CN113249408B

CN113249408B - 一种靶向激活体液免疫和细胞免疫的核酸疫苗载体构建及应用

Info

Publication number: CN113249408B
Application number: CN202110695890.2A
Authority: CN
Inventors: 程功; 太万博; 冯胜勇; 庞慕加
Original assignee: Tsinghua University; Shenzhen Bay Laboratory
Current assignee: Tsinghua University; Shenzhen Bay Laboratory
Priority date: 2021-06-23
Filing date: 2021-06-23
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2041-06-23
Also published as: CN113249408A

Abstract

本发明公开了一种靶向激活体液免疫和细胞免疫的核酸疫苗载体构建及应用。本申请的第一方面提供一种抗原表达载体，该抗原表达载体包括抗原编码区，抗原编码区包含依次连接的信号肽序列、中和抗原序列、内部核糖体进入位点序列、泛素化序列和T细胞抗原序列。根据本申请实施例的抗原表达载体，至少具有如下有益效果：本申请实施例所提供的抗原表达载体经体外转录形成的mRNA链中，一方面利用信号肽介导中和结构域抗原的表达分泌，另一方面由内部核糖体进入位点（IRES）介导泛素化的T细胞表位抗原的表达，促进其降解以及T细胞表位的形成，从而在施用后能够在对象体内同时诱导产生相对独立的中和抗体和T细胞免疫应答。

Description

一种靶向激活体液免疫和细胞免疫的核酸疫苗载体构建及应用

技术领域

本申请涉及免疫技术领域，尤其是涉及一种靶向激活体液免疫和细胞免疫的核酸疫苗载体构建及应用。

背景技术

mRNA疫苗具有理化性质统一、方便使用统一方案流程制备和大规模高通量筛选有效疫苗抗原位点的特点，相比于其他传统疫苗类型（包括灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、病毒载体疫苗），在开发流程方面呈现出更为方便高效的优势。与传统疫苗和DNA疫苗相比，mRNA疫苗研发周期短、研发成本相对较低。传统疫苗研发周期至少需要8年以上，研发成本高。mRNA疫苗研发周期在一年左右，研发成本可控制性强。而且mRNA疫苗的溶解度等理化性质适合药物研发，安全性高。另外，mRNA疫苗进入体内后会经历自然降解过程，副作用能得到更精确控制，不存在整合、诱导基因突变和外源性病毒感染的风险。同时，其设计性强，制备流程简便，与传统灭活疫苗6-12个月的生产时间不同，mRNA疫苗在1个月内就可以完成标准化生产。

在目的抗原基因设计上，依据所靶向诱导的保护性免疫应答类型，选择不同抗原序列进行构建，理想的疫苗设计可以有效诱导病原特异性的体液免疫和细胞免疫应答。目前成功上市的两款新型冠状病毒疫苗均倾向以诱导中和抗体发挥保护性免疫应答，尚未在探索靶向性诱导T细胞免疫应答开展特定设计，尤其是细胞毒性T淋巴细胞介导的针对病毒感染细胞发挥的清除作用。诱导中和抗体的抗原为构象性表位，在mRNA设计时应考虑促进抗原蛋白的表达分泌，进一步诱导抗体产生。而在诱导细胞免疫应答抗原设计时应重点考虑在促进抗原表达后的表位形成，进一步通过抗原递呈细胞，诱导T细胞的活化并发挥保护性免疫应答作用。因此，常规将B细胞抗原和T细胞抗原进行简单的融合，难以满足两种抗原特点。需要提供一种能够同时靶向刺激体液免疫和细胞免疫的mRNA疫苗。

发明内容

本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种抗原表达载体，构建得到的这种载体能够用于制备核酸疫苗，而该核酸疫苗可以同时靶向激活体液免疫和细胞免疫。

本申请的第一方面，提供抗原表达载体，该抗原表达载体包括抗原编码区，抗原编码区包含依次连接的信号肽序列、中和抗原序列、内部核糖体进入位点序列、泛素化序列和T细胞抗原序列。

