CN112500498A

CN112500498A - 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112500498A
Application number: CN202011593318.7A
Authority: CN
Inventors: 宋旭; 刘丹; 赵永云; 李为民; 张天宇; 曾凡亚; 缪辉; 李佳; 李晓杰; 李灵
Original assignee: Sichuan University; Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Sichuan University; Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2020-02-26
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2040-12-29
Also published as: CN112500498B

Abstract

本发明提供了新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用，所述疫苗的编码基因包括：含有新型冠状病毒的S蛋白受体结合域RBD中与ACE2结合的肽段序列、Kozak序列、IgG信号肽序列和人源IgG Fc结构域序列；所述Kozak序列和IgG信号肽序列位于所述RBD中与ACE2结合的肽段序列的5’端；所述人源IgG Fc结构域序列位于所述RBD中与ACE2结合的肽段序列的3’端。本发明采用来自S蛋白的编码序列的第1168～1569位(包含RBD中与ACE2结合的肽段片段)作为抗原蛋白的基因序列，并进行改造，提高抗原蛋白的表达能力、分泌能力和免疫原性，制备的DNA疫苗、蛋白质疫苗和mRNA疫苗直接或经佐剂包装后注入体内表达出相应抗原，诱导机体产生免疫应答，在COVID‑19预防和治疗领域具有广泛应用的前景。

Description

新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用，尤其涉及新型冠状病毒重组蛋白疫苗、DNA疫苗和mRNA疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

重组蛋白疫苗是将病原体最有效的抗原表位基因进行体外重组，构建在表达载体上，转化入细菌、酵母、哺乳动物细胞或昆虫细胞中，在一定的诱导条件下表达出大量的抗原蛋白，纯化后制备得到的疫苗。

DNA疫苗又称为核酸疫苗或基因疫苗，是将抗原基因重组到真核表达载体后，直接或经包装注入体内表达出相应抗原的疫苗，外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，诱导特异性免疫应答。DNA疫苗被认为是继灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗之后的“第三代疫苗”。传统的疫苗如灭活疫苗和弱毒疫苗具有生产周期长、成本高等缺点，DNA疫苗的出现使得这一状况得到显著改善，该疫苗既具有减毒疫苗的优点，又无逆转的危险，还具有制备简单、成本低、不易被核酸酶降解、易于保存运输等优点。编码病毒、细菌和寄生虫等不同种类抗原基因的质粒DNA，目前已经应用于脊椎动物如哺乳类、鸟类和鱼类等多个物种，能够引起强烈而持久的免疫反应。

mRNA翻译快速，起效快，本身具有激活免疫反应的作用；同时，mRNA药物生产简单、易于改造、合成快速、成本较低；更重要的是，mRNA药物不局限于分裂细胞，没有整合到宿主基因组中的风险，且会在体内自动降解。所以，mRNA疫苗的开发具有很大的优势。

目前已开发的SARS等病毒的疫苗选择的是病毒的S蛋白或N蛋白作为抗原，对其进行的改造包括在S蛋白或N蛋白上添加外源病毒RNA输出元件(如Mazon-Pfizer猴病毒的CTE或土拨鼠肝炎病毒(WPRE)的PRE)和IgG Fc结构域。然而针对新型冠状病毒的疫苗还未见报道。

防控新型冠状病毒引起的肺炎疫情是当前最重要的工作，目前对于新型冠状病毒引起的肺炎仍没有特异的治疗方法。预防性疫苗是遏制重大突发性传染疾病大规模流行的重要手段，因此迫切需要开发新型冠状病毒疫苗，以遏制疫情蔓延。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用，选择含有新型冠状病毒的S蛋白受体结合域(receptor-binding domain，RBD)中与ACE2结合的关键结合位点的肽段作为抗原并对其进行改造，将编码基因重组在表达载体上，构建重组蛋白疫苗、DNA疫苗和mRNA疫苗，直接或经佐剂包装后诱导机体产生免疫应答。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括：新型冠状病毒的S蛋白受体结合域中与ACE2结合的肽段、人源IgG Fc结构域和分别连接所述肽段的羧基端和所述人源IgG Fc结构域的氨基端的连接肽。

本发明中，选择含有S蛋白受体结合域(receptor-binding domain，RBD)中与ACE2结合的关键结合位点的肽段作为抗原，原因在于新型冠状病毒通过其包膜上的S蛋白进入人体细胞，S蛋白的RBD负责与人体细胞表面的ACE2受体进行特异性识别结合；S蛋白的3D结构表明，RBD会上下移动，当向上移动时，S蛋白能够通过RBD与细胞表面的ACE2受体结合，当向下移动时，S蛋白中与ACE2受体结合的部位便隐藏起来，说明S蛋白的构象影响其与ACE2的结合能力，更重要的是RBD中的一段多肽直接与ACE2结合，称之为关键结合位点；因此，本发明选择S蛋白RBD中与ACE2结合的关键结合位点或含有S蛋白RBD中与ACE2结合的关键结合位点的肽段作为抗原分子。

本发明中，以含有S蛋白RBD中与ACE2结合的关键结合位点的肽段作为抗原，与人源IgG Fc结构域进行融合表达，增强了肽段的免疫原性，构建的融合蛋白有利于制备预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物。

