CN115960253A - 一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 - Google Patents
一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115960253A CN115960253A CN202211049861.XA CN202211049861A CN115960253A CN 115960253 A CN115960253 A CN 115960253A CN 202211049861 A CN202211049861 A CN 202211049861A CN 115960253 A CN115960253 A CN 115960253A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tumor
- cell
- cell epitope
- epitope peptide
- mage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 150
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 117
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 109
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 70
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 57
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims abstract description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 33
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 102000025850 HLA-A2 Antigen Human genes 0.000 claims description 10
- 108010074032 HLA-A2 Antigen Proteins 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 52
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 52
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 11
- SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N (4S)-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[(2S)-2-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(2S)-5-carbamimidamido-1-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2,6-diaminohexanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SSOORFWOBGFTHL-OTEJMHTDSA-N 0.000 abstract description 9
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 9
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 abstract description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 abstract description 4
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 abstract description 4
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 230000036737 immune function Effects 0.000 abstract description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 3
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 abstract description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 3
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 abstract description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 abstract description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 18
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 17
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 9
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 8
- 102100030385 Granzyme B Human genes 0.000 description 7
- 101001009603 Homo sapiens Granzyme B Proteins 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 7
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 5
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 4
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 102000000412 Annexin Human genes 0.000 description 3
- 108050008874 Annexin Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 2
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 108010061181 influenza matrix peptide (58-66) Proteins 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 208000000649 small cell carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 102000005738 B7 Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010045634 B7 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010050685 Cytokine storm Diseases 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 239000011665 D-biotin Substances 0.000 description 1
- 235000000638 D-biotin Nutrition 0.000 description 1
- 102000001398 Granzyme Human genes 0.000 description 1
- 108060005986 Granzyme Proteins 0.000 description 1
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940076838 Immune checkpoint inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000037984 Inhibitory immune checkpoint proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008026 Inhibitory immune checkpoint proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 206010052015 cytokine release syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000013095 identification testing Methods 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012274 immune-checkpoint protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- GEVPUGOOGXGPIO-UHFFFAOYSA-N oxalic acid;dihydrate Chemical compound O.O.OC(=O)C(O)=O GEVPUGOOGXGPIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001573 trophoblastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037455 tumor specific immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种肿瘤T细胞抗原表位肽，所述肿瘤T细胞抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3任一所示。本发明所述的肿瘤T细胞抗原表位肽可用于体外的T细胞活化实验，可以应用到针对MAGE‑A3和MAGE‑A10抗原高表达的肿瘤如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝癌、头颈肿瘤等肿瘤通用疫苗的研发、肿瘤的诊断以及TCR‑T疗法的研究中。本发明所述肿瘤T细胞抗原表位肽制备成pMHC复合物或直接负荷导抗原递呈细胞，从而活化T细胞，可应用于：肿瘤疫苗的研发和制备、检测机体是否具有抗肿瘤的细胞免疫功能、辅助诊断和TCR‑T细胞免疫疗法开发。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用。
背景技术
