CN113372417A - 一种可诱导免疫的表位多肽组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可诱导免疫的表位多肽组合及其应用，属于生物技术领域，本发明以表位分析优化为基础，利用免疫信息学进行相关疫苗的分子设计。基于结构的抗原表位疫苗设计策略，通过免疫信息学确定新冠病毒S蛋白上的B细胞表位、Th表位以及CTL表位用来诱导主要中和抗体、激活细胞免疫应答、诱导体液与细胞免疫平衡。通过分子佐剂和候选抗原表位连接设计表位疫苗并分析其抗原性、物化性质、蛋白质二级结构以及三级结构建模，借助结构生物学工具分析疫苗构象B细胞表位，通过与TLR4的分子对接、免疫应答模拟刺激验证了疫苗的免疫应答特性。信息学分析结果显示，所设计得候选表位组合具有良好平衡的体液免疫和细胞免疫应答的能力。

Description

一种可诱导免疫的表位多肽组合及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种可诱导免疫的表位多肽组合及其应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染可引起新冠肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，在分类上属于β冠状病毒(Betacoronavirus)，为单链正链RNA病毒。该疾病以发热、干咳、乏力为主要表现，常伴有气促和呼吸困难等，在严重病例中，新冠肺炎可导致严重急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、多功能衰竭甚至死亡。表面有冠状刺突的球状新型冠状病毒外部是由多种蛋白组成的壳，冠状病毒结构上主要包含棘突蛋白(Spike，S)，胞膜蛋白(Envelope，E)，核蛋白(Nucleoca psid，N)和囊膜蛋白(Membrance，M)。S蛋白以三聚体的形式在病毒表面形成特殊的花冠结构，在宿主蛋白酶作用下裂解为S1和S2两个亚基，S1亚基包含受体结合区(RBD)，主要功能是与宿主细胞表面受体结合，S2亚基主要功能是介导病毒与细胞的膜融合过程，其关键特征包括融合肽、两个七肽重复区(称为HR1和HR2)和跨膜结构域，S蛋白三聚体和跨膜域相互作用被认为是完成病毒感染膜融合过程的关键。
目前，针对SARS-CoV-2的表征、候选抗原和表位的鉴定、动物模型的建立、免疫应答的表征以及疫苗设计研究取得了实质性进展。
利用免疫信息学筛选、分析鉴定具有免疫保护的表位，可有效地提高保护性抗体亲和力和细胞免疫平衡。病毒抗原，包括Spike蛋白及RBD区域存在多种表位。其中部分表位具有免疫保护作用，能够诱导中和抗体和抑制病毒复制的抗体，以及抑制或杀伤感染细胞及辅助免疫平衡应答的效应T细胞。但大多数表位所诱导的免疫应答，不具有中和或抑制病毒复制的作用，可能会诱导细胞免疫失衡、加重炎症反应诱导免疫病理损伤、抗体依赖的感染增强ADE等负面风险，同时会稀释具有免疫保护力表位的免疫保护效应。
Spike蛋白是新型冠状病毒SARS-COV-2的关键抗体靶点，其同源三聚体在受体结合和病毒入侵的过程中起着至关重要的作用。全长三聚体Spike蛋白通常具有很高的免疫原性(约600kDa)，它不仅包含RBD，及强效中和抗体的主要靶点，还包含能诱导中和抗体或保护性抗体的非RDB区域，比如N端结构域。如能将有效的抗原表位进行筛选、优化和组合，并进行有效的免疫生物学分析和计算生物学验证，可增强宿主体液免疫和细胞免疫的有效平衡。
发明内容
本发明的目的是提供一种可诱导免疫的表位多肽组合及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，确保免疫效果显著，避免非免疫效应的表位引发的无效免疫，以及平衡细胞和体液免疫。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种新型冠状病毒抗原表位，所述抗原表位位于新型冠状病毒的结构蛋白上；
所述抗原表位包括选自下列组的多肽：
1)B细胞表位多肽，包括氨基酸序列如SEQ ID No.1-5任一所示的多肽或其组合；
2)Th细胞表位多肽，包括氨基酸序列如SEQ ID No.6-11任一所示的多肽或其组合；
3)CTL细胞表位多肽，包括氨基酸序列如SEQ ID No.12-16任一所示的多肽或其组合；
4)由1)-3)任一多肽序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入且具有相同功能的由1)-3)任一多肽衍生的多肽。
在上述抗原表位中，B细胞表位多肽优选至少任意三个的组合，Th细胞表位多肽优选至少任意四个的组合，CTL细胞表位多肽优选至少任意四个的组合。
本发明还提供一种新型冠状病毒抗原表位组合，包括氨基酸序列如SEQ ID No.17所示的多肽。
本发明还提供一种新型冠状病毒抗原表位组合，包括氨基酸序列如SEQ ID No.18所示的多肽，编码该多肽的核苷酸序列如SEQ ID No.19所示。
本发明还提供一种基因，其编码上述的新型冠状病毒抗原表位、上述的新型冠状病毒抗原表位组合或上述的新型冠状病毒抗原表位组合。
本发明还提供一种重组载体，其包含上述的基因。
本发明还提供一种用于上述的重组载体转化或转染的宿主细胞。
本发明还提供一种疫苗组合物，包含上述的新型冠状病毒抗原表位、上述的新型冠状病毒抗原表位组合或上述的新型冠状病毒抗原表位组合，以及药学上可接受的载体或佐剂。