根据本申请实施例的抗原表达载体，至少具有如下有益效果：

本申请实施例所提供的抗原表达载体经体外转录形成的mRNA链，一方面能够利用信号肽介导中和结构域抗原的表达分泌，另一方面能够由内部核糖体进入位点（IRES）介导泛素化的T细胞表位抗原的表达，促进其降解以及T细胞表位的形成，从而在施用后在对象体内同时诱导产生相对独立的中和抗体和T细胞免疫应答。

在本申请的一些实施方式中，信号肽序列为tPA信号肽序列。tPA信号肽是目前应用最广泛的信号肽之一。该抗原表达载体上的外源核酸序列在转录形成mRNA后，tPA信号肽序列可以提高中和抗原的可翻译性，从而有效提高中和抗原的表达和分泌的水平，增强细胞免疫应答。

在本申请的一些实施方式中，tPA信号肽序列包括如SEQ ID No.23所示的核苷酸序列：

ATGGACGCCATGAAGAGGGGGCTGTGCTGCGTGCTGCTGCTGTGCGGAGCCGTGTTCGTGAGCGCCTCC（SEQ ID No.23）。

在本申请的一些实施方式中，内部核糖体进入位点序列包括如SEQ ID No.24所示的核苷酸序列：

GCGGCCGCGGATCCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCACCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAT（SEQ IDNo.24）。IRES元件能够执行帽子结构功能，起始下游序列翻译表达，从而使中和抗原和T细胞抗原都能够被高效表达，提高细胞免疫和体液免疫应答的综合效果。

在本申请的一些实施方式中，泛素化序列包括如SEQ ID No.25所示的核苷酸序列：

ATGCAGATTTTCGTGAAAACCCTGACCGGGAAAACCATCACCCTGGAAGTCGAGCCCAGCGACACCATCGAGAACGTCAAGGCCAAAATCCAGGACAAGGAGGGCATCCCCCCCGACCAGCAGAGGCTGATCTTCGCCGGCAAGCAGCTGGAAGACGGCAGAACACTGAGCGACTACAACATCCAGAAGGAAAGCACCCTGCACCTGGTGCTGAGACTGAGAGGCGCC（SEQ ID No.25）。高效表达的T细胞抗原通过泛素化能够促进自身的降解以及T细胞表位的形成。

在本申请的一些实施方式中，T细胞抗原序列包括多表位串联序列。同时携带多个T细胞抗原表位可以使其能够被多种MHC分子识别结合从而高效提呈，获得更显著的细胞免疫效果。

在本申请的一些实施方式中，多表位串联序列包括多个不同的细胞毒性T淋巴细胞表位（CTL）序列，不同的细胞毒性T淋巴细胞表位序列之间通过接头连接。不同的细胞毒性T淋巴细胞表位至少可以通过现有的生物信息学的分析预测方法、工具获得，如人工神经网络等方法以及SYFPEITHI等工具。将这些表位分析预测鉴定的多表位进行组合，通过AAY或其它蛋白酶切位点作为接头连接。

在本申请的一些实施方式中，多表位串联序列包括抗原蛋白的表位富集区序列，表位富集区序列经片段重排处理。通过对抗原的表位富集区进行片段重排处理，破坏抗原原有的生物学功能而保留其中的CTLs表位，促进抗原的降解和高效提呈，同时有效排除抗体依赖增强（ADE）效应，诱导疫苗的长效保护作用。

在本申请的一些实施方式中，抗原表达载体还包括结构修饰元件，结构修饰元件包括启动子、5′端非翻译区、3′端非编码区和多聚腺苷酸，启动子、5′端非翻译区、抗原编码区、3′端非编码区和多聚腺苷酸在抗原表达载体上依次连接。mRNA一直以来面临不稳定、半衰期短等问题。为了解决该问题，加入修饰作用的结构元件，如5′端非翻译区（5′-UTR）、3′端非编码区（3′-UTR）和多聚腺苷酸（polyA）等，使得mRNA保持完整结构，有利于其稳定性，延长其半衰期并提高mRNA的表达能力。