肿瘤的发生率和死亡率在全球范围内呈现逐年升高的势态，目前存在的最主要问题是缺乏有效的治疗手段。肿瘤免疫治疗是指外源干预机体免疫系统，重新启动并维持“肿瘤-免疫”循环，恢复、提高机体的抗肿瘤免疫反应，加强对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，从而达到控制甚至特异性清除肿瘤的治疗效果。与手术、放疗和化疗等传统的治疗手段相比，肿瘤免疫治疗具有特异性强，副作用小的优点，目前，已应用在临床上的肿瘤免疫治疗方法主要包括免疫检查点抑制剂治疗、过继性细胞免疫治疗、癌症疫苗及一些新兴免疫治疗方法等。癌症的免疫疗法被科学杂志评为2013年度十大科学突破之首，也是目前被广泛研究与开发的新型抗肿瘤治疗手段。
癌症免疫循环包括几个步骤：癌细胞产生的抗原在癌细胞死亡后释放并被树突状细胞(DC)捕获。接下来，DC将MHC分子上捕获的抗原呈递给T细胞，从而引发和激活效应T细胞对癌症抗原的反应。在趋化因子的引导下，活化的T细胞进入并浸润肿瘤部位。T细胞通过TCR与抗原-MHC复合物的相互作用特异性识别并结合癌细胞并杀死癌细胞。因此，T细胞免疫应答在抗肿瘤免疫防御中具有重要作用，在疫苗研发中占据重要地位。CD8+T细胞免疫应答的第一步就是T细胞通过其表面的抗原识别受体特异性识别被癌细胞所递呈的抗原表位肽。因此，抗原表位肽是T细胞特异性识别肿瘤细胞、发挥免疫保护作用的重要关键分子，是免疫检测、免疫治疗和疫苗研发的关键靶向分子。
嵌合抗原受体T细胞技术(CAR-T)以及T细胞受体嵌合型T细胞(TCR-T)作为当前最新的两大免疫细胞技术，受到广泛的关注和研究。CAR-T细胞治疗在血液肿瘤中已经取得较好的疗效，但其引起的细胞因子风暴和神经毒性副作用可能会危及生命。而TCR-T细胞治疗是对实体瘤有效的免疫细胞治疗手段之一，将能识别肿瘤特异性抗原的TCRα和β链基因转染到T细胞中，修饰T细胞使其表达肿瘤抗原特异性的TCR抗原结合区，从而能特异性识别相应的肿瘤抗原。然后经体外扩增并回输到人体内，表达肿瘤抗原特异性TCR的T淋巴细胞可识别肿瘤细胞表面的HLA-抗原肽复合物，进而引发T细胞的免疫效应，达到杀伤肿瘤细胞的目的。肿瘤疫苗是利用肿瘤相关抗原(TAAs)、肿瘤多肽或肿瘤细胞裂解产物等诱导机体产生肿瘤特异性免疫应答，保护机体免受肿瘤细胞侵袭，实现对肿瘤的预防和治疗。包括预防性肿瘤疫苗和治疗性肿瘤疫苗两大类。治疗性肿瘤疫苗主要针对肿瘤患者，通过免疫诱导病人体内产生特异性抗体、效应细胞和特异性免疫记忆细胞，达到治疗肿瘤的目的。已有临床试验证实肿瘤全细胞疫苗、肿瘤特异性蛋白或多肽疫苗以及肿瘤核酸疫苗在肿瘤治疗过程中展现了巨大的应用潜力。
MAGE家族是原癌抗原，是癌睾丸(cancer/testis antigen)抗原超家族成员之一。MAGE家族成员超过60个，均存在于同一个MAGE同源结构域。主要分为两个亚类：MAGE-I类抗原和MAGE-II类抗原。MAGE-II类抗原的表达普遍存在于正常细胞中，而MAGE-I类抗原为TAAs，即在人体除睾丸生殖细胞和胎盘滋养组织以外的组织中均不表达，却在肿瘤中高表达，是肿瘤研究中的热点。由于生殖细胞缺乏HLA因而癌睾丸抗原不能被T细胞识别，但在恶性肿瘤中癌睾丸抗原和HLA分子同时表达则可以被T细胞识别。MAGE-I类抗原可划分为三个亚类：MAGE-A、MAGE-B和MAGE-C。MAGE-A亚家族具有严格的表达模式，其中MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A10及MAGE-A12等是MAGE家族中具有独特特征的一个抗原，在黑色素瘤、肝癌、肺癌和食管癌等患者中存在特异性高表达。近年来，以MAGE-A家族基因为靶点的抗癌作用常用两种方法：(1)接种MAGE表位抗原疫苗；(2)TCR-T免疫细胞治疗。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种肿瘤T细胞表位肽、pMHC及其制备和应用。
本发明的第一目的是提供一种肿瘤T细胞抗原表位肽。
本发明的第二目的是提供一种肿瘤T细胞抗原表位肽组合物。
本发明的第三目的是提供一种pMHC复合物。
本发明的第四目的是提供一种抗原肽-抗原递呈细胞复合物。
本发明的第五目的是提供一种编码上述肿瘤T细胞抗原表位肽的基因。
本发明的第六目的是提供上述肿瘤T细胞抗原表位肽、肿瘤T细胞抗原表位肽组合物、pMHC复合物、抗原肽-抗原递呈细胞复合物和/或基因在制备肿瘤疫苗和/或肿瘤药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
T2-A2是一种通过重组基因工程技术表达人MHC-I类分子HLA-A2的抗原递呈细胞系。只有有效的抗原表位肽才能被其递呈，从而在其细胞表面形成稳定的pMHC复合物，因此可以作为刺激T细胞的人工抗原递呈细胞。
T细胞抗原表位肽单独无法工作，必须以pMHC复合物或抗原肽-抗原递呈细胞复合物的方式进行T细胞活化。本发明利用MHC的单体和鉴定出的新型肿瘤T细胞表位进行联合复性，制备了pMHC复合物。将鉴定出的新型肿瘤T细胞抗原表位肽负荷在抗原递呈细胞表面(T2-A2细胞)，制备了抗原肽-抗原递呈细胞复合物，然后用制备好的pMHC复合物去标记T细胞，发现其抗原表位肽可以有效活化健康人外周血中T细胞产生杀伤性细胞因子，也可以有效杀伤携带肿瘤MAGE-A3，MAGE-A10抗原的靶细胞。该T细胞抗原表位肽组装成pMHC复合物，可以在非小细胞肺癌患者外周血中检测到。证明新发现的MAGE-A3和MAGE-A10 T细胞抗原表位肽能有效诱导T细胞免疫，可以应用于肿瘤通用型疫苗和免疫细胞治疗手段，如TCR-T的开发。
因此本发明请求保护一种肿瘤T细胞抗原表位肽，所述肿瘤T细胞抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3任一所示。
MAGE-A3-Mp4(SEQ ID NO：1)：LVFGIELMEV；
MAGE-A10-Mp30(SEQ ID NO：2)：VIWEALNMM；
MAGE-A10-Mp32(SEQ ID NO：3)：SLLKFLAKV。
