CN114181320B - 一种针对新冠原始株和变异株的重组多表位疫苗rSMEV及其应用 - Google Patents

一种针对新冠原始株和变异株的重组多表位疫苗rSMEV及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种针对新冠原始株和变异株的重组多表位疫苗rSMEV，包括CD8+T细胞表位的一个或两个以上序列、CD4+T细胞表位的一个或两个以上序列、线性B细胞表位的一个或两个以上序列和构象B细胞表位的一个或两个以上序列。本发明还公开上述多表位疫苗rSMEV构建方法，以及表达上述多表位疫苗rSMEV的宿主细胞和载体。本发明提供的多表位疫苗rSMEV能够同时抵抗SARS‑CoV‑2及其突变株(B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429和B.1.617.2)的感染，对多种变异类型的SARS‑CoV‑2的传染具有阻断作用。

Description

一种针对新冠原始株和变异株的重组多表位疫苗rSMEV及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种针对新冠原始株和变异株的重组多表位疫苗rSMEV及其应用。
背景技术
SARS CoV-2属于正链RNA病毒的一种，有四种主要的结构蛋白：S刺突蛋白(Spikeprotein,S蛋白)、核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N蛋白)、膜蛋白(Membrane protein,M蛋白)和包膜蛋白(Envelope protein,E蛋白)。SARS CoV-2利用S蛋白与宿主细胞受体-血管紧张素转换酶II(ACE2)进入细胞。S蛋白根据蛋白结构功能又被分为两个功能单位，分别为S1蛋白亚基和S2蛋白亚基。S1蛋白亚基可分为NTD(N-terminal domain)和RBD(Receptorbinding site)，RBD区域长约240个氨基酸，主要与宿主细胞受体结合，S2蛋白亚基在病毒和细胞膜融合起作用。
随着SARS CoV-2大量传播，全世界已出现了多种突变位点在S蛋白，尤其是位于RBD的突变株，例如突变株B.1.1.7(具有N501Y、D614G等定义突变)、突变株B.1.351(具有K417N、E484K、N501Y、D614G等10个定义突变)、突变株P.1(具有N501Y、E484k、k417T、D614G等定义突变)、突变株B.1.617(具有L452R、E484Q、D614G等定义突变)等，与原始株相比，突变株的传播速度更快，致死率更高，例如突变株B.1.1.7的传播速度提升70％，致死率增加35％，突变株P.1的感染能力是早期新冠病毒毒株的2～2.5倍。
我国目前对SARS CoV-2单克隆抗体或疫苗研究各有侧重，例如申请公告号为CN113512113A的中国发明专利申请公开了一种人源化广谱高中和活性抗新型冠状病毒单克隆抗体，针对的是突变株A株(NC_045512)、突变株B.1.1.7、突变株B.1.351、突变株P.1、突变株B.1.617.1和突变株B.1.617.2；申请公开号为CN113321739A的中国发明专利申请公开的COVID-19亚单位疫苗，针对的是原始株、突变株B.1.1.7和突变株501Y.V2。
为应对传播速度更快，致死率更高的变异株新冠病毒，有效控制国内疫情，迅速开发和生产针对原始株及全球流行的突变株疫苗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以原始株及其5个全球流行的突变株(B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429和B.1.617.2)的S刺突蛋白为靶抗原的重组多表位疫苗rSMEV及其应用。
本发明目的之一在于提供：一种针对新冠原始株和变异株的重组多表位疫苗rSMEV，包括CD8+ T细胞表位的一个或两个以上序列、CD4+ T细胞表位的一个或两个以上序列、线性B细胞表位的一个或两个以上序列和构象B细胞表位的一个或两个以上序列；
Figure BDA0003401553530000021
CD8+ T细胞表位、CD4+ T细胞表位、线性B细胞表位和构象B细胞表位的序列如上表所示。
优选地，还包括Linker，Linker的序列为AAY、GPGPG和/或KK。
优选地，还包括有利于rSMEV穿透细胞膜并在膜内进行传递的TAT序列。
优选地，所述表位的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQID NO.4中的一个或两个以上混合序列。
本发明目的之二在于提供上述多表位疫苗rSMEV构建方法，包括以下步骤：
S1、将CD8+ T细胞表位的一个或两个以上序列按照任意顺序连接，得到CD8+ T细胞表位序列；将CD4+ T细胞表位的一个或两个以上序列按照任意顺序连接，得到CD4+ T细胞表位序列；将线性B细胞表位的一个或两个以上序列按照任意顺序连接，得到线性B细胞表位序列；将构象B细胞表位的一个或两个以上序列按照任意顺序连接，得到构象B细胞表位序列；
S2、再将CD8+ T细胞表位序列、CD4+ T细胞表位序列、线性B细胞表位序列和构象B细胞表位序列按照任意顺序连接，得到rSMEV的氨基酸序列。
本发明目的之三在于提供上述多表位疫苗rSMEV的宿主细胞。
本发明目的之四在于提供上述多表位疫苗rSMEV的载体。
本发明目的之五在于提供上述多表位疫苗在制备预防和治疗SARS CoV-2的药物中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的重组多表位疫苗，被命名为rSMEV。
(2)由于S蛋白可介导病毒感染中SARS-CoV-2与人ACE2受体的结合，对病毒的感染起到决定性作用，所以本发明以原始株及5个全球流行的突变株(B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429和B.1.617.2)的刺突蛋白(Spike protein)为靶抗原，基于人27个HLA-Ⅰ类和27个HLA-Ⅱ类高频限制性等位基因来预测CD8+和CD4+ T细胞表位，及线性、构象B细胞表位。
使用linker蛋白连接技术，将CD8+和CD4+ T以及线性和构象B细胞表位序列进行连接，同时在序列C端加入TAT序列，最终设计出一款重组多价、多表位疫苗rSMEV。
在全球新冠肺炎大流行的背景下，SARS-CoV-2的突变使得原有疫苗的保护力被削弱，本发明提供的rSMEV能够同时抵抗SARS-CoV-2及其突变株(B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429和B.1.617.2)的感染，对多种变异类型的SARS-CoV-2的传染具有阻断作用。
(3)将本发明重组多表位疫苗rSMEV与TLR-3分子进行对接，发现rSMEV与TLR-3具有高度结合能力，说明机体免疫细胞可对rSMEV进行高效摄取及抗原呈递。
(4)本发明通过对小鼠进行了rSMEV的滴鼻接种，构建动物体内实验模型。完成三次接种后，使用酶联免疫斑点检测(enzyme linked immunospot assay,ELISPOT)技术对小鼠的特异性抗体分泌细胞(antibody secreting cells,ASCs)进行了检测，从而证明了rSMEV可以激活小鼠的特异性体液免疫；同时使用酶联免疫吸附检测(enzyme-linkedimmunosorbent assay)技术测定小鼠体内特异性T细胞对IFN-γ和IL-4的分泌能力，从而证实了rSMEV可以激活小鼠的特异性细胞免疫。总之，本发明通过体内外实验，证明了rSMEV具有良好的免疫原性，有望为将来新冠肺炎进一步流行的紧急防控提供免疫学策略和理论依据。