优选地，所述新型冠状病毒的S蛋白受体结合域中与ACE2结合的肽段包括如SEQID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

LCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPAT。

本发明中，如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列即为S蛋白RBD中与ACE2结合的关键结合位点。

优选地，所述人源IgG Fc结构域包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；SEQ IDNO:2：

ESKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

优选地，所述连接肽包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:3：

GGGGSGGGGSGGGGS。

优选地，所述融合蛋白包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:4：

LCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATGTGGGGSGGGGSGGGGSESKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

优选地，所述融合蛋白还包括信号肽。

优选地，所述信号肽包括IgG信号肽。

本发明中，通过在融合蛋白的N端添加IgG信号肽，增强了融合蛋白的分泌能力，提高了融合蛋白的表达量。

优选地，所述IgG信号肽包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:5：

EFGLSWLFLVAALRGVQS。

优选地，所述融合蛋白包括如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:6：

MEFGLSWLFLVAALRGVQSLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATGTGGGGSGGGGSGGGGSESKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的融合蛋白的编码基因，所述编码基因包括：新型冠状病毒的S蛋白受体结合域中与ACE2结合的肽段的核酸序列、Kozak序列、IgG信号肽的核酸序列和人源IgG Fc结构域的核酸序列；

所述Kozak序列和IgG信号肽的核酸序列位于所述肽段的核酸序列的5’端；

所述人源IgG Fc结构域的核酸序列位于所述肽段的核酸序列的3’端。

本发明中，对包含S蛋白受体结合域RBD中与ACE2结合的关键结合位点的片段进行改造，所述改造包括在5’端添加Kozak序列以提高蛋白的表达能力，同时添加IgG信号肽序列以增强蛋白的分泌能力，在3’端添加人源IgG Fc结构域序列以增强蛋白的免疫原性，构成蛋白的编码基因。

优选地，所述新型冠状病毒的S蛋白受体结合域中与ACE2结合的肽段的核酸序列包括如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示的核酸序列；

SEQ ID NO:7：

ctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaact。

根据本发明，RBD的基因序列为S刺突蛋白(Spike protein)的CDS编码序列的第991～1572位碱基，本发明选择来自于Spike protein的CDS编码序列的第1168～1569位碱基，作为包含RBD中与ACE2结合的关键结合位点的肽段的基因序列；

SEQ ID NO:8：

ctgtgcttcaccaacgtgtatgccgacagctttgtgatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgcaccaggacagaccggcaagatcgcagactacaactataagctgcctgacgatttcacaggctgcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggattccaaagtgggcggcaactacaattatctgtaccggctgttcagaaagtccaacctgaagccatttgagcgggacatctctaccgagatctaccaggcaggaagcacaccatgcaacggagtggagggcttcaattgttattttcccctgcagtcctacggcttccagcctaccaatggcgtgggctatcagccatacagggtggtggtgctgtcttttgagctgctgcacgcccctgccaca。

本发明中，利用金斯瑞OptimumGene密码子优化及基因设计技术对如SEQ ID NO:7所示的核酸序列进行密码子优化和mRNA结构优化，得到的SEQ ID NO:8有利于构建mRNA疫苗。

根据本发明，所述含有RBD中与ACE2结合的关键结合位点的核酸序列与人源IgGFc结构域的核酸序列之间还包括酶切位点和G4S，其中，预留酶切位点KpnI是为了方便后续对载体进行改造，采用G4S作为连接肽连接S蛋白受体结合域和人源IgG Fc，有助于避免两个独立的蛋白功能域在折叠时发生相互影响。

优选地，所述编码基因包括如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所述的核酸序列；

SEQ ID NO:9：

gccaccatggagtttgggctgagctggctttttcttgttgctgcattaagaggtgtccagtccctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactggtaccggtggtggtggtagcggcggcggcggcagtggtggcggtggctctgagtccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga；

本发明中，在如SEQ ID NO:7所示的核酸序列的5’端添加Kozak序列和IgG信号肽序列，在3’端添加人源IgG Fc结构域序列，构建得到如SEQ ID NO:9所示的编码基因；

SEQ ID NO:10：

gccaccatggagtttgggctgagctggctttttcttgttgctgcattaagaggtgtccagtccctgtgcttcaccaacgtgtatgccgacagctttgtgatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgcaccaggacagaccggcaagatcgcagactacaactataagctgcctgacgatttcacaggctgcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggattccaaagtgggcggcaactacaattatctgtaccggctgttcagaaagtccaacctgaagccatttgagcgggacatctctaccgagatctaccaggcaggaagcacaccatgcaacggagtggagggcttcaattgttattttcccctgcagtcctacggcttccagcctaccaatggcgtgggctatcagccatacagggtggtggtgctgtcttttgagctgctgcacgcccctgccacaggtaccggtggtggtggtagcggcggcggcggcagtggtggcggtggctctgagtccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga。

本发明中，在如SEQ ID NO:8所示的优化的核酸序列的5’端添加Kozak序列和IgG分泌信号肽序列，在3’端添加人源IgG Fc结构域序列，构建得到如SEQ ID NO:10所示的优化的编码基因。