本发明还提供一种上述的新型冠状病毒抗原表位、上述的新型冠状病毒抗原表位组合或上述的新型冠状病毒抗原表位组合在制备预防和/或治疗新型冠状病毒疾病的药物中的应用。
本发明还提供一种上述的基因、上述的重组载体、上述的宿主细胞或上述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒疾病的药物中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
本发明以表位分析优化为基础，利用免疫信息学进行相关疫苗的分子设计。基于结构的抗原表位疫苗设计策略，通过免疫信息学确定新冠病毒S蛋白上免疫原性强的B细胞表位、具有高保守性和人群覆盖度广的IFN-γ、IL-4阳性的Th表位以及CTL表位用来诱导主要中和抗体、激活细胞免疫应答、诱导体液与细胞免疫平衡。通过50S核糖体L7/L12分子佐剂和候选抗原表位连接设计表位疫苗并分析其抗原性、物化性质、蛋白质二级结构以及三级结构建模，借助结构生物学工具分析疫苗构象B细胞表位，通过与TLR4的分子对接、免疫应答模拟刺激验证了疫苗的免疫应答特性。信息学分析结果显示，所设计的候选表位组合具有良好平衡的体液免疫和细胞免疫应答的能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为新冠S蛋白候选抗原表位空间展示；其中，A.新冠S蛋白单体，Dots：候选B细胞表位，候选Th细胞表位，候选CTL细胞表位；B.新冠S蛋白RBD与ACE2复合体结构示意图，Cartoon：ACE2结合结构域，Dots：候选B细胞表位；S蛋白晶体结构和S-ACE2复合体结构参考自I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/COVID-19/)；
图2为新冠病毒疫苗三级结构建模；其中，Surface：50S L7/L12佐剂；Cartoon：B细胞表位；Dots：Th表位；Mesh：CTL表位；预测TM-score：0.122；
图3为新冠病毒疫苗三级结构模型refine前Ramachandran分析模型质量；Ramachandran结果显示了偏好区、允许区和异常区存在氨基酸残基分布；
图4为候选疫苗三级结构的重修和验证；其中，A.refine前后比对结果；B.ProS A-SEB图，最佳模型的Z值为-7.07，在天然构象蛋白范围内；C.氨基酸序列位置函数的能量显示局部模型质量；
图5为候选疫苗三级结构的重修和验证，Ramachandran图显示了偏好区、允许区和异常区存在氨基酸残基分布；
图6为原核表达载体构建示意图；
图7为构象B细胞表位分析，候选多价表位疫苗构象B细胞表位分析结果展示，Dots部分为构象B细胞表位；
图8为候选疫苗与TLR4/MD2对接结果；其中，A.候选疫苗与TLR4/MD2对接示意图，卡通图为TLR-4/MD2复合体，Surface为疫苗；B.候选疫苗与TLR4/MD2对接配体受体相互作用氨基酸展示；
图9为模拟免疫刺激免疫B细胞和Th数量变化展示；其中，A.B细胞数量变化；B.PBL细胞数量变化；C.不同时期B细胞数量变化；D.不同时期Th细胞数量变化；E.Th细胞数量变化；F.不同时期Th细胞变化百分比；
图10为模拟免疫刺激免疫CTL、NK、MA、DC、EP细胞数量变化展示；其中，A.Tc细胞变化；B.不同时期Tc细胞变化；C.NK细胞数量变化；D.不同时期MA细胞数量变化；E.DC细胞数量变化；F.不同时期EP细胞数量变化；
图11为免疫球蛋白和免疫复合物变化趋势；其中，A.包含50S L7/L12分子佐剂；B.不包含50SL7/L12分子佐剂；
图12为细胞因子和白细胞介素的浓度变化趋势，内图显示危险信号和白细胞生长因子IL-2变化趋势。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1方法
1.1SARS-CoV-2候选疫苗毒株的确定
选择NCBI数据库发表的surface glycoprotein[Severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2](NC_045512.2)为细胞表位预测模板。通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)数据库收集了579条序列不同的SARS-COV-2Spike蛋白氨基酸序列作为保守性分析模板，所有的蛋白数据以FASTA文件格式收集。
1.2细胞表位预测
通过ABCpred(http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/)和BCPreds(http://ailab.ist.psu.edu/bcpred/)预测候选新冠病毒株的线性B细胞表位。ABCpred是基于递归神经网络的学习算法，默认阈值为0.51，表位长度为16，其准确率为65.93％。而目前使用基于内核方法实现的BCPreds准确率为75.8％。IEDB服务器(http://www.iedb.org/),RANKPEP服务器(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)被用来预测MHC-Ⅱ型表位。选择IEDB默认参数设置，并选择一个MHC HLA等位基因中人群覆盖度可达到最小等位基因99％覆盖率的等位基因参考集。