(5)本发明利用免疫信息学高通量预测技术，在预测T细胞表位时，加大了HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ等位基因的选择数量。首先筛选了27个HLA-Ⅰ类等位基因中同时出现4次的CD8+T细胞表位，又筛选了27个HLA-Ⅱ类等位基因中同时出现6次的CD4+ T细胞表位，这些筛选的高频抗原表位可提高疫苗对全球不同人种的覆盖率，扩大了疫苗的保护群体。
(6)本发明将筛选的高频抗原表位使用linker蛋白进行连接，同时注重linker选择的适应性和针对性，这些高频抗原表位的使用以及linker蛋白的优化设计可以增强rSMEV的免疫原性，尤其是采用Linker-AAY连接CD8+ T细胞表位，使用Linker-GPGPG连接CD4+ T细胞表位，Linker-KK连接B细胞表位和TAT序列的rSMEV的免疫原性最佳。
附图说明
图1为6个候选病毒株中S蛋白的序列比对；图中“·”代表与参考序列相同的氨基酸，“-”代表氨基酸序列的缺失，其余突变位点为氨基酸的错义突变；
图2为每个病毒株的所有表位按照起始位置的大小顺序连接，发生突变的CD8+ T细胞表位位于黑色框中；通过序列比对，所有毒株的所有共同和变异表位均用于疫苗构建；
图3为6个候选病毒株的所有表位按照起始位置的大小顺序连接，发生突变的CD4+T细胞表位位于黑色框中。通过序列比对，所有毒株的所有共同和变异表位均用于疫苗构建；
图4为每个病毒株的所有表位按照起始位置的大小顺序连接，发生突变的线性B细胞表位位于黑色框中，通过序列比对，6个候选病毒株的共同和变异表位均用于构建疫苗；
图5为构象B细胞表位的鉴定；图中圈中的区域为6个候选病毒株S蛋白的最佳构象表位区域；图中A是原始毒株S蛋白的构象B细胞表位；B是变异株B.1.1.7的构象B细胞表位；C是变异株B.1.351的构象B细胞表位；D是变异株P.1的构象B细胞表位；E是变异株B.1.429的构象B细胞表位；F是变异株B.1.617.2的构象B细胞表位；
图6为rSMEV的三级结构；图中a：在rSMEV二级结构的预测中，“h”表示α-螺旋，“e”表示延伸链，“t”表示β-转角，“c”表示无规则卷曲；b：以“正面观”和“背面观”展示的三级结构；
图7为rSMEV与TLR-3分子相互作用界面；图中a：由PyMol软件预测的蛋白质相互作用界面是三维的，在这个三维相互作用界面上，有4个氢键和一些疏水力参与了分子间相互作用；b：软件Ligplot预测的蛋白质相互作用界面是二维的，在这个三维相互作用界面上，存在3个氢键和一些疏水力；
图8为疫苗人口覆盖率测试；图中a：CD8+ T细胞表位全球人口覆盖率；图中b：CD4+T细胞表位全球人口覆盖率；
图9为构建rSMEV表达载体的示意图；
图10为rSMEV免疫原性验证；a：HC和rSMEV组的代表性ELISPOT图；b：使用两独立样本t检验后，HC组和rSMEV组的ASCs计数有显著差异(P＜0.001)；c：HC组和rSMEV组之间IFN-γ水平的两独立样本t检验，差异具有统计学意义(P＜0.0001)；d：HC组和rSMEV组IL-4水平的两独立样本t检验，差异具有统计学意义(P＜0.001)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例1-鉴定CD8+ T细胞表位、CD4+ T细胞表位、线性B细胞表位和构象B细胞表位
第一步.选取候选病毒株
从美国国家生物信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)获取了6个候选病毒株的氨基酸序列，分别为原始株和5个全球流行的突变株(B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429和B.1.617.2)。
具体地，根据对应的登录号在NCBI上查找候选病毒株的氨基酸序列并进行比对，如图1所示，以原始株为参考序列，发现从S蛋白的N端到C端，5个突变株的S蛋白共存在37个氨基酸位点的突变。图1中的“·”代表与参考序列相同的氨基酸，“-”代表氨基酸序列的缺失，其余突变位点为氨基酸的错义突变。具体突变如下：
(1)原始株的氨基酸序列：
1 mfvflvllpl
Figure BDA0003401553530000051
sftrgvyypd kvfrssvlhs tqdlflpffs(
Figure BDA0003401553530000052
分别为原始株第13、18、19、20、26位氨基酸)
61
Figure BDA0003401553530000053
npvlpfndgv yfasteksni irgwifgttl dsktqslliv(
Figure BDA0003401553530000054
分别为原始株第69、70、80位氨基酸)
121 nnatnvvikv
Figure BDA0003401553530000055
ssannctfey vsqpflmdle(
Figure BDA0003401553530000056
Figure BDA0003401553530000057
分别为原始株第138、145、152、156、157、158位氨基酸)
181
Figure BDA0003401553530000058
efvfknidgy fkiyskhtpi
Figure BDA0003401553530000059
saleplvdlp iginitrfqt(
Figure BDA00034015535300000510
为原始株第190、215位氨基酸)
241
Figure BDA00034015535300000511
pgdsssgwta gaaayyvgyl
Figure BDA00034015535300000512
engtitdavd caldplsetk(
Figure BDA00034015535300000513
为原始株第241、242、243、274位氨基酸)
301 ctlksftvek giyqtsnfrv qptesivrfp nitnlcpfge vfnatrfasv yawnrkrisn
361 cvadysvlyn sasfstfkcy gvsptklndl cftnvyadsf virgdevrqi
Figure BDA00034015535300000514
(
Figure BDA00034015535300000515
为原始株第417位氨基酸)
421 ynyklpddft gcviawnsnn ldskvggnyn
Figure BDA0003401553530000061
lkpferdist
Figure BDA0003401553530000062
(
Figure BDA0003401553530000063
为原始株第452、478位氨基酸)
481
Figure BDA0003401553530000064
plqsygfqpt
Figure BDA0003401553530000065
vvlsfellha patvcgpkks tnlvknkcvn(
Figure BDA0003401553530000066
分别为原始株第484、501位氨基酸)
541 fnfngltgtg vltesnkkfl
Figure BDA0003401553530000067
dttdavrdpq tleilditpc sfggvsvitp(
Figure BDA0003401553530000068
为原始株第570位氨基酸)
601 gtntsnqvav
Figure BDA0003401553530000069
pvaihadqlt ptwrvystgs nvfqtragcl
Figure BDA00034015535300000610
(
Figure BDA00034015535300000611
分别为原始株第614、655位氨基酸)
661 ecdipigagi casyqtqtns
Figure BDA00034015535300000612
siiaytmslg
Figure BDA00034015535300000613
(
