CN112194711A - 一种新型冠状病毒s蛋白的b细胞线性抗原表位、抗体、鉴定方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于生物学技术领域，提供了一种新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位、抗体、鉴定方法及应用，其中，所述S蛋白的B细胞线性抗原表位的氨基酸序列为如SEQ ID NO.104或SEQ ID NO.82所示，本发明提供了全新的新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位，可以用于检测COVID‑19患者血液中的特定抗体，也可以用于接种健康人群从而诱导产生特异性的抗体，从而为SARS‑CoV‑2疫苗设计、单克隆抗体研发以及抗体检测试剂盒的研发提供重要的抗原靶点。

Description

一种新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位、抗体、鉴定方 法及应用
技术领域
本发明属于生物学技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位、鉴定方法及应用。
背景技术
2019年12月暴发的新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)，病原体为SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome corona virus2)。COVID-19已经成为全球性大流行病，疫情已经发展至200多个国家且形势严峻。
SARS-CoV-2全基因组长度大约为29.8kb核苷酸，编码四种主要的结构蛋白：棘突蛋白S(Spike protein，S蛋白)、膜蛋白M(Membrane protein)、包膜蛋白E(Envelopeprotein)和核衣壳蛋白N(Nucleocapsid)。其中，SARS-CoV-2通过S蛋白上的受体结合域(receptor binding domain，RBD)介导病毒与细胞受体结合后，S1与S2亚基被TMPRSS2切割解离。触发S2亚基发生构象改变，使S2亚基包含的融合肽暴露。融合肽锚定靶细胞膜，促进病毒与靶细胞膜融合。同时，S蛋白也是病毒的主要抗原蛋白。因此，SARS-CoV-2 S蛋白是新冠疫苗研发的热门靶抗原。
最近的报道鉴定出了部分SARS-CoV-2 S蛋白B细胞线性表位，提供了一部分SARS-CoV-2的B细胞线性表位分布信息，但截至目前，SARS-CoV-2抗原表位研究资料还很有限，多数报道仅基于软件预测，准确率低。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位。
本发明实施例是这样实现的，一种新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位，所述S蛋白的B细胞线性抗原表位的氨基酸序列为如SEQ ID NO.104或SEQ ID NO.82所示。
本发明实施例的另一目的在于一种新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位，所述S蛋白的B细胞线性抗原表位的氨基酸序列为如SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.128和SEQ IDNO.129所示。
本发明实施例的另一目的在于一种新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位的鉴定方法，包括：
根据S蛋白的氨基酸序列，设计合成若干肽段组，每个所述肽段组包括若干肽段，所述肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.127所示；
采集恢复期血清或血浆样本，灭活备用；
将所述每个肽段组分别包被ELISA 96孔板，并与所述恢复期血清或血浆样本进行间接酶联免疫反应检测，确定阳性肽段组；
将所述阳性肽段组内的每个肽段分别包被ELISA 96孔板，继续与所述恢复期血清或血浆样本逐一进行间接酶联免疫反应检测，确定阳性反应肽段，所述阳性反应肽段的氨基酸序列为权利要求1所述的SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.82。
本发明实施例的另一目的在于一种新型冠状病毒抗体，所述新型冠状病毒抗体是采用权利要求1所述的B细胞线性抗原表位的氨基酸序列偶联惰性蛋白，按照免疫程序免疫动物获得的抗性血清。
本发明实施例的另一目的在于一种检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括所述的B细胞线性抗原表位。
本发明实施例的另一目的在于一种新型冠状病毒抗体的检测方法，包括：
将所述的B细胞线性抗原表位包被96孔板，与待测血清样本逐一进行间接ELISA检测，重复测定两次；
以健康人血清作为阴性对照计算cutoff值，待测血清样本的平均OD值大于cutoff值认为抗体反应阳性。
本发明实施例的另一目的在于一种新型冠状病毒抗体和抗原的鉴别方法，所述鉴别方法包括采用所述的B细胞线性抗原表位的氨基酸序列作为抗原去检测新型冠状病毒抗体；采用所述的新型冠状病毒抗体检测新型冠状病毒。