本发明还请求保护一种肿瘤T细胞抗原表位肽组合物，所述肿瘤T细胞抗原表位肽含有氨基酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示的肿瘤T细胞抗原表位肽中的一条或多条。
本发明还请求保护一种pMHC复合物，所述pMHC复合物含有上述肿瘤T细胞抗原表位肽和/或上述肿瘤T细胞抗原表位肽组合物。
优选地，所述pMHC复合物的制备方法为：将HLA-A2重链、HLA-A2轻链β2m和上述肿瘤T细胞抗原表位肽复性得到。
本发明还请求保护一种抗原肽-抗原递呈细胞复合物，所述抗原肽-抗原递呈细胞复合物为表面有上述肿瘤T细胞抗原表位肽和/或上述肿瘤T细胞抗原表位肽组合物的抗原递呈细胞。
优选地，所述抗原递呈细胞为T2-A2细胞。
更优选地，所述T2-A2细胞为过表达HLA-A2的T2细胞。
更优选地，所述抗原肽-抗原递呈细胞复合物的制备方法为：将上述肿瘤T细胞抗原表位肽与抗原递呈细胞混合孵育，得到抗原肽-抗原递呈细胞复合物。
本发明还请求保护一种编码上述肿瘤T细胞抗原表位肽的基因。
本发明还请求保护上述肿瘤T细胞抗原表位肽、肿瘤T细胞抗原表位肽组合物、pMHC复合物、抗原肽-抗原递呈细胞复合物和/或基因在制备肿瘤疫苗和/或肿瘤药物中的应用；所述肿瘤为肺癌。
优选地，所述肿瘤还包括MAGE-A3和/或MAGE-A10高表达的肿瘤。
更优选地，所述MAGE-A3和/或MAGE-A10高表达的肿瘤为黑色素瘤、肝癌和/或食管癌。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明发现了3种肿瘤T细胞抗原表位肽，可用于体外的T细胞活化实验。所述肿瘤T细胞抗原表位肽可以应用到针对MAGE-A3和MAGE-A10抗原高表达的肿瘤如黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝癌、头颈肿瘤等肿瘤通用疫苗的研发、肿瘤的诊断以及TCR-T疗法的研究中。
本发明所述肿瘤T细胞抗原表位肽制备成pMHC复合物或直接负荷导抗原递呈细胞，从而活化T细胞，可应用于：
(1)肿瘤疫苗的研发和制备：肿瘤细胞死亡后释放肿瘤抗原，DC将MHC分子上捕获的抗原呈递给T细胞，从而引发和激活效应T细胞对癌症抗原的反应，本发明所述肿瘤T细胞抗原表位肽能诱导机体产生免疫应答生成抗原特异性T细胞，故本发明所述肿瘤T细胞抗原表位肽是肿瘤通用疫苗的候选抗原表位肽。
(2)检测机体是否具有抗肿瘤的细胞免疫功能：待检者体内检测到肿瘤抗原特异性T细胞，代表机体已经产生了T细胞免疫功能，根据该抗原表位肽制备成的pMHC复合物标记的抗原特异性CD8T的比例，反应待检者抗肿瘤免疫反应的强弱。
(3)辅助诊断：使用本发明所述肿瘤T细胞抗原表位肽或肿瘤T细胞抗原表位肽组合物可检测出特异性免疫反应成分，从而提高诊断的特异性，并快速筛查出MAGE-A3或MAGE-A10抗原阳性的肿瘤患者。
(4)TCR-T细胞免疫疗法开发。
附图说明
图1为pMHC复合物的组装示例图；
图2为31种候选肿瘤T细胞抗原表位肽的T2-A2抗原提呈的鉴定；A：31种候选肿瘤T细胞抗原表位肽的T2-A2抗原提呈的鉴定试验结果；B：图A的统计图；
图3为31种候选肿瘤T细胞抗原表位肽形成pMHC复合物的检测图；
图4为31种候选肿瘤T细胞抗原表位肽对CD8+T细胞的活化图；A：流式细胞仪检测图；B：MAGE-A3-Mp4、MAGE-A10-Mp30和MAGE-A10-Mp32对应的CD8+T细胞活化柱形图；
图5为CD8+T细胞释放IFN-γ和GZMB的释放检测图；A：流式细胞仪检测CD8+T细胞的释放的GZMB比例图；B：流式细胞仪检测CD8+T细胞的释放的IFN-γ比例图；
图6为Annexin V-APC的检测结果图；
图7为非小细胞癌患者及健康人体内特异性CD8+T细胞比例图；A：流式细胞术检测HLA-A2阳性的NSCLC患者及健康人中MAGE-A3-Mp4、MAGE-A10-Mp30和MAGE-A10-Mp32抗原表位特异性CD8+T细胞的结果图；B：MAGE-A3-Mp4、MAGE-A10-Mp30和MAGE-A10-Mp32制备的pMHC复合物检测NSCLC患者及健康人体内的CD8+T细胞的结果图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1肿瘤T细胞抗原表位肽的预测及鉴定
pMHC复合物的组装示例图如图1所示。
1、实验方法
(1)肿瘤T细胞抗原表位肽的预测
使用IEDB Recommended 2.22(http://www.iedb.org/)在线网站中的“MHC IBinding”工具对肿瘤抗原MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10和MAGE-A12蛋白序列进行CD8 T细胞表位预测。
MHC等位基因选择为HLA-A*02:01，得到31种候选肿瘤T细胞抗原表位肽，见表1。
(2)肿瘤T细胞抗原表位肽的鉴定
按照表1的序列，人工合成步骤(1)得到的31种候选肿瘤T细胞抗原表位肽，各自分别用DMSO配置成浓度为10mM的母液。
取对数生长期的T2-A2细胞接种到96孔板中(2×105/孔)，分别设置空白组、阴性对照组、阳性对照组和各个肿瘤T细胞抗原表位肽组，每个组别3个复孔，每个孔的终体积为200μL。
空白组为孔中只有T2-A2细胞；
阴性对照组为T2-A2细胞和Negative peptide(EB病毒肽，氨基酸序列：IVTDFSVIK，如SEQ ID NO：4所示)共孵育；
阳性对照组为T2-A2细胞和Positive peptide(甲型流感M1肽，氨基酸序列：GILGFVEFTL，如SEQ ID NO：5所示)共孵育；
设置31个肿瘤T细胞抗原表位肽组，分别用人工合成的31种不同的候选肿瘤T细胞抗原表位肽和T2-A2细胞共孵育。