RANKPEP使用定位特异性评分矩阵(PSSMs)或已知与给定MHC分子结合的一组对齐肽作为MHC肽结合的预测因子，可以重点预测保守的表位，避免突变引起的免疫逃逸，表位与MHCⅡ的结合潜力通过EpiTOP(http://www.pharmfac.net/EpiTOP/index.php)评估。IFNepitope(http://crdd.osdd.net/raghava/ifnepitope/)和IL4pred(http://crdd.osdd.net/raghava/il4pred/)预测IFN-γ诱导性抗原表位和非IL-4诱导性抗原表位。MHC I结合CTL表位预测分别用NetMHCpan 4.1服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)、IEDB服务器(http://tools.iedb.org/mhci/)、Rankpep服务器(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)、CTLpred(http://crdd.osdd.net/raghava/ctlpred/)、NetCTL server 1.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/)进行分析。选择的所有服务器HLA等位基因的参数均可达到97％的群体覆盖率。NetMHCpan4.1 server利用人工神经网络预测表位与任何已知序列的MHC分子的结合，在本发明中只选择了强结合能力的抗原表位进行进一步分析。IEDB服务器使用ANN、SMM和CombLib组成的共识推荐方法。Rankpep使用位置特异性评分矩阵(PSSM)。CTLpred利用T细胞表位模式代替MHC结合物预测CTL表位。NetCTL预测方法综合预测MHC I类结合肽、蛋白酶体C端裂解、TAP转运效率。所有预测的表位均由IEDB(http://tools.iedb.org/immunogenicity/)进行免疫原性检测，并通过ToxinPred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php)确定其无毒性。在我们表位预测策略中，使用多种工具比单独使用一种工具可以获得更可靠的结果。
1.3保护性表位的鉴定
为了选择合适的表位进行进一步分析，通过比较服务器生成的B细胞表位、Th表位和CTL表位，找出重叠度高的最佳片段，使表位同时具有诱导体液免疫和细胞免疫反应的能力。选择MHC I结合物，CTL和B细胞表位重叠区域作为潜在的表位，使用IEDB服务器(http://tools.immuneepitope.org/mhcii/)确定最佳结合物的IEDB评分。
1.4候选抗原表位保守性评估以及T细胞(Th&CTL)表位等位基因人群体覆盖分析
通过IEDB(http://tools.iedb.org/conservancy/)上的表位保守性分析工具评估病毒血清型的保守水平。根据已确定的候选表位与579条不同的SARS-COV-2S蛋白质序列比对，计算抗原表位的保守性情况。分析类型和序列识别阈值分别设置为“线性”和“100％，”选择去除相同模板序列。IEDB人群覆盖度工具(http://tools.iedb.org/population/)用于评估预测的T细胞表位(MHC I和II)的人群覆盖率。
1.5疫苗构建及抗原性、过敏原性、溶解度的预测
基于上述免疫信息学分析得到的表位，我们使用KK、AAY和GPGPG linker将B细胞表位、Th和CTL表位按顺序连接在一起，50S核糖体蛋白L7/L1分子佐剂通过EAAAK在N端连接。采用Vexigen(http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)和ANTIGENpro(http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/)预测构建的多表位疫苗的抗原性。AllerTop server(https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/)用于预测最终疫苗构建的过敏原性，与其他服务器进行过敏原预测相比，AllerTOPV2.0的敏感度高达94％。SOLpro(http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/)用于预测构建的疫苗蛋白的溶解度。利用ExPASy工具(https://web.expasy.org/protparam/)对疫苗的分子量、等电点(PI)、半衰期、稳定性等理化性质进行了预测。
1.6疫苗二级、三级结构的预测及二硫键设计
利用Raptor X(http://raptorx.uchicago.edu/StructPredV2/predict/)和PSIPRED 4.0(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipredtest)对蛋白的二级结构进行预测。利用trRosetta(https://yanglab.nankai.edu.cn/trRosetta/)完成对最终蛋白疫苗的三级结构的预测，PyMOL程序用于三维模型的可视化。在进行下一步之前，有必要提高蛋白模型的稳定性。利用Disul fide by Design2.0(http://cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2/index.php)对候选蛋白疫苗进行二硫键设计。
