CN110960525A - 新型eed-ezh2相互作用抑制剂的确定和评价 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及图1所示的化合物49作为EED‑EZH2相互作用的小分子抑制剂的用途，及其在制备预防和/或治疗恶性淋巴瘤的药物中的用途。所述恶性淋巴瘤为弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的疾病。

Description

新型EED-EZH2相互作用抑制剂的确定和评价
技术领域
本发明属于医药领域，涉及图1所示的化合物49作为EED-EZH2相互作用的小分子抑制剂的用途及其在制备预防和/或治疗恶性淋巴瘤的药物中的用途。
背景技术
组蛋白的甲基化是介导多种基本细胞过程的重要表观遗传修饰之一。多梳抑制复合物2 (Polycomb Repressive Complex 2，即PRC2)具有组蛋白甲基转移酶活性，可催化组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化，在胚胎发育、干细胞可塑性和细胞分化等多种生物学进程中发挥重要的调节作用。PRC2由E2H2、EED和SUZ12三个关键亚基构成，E2H2是催化亚基，与EED和SUZ12形成复合物后发挥作用，EED或SUZ12的缺失都会使PRC2失活。
大量研究表明，PRC2核心组分的活性异常与多种疾病密切相关，尤其是恶性肿瘤的侵袭、发生和发展。在多种人类癌症中，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、大肠癌、神经胶质瘤、淋巴瘤，EZH2、EED和SUZ12表达水平显著升高，而EZH2的下调可以显著抑制这些肿瘤细胞的增殖。因此，PRC2是一种非常有前景的抗肿瘤靶点。
靶向EZH2或EED-EZH2蛋白-蛋白相互作用(PPI)是目前研发PRC2抑制剂的两种策略。在已报道的EZH2抑制剂中，GSK126、EPZ6438和CPI-1205已进入临床试验。然而，一方面，由于EZH2抑制剂直接作用于其天然底物S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的结合位点，而人体内超过50种甲基转移酶中都有类似的SAM结合口袋，因而，需要花费大量的实验资源去检测化合物对其他同源蛋白的选择性；另一方面，EZH2需要与EED和SUZ12形成复合物后才能发挥催化活性，因而，通过抑制EZH2与其辅助蛋白（如EED）的相互作用也可以抑制EZH2的催化活性，同时，由于EZH2蛋白-辅助蛋白相互作用位点的特异性远高于其与SAM结合位点的特异性，故靶向蛋白-蛋白相互作用的位点抑制剂可以解决该化合物的选择性难题。2013年，哈佛医学院的WoojinKim等人根据EZH2与EED的复合物晶体结构，设计合成了一种EZH2环肽类化合物(stapled peptide)，选择性抑制EZH2与EED的结合，促进PRC2多个组分的降解，进而抑制其甲基转移酶活性。相比EZH2抑制剂，该环肽类化合物不仅对依赖EZH2催化活性的肿瘤细胞有杀伤作用，更重要的是，对一些虽然依赖EZH2但是不依赖其甲基转移酶活性的肿瘤细胞（如基底样恶性乳腺癌、雄激素抵抗性恶性前列腺癌等）具有明显的增殖抑制作用，因而，极大地扩大了PRC2复合物抑制剂的应用范围。然而，由于多肽类化合物通常存在细胞渗透能力低、代谢稳定性差和制备昂贵等缺点，其在临床上的使用受到了严重的制约。与此相反，小分子化合物具有通透性好、代谢稳定性高和制备难度低等特点，有效弥补了多肽类化合物的不足。因此，特异性靶向EED-EZH2相互作用的高活性、高成药性小分子抑制剂具有更广阔的临床应用前景，可以为多种依赖于EZH2的恶性肿瘤的治疗提供有力的理论支撑。
EED与EZH2的相互作用界面（顶部和底部）均可以作为PPI抑制剂的靶点。诺华制药公司的研究员已经发现了多个靶向EED顶部的PPI抑制剂并确定了共晶复合物结构，而目前，靶向EED底部的PPI抑制剂却很少。
综上所示，本领域迫切需要开发靶向EED底部的PPI小分子抑制剂。
发明内容
本发明的发明人为解决上述难题，通过虚拟筛选结合生物学评价，发现了一种靶向EED底部的新型EED-EZH2相互作用小分子抑制剂，并测定了其对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系Toledo细胞的抗增殖活性。由此本发明的一个目的在于提供一种新型EED-EZH2相互作用小分子抑制剂——化合物49，如图1所示。
本发明的另一个目的在于提供图1所示的化合物49在制备预防和/或治疗恶性淋巴瘤的药物中的用途。
优选地，所述恶性淋巴瘤为弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的疾病。
图1所示的化合物49作为EED-EZH2相互作用的抑制剂和PRC2的抑制剂，能够有效地抑制EED-EZH2相互作用，从而抑制PRC2的催化活性，进而有效地预防和治疗与弥漫性大B细胞淋巴瘤相关的恶性淋巴瘤疾病。
附图说明
图1 新型EED-EZH2相互作用小分子抑制剂——化合物49。
图2 虚拟筛选流程图。
图3 化合物49的预测结合模式。
图4 MACCS指纹图谱相似度。
图5 化合物49的化学结构和抑制曲线。
图6 化合物49的抗细胞增殖活性。
具体实施方式
在本发明中，采用荧光偏振技术对候选化合物进行高通量筛选，该荧光偏振方法已被广泛地用于蛋白质-蛋白质或核酸-蛋白质之间相互作用的小分子抑制剂的高通量筛选工作，其方法是在缓冲液中加入EED蛋白、FITC-EZH2多肽示踪底物和待检测化合物，室温孵育数小时后，用酶标仪检测其荧光偏振值，结果表明，化合物49可以与EZH2多肽竞争结合EED蛋白；采用分子对接技术探讨了化合物49与EED的结合方式；进行体外细胞活性分析，测定化合物49对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系的Toledo细胞的抗增殖活性，结果表明，化合物49对Toledo细胞表现出剂量依赖性抗增殖活性。