本发明实施例的另一目的在于一种新型冠状病毒疫苗，所述新型冠状病毒疫苗包括抗原表位，所述抗原表位为权利要求1所述的B细胞线性抗原表位。
本发明实施例的另一目的在于一种所述的新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位在制备新型冠状病毒抗体中的应用。
本发明实施例的另一目的在于一种所述的新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。
本发明实施例的另一目的在于一种所述的新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位在鉴别新型冠状病毒抗体和抗原的应用。
本发明实施例提供了全新的新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位，可以用于检测COVID-19患者血液中的特定抗体，也可以用于接种健康人群从而诱导产生特异性的抗体，从而为SARS-CoV-2疫苗设计、单克隆抗体研发以及抗体检测试剂盒的研发提供重要的抗原靶点。
附图说明
图1是本发明实施例提供的表位肽筛选流程图；
图2是本发明实施例提供的SARS-CoV-2 S蛋白B细胞表位的鉴定示意图；
图3是本发明实施例提供的表位肽P82、P104，以及现有表位肽S21P2、S14P5与COVID-19患者恢复期血清的阳性反应率的示意图；
图4是本发明实施例提供的表位肽P82、P104，以及现有表位肽S21P2、S14P5的抗体S/CO值比较和抗体水平的相关性分析示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
S蛋白的B细胞线性抗原表位诱导的特异性抗体对抑制病毒入侵机体有着重要作用。B细胞表位又称抗原决定簇，它是病原体蛋白(也称为抗原)上特定序列的氨基酸组合(也称为多肽)，可以与B细胞抗原受体及特定的抗体发生特异性结合。B细胞表位包括B细胞表面抗原受体或B细胞分泌的特异性抗体所识别的线性表位和构象表位。本发明所指的是S蛋白的B细胞线性表位，即具有15个氨基酸序列特异性的多肽，其可以与COVID-19患者血液中的特异性抗体产生特异性结合。这类氨基酸序列特异性的单条多肽(或与其它多肽的组合)可以用于检测COVID-19患者血液中的特定抗体，也可以用于接种健康人群从而诱导产生特异性的抗体，为SARS-CoV-2疫苗设计、单克隆抗体研发以及抗体检测试剂盒的研发提供重要的抗原靶点。
在本发明实施例中，所述新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位的氨基酸序列为如SEQ ID NO.104(P104)或SEQ ID NO.82(P82)所示。
在本发明一个优选实施例中，所述新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位的氨基酸序列为如SEQ ID NO.104(P104)、SEQ ID NO.128(S14P5)和SEQ ID NO.129(S21P2)所示。
SEQ ID NO:104(P104)KPSKRSFIEDLLFNK，
SEQ ID NO:82(P82)ECVLGQSKRVDFCGK，
SEQ ID NO:128(S14P5)TESNKKFLPFQQFGRDIA，
SEQ ID NO:129(S21P2)PSKPSKRSFIEDLLFNKV。
下面结合具体实施例对本发明的新型冠状病毒S蛋白的B细胞抗原表位、鉴定方法及应用的技术效果做进一步的说明，但这些实施例所提及的具体实施方法只是对本发明的技术方案进行的列举解释，并非限制本发明的实施范围。
实施例1：新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位的鉴定方法
1、肽段库的建立
根据SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列(access number:YP_009724390.1)设计合成多肽。按照氨基酸排列顺序合成长度为15个氨基酸的肽段，相邻肽段重叠5个氨基酸。共获得127个肽段(P1～P127)，覆盖S蛋白全长。肽段按氨基酸位置顺序分为13个组(G1～G13)，每个组包含10或7个连续肽段(表1)。
表1 SARS-CoV-2重叠肽段库序列(肽库)
Figure BDA0002726880300000051
Figure BDA0002726880300000061
Figure BDA0002726880300000071
Figure BDA0002726880300000081
2、COVID-19患者恢复期血清收集
2020年3月5日至2020年5月12日，对包括无症状感染者在内的165名深圳市COVID-19出院患者进行血清采集，冻存于-80℃冰柜备用，使用前血清置于56℃30min灭活可能存在的残余病毒再进行正式试验。
3、B细胞线性表位鉴定方法——间接酶联免疫反应(ELISA)