1.7三级结构重修与验证
GalaxyRefine(http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi？type＝REFINE)用于重修三级结构。为了验证三级结构模型的质量，我们使用了RAMPAGE在线服务器(http://mordred.bioc.cam.ac.uk/～rapper/rampage.php)和ProSA-web(https://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php)对模型进行检测。
1.8B细胞构象表位的预测及蛋白分子对接分析
利用DiscoTope 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/DiscoTope/)预测疫苗蛋白三级结构的构象B细胞表位。蛋白质间的相互作用对于理解细胞功能和组织结构非常重要。分子对接是预测受体与配体在稳定构象下相互作用的一种方法。配体和受体之间的相互作用取决于他们的亲和力,亲和力越高,配体和受体分子之间的相互作用越稳定。我们使用ClusPro 2.0(https://cluspro.bu.edu/login.php)预测作为受体的TLR-4(PDB ID:4G8A)和蛋白疫苗为配体间的相互作用。TLR-4(PDB ID:4G8A)受体使用pyMol去掉水分子及其他杂质。该服务器产生的对接配合物具有良好的脱溶自由能和静电相互作用。LigPLot+被用来确定疫苗配体和TLR-4受体具有氢键和疏水相互作用的氨基酸残基。
1.9计算机克隆及免疫模拟分析
计算机克隆通过SnapGene软件完成，而多表位疫苗的免疫原性和免疫应答由C-ImmSim服务器(http://150.146.2.1/C-IMMSIM/index.php)基于使用位置特异性评分矩阵(PSSM)的基于试剂的模型预测免疫表位，并通过使用机器学习技术预测免疫相互作用。在本实验中，基于群体覆盖率使用了以下MHC等位基因，HLA A*11:01、HLAA*31:01、HLA B*35:01、HLA B*53:01、HLA DRB5*01:01、HLA DRB1*09:01。按典型免疫过程间隔一周注射，共免疫3次。所有模拟参数均设置为默认值，时间步长设置为1、20和40(每个时间步长为8小时，时间步长1为0时的进样)，抗原分子的氨基酸序列作为疫苗。
实施例2结果
2.1新冠病毒候选疫苗毒株的确定
通过选择NCBI数据库发表的surface glycoprotein[Severe acute respiratorysyndr ome coronavirus 2](NC_045512.2)Spike蛋白作为细胞表位预测模板。通过NCBI数据库收集了目前上传的579条不同的Spike蛋白氨基酸序列作为保守性分析模板，所有的蛋白数据以FASTA文件格式收集。
2.2新冠病毒表位的初步筛选
表1列出了经鉴定的5个B细胞表位(SEQ ID No.1-5)。表2列出了6个Th表位(SEQID No.6-11)，表3列出5个CTL表位(SEQ ID No.12-17)。所有候选抗原表位在S蛋白的构象位置如图1A所示，获得能够中和Spike蛋白与ACE2结合域的中和抗体具有重要意义，我们选择的B-1和B-2候选抗原表位如图1B所示，在Spike蛋白RBD和ACE2结合域上，具有能够诱导主要中和抗体，破坏其与ACE2结合的潜力。候选Th抗原表位和CTL抗原表位结合的HLA等位基因对应的不同地区人群覆盖度分析结果如表4所示，候选表位可以覆盖世界95.4％的人群，尽管对应不同地区人群有差异，但是依然有比较高的人群覆盖度，如南亚有98.39％人群覆盖度，欧洲有99.67％人群覆盖度，南美有99.95％的人群覆盖度。对于全球性暴发流行的新冠病毒，开发能够适应高人群覆盖度的疫苗具有重要意义。
表1候选B细胞表位
Figure BDA0003126512060000081
表2候选Th细胞表位
Figure BDA0003126512060000091
表3候选CTL细胞表位
Figure BDA0003126512060000092
表4候选Th和CTL表位等位基因命中不同地区人群覆盖率
Figure BDA0003126512060000101
2.3新冠病毒表位疫苗构建
基于上述免疫信息学分析得到的表位，我们使用KK、AAY和GPGPG linker将B细胞表位、Th和CTL表位按顺序连接在一起，B细胞表位之间使用双赖氨酸(KK)linker可以保持它们独立的免疫原性活性，MHC分子在MHC-II分子介导的抗原提呈到Th0细胞之前，作用于抗原的KK序列，使用AAY和GPGPG linker可以增强疫苗亚基的识别能力。Linker可以确保获得具有良好稳定性、结构域取向和折叠率，使用EAAAK linker将表位和50S L7/L12分子佐剂氨基酸序列连接起来。
2.4新冠病毒表位疫苗理化性质分析
新冠病毒表位疫苗全长392个氨基酸，分子量大小为41.64992KDa，pI：9.35，序列如SEQ ID No.18所示，在体外哺乳动物网织红细胞中半衰期为30小时，体内酵母细胞中大于20小时，大肠杆菌中大于10小时，抗原稳定指数为21.82，归类为稳定蛋白质。Vaxijenv2.0预测保护性抗原在设定阈值为0.4时分数为0.4162，可作为抗原；ANTIGENpro预测抗原免疫原性为0.964894；预测过表达溶解度为0.942995，提示可溶。脂肪族指数为84.52，Grand average of hydropathicity(GRAVY):-0.117，球状蛋白结构中的脂肪族链代表了该蛋白的热稳定性，蛋白质脂肪族指数的升高表明该蛋白质在性质上是热稳定的，GRAVY代表蛋白质序列疏水性的平均值。