Figure BDA00034015535300000614
分别为原始株第681、701、716位氨基酸)
721 svtteilpvs mtktsvdctm yicgdstecs nlllqygsfc tqlnraltgi aveqdkntqe
781 vfaqvkqiyk tppikdfggf nfsqilpdps kpskrsfied llfnkvtlad agfikqygdc
841 lgdiaardli caqkfngltv lpplltdemi aqytsallag titsgwtfga gaalqipfam
901 qmayrfngig vtqnvlyenq klianqfnsa igkiqdslss
Figure BDA00034015535300000615
vvnqnaqaln(
Figure BDA00034015535300000616
为原始株第950位氨基酸)
961 tlvkqlssnf gaissvlndi
Figure BDA00034015535300000617
vqidrlitgr
Figure BDA00034015535300000618
qliraaeira(
Figure BDA00034015535300000619
分别为原始株第982、1006位氨基酸)
1021
Figure BDA00034015535300000620
ecvlgqskrv dfcgkgyhlm sfpqsaphgv vflhvtyvpa qeknfttapa(
Figure BDA00034015535300000621
为原始株第1027位氨基酸)
1081 ichdgkahfp regvfvsngt hwfvtqrnfy
Figure BDA00034015535300000622
fvsgncdvvi givnntvydp(
Figure BDA00034015535300000623
为原始株第1118位氨基酸)
1141 lqpeldsfke eldkyfknht spdvdlgdis
Figure BDA00034015535300000624
keidrlneva knlneslidl(
Figure BDA00034015535300000625
为原始株第1176位氨基酸)
1201 qelgkyeqyi kwpwyiwlgf iagliaivmv timlccmtsc csclkgccscgscckfdedd
1261 sepvlkgvkl hyt
(2)B.1.1.7的氨基酸序列为：
1 mfvflvllpl vssqcvnltt rtqlppaytn sftrgvyypd kvfrssvlhs tqdlflpffs
61 nvtwfhaisg tngtkrfdnp vlpfndgvyf asteksniir gwifgttlds ktqsllivnn(与原始株参考序列相比，B.1.1.7的第69和第70位氨基酸缺失)
121 atnvvikvce fqfcndpflg vyhknnkswm esefrvyssa nnctfeyvsq pflmdlegkq(与原始株参考序列相比，B.1.1.7的第145位氨基酸缺失)
181 gnfknlrefv fknidgyfki yskhtpinlv rdlpqgfsal eplvdlpigi nitrfqtlla
241 lhrsyltpgd sssgwtagaa ayyvgylqpr tfllkyneng titdavdcal dplsetkctl
301 ksftvekgiy qtsnfrvqpt esivrfpnit nlcpfgevfn atrfasvyaw nrkrisncva
361 dysvlynsas fstfkcygvs ptklndlcft nvyadsfvir gdevrqiapg qtgkiadyny
421 klpddftgcv iawnsnnlds kvggnynyly rlfrksnlkp ferdisteiy qagstpcngv
481 egfncyfplq
Figure BDA0003401553530000071
gyqpyrvvvl sfellhapat vcgpkkstnl vknkcvnfnf(
Figure BDA0003401553530000072
为B.1.1.7第501位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.1.7具有N501Y突变)
541 ngltgtgvlt esnkkflpfq
Figure BDA0003401553530000073
davrdpqtle ilditpcsfg gvsvitpgtn(
Figure BDA0003401553530000074
为B.1.1.7第501位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.1.7具有A570D突变)
601 tsnqvavlyq
Figure BDA0003401553530000075
ihadqltptw rvystgsnvf qtragcliga ehvnnsyecd(
Figure BDA0003401553530000076
为B.1.1.7第614位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.1.7具有D614G突变)
661 ipigagicas
Figure BDA0003401553530000077
arsvasqsii aytmslgaen svaysnnsia
Figure BDA0003401553530000078
(
Figure BDA0003401553530000079
为B.1.1.7第681、716位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.1.7具有P681H、T716I突变)
721 teilpvsmtk tsvdctmyic gdstecsnll lqygsfctql nraltgiave qdkntqevfa
781 qvkqiyktpp ikdfggfnfs qilpdpskps krsfiedllf nkvtladagf ikqygdclgd
841 iaardlicaq kfngltvlpp lltdemiaqy tsallagtit sgwtfgagaa lqipfamqma
901 yrfngigvtq nvlyenqkli anqfnsaigk iqdslsstas algklqdvvn qnaqalntlv
961 kqlssnfgai
Figure BDA00034015535300000710
ldkveaevqi drlitgrlqs lqtyvtqqli raaeirasan(
Figure BDA00034015535300000711
为B.1.1.7第614位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.1.7具有S982A突变)
1021 laatkmsecv lgqskrvdfc gkgyhlmsfp qsaphgvvfl hvtyvpaqeknfttapaich
1081 dgkahfpreg vfvsngthwf vtqrnfyepq
Figure BDA00034015535300000712
gncdvvigiv nntvydplqp(
Figure BDA00034015535300000713
为B.1.1.7第1118位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.1.7具有D1118H突变)
1141 eldsfkeeld kyfknhtspd vdlgdisgin asvvniqkei drlnevaknlneslidlqel
1201 gkyeqyikwp wyiwlgfiag liaivmvtim lccmtsccsc lkgccscgscckfdeddsep
1261 vlkgvklhyt