将96孔板在37℃下孵育4小时后离心去上清液，洗涤两次，细胞沉淀用FITC anti-human HLA-A2(β2m)抗体在4℃避光孵育30min，流式细胞仪对各组细胞分别进行检测。
重复上述操作进行三次平行检测。
2、实验结果
预测得到31种候选肿瘤T细胞抗原表位肽的具体信息如表1所示。
表1：31种候选肿瘤T细胞抗原表位肽
肿瘤T细胞抗原表位肽的鉴定结果如图2所示，结果显示：步骤(1)预测得到的31种肿瘤T细胞抗原表位肽种有29种肿瘤T细胞抗原表位肽(除MAGE-A4-Mp14和MAGE-A6-Mp24)可以被抗原递呈细胞有效提呈给T细胞。
结果说明：这29种肿瘤T细胞抗原表位肽是T细胞抗原表位肽。
实施例2肿瘤T细胞抗原表位肽形成pMHC四聚体复合物的检测
1、实验方法
(1)肿瘤T细胞抗原表位肽的pMHC复合物单体的制备
将实施例1步骤(2)得到的母液(10mM)用PBS稀释至400μM，得到稀释后的母液，置于冰上，备用。
将20μL稀释后的母液和20μL的Flex-T单体(200μg/mL)添加至96孔U形板中，吹打混匀，拿开封板摸；将96孔U形板置于冰上，用UV灯照射30min(UV灯到样本之间的距离保持于2～5cm)；盖上封板摸，37℃干暗处孵育30min，即得31种候选肿瘤T细胞抗原表位肽与Flex-T单体分别形成的31个pMHC复合物单体，将其设置为实验组。
将甲型流感M1肽(氨基酸序列：GILGFVEFTL，如SEQ ID NO：5所示)与Flex-T单体形成的pMHC复合物设置为阳性对照组Pos；
将EB病毒肽(氨基酸序列：IVTDFSVIK，如SEQ ID NO：4所示)与Flex-T单体形成的pMHC复合物设置为阴性对照组Neg；
将PBS与Flex-T单体形成的pMHC单体设置为UV对照组；
(2)ELISA检测表位肽形成pMHC四聚体复合物的能力
采用ELISA法检测实施例1步骤(2)人工合成的31种候选肿瘤T细胞抗原表位肽是否可以形成pMHC四聚体，具体方法如下：
室温下，在96孔板中加入100μL的0.5μg/mL的链霉亲和素(Streptavidinsolution)孵育过夜(16～18h)，接着用300μL的1×Wash Buffer洗涤3次，并加入1×Dilution Buffer(1M NaCl，0.5M Tris，1％BSA(w/v)，0.2％Tween 20(w/v)，pH＝8.0)在室温下封闭30min。
将步骤(1)的pMHC复合物单体(阳性对照组Pos、阴性对照组Neg、UV对照组和实验组)分别用1×Dilution Buffer进行1200倍稀释。
同时设置Monomer组：将Flex-T单体进行同等稀释；Blank组：仅加入与其他组等量的1×Dilution Buffer。
以阳性对照组Pos为例：
弃掉96孔板内液体，在滤纸上拍干，向96孔板中加入100μL稀释后的pMHC复合物单体。
将阴性对照组Neg、UV对照组、实验组、Monomer组和Blank组进行同等处理加入96孔板中。
盖上封板摸，37℃孵育1h。孵育结束后，使用洗涤缓冲液对96孔板洗涤3次，接着添加100μL稀释HRP-anti-β2M(抗体BioLegend，Cat#280303，US)，在37℃下继续孵育1h，孵育结束后进行洗涤。
接着向每孔中添加100μL底物溶液(10.34mL的去离子水、1.2mL的pH 4.0，0.1M的柠檬酸一水合物/柠檬酸三钠二水合物、240μL的40nM的ABTS，120μL的过氧化氢溶液)，并在室温(18～25℃)下，干暗处振荡(400～500rpm)显色8min。
使用50μL的Stop Solution(2％草酸二水合物，w/v)终止反应。30min内用酶标仪在414nm波长下测定吸光度值(OD值)。
2、实验结果
以Monomer组OD值为100％，计算UV对照组、阳性对照组Pos、影响对照组Neg和实验组的相对OD值，比值大小代表各肿瘤抗原表位肽形成pMHC四聚体。相对OD值大于UV对照组的，则判断为可形成pMHC四聚体。
结果如图3所示，结果显示：与UV对照组相比，MAGE-A4-Mp14和MAGE-A4-Mp22复合物组相对OD值显著降低，其余各组均显著升高(P＜0.001)。结果说明：31种候选肿瘤T细胞抗原表位肽中除MAGE-A4-Mp14和MAGE-A4-Mp22之外，其余29种候选肿瘤T细胞抗原表位肽均可以形成pMHC四聚体复合物，是潜在的可引起特异性免疫应答的候选抗原表位肽。
实施例3肿瘤T细胞抗原表位肽-抗原递呈细胞活化T细胞
APC或靶细胞表面的抗原肽/MHC复合物与TCR结合，提供T细胞活化的第一个信号；APC表面的B7分子与T细胞上的CD28分子结合，提供第二个信号；IL-2等提供共刺激信号。通过将能与HLA分子结合的肿瘤抗原表位肽负载APC细胞T2A2后与CD8T细胞共培养，通过四聚体检测活化CD8T细胞的比例，流式分析产生γ-干扰素(IFN-γ)及颗粒酶(GZMB)的抗原特异T细胞比例，分析接种肿瘤抗原负载的T2A2诱导CD8T细胞的活化的能力。
1、实验方法
分离健康志愿者的外周静脉血的单个核淋巴细胞(PBMCs)，并进一步分离CD8+T细胞。将T2-A2细胞用CFSE标记，接着用20μg/mL的丝裂霉素处理30min，分别用实施例1步骤(1)的31种候选肿瘤T细胞抗原表位肽进行孵育。
取30μL实施例2步骤(1)得到的肿瘤T细胞抗原表位肽的pMHC复合物单体到1.5mL的EP管中，加入3.3μL的链霉亲和素(BioLegend Cat#405203，US)，枪头吹打混匀，4℃避光孵育30min。
孵育结束后，向EP管中加入2.4μL封闭液(1.6ul，50mM的D-biotin(ThermoFisher，Cat#B20656，US)、6ul的10％(w/v)NaN3和192.4ul PBS)，吹打终止反应。4～8℃下孵育过夜，得到pMHC四聚体复合物。
