CN111848754A

CN111848754A - 新型冠状病毒n蛋白重组抗原及其用途

Info

Publication number: CN111848754A
Application number: CN202010798708.1A
Authority: CN
Inventors: 李为民; 应斌武; 罗汶鑫; 王旻晋; 汪周峰
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: Maccura Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-10
Filing date: 2020-08-10
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-08-10
Also published as: CN111848754B

Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒N蛋白重组抗原及其用途，属于蛋白免疫检测试剂领域。所述重组抗原是一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或3所示。将该重组抗原用于制备检测N蛋白抗体的试剂，相比N蛋白全长抗原，能提高试剂的热稳定性和检测的准确性。

Description

新型冠状病毒N蛋白重组抗原及其用途

技术领域

本发明属于蛋白免疫检测试剂领域，具体涉及新型冠状病毒N蛋白重组抗原及其用途。

背景技术

冠状病毒是自然界广泛存在的一个大型病毒家族，因其形态在电镜下观察似王冠而得名，主要引起呼吸系统疾病。冠状病毒的其基因组为单股、正链的RNA，基因组全长在26～32kb之间，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，分为α、β、γ和δ四个属。冠状病毒在自然界的感染普非常广泛，常见的哺乳类动物如犬、猫、鼠、猪、牛以及家禽类都易感。近几年来，又从白鲸、骆驼，尤其是蝙蝠体内分离到多种类型的冠状病毒。目前已知的人冠状病毒有六种，分别是二十世纪60年代发现的HCoV-229E和HCoV-OC43，2003年出现的SARS-CoV，2004年在荷兰分离的HCoV-NL63，2005年在香港鉴定的HCoV-HKU1以及2012年在中东地区出现的新型中东呼吸综合征冠状病毒MERS-CoV。

2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是一种新的冠状病毒。2020年2月11日，世界卫生组织将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”。与此同时，国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为“SARS-CoV-2”。SARS-CoV-2是一类呈球形、表面有突起、电镜下观察形似皇冠的病毒，病毒基因为连续线性单链RNA，直径在75-160nm。2019-nCoV是目前发现的可以感染人类的冠状病毒科中的第七个成员。其他6个成员分别为：HCoV 229E、HCoV NL63、HCoVOC43、HCoV HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。新型冠状病毒感染人的潜伏期1-14天，多为3-7天。病毒主要经呼吸道飞沫和密切接触传播；患者出现发热、乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重症状。病毒感染人后，机体会发生针对病毒的免疫反应并产生抗体。IgM抗体产生较快(5-7天)，数周或数月后逐渐消失；IgG抗体产生较晚(10-14天)，亲和力更高，可持续多年甚至终生存在。

目前研究发现，虽然SARS-CoV-2与SARS-CoV、MERS-CoV同属于β-CoV，其基因组与SARS-CoV基因组表现出较高的序列同源性。但是，SARS-CoV-2基因组在两个核心位置具有高度变异性。一个是ORF1ab基因中的沉默变异，另一个为氨基酸ORF8中的多态性。据预测，ORF8中的突变会导致其两个变异体(即ORF8-L和ORF8-S)，导致蛋白质的结构异常。在对SARS-CoV-2进行结构分析时发现，其刺突糖蛋白及核衣壳蛋白发生突变。这提示SARS-CoV-2具有独特的基因组特征及结构特征，需要对其做进一步的研究。

N蛋白被认为是最具有临床诊断应用前景的新型冠状病毒抗原。在新型冠状病毒感染者的血清中N蛋白的抗体的滴度较高，持续时间长，使用N蛋白抗原，利用抗原和抗体之间的免疫结合，可检测出血清中N蛋白的抗体，间接反映被检对象是否感染新型冠状病毒。

但当前的新冠病毒抗体检测实践中，全长N蛋白作为抗原仍存在一定的假阳性，且热稳定性偏低。据此，在本领域中存在着对新型冠状病毒N抗原进行改善以提高新型冠状病毒检测试剂性能的强烈需求。