(3)B.1.351的氨基酸序列为：
1 mfvflvllpl vssqcvnltt rtqlppaytn sftrgvyypd kvfrssvlhs tqdlflpffs
61 nvtwfhaihv
Figure BDA0003401553530000081
npvlpfndgv yfasteksni irgwifgttl dsktqslliv(
Figure BDA0003401553530000082
为B.1.351第80位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.351具有D80A突变)
121 nnatnvvikv cefqfcndpf lgvyyhknnk swmesefrvy ssannctfey vsqpflmdle
181 gkqgnfknlr efvfknidgy fkiyskhtpi
Figure BDA0003401553530000083
saleplvdlp iginitrfqt(
Figure BDA0003401553530000084
为B.1.351第215位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.351具有D215G突变)
241 lhrsyltpgd sssgwtagaa ayyvgylqpr tfllkyneng titdavdcal dplsetkctl(与原始株参考序列相比，B.1.351第241-243位氨基酸缺失)
301 ksftvekgiy qtsnfrvqpt esivrfpnit nlcpfgevfn atrfasvyaw nrkrisncva
361 dysvlynsas fstfkcygvs ptklndlcft nvyadsfvir gdevrqiapg qtgkiadyny
421 klpddftgcv iawnsnnlds kvggnynyly rlfrksnlkp ferdisteiy qagstpcngv
481
Figure BDA0003401553530000085
gyqpyrvvvl sfellhapat vcgpkkstnl vknkcvnfnf(
Figure BDA0003401553530000086
分别为B.1.351第484、501位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.351具有E484K、N501Y突变)
541 ngltgtgvlt esnkkflpfq qfgrdiadtt davrdpqtle ilditpcsfg gvsvitpgtn
601 tsnqvavlyq
Figure BDA0003401553530000087
ihadqltptw rvystgsnvf qtragcliga ehvnnsyecd(
Figure BDA0003401553530000088
为B.1.351第614位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.351具有D614G突变)
661 ipigagicas yqtqtnsprr arsvasqsii
Figure BDA0003401553530000089
svaysnnsia iptnftisvt(
Figure BDA00034015535300000810
为B.1.351第701位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.351具有A701V突变)
721 teilpvsmtk tsvdctmyic gdstecsnll lqygsfctql nraltgiave qdkntqevfa
781 qvkqiyktpp ikdfggfnfs qilpdpskps krsfiedllf nkvtladagf ikqygdclgd
841 iaardlicaq kfngltvlpp lltdemiaqy tsallagtit sgwtfgagaa lqipfamqma
901 yrfngigvtq nvlyenqkli anqfnsaigk iqdslsstas algklqdvvn qnaqalntlv
961 kqlssnfgai ssvlndilsr ldkveaevqi drlitgrlqs lqtyvtqqli raaeirasan
1021 laatkmsecv lgqskrvdfc gkgyhlmsfp qsaphgvvfl hvtyvpaqeknfttapaich
1081 dgkahfpreg vfvsngthwf vtqrnfyepq iittdntfvs gncdvvigivnntvydplqp
1141 eldsfkeeld kyfknhtspd vdlgdisgin asvvniqkei drlnevaknlneslidlqel
1201 gkyeqyikwp wyiwlgfiag liaivmvtim lccmtsccsc lkgccscgscckfdeddsep
1261 vlkgvklhyt
(4)P.1的氨基酸序列为：
1 mfvflvllpl
Figure BDA00034015535300000811
sftrgvyypd kvfrssvlhs tqdlflpffs(
Figure BDA00034015535300000812
为P.1第18位氨基酸，
Figure BDA0003401553530000091
为P.1第20位氨基酸，
Figure BDA0003401553530000092
为P.1第26位氨基酸，与原始株参考序列相比，P.1具有L18F、T20N、P26S突变)
61 nvtwfhaihv sgtngtkrfd npvlpfndgv yfasteksni irgwifgttl dsktqslliv
121 nnatnvvikv
Figure BDA0003401553530000093
lgvyyhknnk swmesefrvy ssannctfey vsqpflmdle(
Figure BDA0003401553530000094
为P.1第138位氨基酸，与原始株参考序列相比，P.1具有D138Y突变)
181
Figure BDA0003401553530000095
efvfknidgy fkiyskhtpi nlvrdlpqgf saleplvdlp iginitrfqt(
Figure BDA0003401553530000096
为P.1第190位氨基酸，与原始株参考序列相比，P.1具有R190S突变)
241 llalhrsylt pgdsssgwta gaaayyvgyl qprtfllkyn engtitdavd caldplsetk
301 ctlksftvek giyqtsnfrv qptesivrfp nitnlcpfge vfnatrfasv yawnrkrisn
361 cvadysvlyn sasfstfkcy gvsptklndl cftnvyadsf virgdevrqi
Figure BDA0003401553530000097
(
Figure BDA0003401553530000098
为P.1第417位氨基酸，与原始株参考序列相比，P.1具有K417T突变)
421 ynyklpddft gcviawnsnn ldskvggnyn ylyrlfrksn lkpferdist eiyqagstpc
481
Figure BDA0003401553530000099
plqsygfqpt
Figure BDA00034015535300000910
vvlsfellha patvcgpkks tnlvknkcvn(
Figure BDA00034015535300000911
分别为P.1第484、501位氨基酸，与原始株参考序列相比，P.1具有E484K、N501Y突变)
541 fnfngltgtg vltesnkkfl pfqqfgrdia dttdavrdpq tleilditpc sfggvsvitp