第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包括如第二方面所述的编码基因。

优选地，所述编码基因插于质粒的NheI和XhoI位点之间。

优选地，所述重组载体的启动子包括CMV启动子和/或T7启动子。

本发明中，CMV启动子作为真核转录启动子，T7启动子用于体外转录mRNA。

第四方面，本发明提供了一种DNA疫苗，所述DNA疫苗包括如第二方面所述的编码基因和/或如第三方面所述的重组载体。

第五方面，本发明提供了一种蛋白质疫苗，所述蛋白质疫苗包括如第一方面所述的融合蛋白、如第二方面所述的编码基因编码的融合蛋白、或如第三方面所述的重组载体表达的融合蛋白。

优选地，所述蛋白质疫苗还包括佐剂，所述佐剂包括氢氧化铝、磷酸铝或弗氏完全佐剂中的任意一种或至少两种的组合。

第六方面，本发明提供了一种如第五方面所述的蛋白质疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将如第二方面所述的编码基因插入质粒的NheI和XhoI位点之间，构建如第三方面所述的重组载体；

(2)将步骤(1)所述重组载体转染入HEK293T细胞；培养后的细胞进行裂解，得到裂解液；

(3)从步骤(2)所述的裂解液中提取和纯化蛋白质，加入佐剂，得到所述蛋白质疫苗。

第七方面，本发明提供了一种mRNA疫苗，所述mRNA疫苗包括5’端添加有帽子结构(m⁷Gppp(5′))、3’端添加有多聚腺苷酸尾的如第二方面所述的编码基因。

优选地，所述mRNA疫苗包括如SEQ ID NO:11所示的核酸序列；

SEQ ID NO:11：

gccaccauggaguuugggcugagcuggcuuuuucuuguugcugcauuaagagguguccagucccugugcuucaccaacguguaugccgacagcuuugugaucaggggcgaugaggugcgccagaucgcaccaggacagaccggcaagaucgcagacuacaacuauaagcugccugacgauuucacaggcugcgugaucgccuggaauagcaacaaucuggauuccaaagugggcggcaacuacaauuaucuguaccggcuguucagaaaguccaaccugaagccauuugagcgggacaucucuaccgagaucuaccaggcaggaagcacaccaugcaacggaguggagggcuucaauuguuauuuuccccugcaguccuacggcuuccagccuaccaauggcgugggcuaucagccauacagggugguggugcugucuuuugagcugcugcacgccccugccacagguaccggugguggugguagcggcggcggcggcagugguggcgguggcucugaguccaaaucuugugacaaaacucacacaugcccaccgugcccagcaccugaacuccuggggggaccgucagucuuccucuuccccccaaaacccaaggacacccucaugaucucccggaccccugaggucacaugcguggugguggacgugagccacgaagacccugaggucaaguucaacugguacguggacggcguggaggugcauaaugccaagacaaagccgcgggaggagcaguacaacagcacguaccguguggucagcguccucaccguccugcaccaggacuggcugaauggcaaggaguacaagugcaaggucuccaacaaagcccucccagcccccaucgagaaaaccaucuccaaagccaaagggcagccccgagagccacagguguacacccugcccccaucccgggaugagcugaccaagaaccaggucagccugaccugccuggucaaaggcuucuaucccagcgacaucgccguggagugggagagcaaugggcagccggagaacaacuacaagaccacgccucccgugcuggacuccgacggcuccuucuuccucuacagcaagcucaccguggacaagagcagguggcagcaggggaacgucuucucaugcuccgugaugcaugaggcucugcacaaccacuacacgcagaagagccucucccugucuccggguaaaugacucgagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa。

优选地，所述mRNA疫苗还包括转染试剂，所述转染试剂包括聚乙烯亚胺(PEI)、TransEasy或Lipofectamine 3000。

第八方面，本发明提供了一种如第七方面所述的mRNA疫苗的制备方法，所述方法包括以下步骤：

以如第三方面所述的重组载体为模板，使用如SEQ ID NO:12～13所示的引物对进行PCR；

将PCR产物采用T7启动子进行体外转录和加帽修饰后，加入佐剂(如转染试剂)，得到所述mRNA疫苗；

SEQ ID NO:12：taatacgactcactatagggagacccaagctg；

SEQ ID NO:13：

ttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttctcgagtcatttacccggagacaggg。

第九方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的融合蛋白、如第二方面所述的编码基因、如第三方面所述的重组载体、如第四方面所述的DNA疫苗、如第五方面所述的蛋白质疫苗或如第七方面所述的mRNA疫苗中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第十方面，本发明提供了一种如第一方面所述的融合蛋白、如第二方面所述的编码基因、如第三方面所述的重组载体、如第四方面所述的DNA疫苗、如第五方面所述的蛋白质疫苗、如第七方面所述的mRNA疫苗或如第九方面所述的药物组合物在制备COVID-19预防药物和/或治疗药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用来自于S蛋白(Spike protein)的CDS编码序列的第1168～1569位碱基作为包含RBD中与ACE2结合的关键结合位点的片段的基因序列，并进行改造，通过在5’端添加Kozak序列以提高蛋白的表达能力，同时添加IgG信号肽序列以增强蛋白的分泌能力，在3’端添加人源IgG Fc结构域序列以增强蛋白的免疫原性，构建得到融合蛋白的编码基因；