发明内容

本发明的目的是：提供一种可用于检测血清新型冠状病毒N蛋白抗体的准确性更高、稳定性更好的重组抗原。

本发明的技术方案如下：

一种SARS-CoV-2N蛋白重组抗原，所述重组抗原是一种蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.1(截短型N1抗原)或SEQ ID NO.3(截短型N2抗原)所示。

编码权利要求1所述重组抗原的基因片段。

如前述的基因片段，所述基因片段的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5所示。

一种SARS-CoV-2感染检测试剂盒，所述检测试剂盒包括前述的重组抗原。

如前述的检测试剂盒，所述试剂盒中，所述重组抗原包被于固相支持物上；

优选地：所述固相支持物为膜、板、珠或微球；

进一步优选地：所述膜为NC膜，或，所述珠为磁珠，或，所述微球为羧基微球、氨基微球、氯甲基微球或物理吸附微球。

如前述的检测试剂盒，所述试剂盒中，所述重组抗原通过化学键连接可被检测的分子；

优选地：所述可被检测的分子为酶、放射性同位素、生物素、地高辛、胶态金属、荧光染料、化学发光化合物、生物发光化合物或核酸分子；

进一步优选地：所述酶为辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶，或，所述放射性同位素为³²P或¹²⁵I，或，所述胶态金属为胶体金，或，所述荧光染料为荧光素、罗丹明或德克萨斯红，或，所述化学发光化合物为吖啶酯、二氧杂环丁烷、鲁米诺或吖啶鎓。

如前述的检测试剂盒，所述试剂盒中的试剂为ELISA检测试剂、放射自显影试剂、比浊法检测试剂、荧光显微镜检术检测试剂、酶促反应检测试剂、放射性同位素法检测试剂或非放射性同位素法试剂；

优选地，所述试剂盒中的试剂为：免疫比浊法检测试剂、乳胶增强透射比浊法检测试剂、Western印迹检测试剂、重叠测定试剂、放射免疫测定试剂、免疫放射免疫测定试剂、胶体金免疫测定试剂、酶免疫测定试剂、荧光免疫测定试剂或化学发光免疫测定试剂。

如前述的检测试剂盒，所述试剂盒含有试纸、瓶装/管装试剂或微流体芯片。

前述重组抗原在制备SARS-CoV-2感染检测试剂盒中的用途。

如前述的用途，所述试剂盒是检测人抗SARS-CoV-2N蛋白抗体的试剂盒。

本发明的有益效果如下：

1)热稳定性好。本发明的重组抗原的热稳定性高于N蛋白野生型抗原。在包被于磁珠后在37℃放置7天，N1抗原检测抗新型冠状病毒IgG抗体的信号保留率为89.5％以上，N2抗原检测抗新型冠状病毒IgG抗体的信号保留率为86％以上，整体上高于野生型抗原。

2)临床检测准确性高。临床检测结果的ROC曲线分析显示，用截短型N1抗原的线下面积高达0.998，N2抗原的线下面积为0.981，高于野生型N蛋白的0.977。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：截短型N1的纯化电泳图。

图2：野生型WN的纯化电泳图。

图3：截短型N2的纯化电泳图。

具体实施方式

实施例1 重组截短型Nl抗原的序列构建及表达纯化

截短型N1抗原为新型冠状病毒N蛋白第25-214氨基酸组成的蛋白，其氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下：

GSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGG。

表达截短型N1抗原的基因为碱基优化后的核酸，命名为n1基因，序列(SEQ IDNO.2)如下：

将n1基因构建至pET28a载体的多克隆位点，得重组质粒，命名为pET28a-n1。

将pET28a-n1转化至大肠杆菌E.coli BL21(Rossett)感受态细胞，按照分子克隆实验指南所述方法进行诱导表达。简述为：37℃，200r/min培养至OD600＝0.8，加入IPTG至终浓度1mM，于25℃诱导16小时。将诱导出目的蛋白的克隆子命名为R pET28a-N1。按上述确定的诱导条件对R pET28a-N1进行大量发酵。发酵结束后，收集菌体，并用20mM PBS pH7.4的缓冲液洗涤两次。菌体冻存于-20℃。