间接ELISA主要操作如下：ELISA 96孔板(Corning，#42592)进行抗原包被，每孔加入100μL肽段(每种肽2.5μg/mL)或0.2μg/mL RBD(CUSABIO，#CSB-MP3324GMY1b1)，4℃过夜。300μL洗涤缓冲液(含0.05％Twenn-20的PBS)洗板6次。每孔加入300μL封闭液(含0.1％Tween-20和5％脱脂奶粉的PBS)封闭2小时。洗板后，将经过热灭活的COVID-19患者恢复期血清或作为阴性对照的健康人血清以1:80稀释度，每孔加入100μL。在37℃下孵育1小时。每个样品重复两个孔。孵育后洗板，以100μL/孔加入1：130000稀释的兔抗人IgG HRP(abcam，#6759)二抗缓冲液，37℃孵育1小时。孵育后洗板，每孔加入100μL TMB(Multi Science，#EK0011)。将板在黑暗中于室温孵育25分钟。每孔加入100μL终止溶液(Multi Science，#EK0011)终止反应。根据说明书于450nm和630nm处测定吸光度，计算OD450nm-630nm。以阴性对照血清OD的平均值+3倍标准差(SD)作为cutoff值，待测样品的平均OD值大于cutoff值认为反应阳性。
4、B细胞线性表位筛选流程
首先将每个肽段组(G1～G13)分别包被96孔板，随机选取20份COVID-19出院患者恢复期血清进行间接ELISA检测，筛选具有阳性反应的肽段组。再将阳性肽段组包含的每个肽段分别包被96孔板，继续与血清逐一进行间接ELISA检测，确定阳性反应肽段(图1)。
鉴定结果：
将S蛋白的重叠肽段库与COVID-19患者恢复期血清进行间接ELISA检测。在第一轮筛选中，肽段组G9和G11反应值呈阳性(图2a，通过间接ELISA将恢复期血清与每个肽段组进行检测，筛选出阳性肽组(G9和G11))。再逐一将G9和G11中的每个肽段与恢复期血清进行检测，最后鉴定出了2个恢复期血清IgG可识别的B细胞线性表位P82(811KPSKRSFIEDLLFNK825)和P104(1031ECVLGQSKRVDFCGK1045)(图2b,c,表2，恢复期血清与筛选出的阳性肽组G9和G11中包含的每个肽段进行间接ELISA，筛选出阳性肽(P82和P104)。圆点代表表位与恢复期血清反应的平均OD值。方块代表表位与健康人血清反应的cutoff值)。进一步，比较发现P82完全包含于B细胞表位S21P2中，而本发明鉴定的P104是一个新的15个氨基酸的SARS-CoV-2 B细胞表位。P82虽然被B细胞表位S21P2包围，但S21P2是18个氨基酸多肽，而P82是15个氨基酸的多肽，两者与165份血清反应的阳性率和反应强度也不一样(图3，其中，图3a表示在全部COVID-19患者和无症状患者的恢复期血清中，肽S21P2，S14P5，P82和P104的阳性反应率；图3b表示分析不同肽组合的阳性反应率。S14P4，S21P2+S14P5和S21P2+S14P5+P104分别是单组合，成对组合和三三组合中具有最高总体阳性率的最佳组合。图3c表示通过不同肽段组合检测的详细患者临床类型)。将P82和P104在S蛋白三维结构(PDB ID：6VXX)中定位，显示P82和P104都位于S蛋白S2亚基(图2d)。就空间位置来看，P82位于蛋白表面，P104位于蛋白表面的凹槽内(图2d，S蛋白中两个表位肽的定位；SARS-CoV-2S蛋白的3D结构从NCBI网站(PDB ID：6VXX)获得；该图像是通过NCBI网站处理的。S蛋白的三个单体分别以不同颜色示意)。
表2表位肽序列及氨基酸位置
Figure BDA0002726880300000101
值得注意的是，P104抗原表位是通过合成表1的127个多肽，建立间接酶联免疫反应(ELISA)方法，然后进行165份COVID-19患者恢复期血清的检测才筛选出来，是通过独特的技术路线筛选出来的。
实施例2：以B细胞线性表位检测新型冠状病毒抗体、包含B细胞线性表位P104的检测新型冠状病毒抗体的实施方案
将4个B细胞线性表位(S21P2、S14P5、P82、P104)分别包被96孔板，与165份COVID-19患者恢复期血清逐一进行间接ELISA检测。每个样本重复测定两次。以健康人血清作为阴性对照计算cutoff值，然后计算S/CO值(样品平均OD450nm-630nm值/cutoff值)。
其中，间接ELISA主要操作如下：ELISA 96孔板(Corning，#42592)进行抗原包被，每孔加入100μL肽段(每种肽2.5μg/mL)或0.2μg/mL RBD(CUSABIO，#CSB-MP3324GMY1b1)，4℃过夜。300μL洗涤缓冲液(含0.05％Twenn-20的PBS)洗板6次。每孔加入300μL封闭液(含0.1％Tween-20和5％脱脂奶粉的PBS)封闭2小时。洗板后，将经过热灭活的COVID-19患者恢复期血清或作为阴性对照的健康人血清以1:80稀释度，每孔加入100μL。在37℃下孵育1小时。每个样品重复两个孔。孵育后洗板，以100μL/孔加入1：130000稀释的兔抗人IgG HRP(abcam，#6759)二抗缓冲液，37℃孵育1小时。孵育后洗板，每孔加入100μL TMB(MultiScience，#EK0011)。将板在黑暗中于室温孵育25分钟。每孔加入100μL终止溶液(MultiScience，#EK0011)终止反应。根据说明书于450nm和630nm处测定吸光度，计算OD450nm-630nm。以阴性对照血清OD的平均值+3倍标准差(SD)作为cutoff值，待测样品的平均OD值大于cutoff值认为反应阳性。
检测结果：
(1)表位肽S14P5、S21P2、P82和P104与患者恢复期血清的反应阳性率