(2)本发明对包含RBD中与ACE2结合的关键结合位点的片段的基因序列进行密码子优化和mRNA结构优化，构建得到优化的融合蛋白的编码基因；

(3)本发明将融合蛋白的编码基因重组到表达载体中，制备DNA疫苗，所述表达载体经蛋白表达或体外转录后，制备蛋白质疫苗或mRNA疫苗；

(4)本发明的DNA疫苗、蛋白质疫苗和mRNA疫苗直接或经佐剂包装后注入体内表达出相应抗原，诱导机体产生免疫应答，免疫原性强、副作用小、制备方法简单；

(5)本发明制备的疫苗在COVID-19预防和治疗领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为重组载体pcDNA3.1-minRBD-Fc的简略示意图；

图2为mini-RBD-Fc的SDS-PAGE结果图；

图3(A)为小鼠注射DNA疫苗得到的免疫结果，图3(B)为小鼠注射mRNA疫苗得到的免疫结果，图3(C)为小鼠注射蛋白疫苗(Protein Vaccine)得到的免疫结果；

图4(A)为病毒中和实验细胞感染结果，其中，1、2、3列为对照组，4、5、6列为注射DNA疫苗实验组，A～G排为免疫血清稀释梯度，图4(B)为病毒中和实验病毒中和率曲线图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1融合蛋白的编码基因的设计与合成

选择来自于Spike protein的CDS编码序列的第1168～1569位碱基作为包含RBD中与ACE2结合的关键结合位点的片段的基因序列(SEQ ID NO:7)，进行改造：在5’端添加Kozak序列以提高蛋白的表达能力，同时添加IgG分泌信号肽序列(IgG Leader)以增强蛋白的分泌能力，在3’端添加人源IgG Fc结构域序列(Fc(Homo))以增强蛋白的免疫原性，在S蛋白受体结合域序列和人源IgG Fc结构域序列之间设置G4S，构成如SEQ ID NO:9所示的抗原的编码基因；

或以SEQ ID NO:7为优化对象，按照密码子偏好性，选择使用频率最高的密码子，使用金斯瑞OptimumGene密码子优化及基因设计技术(https://www.genscript.com.cn/codon_opt_pr.html)进一步优化编码序列，优化5’UTR的二级结构，得到优化的包含RBD中与ACE2结合的关键结合位点的片段的基因序列(SEQ ID NO:8)，构成如SEQ ID NO:10所示的融合蛋白的编码基因；

编码基因的结构为IgG Leader-S(mini-RBD)-KpnI-G4S-Fc(Homo)，进行全基因人工合成。

实施例2重组载体的构建

在如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的编码基因的5’端添加Nhe I酶切位点、3’端添加Xho I酶切位点，使用限制性内切酶Nhe I和Xho I消化编码基因，用OMEGA E.Z.N.A

GelExtraction Kit纯化回收；

同样使用限制性内切酶Nhe I和Xho I消化质粒pcDNA3.1(+)，琼脂糖凝胶电泳后，用OMEGA E.Z.N.A

Gel Extraction Kit回收线性载体，作为骨架；采用T4 DNA连接酶将经过回收的线性载体和编码基因连接，获得重组载体pcDNA3.1-mini-RBD-Fc，重组载体的简略示意图如图1所示。

实施例3 DNA疫苗的制备和动物免疫

将100μg重组载体pcDNA3.1-mini-RBD-Fc用生理盐水稀释至终浓度为1μg/μL，作为DNA疫苗注入小鼠体内进行免疫实验：

将四周龄雄性BALB/c小鼠称重后随机分为2组(一组为注射质粒的实验组，一组为注射生理盐水的对照组)，每组4只，采用腹腔注射的方式对小鼠进行麻醉，注射剂量为1％戊巴比妥钠50μL/10g小鼠，待小鼠麻醉5-10min后，于每只小鼠的后腿胫骨前肌注射100μL重组载体pcDNA3.1-mini-RBD-Fc溶液进行免疫，首次注射后间隔1周再次以相同的条件进行注射。

实施例4蛋白质疫苗的制备和动物免疫

使用PEI(Polyethyenimine)将重组载体pcDNA3.1-mini-RBD-Fc转染至HEK293T细胞，在37℃、CO₂培养箱中培养5h，更换培养基后继续培养72h；

使用细胞刮刀刮下HEK293T，于4℃下700g离心5min；加入500μL细胞裂解缓冲液，置于漩涡仪上涡旋裂解，于4℃下12000g离心15min，收集上清；加入20μL经细胞裂解缓冲液平衡后的protein G磁珠，4℃垂直混匀过夜孵育；

使用1mL细胞裂解缓冲液洗涤protein G磁珠，加入100μL 50mM甘氨酸溶液(pH＝2.8)重悬磁珠，洗脱重组抗原蛋白，收集上清，加入100μL 1M Tris-HCl溶液(pH＝7.4)；

采用10KDa超滤管进行浓缩，浓缩后的融合蛋白mini-RBD-Fc(SEQ ID NO:6)于-20℃保存；

图2为制备得到的mini-RBD-Fc的SDS-PAGE结果，可以看出，mini-RBD-Fc分子量约43KD，纯度大于95％；

取4μg融合蛋白mini-RBD-Fc和氢氧化铝佐剂按比例混合后，注射入麻醉小鼠的股四头肌，首次注射后间隔1周再次以相同的条件进行注射，小鼠的分组和麻醉操作同实施例3。