601 gtntsnqvav
Figure BDA00034015535300000912
pvaihadqlt ptwrvystgs nvfqtragcl
Figure BDA00034015535300000913
(
Figure BDA00034015535300000914
分别为P.1第614、655位氨基酸，与原始株参考序列相比，P.1具有D614G、H655Y突变)
661 ecdipigagi casyqtqtns prrarsvasq siiaytmslg aensvaysnn siaiptnfti
721 svtteilpvs mtktsvdctm yicgdstecs nlllqygsfc tqlnraltgi aveqdkntqe
781 vfaqvkqiyk tppikdfggf nfsqilpdps kpskrsfied llfnkvtlad agfikqygdc
841 lgdiaardli caqkfngltv lpplltdemi aqytsallag titsgwtfga gaalqipfam
901 qmayrfngig vtqnvlyenq klianqfnsa igkiqdslss tasalgklqd vvnqnaqaln
961 tlvkqlssnf gaissvlndi lsrldkveae vqidrlitgr lqslqtyvtq qliraaeira
1021
Figure BDA00034015535300000915
ecvlgqskrv dfcgkgyhlm sfpqsaphgv vflhvtyvpa qeknfttapa(
Figure BDA00034015535300000916
为P.1第1027位氨基酸，与原始株参考序列相比，P.1具有T1027I突变)
1081 ichdgkahfp regvfvsngt hwfvtqrnfy epqiittdnt fvsgncdvvigivnntvydp
1141 lqpeldsfke eldkyfknht spdvdlgdis
Figure BDA00034015535300000917
keidrlneva knlneslidl(
Figure BDA00034015535300000918
为P.1第1076位氨基酸，与原始株参考序列相比，P.1具有V1076F突变)
1201 qelgkyeqyi kwpwyiwlgf iagliaivmv timlccmtsc csclkgccscgscckfdedd
1261 sepvlkgvkl hyt
(5)B.1.429的氨基酸序列为：
1 mfvflvllpl
Figure BDA0003401553530000101
rtqlppaytn sftrgvyypd kvfrssvlhs tqdlflpffs(
Figure BDA0003401553530000102
为B.1.429第13位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.429具有S13I突变)
61 nvtwfhaihv sgtngtkrfd npvlpfndgv yfasteksni irgwifgttl dsktqslliv
121 nnatnvvikv cefqfcndpf lgvyyhknnk
Figure BDA0003401553530000103
ssannctfey vsqpflmdle(
Figure BDA0003401553530000104
为B.1.429第152位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.429具有W152C突变)
181 gkqgnfknlr efvfknidgy fkiyskhtpi nlvrdlpqgf saleplvdlp iginitrfqt
241 llalhrsylt pgdsssgwta gaaayyvgyl
Figure BDA0003401553530000105
engtitdavd caldplsetk(
Figure BDA0003401553530000106
为B.1.429第274位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.429具有T274I突变)
301 ctlksftvek giyqtsnfrv qptesivrfp nitnlcpfge vfnatrfasv yawnrkrisn
361 cvadysvlyn sasfstfkcy gvsptklndl cftnvyadsf virgdevrqi apgqtgkiad
421 ynyklpddft gcviawnsnn ldskvggnyn
Figure BDA0003401553530000107
lkpferdist eiyqagstpc(
Figure BDA0003401553530000108
为B.1.429第452位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.429具有L452R突变)
481 ngvegfncyf plqsygfqpt ngvgyqpyrv vvlsfellha patvcgpkks tnlvknkcvn
541 fnfngltgtg vltesnkkfl pfqqfgrdia dttdavrdpq tleilditpc sfggvsvitp
601 gtntsnqvav
Figure BDA0003401553530000109
pvaihadqlt ptwrvystgs nvfqtragcl igaehvnnsy(
Figure BDA00034015535300001010
为B.1.429第614位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.429具有D614G突变)
661 ecdipigagi casyqtqtns prrarsvasq siiaytmslg aensvaysnn siaiptnfti
721 svtteilpvs mtktsvdctm yicgdstecs nlllqygsfc tqlnraltgi aveqdkntqe
781 vfaqvkqiyk tppikdfggf nfsqilpdps kpskrsfied llfnkvtlad agfikqygdc
841 lgdiaardli caqkfngltv lpplltdemi aqytsallag titsgwtfga gaalqipfam
901 qmayrfngig vtqnvlyenq klianqfnsa igkiqdslss tasalgklqd vvnqnaqaln
961 tlvkqlssnf gaissvlndi lsrldkveae vqidrlitgr lqslqtyvtq qliraaeira
1021 sanlaatkms ecvlgqskrv dfcgkgyhlm sfpqsaphgv vflhvtyvpaqeknfttapa
1081 ichdgkahfp regvfvsngt hwfvtqrnfy epqiittdnt fvsgncdvvigivnntvydp
1141 lqpeldsfke eldkyfknht spdvdlgdis ginasvvniq keidrlnevaknlneslidl
1201 qelgkyeqyi kwpwyiwlgf iagliaivmv timlccmtsc csclkgccscgscckfdedd
1261 sepvlkgvkl hyt
(6)B.1.617.2的氨基酸序列为：
1 mfvflvllpl
Figure BDA0003401553530000111
rtqlppaytn sftrgvyypd kvfrssvlhs tqdlflpffs(
Figure BDA0003401553530000112