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，这些实施例并非限制性的，而仅作为示例说明本发明。
实验例1：对SPECS数据库进行基于分子对接的虚拟筛选，选出候选化合物，采用分子对接技术预测苗头化合物与EED的结合模式。
在之前的研究中，我们通过虚拟筛选发现了第一个靶向EED底部的有效EED-EZH2相互作用抑制剂（阿司咪唑IC50 = 93.80 μM），为了获得更多靶向EED底部的PPI抑制剂，对包含211838个化合物的SPECS数据库进行基于分子对接的虚拟筛选。
分子对接使用软件包Maestro 7.5.中的Glide 5.5程序。使用蛋白制备向导工作流程中的默认设置最小化蛋白质坐标，以分解结合自由能确定的关键残基（R46残基）为中心，构建一个长度为15 Å 的立方体盒子作为结合位点，同时在该盒子范围内生成格点；将SPECS数据库准备好的化合物以标准精度(SP)模式导入预先设定好的结合位点中，对排名前500的化合物进行进一步的对接验证和额外精度(XP)分析；随后，采用Pipeline Pilot7.5对排名前200的化合物进行聚类分析，根据聚类分析结果，选择50种候选化合物并从SPECS数据库供应商购买；之后采用荧光偏振实验检测它们的EED-EHZ2相互作用抑制活性，选出苗头化合物，虚拟筛选流程图如图2所示。
预测的化合物49的结合模式如图3所示，从图中可知，化合物49能很好地占据R46的结合位点，与残基F372、W373和L391形成氢键作用，与残基L315、L318、L253、C330、F356、Q374、V393、E394和P396形成疏水作用。
实施例2：用RDKit计算MACCS指纹图谱相似度。
采用MolFromSmiles将化合物49和参考化合物（阿司咪唑和盐酸阿扑吗啡）的smiles格式转换成二维结构，计算MACCS关键指纹图谱相似度并做比较。实验结果如图4所示，从结果可以看出，化合物49与阿司咪唑和盐酸阿扑吗啡的结构相似度很小。
实施例3：蛋白质的表达和纯化。
将EED基因（编码氨基酸序列为81~441的EED蛋白）亚克隆到一个修饰过的pET28a载体（N-末端有6 × His SUMO 标记）中，用大肠杆菌菌株BL21 (DE3)在16 ℃下过度表达重组蛋白，收集菌株，超声，离心 (18000 rpm, 30 min, 4 ℃)，取上清液；用镍亲和层析色谱 (GE Healthcare)和尺寸排阻色谱 (Superdex 75; GE Healthcare)纯化蛋白质。蛋白质储存在含有 25 mM HEPES (pH 8.0), 150 mM NaCl and 1 mM DTT的缓冲液中。
实施例4：荧光偏振方法(Fluorescence Polarization, FP)检测候选化合物对EED-EZH2相互作用的影响。
荧光偏振实验，采用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate ,FITC)标记的EHZ2多肽作为示踪底物，从100 mM DMSO储存液中制备一系列稀释浓度的待测化合物49，在40 μL FP缓冲液(25mM HEPES, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1 mg/mL BSA和0.01% NP40)中加入625 nM EED蛋白、20 nM FITC-EZH2多肽示踪底物（残基为39-63）和不同浓度的待测化合物49，室温孵育2小时，用全自动多功能酶标仪(POLAR star Omega Microplatereader, EnVision, Perkin Elmer)检测荧光偏振值，所用激发光和发射光波长分别为485nm和520nm；每组均设三组重复实验，实验数据采用GraphPad Prism 6.0软件分析并制图。结果如图5所示，化合物49(IC50 = 54.90 ± 2.85 μM)表现出比阿司咪唑(IC50 =93.80 μM)更有效的抑制活性，表明化合物49可以与EZH2多肽竞争结合EED蛋白，表现出有效的抑制活性。
实施例5：体外细胞活性分析实验检验化合物49对PRC2活性失调引起的DLBCLs癌细胞增殖的影响。
在含有10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基上，以每孔2 x104个细胞的密度培养指数生长的细胞，然后用100μM和50μM的化合物49进行孵育，孵育三天后，用Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability kit (Promega)检测细胞活性，实验结果如图6所示，化合物49对Toledo细胞表现出剂量依赖性抗增殖活性。
综合上述具体实施例测定结果，化合物49能很好地占据R49的结合位点，与两个已知活性化合物（阿司咪唑和盐酸阿扑吗啡）的指纹图谱相似性很小，表现出比阿司咪唑(IC50= 93.80μM)更有效的抑制活性，对Toledo细胞表现出剂量依赖性抗增殖活性。我们的工作为发现更多PRC2抑制剂提供了新的骨架，为设计新型EED-EZH2相互作用抑制剂提供了结构上的启示。

Claims (1)

1.图1所示的化合物49作为EED-EZH2相互作用的小分子抑制剂及其在制备预防和/或治疗恶性淋巴瘤的药物中的用途。
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