实施例5 mRNA疫苗的制备和动物免疫

以重组载体pcDNA3.1-mini-RBD-Fc为模板，使用正向引物mini-RBD-Fc FP(SEQID NO:12)和反向引物mini-RBD-Fc RP(SEQ ID NO:13)进行PCR扩增，将扩增产物采用T7启动子体外转录为mini-RBD-Fc RNA；

对mini-RBD-Fc RNA进行加帽修饰以保护RNA，20μL反应体系包括：20μg mini-RBD-Fc RNA、10×加帽缓冲液(Capping Buffer)2μL、10mM GTP 1μL、2mM SAM 1μL、Vaccinia virus Capping Enzyme(加帽酶)1μL和无RNase H₂O 15μL；37℃孵育30分钟，最后用TRIzol试剂抽提纯化RNA，获得mini-RBD-Fc mRNA(SEQ ID NO:11)；

取5μg mini-RBD-Fc mRNA和PEI按比例混合后，注射入麻醉小鼠的胫骨前肌，首次注射后间隔1周再次以相同的条件进行注射，小鼠的分组和麻醉操作同实施例3。

实施例6 DNA疫苗、蛋白质疫苗和mRNA疫苗的抗原性

本实施例采用ELISA法验证实施例3～5构建的DNA疫苗、蛋白质疫苗和mRNA疫苗在小鼠体内诱导抗体的能力。

以mini-RBD-F包被酶标板，采用ELISA法检测不同实验组接种小鼠血清中的抗体，并以生理盐水和无血清作为对照组，使用酶标仪于450nm处读取OD值；

具体步骤如下：用100mM NaHCO₃溶液稀释抗原蛋白mini-RBD-Fc至终浓度为2ng/μL，以100μL/孔加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜；加入100μL PBST缓冲液(含0.2％Tween-20)洗涤酶标板后，加入PBST缓冲液(含0.2％Tween-20)配制的5％脱脂奶粉溶液作为封闭液，200μL/孔，室温封闭1h；去除封闭液，用封闭液10倍和40倍稀释免疫血清，以100μL/孔加入酶标板中，37℃震荡孵育1h；去除血清，加入PBST缓冲液(含0.2％Tween-20)洗涤酶标板；用封闭液稀释辣根过氧化物酶酶标二抗，稀释比例为1:10000，以100μL/孔加入酶标板中，37℃孵育1h；去除二抗，加入PBST缓冲液(含0.2％Tween-20)洗涤酶标板；加入TMB溶液显色，100μL/孔，室温振荡孵育15～30min，加入2M硫酸溶液终止显色反应，100μL/孔；使用酶标仪于450nm处读取酶标板OD值。

图3(A)、图3(B)和图3(C)分别为小鼠注射DNA疫苗(DNA Vaccine)、mRNA(mRNAVaccine)和蛋白疫苗(Protein Vaccine)得到的免疫结果，1～4是实验组的4只小鼠血清，NC是注射生理盐水的对照组血清，-S是无血清对照孔，可以看出，注射DNA疫苗的实验组小鼠免疫血清稀释50倍和400倍时；注射mRNA疫苗的实验小鼠免疫血清稀释10倍时；注射蛋白疫苗的实验小鼠免疫血清稀释10倍和40倍时；DNA疫苗、蛋白疫苗和mRNA疫苗均可检测到mini-RBD-Fc的抗体，而对照和无血清组没有产生抗体。

实施例7 DNA疫苗、蛋白质疫苗和mRNA疫苗的预防性保护作用

本实施例通过病毒中和实验检测疫苗对宿主的预防性保护作用。

具体步骤如下：采用固定病毒稀释血清法检测血清的抗体效价，滴定病毒毒价，将其稀释成每一单位剂量含100个TCID₅₀，再将待检血清倍比稀释；加入等量100个TCID₅₀/mL的病毒液，混匀后37℃孵育1h，每一稀释度接种24孔Vero单层细胞培养板4孔，每孔0.2mL；5％CO₂培养箱培养48h后，记录出现病毒细胞病变效应(CPE)的孔数，以不出现CPE数和接种数的比值为中和比值；按Reed Muench公式计算中和价。

结果如图4(A)和图4(B)显示，加入血清的实验组(4，5，6)中的病毒感染的细胞数量比对照组(注射生理盐水的小鼠血清，1，2，3)中病毒感染的细胞数量少；不同浓度梯度稀释的实验组(分别稀释了10倍，40倍，160倍，640倍，2560倍，10240倍，40960倍)中的病毒感染的细胞数量比对照组(注射生理盐水的小鼠血清)中病毒感染的细胞数量少。说明血清中的抗体可以中和病毒感染细胞。