在本申请的一些实施方式中，多聚腺苷酸的腺苷酸数量在100个以上。

在本申请的一些实施方式中，启动子选自T7启动子、SP6启动子中的任一种。

上述抗原表达载体中，中和抗原序列和T细胞抗原序列可以是针对任何病原体的B细胞抗原和T细胞抗原。可以进一步根据上述的策略或本领域熟知的其它方法策略构建得到针对对应病原体的中和抗原序列和T细胞抗原序列。

在本申请的一些实施方式中，抗原表达载体为新型冠状病毒的抗原表达载体。

在本申请的一些实施方式中，中和抗原序列包括如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列：

AACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCAGATTCGCCAGTGTGTACGCCTGGAACAGAAAGAGGATCTCCAACTGCGTGGCCGATTACTCTGTGCTGTATAATAGCGCCTCCTTCTCTACCTTCAAATGCTATGGCGTGTCCCCCACAAAGCTGAACGATCTGTGTTTTACCAACGTGTACGCCGACTCCTTCGTGATCAGAGGCGACGAGGTGAGGCAGATCGCCCCCGGACAGACCGGAAAGATCGCCGATTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACTCCAACAACCTGGACAGTAAGGTGGGGGGAAACTACAACTACCTGTACCGGCTGTTCCGCAAGAGCAACCTGAAGCCCTTTGAGAGAGACATCAGCACAGAGATTTATCAGGCCGGCAGCACCCCCTGCAACGGAGTGGAAGGATTCAACTGCTACTTCCCACTGCAAAGCTACGGCTTCCAGCCCACCAACGGCGTGGGATACCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGTCTTTTGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTG（SEQ ID No.1）。

在本申请的一些实施方式中，T细胞抗原序列表达的多表位串联抗原包含19个细胞毒性T淋巴细胞表位，19个细胞毒性T淋巴细胞表位的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2~20所示：FTSDYYQLY（SEQ ID No.2）、VYFLQSINF（SEQ ID No.3）、ALSKGVHFV（SEQ ID No.4）、NRFLYIIKL（SEQ ID No.5）、SELVIGAVIL（SEQ ID No.6）、QRNAPRITF（SEQ ID No.7）、SPRWYFYYL（SEQ ID No.8）、ATEGALNTPK（SEQ ID No.9）、KTFPPTEPKK（SEQ ID No.10）、MEVTPSGTWL（SEQ ID No.11）、QYIKWPWYI（SEQ ID No.12）、LTDEMIAQY（SEQ ID No.13）、YLQPRTFLL（SEQ ID No.14）、GPKKSTNLV（SEQ ID No.15）、IEYPIIGDEL（SEQ ID No.16）、VYIGDPAQL（SEQ ID No.17）、TTDPSFLGRY（SEQ ID No.18）、VMVELVAEL（SEQ ID No.19）、VLSEARQHL（SEQ ID No.20）。

在本申请的一些实施方式中，多表位串联抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.21所示：

FTSDYYQLYAAYVYFLQSINFAAYALSKGVHFVAAYNRFLYIIKLAAYSELVIGAVILAAYQRNAPRITFAAYSPRWYFYYLAAYATEGALNTPKAAYKTFPPTEPKKAAYMEVTPSGTWLAAYQYIKWPWYIAAYLTDEMIAQYAAYYLQPRTFLLAAYGPKKSTNLVAAYIEYPIIGDELAAYVYIGDPAQLAAYTTDPSFLGRYAAYVMVELVAELAAYVLSEARQHLAAY（SEQ ID No.21）。