165名COVID-19患者恢复期血清与4个表位肽S14P5、S21P2、P82和P104分别进行间接ELISA检测，总体反应阳性率分别为77.0％、73.9％、61.2％和30.3％。表位肽S14P5、S21P2和P82显示出较高的反应阳性率，与P104阳性率的差异有统计学意义(P<0.001)。30名无症状感染者恢复期血清与4个表位肽反应阳性率分别为63.3％、53.3％、46.7％和36.7％(图3a,P＝0.209)。将4个表位肽进行不同的配对组合，分析它们的联合检出率。S12P2+S14P5是检出率最高的两两组合(88.5％)，S12P2+S14P5+P104是所有三个组合中患者检出率最高的(92.7％)，且与四个表位肽联合检测的结果相同。与单个表位肽检测相比，表位肽的联合使用可以明显提高患者检出率(P<0.001，图3b)。对于无症状感染者，虽然不同表位肽的联合检测阳性率差异无统计学意义，但S12P2+S14P5+P104的联合检测将阳性率由63.3％提高至86.7％(P＝0.084)。表位肽的联合使用能明显提高COVID-19所有类型患者的检出率(图3c)。鉴于S12P2+S14P5+P104的组合能与92.7％的患者恢复期血清发生阳性反应，认为该组合是最有效的包含B细胞线性表位P104的检测新型冠状病毒抗体的实施方案。
(2)表位肽S14P5、S21P2、P82和P104的血清反应性及抗体相关性分析
165份COVID-19患者恢复期血清与表位肽S14P5、S21P2、P82和P104抗原抗体反应的S/CO值中位数(IQR)分别为1.4339(1.2299)、1.5564(4.2269)、1.2237(2.7857)和0.6917(0.6294)。P104的S/CO值明显低于其它3个表位肽(P<0.001)。在普通型与轻型患者中，P104的S/CO值也均低于其他3个表位肽(图4a,b)。其中，图4a-b表示所有患者(a)或具有不同临床类型的患者(b)的恢复期血清与表位肽反应的S/CO值；每组数据均用中位数(四分位间距)表示；每个点代表每个血清的抗体检测结果。*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。
综上，本发明提供的抗原表位P104在COVID-19患者中的反应阳性率虽然较低，但经研究发现，P104与无症状感染者的反应阳性率(36.7％)高于其与有症状患者的反应阳性率(28.9％，P＝0.388)，而另3个表位肽与无症状感染者的阳性率均比有症状患者低。虽然S14P5和S21P2在感染人群中的检出率较高，但由于个体免疫应答差异等原因，单一表位肽检测存在较高的漏检率，但多个表位肽组合后能显著提高患者检出率。其中，S14P5+S21P2+P104的总体检出率最高(92.7％)，与4个表位肽的联合检出率相同，说明多个表位肽的合理搭配可以达到最优检测效果。对于疑似病例的确证，血清学检测具有较高的特异性。尤其是无症状感染者的筛查，将血清学检测作为辅助手段，更加快捷、方便，且可以降低漏检率。
值得注意的是，抗原表位P104的氨基酸序列作为SARS-CoV-2的线性表位，其氨基酸序列是没有人报道过的；而抗原表位P82氨基酸序列虽然包含在S21P2中，但至少可以表明，S21P2少了头尾3个氨基酸所形成的P82线性表位，依然具有一定抗体结合的能力。另外，通过使用两个线性表位S14P5和S21P2联合进行165份血清检测阳性率为88.5％，S14P5、S21P2和P104三个表位的联合检测，阳性率提高到92.7％，这说明P104这个新发现的表位具有提高检测阳性率的作用。
实施例3：新型冠状病毒疫苗
将抗原表位P104用于新型冠状病毒疫苗的制备，即用抗原表位P104多肽免疫人或动物，接种后的人或动物会产生相对应的抗体，而产生抗体是疫苗接种的主要目的。具体实现方式可参照现有技术，在此不再做具体赘述。
实施例4：采用P104多肽制备的新型冠状病毒抗体检测新型冠状病毒
通过用抗原表位P104多肽偶连惰性蛋白免疫人或动物，使人或动物产生与该抗原表位P104多肽结合的抗体，提取纯化抗体，再用该抗体去检测新型冠状病毒。具体实现方式可参照现有技术，在此不再做具体赘述。
综上，本发明实施例提供了全新的冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位，可以用于检测COVID-19患者血液中的特定抗体，也可以用于接种健康人群从而诱导产生特异性的抗体，从而为SARS-CoV-2疫苗设计、单克隆抗体研发以及抗体检测试剂盒的研发提供重要的抗原靶点。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市疾病预防控制中心（深圳市卫生检验中心、深圳市预防医学研究所）
<120> 新型冠状病毒S蛋白的B细胞抗原表位、抗体、鉴定方法及应用
<160> 127
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile
1 5 10 15
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg
1 5 10 15
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys
1 5 10 15
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys
1 5 10 15
<210> 84
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala
1 5 10 15
<210> 85
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe
1 5 10 15
<210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu
1 5 10 15
<210> 87
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser
1 5 10 15
<210> 88
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly
1 5 10 15
<210> 89
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln
1 5 10 15
<210> 90
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg
1 5 10 15
<210> 91
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val
1 5 10 15
<210> 92
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn
1 5 10 15
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln
1 5 10 15
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu
1 5 10 15
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn
1 5 10 15
<210> 96
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln
1 5 10 15
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser
1 5 10 15
<210> 98
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp
1 5 10 15
<210> 99
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg
1 5 10 15
<210> 100
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln
1 5 10 15
<210> 101
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala
1 5 10 15
<210> 102
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala
1 5 10 15
<210> 103
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly
1 5 10 15
<210> 104
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys
1 5 10 15
<210> 105
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser
1 5 10 15
<210> 106
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val
1 5 10 15
<210> 107
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe
1 5 10 15
<210> 108
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly
1 5 10 15
<210> 109
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe
1 5 10 15
<210> 110
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr
1 5 10 15
<210> 111
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile
1 5 10 15
<210> 112
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn
1 5 10 15
<210> 113
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn
1 5 10 15
<210> 114
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu
1 5 10 15