为B.1.617.2第19位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.617.2具有T19R突变)
61 nvtwfhaihv sgtngtkrfd npvlpfndgv yfasteksni irgwifgttl dsktqslliv
121 nnatnvvikv cefqfcndpf ldvyyhknnk
Figure BDA0003401553530000113
annctfeyvs qpflmdlegk(与原始株参考序列相比，B.1.617.2第156和第157位缺失，
Figure BDA0003401553530000114
为B.1.617.2第158位氨基酸，具有R158G突变)
181 qgnfknlref vfknidgyfk iyskhtpinl vrdlpqgfsa leplvdlpig initrfqtll
241 alhrsyltpg dsssgwtaga aayyvgylqp rtfllkynen gtitdavdca ldplsetkct
301 lksftvekgi yqtsnfrvqp tesivrfpni tnlcpfgevf natrfasvya wnrkrisncv
361 adysvlynsa sfstfkcygv sptklndlcf tnvyadsfvi rgdevrqiap gqtgkiadyn
421 yklpddftgc viawnsnnld skvggnynyr
Figure BDA0003401553530000115
pferdistei
Figure BDA0003401553530000116
(
Figure BDA0003401553530000117
分别为B.1.617.2第452、478位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.617.2具有L452R、T478K突变)
481 vegfncyfpl qsygfqptng vgyqpyrvvv lsfellhapa tvcgpkkstn lvknkcvnfn
541 fngltgtgvl tesnkkflpf qqfgrdiadt tdavrdpqtl eilditpcsf ggvsvitpgt
601 ntsnqvavly
Figure BDA0003401553530000118
aihadqltpt wrvystgsnv fqtragclig aehvnnsyec(
Figure BDA0003401553530000119
为B.1.617.2第614位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.617.2具有D614G突变)
661 dipigagica
Figure BDA00034015535300001110
rarsvasqsi iaytmslgae nsvaysnnsi aiptnftisv(
Figure BDA00034015535300001111
为B.1.617.2第681位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.617.2具有P681R突变)
721 tteilpvsmt ktsvdctmyi cgdstecsnl llqygsfctq lnraltgiav eqdkntqevf
781 aqvkqiyktp pikdfggfnf sqilpdpskp skrsfiedll fnkvtladag fikqygdclg
841 diaardlica qkfngltvlp plltdemiaq ytsallagti tsgwtfgaga alqipfamqm
901 ayrfngigvt qnvlyenqkl ianqfnsaig kiqdslssta
Figure BDA00034015535300001112
nqnaqalntl(
Figure BDA00034015535300001113
为B.1.617.2第950位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.617.2具有D950N突变)
961 vkqlssnfga issvlndils rldkveaevq idrlitgrlq
Figure BDA00034015535300001114
iraaeirasa(
Figure BDA00034015535300001115
为B.1.617.2第1006位氨基酸，与原始株参考序列相比，B.1.617.2具有T1006I突变)
1021 nlaatkmsec vlgqskrvdf cgkgyhlmsf pqsaphgvvf lhvtyvpaqeknfttapaic
1081 hdgkahfpre gvfvsngthw fvtqrnfyep qiittdntfv sgncdvvigivnntvydplq
1141 peldsfkeel dkyfknhtsp dvdlgdisgi nasvvniqke idrlnevaknlneslidlqe
1201 lgkyeqyikw pwyiwlgfia gliaivmvti mlccmtsccs clkgccscgscckfdeddse
1261 pvlkgvklhy t
使用在线服务器VaxiJen 2.0预测6个候选病毒株的抗原性，以用于抗原表位的鉴定和筛选，6个候选病毒株的具体信息和抗原值参见表1。
表1：6个候选病毒株的基本信息及抗原性
Figure BDA0003401553530000121
第二步.鉴定抗原表位
(1)鉴定CD8+ T细胞表位
在鉴定S蛋白的CD8+ T细胞表位时，本实施例选择了IEDB数据库中默认的全球高频的27个HLA-Ⅰ类等位基因以扩大人群覆盖率，27个HLA-Ⅰ类等位基因分别为：
表2：27个HLA-Ⅰ类等位基因
Figure BDA0003401553530000122
使用在线软件NetCTLpan 1.1预测CD8+ T细胞表位，最终根据预测出的表位的出现频率，选定在27个等位基因中同时出现4次的表位作为CD8+ T细胞表位。结合序列比对技术，对6种S蛋白的表位序列进行比对，筛选出6个候选病毒株共同拥有或每个病毒株单独具有的表位作为疫苗设计最终表位。
图2为每个病毒株的所有表位按照起始位置的大小顺序连接，发生突变的CD8+ T细胞表位位于黑色框中；通过序列比对，所有毒株的所有共同和变异表位均用于疫苗构建。
(2)鉴定CD4+ T细胞表位
在构建CD4+ T细胞表位时，同样选择了IEDB数据库中默认的全球最高频的27个HLA-Ⅱ类等位基因，具体等位基因如表3所示：
表3：27个HLA-Ⅱ类等位基因
Figure BDA0003401553530000131
使用在线软件NetMHCIIpan 4.0预测了CD4+ T细胞表位。最终根据预测出的表位的出现频率，选定在27个等位基因中同时出现6次的表位作为CD4+ T细胞表位。结合序列比对技术，对6种S蛋白的表位序列进行比对，最终如图3所示，筛选出6个候选病毒株共同拥有或每个病毒株单独具有的CD4+ T细胞表位作为疫苗设计最终表位。
(3)鉴定线性B细胞表位
本实施例使用在线服务器BepiPred-2.0预测了6个候选病毒株S蛋白的线性B细胞表位，完成表位预测后。利用序列比对技术，对6个候选病毒株S蛋白的线性B细胞表位序列进行比对，随后筛选出6个候选病毒株S蛋白共有或者自身特有的表位序列，用于构建疫苗，具体序列参见图4。
(4)鉴定构象B细胞表位
从PDB蛋白数据库中，下载6个候选病毒株S蛋白的三级结构模型，以用于S蛋白构象B细胞表位的预测，根据构象表位构建疫苗(见图5)。
综上，用于疫苗构建的抗原表位具体如下表4所示：
表4：用于疫苗构建的抗原表位
Figure BDA0003401553530000141
a在每种类型的抗原表位中，属于变异株的表位的占有比例。
实施例2-构建重组多表位疫苗rSMEV
具体构建方法如下：