用破菌缓冲液(20mM PBS pH7.4，0.5M NaCl)重悬R pET28a-N1发酵菌体，混匀后进行超声破碎；破碎完成后12000rpm 4℃离心20min，收集破碎液上清。

取破碎液上清进行NI柱纯化。上样缓冲液为：20mM PBS，0.5M NaCl，pH7.4；平衡缓冲液为：20mM PBS，0.5M NaCl，pH7.4；杂缓冲液：20mM PBS，0.5M NaCl，30mM咪唑，pH7.4；洗脱缓冲液为：20mM PBS，300mM咪唑，pH7.4。所得洗脱液即为纯化后的蛋白，对洗脱液进行电泳检测，如图1所示。

收集洗脱液，装入3000-3500道尔顿分子量的透析袋，在2-8℃条件下用10mM PBS，1mMEDTA pH7.4透析目的蛋白洗脱液透析两次。透析后的目的蛋白以12000rpm于2-8℃离心20min，收集上清于50mL离心管中，并测定抗原蛋白浓度。重组蛋白命名为：截短型N1。

以下用实验例的形式对本发明的有益效果做进一步说明。

实验例1 重组抗原的结合性能比较

1.重组抗原

截短型N1：同实施例1。

截短型N2：选取新型冠状病毒的N蛋白第184-419氨基酸构成，氨基酸序列(SEQ IDNO.3)为：

SRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA。

野生型WN：野生型N蛋白，氨基酸序列(SEQ ID NO.4)为：

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA。

除了构建至pET28a载体的抗原基因不同，N2和WN的表达纯化方法与实施例1相同，其NI柱纯化结果分别如图2和图3所示。

截短型N2的基因的序列(SEQ ID NO.5)：

TCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAACAAACCCAAGGAAATTTTGGGGACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGCAAATTGCACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAGCGTTCTTCGGAATGTCGCGCATTGGCATGGAAGTCACACCTTCGGGAACGTGGTTGACCTACACAGGTGCCATCAAATTGGATGACAAAGATCCAAATTTCAAAGATCAAGTCATTTTGCTGAATAAGCATATTGACGCATACAAAACATTCCCACCAACAGAGCCTAAAAAGGACAAAAAGAAGAAGGCTGATGAAACTCAAGCCTTACCGCAGAGACAGAAGAAACAGCAAACTGTGACTCTTCTTCCTGCTGCAGATTTGGATGATTTCTCCAAACAATTGCAACAATCCATGAGCAGTGCTGACTCAACTCAGGCC

野生型WN的基因的序列(SEQ ID NO.6)：

2.抗原活性检测

采用间接法原理进行检测，具体的：将重组野生型WN抗原、重组截短型N1抗原、N2抗原分别包被磁珠，与样本中抗新型冠状病毒抗体反应，形成免疫复合物，洗涤去游离成分；加入标记吖啶酯(AE)的抗人IgG抗体反应，形成AE-抗人IgG抗体-人抗新型冠状病毒抗体-重组抗原-磁珠复合物，洗涤去游离成分；加入化学发光底物液(NaOH溶液和过氧化氢溶液)，在全自动化学发光测定仪上测定各反应管中的发光值(RLU)(每个样本测2次)。结果见表1：

表1 使用抗体进行检测

根据表1的发光值数据，计算信噪比，结果显示：三种新冠N蛋白重组抗原的活性强弱(信噪比)如下：野生型WN>截短型N1>截短型N2。其中，信噪比＝阳性样本发光值/阴性样本发光值，信噪比越高，则重组抗原的活性越强。