在本申请的一些实施方式中，T细胞抗原序列包括如SEQ ID No.22所示的核苷酸序列：

TTCACCAGCGATTACTATCAGCTGTACGCTGCCTACGTGTATTTTCTGCAGAGCATCAACTTTGCCGCCTACGCCCTGAGCAAGGGCGTGCACTTCGTGGCCGCCTACAACAGGTTCCTGTACATCATCAAGCTGGCCGCCTACTCCGAACTGGTGATCGGCGCCGTCATCCTGGCCGCCTATCAGAGAAATGCCCCCAGAATCACCTTCGCCGCCTATTCCCCCCGCTGGTACTTCTACTACCTGGCCGCCTACGCTACCGAGGGAGCCCTGAACACCCCCAAGGCCGCCTATAAGACCTTCCCCCCCACCGAGCCCAAGAAAGCTGCCTACATGGAGGTGACCCCCAGCGGCACCTGGCTGGCTGCTTACCAGTACATCAAGTGGCCCTGGTACATCGCCGCCTACCTGACCGACGAGATGATCGCCCAGTACGCCGCCTATTATCTGCAGCCCAGAACCTTCCTGCTGGCCGCTTACGGGCCCAAAAAGTCCACCAACCTGGTAGCCGCCTACATCGAATACCCCATCATCGGAGATGAGCTGGCCGCCTACGTGTACATCGGCGACCCCGCCCAGCTGGCCGCTTATACAACCGACCCCAGCTTCCTGGGCAGATACGCCGCCTACGTCATGGTGGAGCTGGTGGCCGAACTGGCCGCCTACGTGCTGTCTGAGGCTAGACAGCACCTGGCCGCTTAC（SEQ ID No.22）。

在本申请的一些实施方式中，抗原编码区还包括报告基因。为了明确不同抗原的表达情况或其它目的，在抗原编码区内还可以插入报告基因从而方便检测。

在本申请的一些实施方式中，报告基因选自荧光蛋白、荧光素酶、蛋白标签中的至少一种。

在本申请的一些实施方式中，蛋白标签选自HA标签、Flag标签、His标签或V5标签中的至少一种。

本申请的第二方面，提供mRNA疫苗，该mRNA疫苗由上述的抗原表达载体制备得到。由上述的抗原表达载体经体外转录而成的mRNA疫苗，一方面能够利用信号肽介导中和结构域抗原的表达分泌，另一方面能够由内部核糖体进入位点（IRES）介导泛素化的T细胞表位抗原的表达，促进其降解以及T细胞表位的形成，从而在施用后在对象体内同时诱导产生相对独立的中和抗体和T细胞免疫应答。

本申请的第三方面，提供新型冠状病毒mRNA疫苗，该新型冠状病毒mRNA疫苗由上述的抗原表达载体制备得到。

本申请的第四方面，提供制剂，该制剂包括上述的mRNA疫苗或新型冠状病毒mRNA疫苗和药学上可接受的载体。通过载体对mRNA疫苗进行递送能够进一步克服mRNA不稳定、半衰期短的问题。载体的非限制性实例包括脂质体载体，如阳离子脂质体，采用包括但不限于薄膜水化法、逆向蒸发法等方式制备得到的脂质体与mRNA疫苗混匀孵育即得到该制剂。

本申请的第五方面，提供试剂盒，该试剂盒包括权上述的抗原表达载体。

本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

图1是本申请的一个实施例的抗原表达载体的图谱。

图2是本申请的一个实施例的T细胞抗原的构建策略示意图。

图3是本申请的对比实验中不同mRNA的结构示意图。

图4是本申请的对比实验中mRNA的电泳结果。

图5是本申请的对比实验中抗原表达水平的Western Blot检测结果。

图6是本申请的对比实验中抗原表达水平的流式细胞仪的检测结果。

图7是本申请的对比实验中免疫应答评价的抗体ELISA检测结果。

图8是本申请的对比实验中免疫应答评价的IFN-γ分泌水平检测结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。

下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。

在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

参考图1，示出了本申请的一个实施例的抗原表达载体的图谱。该抗原表达载体包括抗原编码区，该抗原编码区包含依次连接的信号肽序列、中和抗原序列、内部核糖体进入位点序列、泛素化序列和T细胞抗原序列。该抗原表达载体经体外转录形成的mRNA链，一方面能够利用信号肽介导中和结构域抗原的表达分泌，另一方面能够由内部核糖体进入位点（IRES）介导泛素化的T细胞表位抗原的表达，促进其降解以及T细胞表位的形成，从而在施用后在对象体内同时诱导产生相对独立的中和抗体和T细胞免疫应答。