2.5新冠病毒表位疫苗二级结构预测
根据PSIPRED和Raptox对二级结构的预测结果表明，蛋白疫苗由11.1％的螺旋、35.3％的折叠片和53.6％的卷曲组成。溶剂可及性(ACC)由26％的埋藏、25％的居中和48％的外侧组成。
2.6疫苗三级结构建模
建模使用trRosetta(https://yanglab.nankai.edu.cn/trRosetta/)在线服务器进行，trRosetta是一种快速、准确地从头预测蛋白质结构的算法。它基于一个限制性的Rosetta模块直接能量最小化构建蛋白质结构，约束了包括残基间距离和方向分布，由深度残基神经网络进行预测。在CASP13和CAMEO派生集的基准测试中，trRosetta的性能优于所有之前描述的方法。基于Omega、Phi、Distance、Theta、Contact参数以及TM-score，最佳疫苗三级结构建模结果如图2所示。进一步使用Disulfide by Design2.0进行二硫键设计，在默认参数下，分析得到的B-factor都为0，认为通过trRosetta能量最小化的蛋白质建模已足够稳定，不需要进一步的二硫键设计。
2.7疫苗三级结构的refine和验证
应用GalaxyRefine程序对同源性建模模型结构进行了改进重修。GalaxyRefine为模型构建了5个重修模型。重修前蛋白质模型各种参数为GDT-HA(1.0000),RMSD(0.000),Molprobity(2.509),Clash score(48.7),poor rotamers(2.0)and Ramachandran plot(97.2)，重修后确认模型1为最佳候选模型，具体参数为GDT-HA(0.9458),RMSD(0.440),Molprobity(1.995),Clash score(19.4),poor rotamers(0.7)and Ramachandran plot(97.9)。使用Pymol软件进行的卡通图比对结果如图4A所示。通过Ramachandran对模型进行研究后，Ramachandran对重修三级结构模型的验证表明，在预测模型中，重修模型中有379个氨基酸(97.2％)、8个氨基酸(2.1％)和3个氨基酸(0.8％)的氨基酸残基分别位于有利、允许和异常区域(图3)，而重修化后质量获得提升(图5)。Ramachandran图表明，在优化后，有利区域为382个氨基酸(97.9％)，允许区域为6个氨基酸(1.5％)，不允许区域为2个氨基酸(0.5％)。而ProSA网络(蛋白质结构分析)显示，蛋白质疫苗的z值超出了在类似大小的天然蛋白质中常见的分数范围，z值为-7.07(图4B)。该图通过绘制作为氨基酸序列位置函数的能量来显示局部模型质量(图4C)，一般来说，正值对应于输入结构的问题部分或错误部分。结果提示基于同源性建模的多价抗原表位肠道病毒蛋白质结构模型精度可以满足进一步分析。
2.8计算机模拟克隆候选多价表位疫苗及构象B细胞表位分析
计算机模拟克隆选择pGEX-KG原核表达载体，使用Snapgene软件对疫苗的氨基酸序列进行反向翻译得到疫苗表达基因序列，通过密码子的优化获得更好的表达，其核苷酸序列如SEQ ID No.19所示。通过选择BamH I和Hind III限制性内切酶酶切位点构建pGEX-S新冠疫苗原核表达载体，示意图如图6所示。候选疫苗构象B细胞表位分析surface结构如图7所示，共有44个构象B细胞表位。
2.9疫苗与TLR4-MD2复合体对接
我们使用ClusPro 2.0预测作为受体的TLR-4(PDB ID:4G8A)和蛋白疫苗为配体间的相互作用。参考TLR-4与LPS的相互作用模式，我们在平衡模式下选择model.000.05作为最佳对接模型，对接结果如图8所示，在该对接模式下可以获得稳定的结合。LigPLot+确定疫苗配体和TLR-4/MD2受体具有氢键的氨基酸残基为Asn365，Asn181，Gly363，Arg184，Asn210，Lys170，Tyr371，His350，Gly391，Tyr383，Thr389，Glu33，Arg368。具有疏水相互作用的氨基酸残基为Ile366，Ile362，Ile364，Gly213，Trp374，Val353，Ala357，Phe375，Ala392，Phe390，Trp388，His379，Tyr371，Thr35，Phe375，His376。
2.10计算机模拟免疫应答刺激
多表位疫苗的免疫原性和免疫应答由C-ImmSim服务器进行，按典型免疫过程间隔一周注射，共免疫3次。所有模拟参数均设置为默认值，时间步长设置为1、20和40(每个时间步长为8小时，时间步长1为0时的进样)，抗原分子的氨基酸序列作为疫苗。通过计算机模拟免疫应答刺激可以快速评估疫苗的免疫原性，快速筛选候选疫苗，节约时间和成本。计算机模拟免疫应答刺激可以确定疫苗符合诱导免疫应答规律，具有良好的免疫原性，可以有效激活体液免疫和细胞免疫,结果如图9-12所示，其中，Act＝active(激活)，Intern＝internalized the Ag(抗原内化)，Pres II＝presenting on MHC II(提呈于MHC II分子中)，Dup＝in the mitotic cycle(在有丝分裂周期中)，Anergic＝anergic(无能)，Resting＝not active(没有活化)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 汕头大学医学院