Mixed peps组设置为：将0.5×106的CD8+T细胞与0.5×106负荷31种候选肿瘤T细胞抗原表位肽的T2-A2细胞在培养基中共培养。
并用1μg/mL的抗人CD28抗体核50IU/mL的IL-2共刺激。培养过程中每隔两天向培养基中补充50IU/mL的IL-2及20μM的候选肿瘤T细胞抗原表位肽。
培养7天后，用pMHC四聚体复合物标记特异性CD8+T细胞，检测特异性CD8+T比例和抗原特异性CD8+T细胞释放IFN-γ和GZMB情况，并同时检测T2-A2细胞凋亡标记物AnnexinV-APC百分比。
同时设置阳性对照组(T2-A2细胞负荷甲型流感M1肽)、阴性对照组(T2-A2细胞负荷EB病毒肽)和UV对照组(PBS与Flex-T单体形成的pMHC复合物)，进行同等处理检测。
2、实验结果
不同肿瘤T细胞抗原表位肽活化CD8+T细胞的结果如图4所示；结果显示：31种候选肿瘤T细胞抗原表位肽种有3种肿瘤T细胞抗原表位肽可以活化T细胞，分别为MAGE-A3-Mp4(SEQ ID NO：1)、MAGE-A10-Mp30(SEQ ID NO：2)和MAGE-A10-Mp32(SEQ ID NO：3)，活化CD8+T细胞的比例分别为5.20％，0.55％和5.21％。
CD8+T细胞释放IFN-γ和GZMB的情况如图5所示；结果显示：与阴性对照组Negctrl相比，mixed peps组活化CD8+T细胞释放IFN-γ和GZMB的效率极显著升高(P＜0.001)；结果说明：MAGE-A3-Mp4(SEQ ID NO：1)、MAGE-A10-Mp30(SEQ ID NO：2)和MAGE-A10-Mp32(SEQ ID NO：3)抗原表位活化的特异性CD8+T细胞可以释放IFN-γ和GZMB。
Annexin V-APC的检测结果如图6所示；结果显示：与阴性对照组Neg ctrl相比，mixed peps组Annexin V+CFSE+T2A2细胞比例极显著增加(P<0.001)；结果说明：MAGE-A3-Mp4(SEQ ID NO：1)、MAGE-A10-Mp30(SEQ ID NO：2)和MAGE-A10-Mp32(SEQ ID NO：3)抗原表位活化的特异性CD8+T细胞可以杀伤靶细胞T2-A2。
实施例4临床患者外周血抗原表位肽特异性细胞毒性T细胞检测
1、实验方法
分离非小细胞癌症(NSCLC)患者及健康人外周静脉血中的单个核淋巴细胞(PBMCs)，并鉴定其HLA亚型。
对于其中HLA-A2阳性的PBMCs样品用实施例3中得到的pMHC四聚体复合物和CD8-APC抗体进行染色，然后进行流式上机观察。
2、实验结果
流式上机观察结果图如图7所示，结果显示，氨基酸序列如SEQ ID NO1～3所示的3中肿瘤T细胞抗原表位肽MAGE-A3-Mp4(SEQ ID NO：1)、MAGE-A10-Mp30(SEQ ID NO：2)和MAGE-A10-Mp32(SEQ ID NO：3)的pMHC复合物可以识别NSCLC患者体内产生的抗原特异性CD8+T细胞，且于健康人相比显著升高；结果说明：NSCLC患者体内存在MAGE-A3-Mp4(SEQ IDNO：1)、MAGE-A10-Mp30(SEQ ID NO：2)和MAGE-A10-Mp32(SEQ ID NO：3)此三种抗原表位肽产生免疫应答的特异性杀伤型CD8+T细胞
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种肿瘤T细胞抗原表位肽，其特征在于，所述肿瘤T细胞抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3任一所示。
2.一种肿瘤T细胞抗原表位肽组合物，其特征在于，所述肿瘤T细胞抗原表位肽含有氨基酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：3所示的肿瘤T细胞抗原表位肽中的一条或多条。
3.一种pMHC复合物，其特征在于，所述pMHC复合物含有权利要求1所述的肿瘤T细胞抗原表位肽和/或权利要求2所述的肿瘤T细胞抗原表位肽组合物。
4.权利要求3所述的pMHC复合物的制备方法，其特征在于，将HLA-A2重链、HLA-A2轻链β2m和权利要求1所述的肿瘤T细胞抗原表位肽复性得到。
5.一种抗原肽-抗原递呈细胞复合物，其特征在于，所述抗原肽-抗原递呈细胞复合物为表面有权利要求1所述的肿瘤T细胞抗原表位肽和/或权利要求2所述的肿瘤T细胞抗原表位肽组合物的抗原递呈细胞。
6.根据权利要求5所述的抗原肽-抗原递呈细胞复合物，其特征在于，所述抗原递呈细胞为T2-A2细胞。
7.根据权利要求6所述的抗原肽-抗原递呈细胞复合物，其特征在于，所述T2-A2细胞为过表达HLA-A2的T2细胞。
8.权利要求5～7任一所述的抗原肽-抗原递呈细胞复合物的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的肿瘤T细胞抗原表位肽与抗原递呈细胞混合孵育，得到抗原肽-抗原递呈细胞复合物。
9.一种编码权利要求1所述肿瘤T细胞抗原表位肽的基因。
10.权利要求1所述的肿瘤T细胞抗原表位肽、权利要求2所述的肿瘤T细胞抗原表位肽组合物、权利要求3所述的pMHC复合物、权利要求5所述的抗原肽-抗原递呈细胞复合物和/或权利要求9所述的基因在制备肿瘤疫苗和/或肿瘤药物中的应用；所述肿瘤为肺癌。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311437367.5A CN117487000A (zh) | 2022-08-30 | 2022-08-30 | 一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 |
| CN202311435378.XA CN117486999A (zh) | 2022-08-30 | 2022-08-30 | 一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 |