虽然上述三种重组抗原的活性有差异，但与抗新型冠状病毒抗体均有免疫活性，均可用于新型冠状病毒抗体检测试剂，但需要对稳定性、准确性等其他性能进行研究，以期获得综合性能更优的检测试剂。

3.热稳定性检测

将重组野生型WN抗原、重组截短型N1抗原、N2抗原分别包被于磁珠后，分别在4℃冰箱和37℃恒温水浴箱中放置7天，取出后同时检测不同稀释比的新型冠状病毒IgG抗体(检测方法同第2节)，比较37℃放置7天后的信号保留率，结果见表2：

表2 热稳定性检测

从表2看出，三种新冠N蛋白重组抗原在37℃下放置7天的信号保留率均在85％～92％之间。其中，截短型N1的信号保留率最好，说明其热稳定性最佳。

4.临床样本检测

采用第2节的方法，将重组野生型WN抗原、重组截短型N1抗原、N2抗原分别包被于磁珠后，分别对40例临床COVID-19阴性样本和30例COVID-19临床阳性样本进行检测，测得的发光值(RLU)结果见表3。

表3 临床检测RLU值

从表3看出：随机检测40例正常人样本，重组野生型WN抗原检测信号平均值为2777RLU，最低值为173RLU，最高值为48112RLU；重组截短型N1抗原检测信号平均值为435RLU，最低值为119RLU，最高值为1443RLU；重组截短型N2抗原检测信号平均值为662RLU，最低值为144RLU，最高值为2463RLU。即，三种抗原检测阴性样本的信号值由高到低依次为野生型WN>截短型N2>截短型N1，且野生型WN检测部分阴性样本信号值是N1或N2的10～20倍(值得注意的是，阴性样本信号值越大，背景越高，有损检测结果的准确性)。

检测临床确诊新冠肺炎患者的血清或血浆样本30例，重组野生型WN抗原检测信号平均值为190135RLU，最低值为1983RLU，最高值为592225RLU；重组截短型N1抗原检测信号平均值为101976RLU，最低值为1159RLU，最高值为371291RLU；重组截短型N2抗原检测信号平均值为28395RLU，最低值为1400RLU，最高值为143537RLU。即，三种抗原检测阳性样本的信号值由高到低依次为野生型WN>截短型N1>截短型N2，但是，野生型WN抗原检测阳性样本信号值约为截短型N1抗原信号值的2～3倍，而截短型N2抗原检测阳性样本信号值普遍偏低。

进一步地，为了验证重组野生型WN抗原、重组截短型N1抗原、N2抗原这三种抗原的检测准确度，采用MedCal软件中的ROC曲线分析对上述三种抗原进行分析，结果见表4～表6。

表4 野生型WN抗原的分析结果

表5 截短型N1抗原的分析结果

Area under the ROC curve(AUC)	0.998
		Standard Error	0.00203
95％Confidence Interval	0.945to 1.000
		z statistic	245.183
Significance level P(Area＝0.5)	＜0.0001

表6 截短型N2抗原的分析结果

Area under the ROC curve(AUC)	0.981
		Standard Error	0.0120
95％Confidence Interval	0.915to 0.999
		z statistic	39.931
Significance level P(Area＝0.5)	＜0.0001

表4～表6看出：野生型WN抗原的AUC为0.977，95％CI：0.909～0.998；截短型N1抗原的AUC为0.998，95％CI：0.945～1.000；截短型N2抗原的AUC为0.981，95％CI：0.915～0.999。即，从三种抗原的ROC曲线分析显示，野生型WN、截短型N1、截短型N2重组抗原的线下面积(AUC)分别为0.977、0.998和0.981，其中截短型N1重组抗原的AUC最高，说明该抗原区分阴性结果和阳性结果的准确性越高。因此，三种抗原检测临床样本结果的准确性依次为截短型N1抗原>截短型N2抗原>野生型WN抗原。