实施例8融合的编码基因的设计与合成

选择来自于S蛋白(Spike protein，刺突蛋白)的CDS编码序列的第988～1575位碱基作为包含RBD中与ACE2结合的关键结合位点的片段的基因序列，进行改造：在5’端添加Kozak序列以提高蛋白的表达能力，同时添加IgG分泌信号肽序列(IgG Leader)以增强蛋白的分泌能力，在3’端添加人源IgG Fc结构域序列(Fc(Homo))以增强蛋白的免疫原性，在S蛋白受体结合域序列和人源IgG Fc结构域序列之间设置G4S，得到如SEQ ID NO:14所示的编码基因；

cctaatattacaaacttgtgcccttttggtgaagtttttaacgccaccagatttgcatctgtttatgcttggaacaggaagagaatcagcaactgtgttgctgattattctgtcctatataattccgcatcattttccacttttaagtgttatggagtgtctcctactaaattaaatgatctctgctttactaatgtctatgcagattcatttgtaattagaggtgatgaagtcagacaaatcgctccagggcaaactggaaagattgctgattataattataaattaccagatgattttacaggctgcgttatagcttggaattctaacaatcttgattctaaggttggtggtaattataattacctgtatagattgtttaggaagtctaatctcaaaccttttgagagagatatttcaactgaaatctatcaggccggtagcacaccttgtaatggtgttgaaggttttaattgttactttcctttacaatcatatggtttccaacccactaatggtgttggttaccaaccatacagagtagtagtactttcttttgaacttctacatgcaccagcaactgtttgt；

采用与实施例1相同的方法对SEQ ID NO:14进行密码子优化和mRNA结构优化,重新设计编码序列，得到如SEQ ID NO:15所示的编码基因；

cccaatatcacaaacctgtgcccttttggcgaggtgttcaatgcaaccaggttcgcctccgtgtacgcatggaataggaagcgcatcagcaactgcgtggccgattattccgtgctgtacaacagcgcctccttctctacctttaagtgctatggcgtgtctcccacaaagctgaatgacctgtgctttaccaacgtgtacgccgatagcttcgtgatcaggggcgacgaggtgcgccagatcgcacctggacagacaggcaagatcgccgattacaactataagctgccagacgatttcaccggctgcgtgatcgcctggaattctaacaatctggacagcaaagtgggcggcaactacaattatctgtaccggctgtttagaaagagcaacctgaagcccttcgagagggacatctccacagaaatctaccaggccggctctaccccttgcaatggcgtggagggctttaactgttatttccctctgcagtcctacggctttcagccaaccaatggcgtgggctatcagccctaccgcgtggtggtgctgtccttcgagctgctgcacgcacctgcaacagtgtgc；

编码基因进行全基因人工合成后，构建重组载体，进行蛋白表达和体外转录mRNA，制备DNA疫苗、蛋白质疫苗和mRNA疫苗，注射小鼠进行免疫检测，具体操作步骤同实施例2-6。

综上所述，本发明采用来自于Spike protein的CDS编码序列的第1168～1569位碱基作为包含RBD中与ACE2结合的关键结合位点的片段的基因序列，并进行改造，提高了蛋白的表达能力和分泌能力，增强了蛋白的免疫原性，制备的DNA疫苗、蛋白质疫苗和mRNA疫苗能够诱导机体产生免疫应答，免疫原性强、副作用小、制备方法简单，在COVID-19预防和治疗领域具有广阔的应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学；中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用

<130> 20200225

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工

<400> 1

Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr

20 25 30

Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn

35 40 45

Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr

50 55 60

Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser

65 70 75 80

Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly

85 90 95

Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn

100 105 110

Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu

115 120 125

Leu His Ala Pro Ala Thr

130

<210> 2

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工

<400> 2

Glu Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 4

<211> 383

<212> PRT

<213> 人工

<400> 4

Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp

1 5 10 15

Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr

20 25 30

Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn

35 40 45

Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr

50 55 60

Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser

65 70 75 80

Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly

85 90 95

Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn

100 105 110

Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu

115 120 125

Leu His Ala Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

145 150 155 160

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

165 170 175

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

180 185 190

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

195 200 205

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

210 215 220

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

225 230 235 240

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

245 250 255

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

260 265 270

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

275 280 285

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

290 295 300

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

305 310 315 320

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

325 330 335

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

340 345 350

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

355 360 365

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工

<400> 5

Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ala Leu Arg Gly Val

1 5 10 15

Gln Ser

<210> 6

<211> 402

<212> PRT

<213> 人工

<400> 6

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ala Leu Arg Gly

1 5 10 15

Val Gln Ser Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile

20 25 30

Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile

35 40 45

Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile

50 55 60

Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg

85 90 95

Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly

100 105 110

Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln

115 120 125

Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser

130 135 140

Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ser Lys Ser Cys Asp

165 170 175

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

180 185 190

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

195 200 205

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

210 215 220

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

225 230 235 240

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

245 250 255

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

260 265 270

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

275 280 285

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

290 295 300

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

305 310 315 320

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

325 330 335

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

340 345 350

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

355 360 365

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

370 375 380

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

385 390 395 400

Gly Lys

<210> 7

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工

<400> 7

ctctgcttta ctaatgtcta tgcagattca tttgtaatta gaggtgatga agtcagacaa 60

atcgctccag ggcaaactgg aaagattgct gattataatt ataaattacc agatgatttt 120

acaggctgcg ttatagcttg gaattctaac aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat 180