在其中一些具体实施方式中，信号肽为tPA信号肽。在抗原表达载体的编码区添加tPA信号肽序列可以提高与其相连的中和抗原序列的可翻译性，从而有效提高中和抗原的表达和分泌的水平，增强细胞免疫应答。

在其中一些具体实施方式中，IRES元件能够执行帽子结构功能，介导泛素化的融合T细胞表位串联抗原表达，促进T细胞抗原降解以及T细胞表位的形成，从而使得转录得到的mRNA中的中和抗原和T细胞抗原都能够被高效表达，提高细胞免疫和体液免疫应答效果。

在其中一些具体实施方式中，T细胞抗原序列包括多表位串联序列。利用多个T细胞抗原表位使其可以被多种MHC分子识别结合从而高效提呈，获得更显著的细胞免疫效果。多表位串联的方式可以是将通过表位分析预测鉴定的多个不同表位，采用诸如AAY、其它蛋白酶切位点、或其它接头的方式相互连接从而串联。同样，该多表位串联的方式还可以参考图2，选择抗原蛋白的T细胞表位抗原富集区，通过将不同的表位片段（1~3）重排，使其在破坏抗原原有的生物学功能而保留其中的CTLs表位，促进抗原的降解和高效提呈，同时有效排除抗体依赖增强（ADE）效应，诱导疫苗的长效保护作用。

在其中一些具体实施方式中，抗原编码区的上下游还分别连接有启动子、5′端非翻译区、抗原编码区、3′端非编码区和多聚腺苷酸，通过这些结构元件的添加，使得mRNA保持完整结构，有利于其稳定性，延长其半衰期并提高mRNA的表达能力。

下面以SARS-CoV-2病毒为例说明。

实施例1

本实施例提供一种新冠病毒mRNA疫苗的抗原表达载体。该抗原表达载体参考图1，构建方法如下：

（1）酶切pCAGGS载体，使用限制性内切酶Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切载体，回收大片段（载体）。

（2）交由生物公司合成如下三段基因序列：

序列一（678 bp）：包括tPA信号肽序列（SEQ ID No.23）和SARS-CoV-2的Spike蛋白的受体结合域片段（RBD，SEQ ID No.1），另外在3′端还插入有Flag标签和终止密码子。序列一整体的核酸序列如SEQ ID No.26所示。

序列二（596 bp）：IRES元件序列（SEQ ID No.24）；

序列三（985 bp）：包括泛素化序列（SEQ ID No.25）和CTL序列（SEQ ID No.22），其中CTL序列表达19个串联的预测的T淋巴细胞表位，各表位间由AAY连接，19个CTL的氨基酸序列分别如SEQ ID No.2~20所示，表达的抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.21所示。序列三整体的核酸序列如SEQ ID No.27所示。

根据上述的序列一、二和三设计同源重组引物，扩增相应片段，电泳并胶回收特异性片段，利用同源重组方法，连接各片段与载体。

（3）按常规方法进行大肠杆菌转化，次日挑选克隆菌，小提质粒，测序公司测序。

（4）序列比对正确后，利用Kpn Ⅰ和Bsa I酶切质粒，电泳并胶回收大片段（载体）。

（5）生物公司合成一段基因序列：序列四（232 bp）：包含3′-UTR和Poly(A)。序列四整体的核酸序列如SEQ ID No.28所示。

（6）利用Kpn Ⅰ和Bsa I酶切质粒，电泳并胶回收小片段（3′-UTR-Poly(A)）。

（7）将步骤（4）中酶切回收的载体和3′-UTR-Poly(A)利用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌感受态细胞，涂Amp抗性平板，次日挑选克隆菌，小提质粒，测序公司测序。