综上，本发明的截短型N1、N2抗原的热稳定性高，抗体临床检测的准确性高，均优于野生型抗原，其中截短型N1抗原性能又优于截短型N2抗原。将本发明的截短型N1、N2抗原用于制备新型冠状病毒(抗体)检测试剂盒，具备十分良好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> 新型冠状病毒N蛋白重组抗原及其用途

<130> GYKH1094-2020P0111238CC20JS030

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 191

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg

1 5 10 15

Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu

20 25 30

Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val

35 40 45

Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg

50 55 60

Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu

65 70 75 80

Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly

85 90 95

Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu

100 105 110

Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala

115 120 125

Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro

130 135 140

Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser

145 150 155 160

Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly

165 170 175

Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly

180 185 190

<210> 2

<211> 573

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

ggttctaacc agaacggtga acgttctggt gctcgttcta aacagcgtcg tccgcagggt 60

ctgccgaaca acaccgcttc ttggttcacc gctctgaccc agcacggtaa agaagacctg 120

aaattcccgc gtggtcaggg tgttccgatc aacaccaact cttctccgga cgaccagatc 180

ggttactacc gtcgtgctac ccgtcgtatc cgtggtggtg acggtaaaat gaaagacctg 240

tctccgcgtt ggtacttcta ctacctgggt accggtccgg aagctggtct gccgtacggt 300

gctaacaaag acggtatcat ctgggttgct accgaaggtg ctctgaacac cccgaaagac 360

cacatcggta cccgtaaccc ggctaacaac gctgctatcg ttctgcagct gccgcagggt 420

accaccctgc cgaaaggttt ctacgctgaa ggttctcgtg gtggttctca ggcttcttct 480

cgttcttctt ctcgttctcg taactcttct cgtaactcta ccccgggttc ttctcgtggt 540

acctctccgg ctcgtatggc tggtaacggt ggt 573

<210> 3

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro

1 5 10 15

Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly

20 25 30

Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu

35 40 45

Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr

50 55 60

Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr

65 70 75 80

Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro

85 90 95

Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly

100 105 110

Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala

115 120 125

Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser

130 135 140

Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp

145 150 155 160

Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala

165 170 175

Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys

180 185 190

Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr

195 200 205

Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu

210 215 220

Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala

225 230 235

<210> 4

<211> 419

<212> PRT

<213> 新型冠状病毒（SARS-Cov-2）

<400> 4

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

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65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

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Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr

100 105 110

Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

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Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