aattacctgt atagattgtt taggaagtct aatctcaaac cttttgagag agatatttca 240

actgaaatct atcaggccgg tagcacacct tgtaatggtg ttgaaggttt taattgttac 300

tttcctttac aatcatatgg tttccaaccc actaatggtg ttggttacca accatacaga 360

gtagtagtac tttcttttga acttctacat gcaccagcaa ct 402

<210> 8

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工

<400> 8

ctgtgcttca ccaacgtgta tgccgacagc tttgtgatca ggggcgatga ggtgcgccag 60

atcgcaccag gacagaccgg caagatcgca gactacaact ataagctgcc tgacgatttc 120

acaggctgcg tgatcgcctg gaatagcaac aatctggatt ccaaagtggg cggcaactac 180

aattatctgt accggctgtt cagaaagtcc aacctgaagc catttgagcg ggacatctct 240

accgagatct accaggcagg aagcacacca tgcaacggag tggagggctt caattgttat 300

tttcccctgc agtcctacgg cttccagcct accaatggcg tgggctatca gccatacagg 360

gtggtggtgc tgtcttttga gctgctgcac gcccctgcca ca 402

<210> 9

<211> 1215

<212> DNA

<213> 人工

<400> 9

gccaccatgg agtttgggct gagctggctt tttcttgttg ctgcattaag aggtgtccag 60

tccctctgct ttactaatgt ctatgcagat tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga 120

caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt gctgattata attataaatt accagatgat 180

tttacaggct gcgttatagc ttggaattct aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat 240

tataattacc tgtatagatt gtttaggaag tctaatctca aaccttttga gagagatatt 300

tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca ccttgtaatg gtgttgaagg ttttaattgt 360

tactttcctt tacaatcata tggtttccaa cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac 420