| CN202211049861.XA CN115960253A (zh) | 2022-08-30 | 2022-08-30 | 一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211049861.XA CN115960253A (zh) | 2022-08-30 | 2022-08-30 | 一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 |
Related Child Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311435378.XA Division CN117486999A (zh) | 2022-08-30 | 2022-08-30 | 一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 |
| CN202311437367.5A Division CN117487000A (zh) | 2022-08-30 | 2022-08-30 | 一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115960253A true CN115960253A (zh) | 2023-04-14 |
Family
ID=87360505
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311435378.XA Pending CN117486999A (zh) | 2022-08-30 | 2022-08-30 | 一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 |
| CN202211049861.XA Pending CN115960253A (zh) | 2022-08-30 | 2022-08-30 | 一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 |
| CN202311437367.5A Pending CN117487000A (zh) | 2022-08-30 | 2022-08-30 | 一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311435378.XA Pending CN117486999A (zh) | 2022-08-30 | 2022-08-30 | 一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311437367.5A Pending CN117487000A (zh) | 2022-08-30 | 2022-08-30 | 一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (3) | CN117486999A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117003855A (zh) * | 2023-09-20 | 2023-11-07 | 广州市老人院 | 一种t细胞受体及其应用 |
| CN117402214A (zh) * | 2023-10-24 | 2024-01-16 | 暨南大学附属第六医院(东莞市东部中心医院) | 甲型流感病毒cd8+t细胞抗原表位肽及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140206574A1 (en) * | 2011-08-31 | 2014-07-24 | Karen Chapman | Methods and Compositons for the Treatment and Diagnosis of Cancer |
| CN108865994A (zh) * | 2014-03-12 | 2018-11-23 | 国立癌中心 | 自身癌抗原特异性cd8+ t细胞的分离及增殖方法 |
| US20210113653A1 (en) * | 2019-10-18 | 2021-04-22 | Trustees Of Boston University | Cal-t constructs and uses thereof |
| CN114751965A (zh) * | 2022-02-24 | 2022-07-15 | 暨南大学 | 一种新型冠状病毒t细胞抗原表位肽及其在制备疫苗中的应用 |
-
2022
- 2022-08-30 CN CN202311435378.XA patent/CN117486999A/zh active Pending
- 2022-08-30 CN CN202211049861.XA patent/CN115960253A/zh active Pending
- 2022-08-30 CN CN202311437367.5A patent/CN117487000A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140206574A1 (en) * | 2011-08-31 | 2014-07-24 | Karen Chapman | Methods and Compositons for the Treatment and Diagnosis of Cancer |
| CN108865994A (zh) * | 2014-03-12 | 2018-11-23 | 国立癌中心 | 自身癌抗原特异性cd8+ t细胞的分离及增殖方法 |