165 170 175

Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn

180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu

210 215 220

Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln

225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

245 250 255

Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln

260 265 270

Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp

275 280 285

Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile

290 295 300

Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile

305 310 315 320

Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala

325 330 335

Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu

340 345 350

Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro

355 360 365

Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln

370 375 380

Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu

385 390 395 400

Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser

405 410 415

Thr Gln Ala

<210> 5

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

tctcgttcct catcacgtag tcgcaacagt tcaagaaatt caactccagg cagcagtagg 60

ggaacttctc ctgctagaat ggctggcaat ggcggtgatg ctgctcttgc tttgctgctg 120

cttgacagat tgaaccagct tgagagcaaa atgtctggta aaggccaaca acaacaaggc 180

caaactgtca ctaagaaatc tgctgctgag gcttctaaga agcctcggca aaaacgtact 240

gccactaaag catacaatgt aacacaagct ttcggcagac gtggtccaga acaaacccaa 300

ggaaattttg gggaccagga actaatcaga caaggaactg attacaaaca ttggccgcaa 360

attgcacaat ttgcccccag cgcttcagcg ttcttcggaa tgtcgcgcat tggcatggaa 420

gtcacacctt cgggaacgtg gttgacctac acaggtgcca tcaaattgga tgacaaagat 480

ccaaatttca aagatcaagt cattttgctg aataagcata ttgacgcata caaaacattc 540

ccaccaacag agcctaaaaa ggacaaaaag aagaaggctg atgaaactca agccttaccg 600

cagagacaga agaaacagca aactgtgact cttcttcctg ctgcagattt ggatgatttc 660

tccaaacaat tgcaacaatc catgagcagt gctgactcaa ctcaggcc 708

<210> 6

<211> 1260

<212> DNA

<213> 新型冠状病毒（SARS-Cov-2）

<400> 6

atgtctgaca acggtccgca gaaccagcgt aacgctccgc gtatcacctt cggtggtccg 60

tctgactcta ccggttctaa ccagaacggt gaacgttctg gtgctcgttc taaacagcgt 120

cgtccgcagg gtctgccgaa caacaccgct tcttggttca ccgctctgac ccagcacggt 180

aaagaagacc tgaaattccc gcgtggtcag ggtgttccga tcaacaccaa ctcttctccg 240

gacgaccaga tcggttacta ccgtcgtgct acccgtcgta tccgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagacc tgtctccgcg ttggtacttc tactacctgg gtaccggtcc ggaagctggt 360

ctgccgtacg gtgctaacaa agacggtatc atctgggttg ctaccgaagg tgctctgaac 420

accccgaaag accacatcgg tacccgtaac ccggctaaca acgctgctat cgttctgcag 480

ctgccgcagg gtaccaccct gccgaaaggt ttctacgctg aaggttctcg tggtggttct 540

caggcttctt ctcgttcttc ttctcgttct cgtaactctt ctcgtaactc taccccgggt 600

tcttctcgtg gtacctctcc ggctcgtatg gctggtaacg gtggtgacgc tgctctggct 660

ctgctgctgc tggaccgtct gaaccagctg gaatctaaaa tgtctggtaa aggtcagcag 720

cagcagggtc agaccgttac caaaaaatct gctgctgaag cttctaaaaa accgcgtcag 780

aaacgtaccg ctaccaaagc ttacaacgtt acccaggctt tcggtcgtcg tggtccggaa 840

cagacccagg gtaacttcgg tgaccaggaa ctgatccgtc agggtaccga ctacaaacac 900

tggccgcaga tcgctcagtt cgctccgtct gcttctgctt tcttcggtat gtctcgtatc 960

ggtatggaag ttaccccgtc tggtacctgg ctgacctaca ccggtgctat caaactggac 1020

gacaaagacc cgaacttcaa agaccaggtt atcctgctga acaaacacat cgacgcttac 1080

aaaaccttcc cgccgaccga accgaaaaaa gacaaaaaaa aaaaagctga cgaaacccag 1140

gctctgccgc agcgtcagaa aaaacagcag accgttaccc tgctgccggc tgctgacctg 1200

gacgacttct ctaaacagct gcagcagtct atgtcttctg ctgactctac ccaggcttaa 1260

Claims

1.一种SARS-CoV-2N蛋白重组抗原，其特征在于：所述重组抗原是一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

2.编码权利要求1所述重组抗原的基因片段。

3.如权利要求2所述的基因片段，其特征在于：所述基因片段的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.5所示。

4.一种SARS-CoV-2感染检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括权利要求1所述的重组抗原。

5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，所述重组抗原包被于固相支持物上；

优选地：所述固相支持物为膜、板、珠或微球；

6.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，所述重组抗原通过化学键连接可被检测的分子；

7.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中的试剂为ELISA检测试剂、放射自显影试剂、比浊法检测试剂、荧光显微镜检术检测试剂、酶促反应检测试剂、放射性同位素法检测试剂或非放射性同位素法试剂；

8.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有试纸、瓶装/管装试剂或微流体芯片。

9.权利要求1所述重组抗原在制备SARS-CoV-2感染检测试剂盒中的用途。

10.如权利要求要求9所述的用途，其特征在于：所述试剂盒是检测人抗SARS-CoV-2N蛋白抗体的试剂盒。