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr
1 5 10 15
<210> 116
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp
1 5 10 15
<210> 117
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser
1 5 10 15
<210> 118
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg
1 5 10 15
<210> 119
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu
1 5 10 15
<210> 120
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys
1 5 10 15
<210> 121
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr
1 5 10 15
<210> 122
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile
1 5 10 15
<210> 123
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys
1 5 10 15
<210> 124
<211> 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys
1 5 10 15
<210> 125
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys
1 5 10 15
<210> 126
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val Leu
1 5 10 15
<210> 127
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1 5 10

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位，其特征在于，所述S蛋白的B细胞线性抗原表位的氨基酸序列为如SEQ ID NO.104或SEQ ID NO.82所示。
2.一种新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位，其特征在于，所述S蛋白的B细胞线性抗原表位的氨基酸序列为如SEQ ID NO.104、SEQ ID NO.128和SEQ ID NO.129所示。
3.一种新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位的鉴定方法，其特征在于，包括：
根据S蛋白的氨基酸序列，设计合成若干肽段组，每个所述肽段组包括若干肽段，所述肽段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.127所示；
采集恢复期血清或血浆样本，灭活备用；
将所述每个肽段组分别包被ELISA 96孔板，并与所述恢复期血清或血浆样本进行间接酶联免疫反应检测，确定阳性肽段组；
将所述阳性肽段组内的每个肽段分别包被ELISA 96孔板，继续与所述恢复期血清或血浆样本逐一进行间接酶联免疫反应检测，确定阳性反应肽段，所述阳性反应肽段的氨基酸序列为权利要求1所述的SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.82。
4.一种新型冠状病毒抗体，其特征在于，所述新型冠状病毒抗体是采用权利要求1所述的B细胞线性抗原表位的氨基酸序列偶联惰性蛋白，按照免疫程序免疫动物获得的抗性血清。
5.一种检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的B细胞线性抗原表位。
6.一种新型冠状病毒抗体的检测方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述的B细胞线性抗原表位包被96孔板，与待测血清样本逐一进行间接ELISA检测，重复测定两次；
以健康人血清作为阴性对照计算cutoff值，待测血清样本的平均OD值大于cutoff值认为抗体反应阳性。
7.一种新型冠状病毒抗体和抗原的鉴别方法，其特征在于，所述鉴别方法包括采用权利要求1所述的B细胞线性抗原表位的氨基酸序列作为抗原去检测新型冠状病毒抗体；采用权利要求5所述的新型冠状病毒抗体检测新型冠状病毒。
8.一种新型冠状病毒疫苗，其特征在于，所述新型冠状病毒疫苗包括抗原表位，所述抗原表位为权利要求1所述的B细胞线性抗原表位。
9.如权利要求1所述的新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位在制备新型冠状病毒抗体中的应用或在制备新型冠状病毒疫苗中的应用。
10.如权利要求1所述的新型冠状病毒S蛋白的B细胞线性抗原表位在鉴别新型冠状病毒抗体和抗原的应用。
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