<120> 一种可诱导免疫的表位多肽组合及其应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp
1 5 10
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
1 5 10 15
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn
1 5 10
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln
1 5 10
<210> 5
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val
1 5 10
<210> 6
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala
1 5 10 15
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu
1 5 10 15
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala
1 5 10 15
<210> 9
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
1 5 10 15
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn
1 5 10 15
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile
1 5 10 15
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg
1 5
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala
1 5
<210> 17
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Lys Lys
1 5 10 15
Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro
20 25 30
Lys Lys Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Lys Lys Arg Asp
35 40 45
Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Lys Lys Lys Arg
50 55 60
Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Gly Pro Gly Pro Gly
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Gly
85 90 95
Pro Gly Pro Gly Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile
100 105 110
Thr Asn Leu Gly Pro Gly Pro Gly Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile
115 120 125
Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Gly Pro Gly Pro Gly Thr Arg Phe Ala
130 135 140
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Gly Pro Gly Pro Gly
145 150 155 160
Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Gly
165 170 175
Pro Gly Pro Gly Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile
180 185 190
Gly Lys Ile Ala Ala Tyr Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Ala
195 200 205
Ala Tyr Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Ala Ala Tyr Leu Pro
210 215 220
Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Ala Ala Tyr Val Thr Trp Phe His Ala
225 230 235 240
Ile His Val Ala Ala Tyr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala
245 250 255
<210> 18
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Met Ala Lys Leu Ser Thr Asp Glu Leu Leu Asp Ala Phe Lys Glu Met
1 5 10 15
Thr Leu Leu Glu Leu Ser Asp Phe Val Lys Lys Phe Glu Glu Thr Phe
20 25 30
Glu Val Thr Ala Ala Ala Pro Val Ala Val Ala Ala Ala Gly Ala Ala
35 40 45
Pro Ala Gly Ala Ala Val Glu Ala Ala Glu Glu Gln Ser Glu Phe Asp
50 55 60
Val Ile Leu Glu Ala Ala Gly Asp Lys Lys Ile Gly Val Ile Lys Val
65 70 75 80
Val Arg Glu Ile Val Ser Gly Leu Gly Leu Lys Glu Ala Lys Asp Leu
85 90 95
Val Asp Gly Ala Pro Lys Pro Leu Leu Glu Lys Val Ala Lys Glu Ala
100 105 110
Ala Asp Glu Ala Lys Ala Lys Leu Glu Ala Ala Gly Ala Thr Val Thr
115 120 125
Val Lys Glu Ala Ala Ala Lys Lys Lys Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly
130 135 140
Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Lys Lys Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly
145 150 155 160
Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Lys Lys Thr Val Cys Gly Pro
165 170 175
Lys Lys Ser Thr Asn Lys Lys Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala
180 185 190
Val Arg Asp Pro Gln Lys Lys Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu
195 200 205
Phe Asn Lys Val Gly Pro Gly Pro Gly Tyr Arg Val Val Val Leu Ser
210 215 220
Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Gly Pro Gly Pro Gly Gln Pro Thr
225 230 235 240
Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Gly Pro Gly Pro
245 250 255
Gly Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala
260 265 270
Gly Pro Gly Pro Gly Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
275 280 285
Lys Arg Ile Ser Gly Pro Gly Pro Gly Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr
290 295 300
Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Gly Pro Gly Pro Gly Gln Lys Leu
305 310 315 320
Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Ala Ala Tyr Lys
325 330 335
Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Ala Ala Tyr Gly Thr His Trp Phe
340 345 350
Val Thr Gln Arg Ala Ala Tyr Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg
355 360 365
Ala Ala Tyr Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ala Ala Tyr Ile
370 375 380
Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala
385 390
<210> 19
<211> 1188
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggatccatgg cgaaactgag caccgatgaa ctgctggatg cgtttaaaga aatgaccctg 60