（8）序列比对正确后，利用大提质粒试剂盒进行质粒大提，NanoDrop测量质粒浓度和纯度备用，并将其命名为1R19。

mRNA转录验证实验

利用Bsa I限制性内切酶对实施例1中构建得到的抗原表达载体进行线性化后电泳鉴定，电泳位移相对较小。回收后蛋白激酶K处理，酚氯仿抽提，溶解于无RNA酶水中，分光光度计检测浓度。

利用公司购买的体外转录试剂盒及加帽试剂盒，按说明书操作合成含有50%pseudoUTP的mRNA，氯化锂沉淀纯化，75%乙醇洗涤一次，晾干，溶于无RNA酶水中，分光光度计检测浓度。

配置变性RNA凝胶，将RNA样品与2×RNA上样缓冲液1：1混合，70℃金属浴热变性10分钟，冰浴5分钟，电泳（120V，20min）。

结果如图4所示，RBD约为800 bp，19CTL约为1100 bp，1R19约为2500 bp，与预期相符。

对比实验

蛋白表达验证实验

参考图3构建仅包含中和抗原和T细胞抗原的对照质粒，分别命名为RBD和19CTLs。

利用PEI将1R19、RBD和19CTLs分别转染HEK 293T细胞，鉴定相关基因元件的功能。

转染后40小时，向细胞培养基中添加蛋白酶体抑制剂MG132（50μM)，并设置对照，8小时后，对细胞进行处理：

（1）Western Blot：细胞裂解后收集蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜封闭后，分别用抗Flag标签抗体和抗V5标签抗体鉴定B细胞抗原（RBD）和T细胞抗原（19CTLs）的表达。

（2）流式细胞术：胰酶消化为单个细胞，破膜固定后，分别用FITC标记的抗Flag标签抗体和Alexa Fluor-555（AF555）标记的抗V5标签抗体染色，利用流式细胞仪鉴定RBD和19CTLs抗原的表达。

Western Blot结果如图5所示，从图中可以看出，19CTLs质粒组和1R19质粒组中，未加MG132（-）相比于加过MG132（+），19CTLs的蛋白条带明显弱化。同时，RBD质粒组和1R19质粒组中，RBD的蛋白条带都较为明显。该结果表明，1R19质粒能够有效实现RBD和19个串联CTL表位的表达，证明IRES能够执行帽子结构功能，起始下游序列翻译表达。泛素化序列能够促进19个串联CTL表位的降解，而CTL表位的降解则能够进一步促进表位的递呈及细胞免疫应答的诱导。

流式细胞术检测结果如图6所示，结果显示，与WB结果一致，1R19质粒能够有效实现RBD和19个串联CTL表位的表达，证明IRES能够执行帽子结构功能，起始下游序列翻译表达。泛素化序列能够促进19个串联CTL表位的降解和表位的形成，符合设计预期。

免疫评价实验

参考实施例1中图4合成的mRNA，送公司制备mRNA脂质体纳米颗粒，免疫C57BL/6小鼠，免疫剂量为10 μg，通过肌肉免疫途径，免疫两次，间隔为3周，二次免疫后2周采血分析特异性抗体水平，二次免疫后3周，分离脾细胞，利用多肽刺激，检测脾细胞培养上清中IFN-γ水平，分析细胞免疫抗原CTL表位特异性的细胞免疫应答。参考上述实施例设置RBD组、19CTLs组和1R19组以及质控（脂质体空载体）。

（1）抗体检测：将新冠病毒RBD重组蛋白（1 μg/ml）包被ELISA板，分离采血得到的免疫血清后，倍比稀释，加入对应ELISA板中，依次加入HRP-anti-mouse IgG 二抗，及TMB显色液，显色终止后A450检测OD值，计算抗体滴度。

（2）IFN-γ分泌检测：将免疫后小鼠处死，取脾，分离脾细胞，多肽刺激后，同时，各组以加入相应浓度DMSO作为阴性对照，培养3天，利用检测试剂盒检测上清中IFN-γ浓度，反应细胞毒性T淋巴细胞活性。

抗体检测结果如图7所示，从图中可以看出，相比于对照组和19CTLs组，RBD组和1R19组均能诱导产生显著水平的RBD特异性的IgG抗体，该结果表明本申请所提供的mRNA疫苗能够有效地诱导机体产生体液免疫应答。

IFN-γ分泌检测结果如图8，从图中可以看出，相比于对照组和RBD组，19CTLs组和1R19组均能够对作为刺激物的抗原肽产生免疫应答反应，从而分泌出IFN-γ。该结果表明，本申请实施例所提供的mRNA疫苗所表达的泛素化的CTL串联抗原能够在体内有效诱导产生相应的细胞免疫应答反应，符合设计预期。

综合上述实施例可以看到，本申请实施例所提供的抗原表达载体经体外转录形成的mRNA链，一方面能够利用信号肽介导中和结构域抗原的表达分泌，另一方面能够由内部核糖体进入位点（IRES）介导泛素化的T细胞表位抗原的表达，促进其降解以及T细胞表位的形成，从而在施用后在对象体内同时诱导产生相对独立的中和抗体和T细胞免疫应答。

上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳湾实验室

清华大学

<120> 一种靶向激活体液免疫和细胞免疫的核酸疫苗载体构建及应用

<130> 1

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 582

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aacatcacca acctgtgccc cttcggcgag gtgttcaacg ccaccagatt cgccagtgtg 60

tacgcctgga acagaaagag gatctccaac tgcgtggccg attactctgt gctgtataat 120

agcgcctcct tctctacctt caaatgctat ggcgtgtccc ccacaaagct gaacgatctg 180

tgttttacca acgtgtacgc cgactccttc gtgatcagag gcgacgaggt gaggcagatc 240

gcccccggac agaccggaaa gatcgccgat tacaactaca agctgcccga cgacttcacc 300

ggctgcgtga tcgcctggaa ctccaacaac ctggacagta aggtgggggg aaactacaac 360

tacctgtacc ggctgttccg caagagcaac ctgaagccct ttgagagaga catcagcaca 420

gagatttatc aggccggcag caccccctgc aacggagtgg aaggattcaa ctgctacttc 480

ccactgcaaa gctacggctt ccagcccacc aacggcgtgg gataccagcc ctacagagtg 540

gtggtgctgt cttttgagct gctgcacgcc cccgccaccg tg 582

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr Gln Leu Tyr

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Val Tyr Phe Leu Gln Ser Ile Asn Phe

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ala Leu Ser Lys Gly Val His Phe Val

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile Lys Leu

1 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile Leu

1 5 10

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr Phe

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr Leu

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys

1 5 10

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys

1 5 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu

1 5 10

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val

1 5

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Ile Glu Tyr Pro Ile Ile Gly Asp Glu Leu

1 5 10

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 17

Val Tyr Ile Gly Asp Pro Ala Gln Leu

1 5

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 18

Thr Thr Asp Pro Ser Phe Leu Gly Arg Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 19

Val Met Val Glu Leu Val Ala Glu Leu

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 20

Val Leu Ser Glu Ala Arg Gln His Leu

1 5

<210> 21

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 21

Phe Thr Ser Asp Tyr Tyr Gln Leu Tyr Ala Ala Tyr Val Tyr Phe Leu

1 5 10 15

Gln Ser Ile Asn Phe Ala Ala Tyr Ala Leu Ser Lys Gly Val His Phe

20 25 30

Val Ala Ala Tyr Asn Arg Phe Leu Tyr Ile Ile Lys Leu Ala Ala Tyr

35 40 45

Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile Leu Ala Ala Tyr Gln Arg Asn

50 55 60

Ala Pro Arg Ile Thr Phe Ala Ala Tyr Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr

65 70 75 80

Tyr Leu Ala Ala Tyr Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Ala

85 90 95

Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys Ala Ala Tyr Met

100 105 110

Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Ala Ala Tyr Gln Tyr Ile Lys

115 120 125

Trp Pro Trp Tyr Ile Ala Ala Tyr Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln

130 135 140

Tyr Ala Ala Tyr Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Ala Ala Tyr

145 150 155 160

Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Ala Ala Tyr Ile Glu Tyr Pro

165 170 175

Ile Ile Gly Asp Glu Leu Ala Ala Tyr Val Tyr Ile Gly Asp Pro Ala

180 185 190

Gln Leu Ala Ala Tyr Thr Thr Asp Pro Ser Phe Leu Gly Arg Tyr Ala

195 200 205

Ala Tyr Val Met Val Glu Leu Val Ala Glu Leu Ala Ala Tyr Val Leu

210 215 220

Ser Glu Ala Arg Gln His Leu Ala Ala Tyr

225 230

<210> 22

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttcaccagcg attactatca gctgtacgct gcctacgtgt attttctgca gagcatcaac 60

tttgccgcct acgccctgag caagggcgtg cacttcgtgg ccgcctacaa caggttcctg 120

tacatcatca agctggccgc ctactccgaa ctggtgatcg gcgccgtcat cctggccgcc 180

tatcagagaa atgcccccag aatcaccttc gccgcctatt ccccccgctg gtacttctac 240

tacctggccg cctacgctac cgagggagcc ctgaacaccc ccaaggccgc ctataagacc 300

ttccccccca ccgagcccaa gaaagctgcc tacatggagg tgacccccag cggcacctgg 360

ctggctgctt accagtacat caagtggccc tggtacatcg ccgcctacct gaccgacgag 420

atgatcgccc agtacgccgc ctattatctg cagcccagaa ccttcctgct ggccgcttac 480

gggcccaaaa agtccaccaa cctggtagcc gcctacatcg aataccccat catcggagat 540

gagctggccg cctacgtgta catcggcgac cccgcccagc tggccgctta tacaaccgac 600

cccagcttcc tgggcagata cgccgcctac gtcatggtgg agctggtggc cgaactggcc 660

gcctacgtgc tgtctgaggc tagacagcac ctggccgctt ac 702

<210> 23

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

atggacgcca tgaagagggg gctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggagc cgtgttcgtg 60

agcgcctcc 69

<210> 24

<211> 590

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gcggccgcgg atcccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct 60

tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg 120

gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt 180

cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg 240

aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac 300

ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct gcaaaggcgg 360

cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctcacct 420

caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg 480

atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aacgtctagg 540

ccccccgaac cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgatgataat 590

<210> 25

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

atgcagattt tcgtgaaaac cctgaccggg aaaaccatca ccctggaagt cgagcccagc 60

gacaccatcg agaacgtcaa ggccaaaatc caggacaagg agggcatccc ccccgaccag 120

cagaggctga tcttcgccgg caagcagctg gaagacggca gaacactgag cgactacaac 180

atccagaagg aaagcaccct gcacctggtg ctgagactga gaggcgcc 228

Claims

1.新型冠状病毒mRNA疫苗的抗原表达载体，其特征在于，包括抗原编码区，所述抗原编码区包含依次连接的信号肽序列、中和抗原序列、内部核糖体进入位点序列、泛素化序列和T细胞抗原序列；所述中和抗原序列如SEQ ID No.1所示，所述T细胞抗原序列如SEQ IDNo.22所示，所述信号肽序列如SEQ ID No.23所示，所述内部核糖体进入位点序列如SEQ IDNo.24所示，所述泛素化序列如SEQ ID No.25所示。

2.根据权利要求1所述的抗原表达载体，其特征在于，所述抗原表达载体还包括结构修饰元件，所述结构修饰元件包括启动子、5′端非翻译区、3′端非编码区和多聚腺苷酸，所述启动子、所述5′端非翻译区、所述抗原编码区、所述3′端非编码区和所述多聚腺苷酸在所述抗原表达载体上依次连接。

3.新型冠状病毒mRNA疫苗，其特征在于，由权利要求1至2任一项所述的抗原表达载体制备得到。

4.制剂，其特征在于，包括mRNA疫苗和药学上可接受的载体，所述mRNA疫苗为权利要求3所述的新型冠状病毒mRNA疫苗。