agagtagtag tactttcttt tgaacttcta catgcaccag caactggtac cggtggtggt 480

ggtagcggcg gcggcggcag tggtggcggt ggctctgagt ccaaatcttg tgacaaaact 540

cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 600

cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 660

gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 720

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 780

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 840

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 900

cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 960

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1020

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1080

ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1140

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1200

tctccgggta aatga 1215

<210> 10

<211> 1215

<212> DNA

<213> 人工

<400> 10

gccaccatgg agtttgggct gagctggctt tttcttgttg ctgcattaag aggtgtccag 60

tccctgtgct tcaccaacgt gtatgccgac agctttgtga tcaggggcga tgaggtgcgc 120

cagatcgcac caggacagac cggcaagatc gcagactaca actataagct gcctgacgat 180

ttcacaggct gcgtgatcgc ctggaatagc aacaatctgg attccaaagt gggcggcaac 240

tacaattatc tgtaccggct gttcagaaag tccaacctga agccatttga gcgggacatc 300

tctaccgaga tctaccaggc aggaagcaca ccatgcaacg gagtggaggg cttcaattgt 360

tattttcccc tgcagtccta cggcttccag cctaccaatg gcgtgggcta tcagccatac 420

agggtggtgg tgctgtcttt tgagctgctg cacgcccctg ccacaggtac cggtggtggt 480

ggtagcggcg gcggcggcag tggtggcggt ggctctgagt ccaaatcttg tgacaaaact 540

cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 600

cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 660

gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 720

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 780

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 840

tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 900

cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 960

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1020

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1080

ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1140

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1200

tctccgggta aatga 1215

<210> 11

<211> 1271

<212> RNA

<213> 人工

<400> 11

gccaccaugg aguuugggcu gagcuggcuu uuucuuguug cugcauuaag agguguccag 60

ucccugugcu ucaccaacgu guaugccgac agcuuuguga ucaggggcga ugaggugcgc 120

cagaucgcac caggacagac cggcaagauc gcagacuaca acuauaagcu gccugacgau 180

uucacaggcu gcgugaucgc cuggaauagc aacaaucugg auuccaaagu gggcggcaac 240

uacaauuauc uguaccggcu guucagaaag uccaaccuga agccauuuga gcgggacauc 300

ucuaccgaga ucuaccaggc aggaagcaca ccaugcaacg gaguggaggg cuucaauugu 360

uauuuucccc ugcaguccua cggcuuccag ccuaccaaug gcgugggcua ucagccauac 420

aggguggugg ugcugucuuu ugagcugcug cacgccccug ccacagguac cggugguggu 480

gguagcggcg gcggcggcag ugguggcggu ggcucugagu ccaaaucuug ugacaaaacu 540

cacacaugcc caccgugccc agcaccugaa cuccuggggg gaccgucagu cuuccucuuc 600

cccccaaaac ccaaggacac ccucaugauc ucccggaccc cugaggucac augcguggug 660

guggacguga gccacgaaga cccugagguc aaguucaacu gguacgugga cggcguggag 720

gugcauaaug ccaagacaaa gccgcgggag gagcaguaca acagcacgua ccgugugguc 780

agcguccuca ccguccugca ccaggacugg cugaauggca aggaguacaa gugcaagguc 840

uccaacaaag cccucccagc ccccaucgag aaaaccaucu ccaaagccaa agggcagccc 900

cgagagccac agguguacac ccugccccca ucccgggaug agcugaccaa gaaccagguc 960

agccugaccu gccuggucaa aggcuucuau cccagcgaca ucgccgugga gugggagagc 1020

aaugggcagc cggagaacaa cuacaagacc acgccucccg ugcuggacuc cgacggcucc 1080

uucuuccucu acagcaagcu caccguggac aagagcaggu ggcagcaggg gaacgucuuc 1140

ucaugcuccg ugaugcauga ggcucugcac aaccacuaca cgcagaagag ccucucccug 1200

ucuccgggua aaugacucga gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1260

aaaaaaaaaa a 1271

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工

<400> 12

taatacgact cactataggg agacccaagc tg 32

<210> 13

<211> 76

<212> DNA

<213> 人工

<400> 13

tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ctcgagtcat 60

ttacccggag acaggg 76

<210> 14

<211> 588

<212> DNA

<213> 人工

<400> 14

cctaatatta caaacttgtg cccttttggt gaagttttta acgccaccag atttgcatct 60

gtttatgctt ggaacaggaa gagaatcagc aactgtgttg ctgattattc tgtcctatat 120

aattccgcat cattttccac ttttaagtgt tatggagtgt ctcctactaa attaaatgat 180

ctctgcttta ctaatgtcta tgcagattca tttgtaatta gaggtgatga agtcagacaa 240

atcgctccag ggcaaactgg aaagattgct gattataatt ataaattacc agatgatttt 300

acaggctgcg ttatagcttg gaattctaac aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat 360

aattacctgt atagattgtt taggaagtct aatctcaaac cttttgagag agatatttca 420

actgaaatct atcaggccgg tagcacacct tgtaatggtg ttgaaggttt taattgttac 480

tttcctttac aatcatatgg tttccaaccc actaatggtg ttggttacca accatacaga 540

gtagtagtac tttcttttga acttctacat gcaccagcaa ctgtttgt 588

<210> 15

<211> 588

<212> DNA

<213> 人工

<400> 15

cccaatatca caaacctgtg cccttttggc gaggtgttca atgcaaccag gttcgcctcc 60

gtgtacgcat ggaataggaa gcgcatcagc aactgcgtgg ccgattattc cgtgctgtac 120

aacagcgcct ccttctctac ctttaagtgc tatggcgtgt ctcccacaaa gctgaatgac 180

ctgtgcttta ccaacgtgta cgccgatagc ttcgtgatca ggggcgacga ggtgcgccag 240

atcgcacctg gacagacagg caagatcgcc gattacaact ataagctgcc agacgatttc 300

accggctgcg tgatcgcctg gaattctaac aatctggaca gcaaagtggg cggcaactac 360

aattatctgt accggctgtt tagaaagagc aacctgaagc ccttcgagag ggacatctcc 420

acagaaatct accaggccgg ctctacccct tgcaatggcg tggagggctt taactgttat 480

ttccctctgc agtcctacgg ctttcagcca accaatggcg tgggctatca gccctaccgc 540

gtggtggtgc tgtccttcga gctgctgcac gcacctgcaa cagtgtgc 588

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括：新型冠状病毒的S蛋白受体结合域中与ACE2结合的肽段、人源IgG Fc结构域和分别连接所述肽段的羧基端和所述人源IgG Fc结构域的氨基端的连接肽。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述新型冠状病毒的S蛋白受体结合域中与ACE2结合的肽段包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

优选地，所述人源IgG Fc结构域包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

优选地，所述连接肽包括如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

优选地，所述融合蛋白包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

优选地，所述融合蛋白还包括信号肽；

优选地，所述信号肽包括IgG信号肽；

优选地，所述IgG信号肽包括如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

优选地，所述融合蛋白包括如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

3.一种如权利要求1或2所述的融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括：新型冠状病毒的S蛋白受体结合域中与ACE2结合的肽段的核酸序列、Kozak序列、IgG信号肽的核酸序列和人源IgG Fc结构域的核酸序列；

所述人源IgG Fc结构域的核酸序列位于所述肽段的核酸序列的3’端；

优选地，所述编码基因包括如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所述的核酸序列。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括如权利要求3所述的编码基因；

优选地，所述编码基因插于质粒的NheI和XhoI位点之间；

5.一种DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗包括如权利要求3所述的编码基因和/或如权利要求4所述的重组载体。

6.一种蛋白质疫苗，其特征在于，所述蛋白质疫苗包括如权利要求1或2所述的融合蛋白、如权利要求3所述的编码基因编码的融合蛋白、或如权利要求4所述的重组载体表达的融合蛋白；

7.一种如权利要求6所述的蛋白质疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将如权利要求3所述的编码基因插入质粒的NheI和XhoI位点之间，构建如权利要求4所述的重组载体；

8.一种mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗包括5’端添加有帽子结构、3’端添加有多聚腺苷酸尾的如权利要求3所述的编码基因；

优选地，所述mRNA疫苗包括如SEQ ID NO:11所示的核酸序列；

优选地，所述mRNA疫苗还包括转染试剂。

9.一种如权利要求8所述的mRNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

以如权利要求4所述的重组载体为模板，使用如SEQ ID NO:12～13所示的引物对进行PCR；

将PCR产物采用T7启动子进行体外转录和加帽修饰后，加入转染试剂，得到所述mRNA疫苗。

10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1或2所述的融合蛋白、如权利要求3所述的编码基因、如权利要求4所述的重组载体、如权利要求5所述的DNA疫苗、如权利要求6所述的蛋白质疫苗或如权利要求8所述的mRNA疫苗中的任意一种或至少两种的组合；

11.一种如权利要求1或2所述的融合蛋白、如权利要求3所述的编码基因、如权利要求4所述的重组载体、如权利要求5所述的DNA疫苗、如权利要求6所述的蛋白质疫苗、如权利要求8所述的mRNA疫苗或如权利要求10所述的药物组合物在制备COVID-19预防药物和/或治疗药物中的应用。