ctggaactga gcgattttgt gaaaaaattt gaagaaacct ttgaagtgac cgcggcggcg 120
ccggtggcgg tggcggcggc gggcgcggcg ccggcgggcg cggcggtgga agcggcggaa 180
gaacagagcg aatttgatgt gattctggaa gcggcgggcg ataaaaaaat tggcgtgatt 240
aaagtggtgc gcgaaattgt gagcggcctg ggcctgaaag aagcgaaaga tctggtggat 300
ggcgcgccga aaccgctgct ggaaaaagtg gcgaaagaag cggcggatga agcgaaagcg 360
aaactggaag cggcgggcgc gaccgtgacc gtgaaagaag cggcggcgaa aaaaaaagtg 420
cgccagattg cgccgggcca gaccggcaaa attgcggata aaaaaggcag caccccgtgc 480
aacggcgtgg aaggctttaa ctgctatttt ccgaaaaaaa ccgtgtgcgg cccgaaaaaa 540
agcaccaaca aaaaacgcga tattgcggat accaccgatg cggtgcgcga tccgcagaaa 600
aaaaaacgca gctttattga agatctgctg tttaacaaag tgggcccggg cccgggctat 660
cgcgtggtgg tgctgagctt tgaactgctg catgcgccgg cgggcccggg cccgggccag 720
ccgaccgaaa gcattgtgcg ctttccgaac attaccaacc tgggcccggg cccgggccag 780
ctgattcgcg cggcggaaat tcgcgcgagc gcgaacctgg cgggcccggg cccgggcacc 840
cgctttgcga gcgtgtatgc gtggaaccgc aaacgcatta gcggcccggg cccgggcagc 900
aacctgctgc tgcagtatgg cagcttttgc acccagctga acggcccggg cccgggccag 960
aaactgattg cgaaccagtt taacagcgcg attggcaaaa ttgcggcgta taaatggccg 1020
tggtatattt ggctgggcgc ggcgtatggc acccattggt ttgtgaccca gcgcgcggcg 1080
tatctgccga ttggcattaa cattacccgc gcggcgtatg tgacctggtt tcatgcgatt 1140
catgtggcgg cgtatattac cagcggctgg acctttggcg cgaagctt 1188

Claims (9)

1.一种新型冠状病毒抗原表位，其特征在于，所述抗原表位位于新型冠状病毒的结构蛋白上；
所述抗原表位包括选自下列组的多肽：
1)B细胞表位多肽，包括氨基酸序列如SEQ ID No.1-5任一所示的多肽或其组合；
2)Th细胞表位多肽，包括氨基酸序列如SEQ ID No.6-11任一所示的多肽或其组合；
3)CTL细胞表位多肽，包括氨基酸序列如SEQ ID No.12-16任一所示的多肽或其组合；
4)由1)-3)任一多肽序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或插入且具有相同功能的由1)-3)任一多肽衍生的多肽。
2.一种新型冠状病毒抗原表位组合，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQ ID No.17所示的多肽。
3.一种新型冠状病毒抗原表位组合，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQ ID No.18所示的多肽。
4.一种基因，其特征在于，其编码如权利要求1所述的新型冠状病毒抗原表位、如权利要求2所述的新型冠状病毒抗原表位组合或如权利要求3所述的新型冠状病毒抗原表位组合。
5.一种重组载体，其特征在于，其包含如权利要求4所述的基因。
6.一种用于如权利要求5所述的重组载体转化或转染的宿主细胞。
7.一种疫苗组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的新型冠状病毒抗原表位、如权利要求2所述的新型冠状病毒抗原表位组合或如权利要求3所述的新型冠状病毒抗原表位组合，以及药学上可接受的载体或佐剂。
8.一种如权利要求1所述的新型冠状病毒抗原表位、如权利要求2所述的新型冠状病毒抗原表位组合或如权利要求3所述的新型冠状病毒抗原表位组合在制备预防和/或治疗新型冠状病毒疾病的药物中的应用。
9.一种如权利要求4所述的基因、如权利要求5所述的重组载体、如权利要求6所述的宿主细胞或如权利要求7所述的疫苗组合物在制备预防和/或治疗新型冠状病毒疾病的药物中的应用。
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