S1、采用Linker 1将实施例1获得的CD8+ T细胞表位的一个或两个以上序列按照任意顺序连接，得到CD8+ T细胞表位序列，每个序列可出现两次以上；采用Linker 2将实施例1获得的CD4+ T细胞表位的一个或两个以上序列按照任意顺序连接，得到CD4+ T细胞表位序列，每个序列可出现两次以上；采用Linker 3将实施例1获得的线性B细胞表位的一个或两个以上序列按照任意顺序连接，得到线性B细胞表位序列，每个序列可出现两次以上；采用Linker 4将实施例1获得的构象B细胞表位的一个或两个以上序列按照任意顺序连接，得到构象B细胞表位序列，每个序列可出现两次以上。CD8+ T细胞表位序列、CD4+ T细胞表位序列、线性B细胞表位序列和构象B细胞表位序列之间通过Linker 1、Linker 2、Linker 3或Linker 4连接。
具体地，本实施例优选Linker 1的序列为AAY，Linker 2的序列为GPGPG，Linker 3的序列和Linker 4的序列相同，序列均为KK。
S2、再将CD8+ T细胞表位序列、CD4+ T细胞表位序列、线性B细胞表位序列和构象B细胞表位序列按照任意顺序连接；
S3、在序列的C端加入TAT序列，得到rSMEV的氨基酸序列。TAT序列有利于rSMEV穿透细胞膜并在膜内进行传递。TAT序列为TGALLAAGAAA。
rSMEV的氨基酸序列可以为SEQ ID NO.1：
Figure BDA0003401553530000151
CD8+ T细胞表位序列和CD4+ T细胞表位序列之间通过Linker 1-AAY连接，CD4+ T细胞表位序列和线性B细胞表位序列之间通过Linker 2-GPGPG连接，线性B细胞表位序列和构象B细胞表位序列之间通过Linker 3-KK连接。
rSMEV的氨基酸序列还可以为SEQ ID NO.2：
Figure BDA0003401553530000152
Figure BDA0003401553530000161
rSMEV的氨基酸序列还可以为SEQ ID NO.3：
Figure BDA0003401553530000162
rSMEV的氨基酸序列还可以为SEQ ID NO.4：
Figure BDA0003401553530000163
实施例3-预测序列为SEQ ID NO.1的rSMEV的蛋白二三级结构
使用在线软件SOMPA预测了rSMEV的二级结构。图6为rSMEV的三级结构；图中a：在rSMEV二级结构的预测中，“h”表示α-螺旋，“e”表示延伸链，“t”表示β-转角，“c”表示无规则卷曲；b：以“正面观”和“背面观”展示的三级结构。
rSMEV含有20.03％的α-螺旋、23.94％的延伸链、6.51％的β-转角和49.51％的无规则卷曲。同时使用高精确度超级计算机运行软件Rosettafold来预测rSMEV的三级结构，最终结果显示，rSMEV的二三级结构能够相互吻合，模型合理度较高。
Toll样受体(toll-like receptor，TLR)是一类参与先天免疫的重要蛋白分子，也是非特异性免疫和特异性免疫之间的桥梁。TLR-3分子广泛存在于组织的树突状细胞和单核细胞等抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs)上，可以激活机体APC识别RNA病毒感染的特异性反应。为了证明rSMEV可以与TLR-3分子具有高度结合力，本实施例采用分子对接技术来验证了rSMEV与TLR-3的相互作用，并使用软件PyMol和Ligplot绘制了rSMEV-TLR-3复合体的相互作用界面，具体作用如图7所示。图7为rSMEV与TLR-3分子相互作用界面；图中a：由PyMol软件预测的蛋白质相互作用界面是三维的，在这个三维相互作用界面上，有4个氢键和一些疏水力参与了分子间相互作用；b：软件Ligplot预测的蛋白质相互作用界面是二维的，在这个三维相互作用界面上，存在3个氢键和一些疏水力。
实施例4-预测疫苗全球人群覆盖率
本实施例在鉴定抗原表位时，针对机体免疫细胞对抗原肽的识别提呈中所涉及的HLA等位基因限制性问题，特别选择了全球流行的27种HLA-Ⅰ类和27种HLA-Ⅱ类等位基因，从而提高了疫苗的人群覆盖率。在后期的疫苗全球人群覆盖率预测中发现，疫苗rSMEV的CD8+T细胞表位全球人口覆盖率达到93.16％，CD4+ T细胞表位全球人口覆盖率达到99.9％，有力地说明了疫苗rSMEV的人群高度适应性(具体实验结果如图8所示，图8为疫苗人口覆盖率测试；图中a：CD8+ T细胞表位全球人口覆盖率；图中b：CD4+ T细胞表位全球人口覆盖率)。
实施例5-动物免疫实验
本动物免疫实验经新疆医科大学动物伦理委员会批准，整个动物实验过程严格按照新疆医科大学动物伦理委员会的实验要求和操作指南进行。
本实施例使用质粒载体pET28a(+)完成了rSMEV的表达，具体构建过程如图9所示。
经纯化后用于小鼠体内疫苗接种实验。本实施例采用滴鼻发对小鼠进行滴鼻接种，新疆医科大学动物实验中心提供的8周龄SPF级BALB/c小鼠被随机分为rSMEV组(n＝8)和健康对照(health control,HC)组(n＝8)。rSMEV组小鼠经鼻滴注rSMEV，HC组小鼠经鼻滴注生理盐水。rSMEV溶液浓度为500μg/ml，每次给小鼠60μl(每个鼻孔30μl)，每2周一次，共3次，使用前用鲎试剂(LAL)检测疫苗溶液内毒素为阴性。第三次接种两周后，无菌条件下收集rSMEV和HC组小鼠脾细胞用于体外实验检测。
图10为rSMEV免疫原性验证；a：HC和rSMEV组的代表性ELISPOT图；b：使用两独立样本t检验后，HC组和rSMEV组的ASCs计数有显著差异(P＜0.001)；c：HC组和rSMEV组之间IFN-γ水平的两独立样本t检验，差异具有统计学意义(P＜0.0001)；d：HC组和rSMEV组IL-4水平的两独立样本t检验，差异具有统计学意义(P＜0.001)。具体实验结果如图10所示，通过ELISPOT实验，本实施例发现接种rSMEV的小鼠的特异性抗体分泌细胞(antibodysecreting cells,ASCs)的水平显著高于HC组小鼠，从而证明rSMEV可以激活小鼠的体液免疫反应。同时ELISA实验检测到rSMEV组小鼠特异性分泌的IFN-γ和IL-4水平显著高于HC组，从而证明了rSMEV可以激活小鼠的细胞免疫反应。以上体外实验表明，本实施例设计疫苗rSMEV具有良好的免疫原性。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110>新疆医科大学第一附属医院
<120>一种针对新冠原始株和变异株的重组多表位疫苗rSMEV及其应用
<160>4
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 614
<212> DNA
<213>新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2）
<400> 1
TTRTQLPPAY AAYRTRTQLP PAYAAYLPFF SNVTWFAAYL PIGINITRFA AYFPNITNLC 60
PFAAYLQSYG FQPTYAAYQP YRVVVLSFAA YNTSNQVAVL YAAYIGINIT RFQTLHRSYG 120
PGPGNDGVYF ASTEKSNIIG PGPGGINITR FQTLHRSYLG PGPGVEKGIY QTSNFRVQPG 180
PGPGEKGIYQ TSNFRVQPTG PGPGKGIYQT SNFRVQPTEG PGPGQTSNFR VQPTESIVRG 240
PGPGTSNFRV QPTESIVRFG PGPGNRALTG IAVEQDKNTG PGPGFGGFNF SQILPDPSKG 300
PGPGRAAEIR ASANLAATKG PGPGRAAEIR ASANLAAIKG PGPGAAEIRA SANLAATKMG 360
PGPGAAEIRA SKANLAAIMG PGPGEPQIIT TDNTFVSGNG PGPGYEPQII TTDNTFVSGG 420