| US20210113653A1 (en) * | 2019-10-18 | 2021-04-22 | Trustees Of Boston University | Cal-t constructs and uses thereof |
| CN114751965A (zh) * | 2022-02-24 | 2022-07-15 | 暨南大学 | 一种新型冠状病毒t细胞抗原表位肽及其在制备疫苗中的应用 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117003855A (zh) * | 2023-09-20 | 2023-11-07 | 广州市老人院 | 一种t细胞受体及其应用 |
| CN117003855B (zh) * | 2023-09-20 | 2024-02-23 | 广州市老人院 | 一种t细胞受体及其应用 |
| CN117402214A (zh) * | 2023-10-24 | 2024-01-16 | 暨南大学附属第六医院(东莞市东部中心医院) | 甲型流感病毒cd8+t细胞抗原表位肽及其应用 |
| CN117402214B (zh) * | 2023-10-24 | 2024-03-19 | 暨南大学附属第六医院(东莞市东部中心医院) | 甲型流感病毒cd8+t细胞抗原表位肽及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117487000A (zh) | 2024-02-02 |
| CN117486999A (zh) | 2024-02-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN115960253A (zh) | 一种肿瘤T细胞抗原表位肽、pMHC及其制备和应用 | |
| JP6435286B2 (ja) | 癌ワクチン組成物 | |
| EP1691824B1 (en) | Proteins belonging to the bcl-2 family and fragments thereof, and their use in cancer patients | |
| KR101391561B1 (ko) | Ｈｌａ-ａ*3303 구속성 ｗｔ1 펩티드, 및 그것을 포함하는 의약 조성물 | |
| Zeestraten et al. | Addition of interferon‐α to the p53‐SLP® vaccine results in increased production of interferon‐γ in vaccinated colorectal cancer patients: A phase I/II clinical trial | |
| JP2005511037A5 (zh) | ||
| CA2468258A1 (en) | Peptide agonists of prostate-specific antigen, and uses therefor | |
| EP2933261B1 (en) | Method for activating helper t cell | |
| CA2777821A1 (en) | Tumor-associated peptides that bind to mhc-molecules | |
| US20110097312A1 (en) | Anti-cancer vaccines | |
| Cai et al. | Protective cellular immunity generated by cross-presenting recombinant overlapping peptide proteins | |
| CN115785253A (zh) | 原发性肝癌相关抗原的胸腺依赖性淋巴细胞抗原表位肽及其应用 | |
| CN116970058B (zh) | 针对tp53基因r249s突变的肿瘤新抗原多肽及其应用 | |
| CN114085281A (zh) | 一种肿瘤抗原表位肽及其多聚体和应用 | |
| CN1201817C (zh) | 一种治疗肝癌的肿瘤ct抗原免疫诱导剂及其制备方法 | |
| EP3322718A1 (en) | Histone anti-cancer vaccines | |
| CN113416240B (zh) | 一种用于诱导肿瘤特异性免疫响应的通用型抗原肽库及试剂盒 | |
| CN1253572C (zh) | 分离的结合hla－c分子的肽及其用途 | |
| CN110139875B (zh) | Col14a1衍生的肿瘤抗原多肽及其应用 | |
| CN110960525A (zh) | 新型eed-ezh2相互作用抑制剂的确定和评价 | |
| CN116948004B (zh) | 针对ctnnb1基因h36p突变的肿瘤新抗原多肽及其应用 | |
| JP4039483B2 (ja) | ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球ｍＨＡエピトープペプチド及びその用途 | |
| JP5504562B2 (ja) | 癌の検出方法 | |
| WO2010018207A1 (en) | Endoglin peptides, vaccines and methods for preparing the same | |
| Chen et al. | Neo‐Antigen‐Reactive T Cells Immunotherapy for Colorectal Cancer: A More Personalized Cancer Therapy Approach |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |