CN113336857B - 一种新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法，其中，方法包括步骤：将RBD序列和IFN序列连接至Fc序列的两端，得到融合蛋白基因RBD‑Fc‑IFN；将所述融合蛋白基因RBD‑Fc‑IFN接入pCMV‑MCS‑3flag质粒，得到重组质粒pCMV‑RBD‑Fc‑IFN；将所述重组质粒pCMV‑RBD‑Fc‑IFN转染至293T细胞并培养预定时间后，收集转染上清液；对所述转染上清液进行纯化处理，得到RBD‑Fc‑IFN融合蛋白，即制得所述新型新冠病毒亚单位疫苗。本发明制备的新型新冠病毒亚单位疫苗有效解决了RBD亚单位疫苗在临床应用中遇到的半衰期短、免疫原性较弱以及联合使用IFN时存在不利因素的问题，为开发安全有效的新型SARS‑CoV‑2疫苗提供候选疫苗。

Description

一种新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物疫苗技术领域，尤其涉及一种新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法。
背景技术
冠状病毒是一类可在多种动物中引起不同严重程度的单股正链RNA病毒。自从公布SARS-CoV-2全基因组序列后，各国科研机构及制药公司都在积极开发SARS-CoV-2疫苗。针对SARS-CoV-2已建立多个不同的疫苗平台，包括灭活全病毒疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗和减毒活疫苗等，不同平台各有优缺点。
SARS-CoV-2棘突蛋白(Spike，S)位于病毒最外层，参与病毒与宿主细胞表面受体的结合，是宿主中和抗体的重要作用位点和疫苗研发最重要的靶抗原。S蛋白在病毒表面以三聚体形式存在，在结构上可分为S1和S2两个亚基，其中S1亚基的331-524位氨基酸为其受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)，负责与细胞膜上特异性受体血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)结合，介导病毒进入细胞。SRAS-CoV-2S蛋白存在融合前和融合后两种构象形式，在天然状态下呈现不稳定的融合前构象(prefusion)，与ACE2受体结合介导病毒进入细胞过程中，S蛋白构象发生显著变化，转变为更稳定的融合后构象(postfusion)。除了构象不稳定，S蛋白序列较长且高度糖基化，直接使用全长S蛋白作为抗原设计，对体外表达和翻译后修饰要求较高。
鉴于S蛋白的复杂性，一个有效的策略是采用S蛋白核心区域RBD进行疫苗研发。基于RBD抗原设计的亚单位疫苗，不仅可以避免S蛋白构象变化问题，且可以诱导中和抗体产生。此外，亚单位更容易进行体外重组表达和放大，极大降低疫苗的开发和生产成本。然而，通常情况下亚单位疫苗存在半衰期短以及免疫原性较弱的问题，因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法，旨在解决现有RBD亚单位疫苗在临床应用中遇到的半衰期短、免疫原性较弱的问题。
本发明的技术方案如下：
一种新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其中，包括步骤：
提供编码SARS-CoV-2S蛋白331-524位氨基酸的基因序列，记为RBD序列；
提供编码人IgG1 Fc区的基因序列，记为Fc序列；
提供编码人或鼠IFN的基因序列，记为IFN序列；
将所述RBD序列和IFN序列连接至所述Fc序列的两端，得到融合蛋白基因RBD-Fc-IFN；
将所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒，得到重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN；
将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至293T细胞并培养预定时间后，收集转染上清液；
对所述转染上清液进行纯化处理，得到RBD-Fc-IFN融合蛋白，即制得所述新冠病毒亚单位疫苗。
所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其中，所述RBD序列和IFN序列通过编码GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS连接肽的序列连接至所述Fc序列的两端。
所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其中，将所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒的步骤包括：
采用HindIII酶和EcoRI酶对所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN以及pCMV-MCS-3flag质粒进行酶切处理，使酶切后的融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒，得到重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN。
所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其中，将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至293T细胞的步骤包括：
将处于对数生长期的293T细胞用胰酶消化后稀释至预定密度，接种到培养皿中，每个培养皿加入无血清培养基；
采用转染试剂将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至培养皿中的293T细胞中。
所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其中，对所述转染上清液进行纯化处理的步骤包括：
采用Protein A亲合层析柱对所述转染上清液进行纯化处理。
一种新冠病毒亚单位疫苗，其中，采用本发明所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法制得，所述新冠病毒亚单位疫苗为RBD-Fc-IFN融合蛋白。
有益效果：本发明提供的新冠病毒亚单位疫苗，通过将SARS-CoV-2S蛋白RBD和IFN分别连接至IgG1 Fc的两端，利用IFN作为内源佐剂并通过Fc实现RBD二聚体化，实现提高RBD半衰期的同时，增强其免疫原性。本发明提供的新冠病毒亚单位疫苗有效解决了RBD亚单位疫苗在临床应用中遇到的半衰期短、免疫原性较弱以及联合使用IFN时存在不利因素的问题，为开发安全有效的新型SARS-CoV-2疫苗提供候选疫苗。
附图说明
图1为本发明提供的一种新冠病毒亚单位疫苗的构建方法较佳实施例的流程图。
图2为RBD-Fc-IFN血浆半衰期测定结果图。
图3为RBD-Fc-IFN诱导产生中和抗体测定结果图。
图4为RBD-Fc-IFN引起细胞免疫应答测定结果图。
具体实施方式
本发明提供一种新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
通常情况下亚单位疫苗存在半衰期短以及免疫原性较弱的问题，尽管可以通过构建抗原二聚体或三聚体以增强亚单位疫苗的免疫原性，但主流策略仍然是通过添加疫苗佐剂提高其免疫原性。先天免疫应答在机体识别和清除病原体过程中发挥重要作用，其中干扰素(Interferon,IFN)应答是机体抗病毒最主要的第一道防线。研究表明，IFN应答不健全与患者对疾病易感程度相关。联合应用IFN可以提供保护作用，延长患者治疗窗口期，对于COVID-19早期患者、IFN应答发生延迟或受阻的人群以及老年患者等特殊人群具有重要意义，但联合应用IFN存在费用昂贵、半衰期短等缺点，不利于推广普及。
基于此，本发明提供了一种新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，如图1所示，其包括步骤：
S10、提供编码SARS-CoV-2S蛋白331-524位氨基酸的基因序列，记为RBD序列；
S20、提供编码人IgG1 Fc区的基因序列，记为Fc序列；
S30、提供编码人或鼠IFN的基因序列，记为IFN序列；
S40、将所述RBD序列和IFN序列连接至所述Fc序列的两端，得到融合蛋白基因RBD-Fc-IFN；
S50、将所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒，得到重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN；
S60、将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至293T细胞并培养预定时间后，收集转染上清液；
S70、对所述转染上清液进行纯化处理，得到RBD-Fc-IFN融合蛋白，即制得所述新冠病毒亚单位疫苗。
本实施例通过将编码SARS-CoV-2S蛋白331-524位氨基酸的RBD序列和编码人或鼠IFN的IFN序列分别连接至Fc序列的两端，得到融合蛋白基因RBD-Fc-IFN，所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN表达后得到RBD-Fc-IFN融合蛋白，即制得本实施例中的新冠病毒亚单位疫苗。本实施例制得的新冠病毒亚单位疫苗利用IFN作为内源佐剂并通过Fc实现RBD二聚体化，实现提高RBD半衰期的同时，增强其免疫原性。所述新冠病毒亚单位疫苗有效解决了RBD亚单位疫苗在临床应用中遇到的半衰期短、免疫原性较弱以及联合使用IFN时存在不利因素的问题，为开发安全有效的新型SARS-CoV-2疫苗提供候选疫苗。
在一些实施方式中，所述RBD序列和IFN序列通过编码GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS连接肽的序列连接至所述Fc序列的两端。
在本实施例中，所述RBD序列如SEQ ID.1所示，所述Fc序列如SEQ ID.2所示，所述编码鼠IFN的基因序列如SEQ ID.3所示，所述编码GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS连接肽的序列如SEQ ID.4所示。本实施例制得的融合蛋白基因RBD-Fc-IFN如SEQ ID.5所示。
在一些实施方式中，将所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒的步骤包括：采用HindIII酶和EcoRI酶对所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN以及pCMV-MCS-3flag质粒进行酶切处理，使酶切后的融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒，得到重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN。
在一些实施方式中，将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至293T细胞的步骤包括：将处于对数生长期的293T细胞用胰酶消化后稀释至预定密度，接种到培养皿中，每个培养皿加入无血清培养基；采用转染试剂将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至培养皿中的293T细胞中。
作为举例，使用无内毒素质粒抽提试剂盒抽提所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN，备用；将处于对数生长期的293T细胞用胰酶消化后稀释至5x105/mL的密度，接种到10cm培养皿中，每个培养皿加10ml无血清培养基，培养24小时左右后，利用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen)将重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至培养皿内的293T细胞，并在转染后3-4天后收取转染上清液，所述转染上清液中包括表达的RBD-Fc-IFN融合蛋白。本实施例制得的RBD-Fc-IFN融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID.6所示。
在一些实施方式中，采用Protein A亲合层析柱对所述转染上清液进行纯化处理。具体来讲，用20mM PBS(PH＝7.4)清洗和平衡纯化柱，上样速度1ml/min，过10倍柱体积。调节上样流速至1ml/min进行转染上清液上样，上样结束后，用20mM PBS(PH＝7.4)清洗纯化柱，上样速度1ml/min，过10倍柱体积。之后使用甘氨酸溶液(PH＝3.0)进行洗脱，洗脱流速为1ml/min。向收集管中加入一定量的pH8.0的Tris-HCl缓冲液将蛋白调至接近中性，并透析至20mM PBS(PH＝7.4)保存，得到纯化后的RBD-Fc-IFN融合蛋白。
在一些实施方式中，还提供一种新冠病毒亚单位疫苗，其采用本发明所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法制得，所述新冠病毒亚单位疫苗为RBD-Fc-IFN融合蛋白。
下面通过具体实施例对本发明制备的新冠病毒亚单位疫苗的性能做进一步的测试：
实施例1
RBD-Fc-IFN融合蛋白的血浆半衰期测定
取6只8-10周龄BALB/c小鼠，通过尾静脉注射融合蛋白，每只给药20μg蛋白，并在注射后12小时、1天、2天、4天、6天、8天、10天和12通过眼静脉取血，采集的血清经12000rpm离心5min，取上清ELISA检测融合蛋白浓度，结果如图2所示。从图2可以看出，RBD-Fc-IFN融合蛋白在注射小鼠体内12天后，其浓度由6000ng/ml降低为2000ng/ml；而RBD-His在注射小鼠体内12天后，其浓度由6000ng/ml降低为接近于0ng/ml。显然RBD-Fc-IFN融合蛋白在体内的半衰期要长于RBD在体内的半衰期。
实施例2
RBD-Fc-IFN融合蛋白诱导产生中和抗体测定
使用5μg RBD-Fc、RBD-Fc-IFN或PBS免疫小鼠，在免疫后第7天通过眼静脉采集血清。采集的血清经12000rpm离心5min，取上清进行梯度稀释，ELISA测定与RBD蛋白的结合情况，结果如图3所示。从图3可以看出RBD-Fc-IFN诱导产生的中和抗体显著高于RBD诱导产生的中和抗体。
实施例3
RBD-Fc-IFN融合蛋白引起细胞免疫应答测定1，取免疫后小鼠的脾脏，分离淋巴细胞，计数后加入预包被有抗鼠IFN-γ或IL-4捕获抗体的ELISpot板中，之后分别加入5μg/ml的RBD-Fc-IFN、RBD以及PBS培养72h，计数IFN-γ或IL-4阳性斑点数目，结果如图4所示。从图4可以看出，所述RBD-Fc-IFN免疫小鼠产生较强的Th1型细胞免疫应答。
综上所述，本发明提供的新冠病毒亚单位疫苗，通过将SARS-CoV-2S蛋白RBD和IFN分别连接至IgG1 Fc的两端，利用IFN作为内源佐剂并通过Fc实现RBD二聚体化，实现提高RBD半衰期的同时，增强其免疫原性。本发明提供的新冠病毒亚单位疫苗有效解决了RBD亚单位疫苗在临床应用中遇到的半衰期短、免疫原性较弱以及联合使用IFN时存在不利因素的问题，为开发安全有效的新型SARS-CoV-2疫苗提供候选疫苗。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Figure IDA0003793969130000011
Figure IDA0003793969130000021
Figure IDA0003793969130000031
Figure IDA0003793969130000041
Figure IDA0003793969130000051

Claims (4)

1.一种新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其特征在于，包括步骤：
提供编码SARS-CoV-2S蛋白331-524位氨基酸的基因序列，记为RBD序列；
提供编码人IgG1 Fc区的基因序列，记为Fc序列；
提供编码人或鼠IFN的基因序列，记为IFN序列；
将所述RBD序列和IFN序列通过编码GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS连接肽的序列连接至所述Fc序列的两端，得到融合蛋白基因RBD-Fc-IFN；
将所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒，得到重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN；
将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至293T细胞并培养预定时间后，收集转染上清液；
采用Protein A亲合层析柱对所述转染上清液进行纯化处理，得到RBD-Fc-IFN融合蛋白，即制得所述新冠病毒亚单位疫苗。
2.根据权利要求1所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其特征在于，将所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒的步骤包括：
采用HindIII酶和EcoRI酶对所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN以及pCMV-MCS-3flag质粒进行酶切处理，使酶切后的融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒，得到重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN。
3.根据权利要求1所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其特征在于，将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至293T细胞的步骤包括：
将处于对数生长期的293T细胞用胰酶消化后稀释至预定密度，接种到培养皿中，每个培养皿加入无血清培养基；
采用转染试剂将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至培养皿中的293T细胞中。
4.一种新冠病毒亚单位疫苗，其特征在于，采用权利要求1-3任一所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法制得，所述新冠病毒亚单位疫苗为RBD-Fc-IFN融合蛋白。
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Title
Therapeutic efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding heat shock protein 65 of Mycobacterium tuberculosis and the human interleukin 2 fusion gene;ShiChanghong等;《Tuberculosis》;20081203;第89卷(第1期);第54-61页 *

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