PGPGEPQIIT TDNTFVSGNG PGPGCVNLTT RTQLPPKKVR CLPQGFSALE KKRQLAPGQT 480
GKIAKKVRDI APGQTGTIKK NFNFNGLTGT GVKKSKVGGN YNYRYRKKEC DIPIGACICA 540
KKHVTYVPAQ EKNFKKNNTV YDPLQPELKK YDPLQPELDS KKNSVAKKKN HTSPKKNHTS 600
PKKTGALLAA GAAA 614
<210> 2
<211> 614
<212> DNA
<213>新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2）
<400> 2
TTRTQLPPAY AAYRTRTQLP PAYAAYLPFF SNVTWFAAYL PIGINITRFA AYFPNITNLC 60
PFAAYLQSYG FQPTYAAYQP YRVVVLSFAA YNTSNQVAVL YAAYEKGIYQ TSNFRVQPTG 120
PGPGNDGVYF ASTEKSNIIG PGPGGINITR FQTLHRSYLG PGPGVEKGIY QTSNFRVQPG 180
PGPGIGINIT RFQTLHRSYG PGPGKGIYQT SNFRVQPTEG PGPGQTSNFR VQPTESIVRG 240
PGPGTSNFRV QPTESIVRFG PGPGNRALTG IAVEQDKNTG PGPGFGGFNF SQILPDPSKG 300
PGPGRAAEIR ASANLAATKG PGPGRAAEIR ASANLAAIKG PGPGAAEIRA SANLAATKMG 360
PGPGAAEIRA SKANLAAIMG PGPGEPQIIT TDNTFVSGNG PGPGYEPQII TTDNTFVSGG 420
PGPGEPQIIT TDNTFVSGNG PGPGYDPLQP ELDSKKNSVA KKKNHTSPKK NHTSPKKCVN 480
LTTRTQLPPK KVRCLPQGFS ALEKKRQLAP GQTGKIAKKV RDIAPGQTGT IKKNFNFNGL 540
TGTGVKKSKV GGNYNYRYRK KECDIPIGAC ICAKKHVTYV PAQEKNFKKN NTVYDPLQPE 600
LKKTGALLAA GAAA 614
<210> 3
<211> 614
<212> DNA
<213>新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2）
<400> 3
YDPLQPELDS KKNSVAKKKN HTSPKKNHTS PKKTTRTQLP PAYAAYRTRT QLPPAYAAYL 60
PFFSNVTWFA AYLPIGINIT RFAAYFPNIT NLCPFAAYLQ SYGFQPTYAA YQPYRVVVLS 120
FAAYNTSNQV AVLYAAYIGI NITRFQTLHR SYGPGPGNDG VYFASTEKSN IIGPGPGGIN 180
ITRFQTLHRS YLGPGPGVEK GIYQTSNFRV QPGPGPGEKG IYQTSNFRVQ PTGPGPGKGI 240
YQTSNFRVQP TEGPGPGQTS NFRVQPTESI VRGPGPGTSN FRVQPTESIV RFGPGPGNRA 300
LTGIAVEQDK NTGPGPGFGG FNFSQILPDP SKGPGPGRAA EIRASANLAA TKGPGPGRAA 360
EIRASANLAA IKGPGPGAAE IRASANLAAT KMGPGPGAAE IRASKANLAA IMGPGPGEPQ 420
IITTDNTFVS GNGPGPGYEP QIITTDNTFV SGGPGPGEPQ IITTDNTFVS GNGPGPGCVN 480
LTTRTQLPPK KVRCLPQGFS ALEKKRQLAP GQTGKIAKKV RDIAPGQTGT IKKNFNFNGL 540
TGTGVKKSKV GGNYNYRYRK KECDIPIGAC ICAKKHVTYV PAQEKNFKKN NTVYDPLQPE 600
LKKTGALLAA GAAA 614
<210> 4
<211> 614
<212> DNA
<213>新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2）
<400> 4
YDPLQPELDS KKNSVAKKKN HTSPKKNHTS PKKTTRTQLP PAYAAYRTRT QLPPAYAAYL 60
PFFSNVTWFA AYLPIGINIT RFAAYFPNIT NLCPFAAYLQ SYGFQPTYAA YQPYRVVVLS 120
FAAYNTSNQV AVLYAAYCVN LTTRTQLPPK KVRCLPQGFS ALEKKRQLAP GQTGKIAKKV 180
RDIAPGQTGT IKKNFNFNGL TGTGVKKSKV GGNYNYRYRK KECDIPIGAC ICAKKHVTYV 240
PAQEKNFKKN NTVYDPLQPE LKKIGINITR FQTLHRSYGP GPGNDGVYFA STEKSNIIGP 300
GPGGINITRF QTLHRSYLGP GPGVEKGIYQ TSNFRVQPGP GPGEKGIYQT SNFRVQPTGP 360
GPGKGIYQTS NFRVQPTEGP GPGQTSNFRV QPTESIVRGP GPGTSNFRVQ PTESIVRFGP 420
GPGNRALTGI AVEQDKNTGP GPGFGGFNFS QILPDPSKGP GPGRAAEIRA SANLAATKGP 480
GPGRAAEIRA SANLAAIKGP GPGAAEIRAS ANLAATKMGP GPGAAEIRAS KANLAAIMGP 540
GPGEPQIITT DNTFVSGNGP GPGYEPQIIT TDNTFVSGGP GPGEPQIITT DNTFVSGNGP 600
GPGTGALLAA GAAA 614

Claims (7)

1. 一种针对新冠原始株和变异株的重组多表位疫苗rSMEV，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的多表位疫苗rSMEV构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将CD8+ T细胞表位的多个序列按照顺序连接，得到CD8+ T细胞表位序列；将CD4+ T细胞表位的多个序列按照顺序连接，得到CD4+ T细胞表位序列；将线性B细胞表位的多个序列按照顺序连接，得到线性B细胞表位序列；将构象B细胞表位的多个序列按照顺序连接，得到构象B细胞表位序列；
S2、再将CD8+ T细胞表位序列、CD4+ T细胞表位序列、线性B细胞表位序列和构象B细胞表位序列按照顺序连接，得到rSMEV的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的多表位疫苗rSMEV构建方法，其特征在于，还包括S3、在序列的C端加入TAT序列。
4. 根据权利要求2或3所述的重组多表位疫苗rSMEV构建方法，其特征在于，S1中，通过Linker连接CD8+ T细胞表位序列、CD4+ T细胞表位序列、线性B细胞表位序列和构象B细胞表位序列，Linker的序列为AAY、GPGPG和/或KK。
5.一种表达权利要求1所述的多表位疫苗rSMEV的宿主细胞。
6.一种包含表达权利要求1所述的多表位疫苗rSMEV的核酸的载体。
7. 根据权利要求1所述的多表位疫苗在制备预防SARS CoV-2的药物中的应用。
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