白全蛋白组筛选的特异性T细胞表位肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ No.48所示:EIYQAGSTPCNGVEG。
2.权利要求1所述特异性T细胞表位肽在制备新型冠状病毒感染者筛查检测试剂中的应用。
3.权利要求1所述特异性T细胞表位肽为评估新型冠状病毒疫苗免疫保护持久力提供检测抗原。
4.权利要求1所述特异性T细胞表位肽为检测病毒变异株诱导的免疫应答评价提供检测抗原。
5.权利要求1所述特异性T细胞表位肽为检测新冠患者特异性T细胞免疫应答水平提供检测抗原。
6.权利要求1所述特异性T细胞表位肽为体外诱导特异性T细胞提供抗原。
7.一种核酸，其编码权1所述的特异性T细胞表位肽。
8.一种重组载体，其包含权7所述核酸。
9.一种宿主细胞，其包含权8所述重组载体。
10.一种疫苗，其包含(1)权1所述表位肽、(2)权7所述核酸、(3)权8所述重组载体或(4)权1所述表位肽的呈递细胞，其中之一。
11.一种检测新冠病毒特异性T细胞比例的方法，其特征在于，用权1所述的表位肽与受试者外周血分离的单个核细胞共培养，刺激T细胞产生应答，同时设置阴性对照，用流式细胞术测定产生细胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α和/或具有细胞功能状态活化标志的T细胞比例，扣除阴性对照值，以此获得表位肽P48诱导产生的新冠特异性T细胞占总T细胞的比例。
12.一种针对新冠病毒感染的主动免疫疗法剂，其包含权1所述特异性T细胞表位肽。
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