CN1201817C

CN1201817C - 一种治疗肝癌的肿瘤ct抗原免疫诱导剂及其制备方法

Info

Publication number: CN1201817C
Application number: CN 01134673
Authority: CN
Inventors: 陈红松
Original assignee: Hepatosis Inst Peking University
Current assignee: Hepatosis Inst Peking University; Beijing Institute of Hepatology
Priority date: 2001-11-09
Filing date: 2001-11-09
Publication date: 2005-05-18
Anticipated expiration: 2021-11-09
Also published as: CN1416896A

Abstract

本发明合成了一系列可激活体外细胞毒T淋巴细胞的MAGE-3、4、10以及NY-ESO-1中可被HLA-A2结合的九肽或十肽片段，不采用用DC递呈该或DC递呈该肽，可激活具有特异性杀伤功能的CTL，活化的淋巴细胞的分泌IL-12和IL-10的功能增强。结果表明无论是正常人还是HCC患者，均可以通过DC递呈MAGE和NY-ESO-1抗原肽活化效应T细胞，从而产生特异性的针对MAGE和NY-ESO-1抗原肽的CTL应答。证明单独或由DC递呈的MAGE和NY-ESO-1抗原肽是一种有前途的治疗肝癌的肿瘤CT抗原疫苗。也可能成为一种预防性疫苗。本发明的方法简单可行，适合工业化生产。

Description

一种治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂及其制备方法

发明领域

本发明涉及一种治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂及其制备方法，特别是使用至少两种多肽伴或不伴有细胞佐剂作为治疗性疫苗，以达到杀伤所有残存肿瘤细胞并增强细胞免疫应答的治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂及其制备方法，属于生物工程领域。

现有技术

恶性肿瘤是严重威胁人类身体健康的难治性重大疾病。原发性肝细胞癌(HCC)是一种恶性程度高、治愈率低、预后差的恶性肿瘤。其中肝细胞癌在我国属高发性肿瘤，其死亡率在我国为所有恶性肿瘤的第二位。全世界有25万人死于肝癌，其中我国为11万人，占全世界死亡人数的44％。采用现阶段的治疗手段，国外报道肝癌的5年生存率仅为10％左右，我国学者报道5年生存率为32.7％，10年生存率为23.4％。复发和转移是肝癌治疗中的主要问题，也是影响生存率的主要因素。

肝细胞癌(HCC)死亡率高是由于HCC的高转移率和高复发率而居高不下。近年来西医对于原发性肝癌的治疗主要有外科手术治疗、介入治疗、化学药物治疗、放射治疗等。其中外科手术治疗占主导地位，由于我国肝癌多合并严重的肝硬化，且易肝内播散和远处转移，使手术切除受到很大限制。而且这些治疗模式基本上都是基于直接杀伤肿瘤细胞，对正常细胞和免疫系统均有破坏和抑制作用。因此，人们正在摸索一些新的治疗模式和手段。

WO00/06602 A1公开了一种肿瘤抑制基因WT1编码的蛋白及相关多肽，并公开了与之相关的肿瘤疫苗；EY0229492 A2公开了gp650糖蛋白抗原及相关多肽专利，并公开了了与之相关的单克隆抗体的制备，上述两篇专利主要涉及的专利保护领域与本发明领域不冲突。

近年来，随着分子免疫学和细胞生物学的飞速发展，以基因治疗和免疫治疗为两大支柱的生物治疗技术成为了肿瘤治疗的新型模式。其中免疫治疗越来越受到国际生物医学界的重视，并且在基础研究和临床应用方面均获得了大量的突破性成果。自八十年代末起，来源于肿瘤病人体内的肿瘤特异性的杀伤T细胞，包括CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞，得到了大量克隆。体外实验证明，它们可以有效地杀伤肿瘤细胞。基于这些发现，1991年和1995年，Terry Boon和Ugur Sahin等人分别建立了以肿瘤特异性CTL和抗体识别为基础肿瘤抗原筛选方法，并得到了大量肿瘤特异性和相关性抗原。包括(1)肿瘤共享抗原：又被称为Cancer-testis(CT)抗原，指那些在多种肿瘤组织中均有表达，而在除睾丸外的正常组织中无表达的抗原。如MAGE家族，BAGE，GAGE，LAGE，NY-ESO-1，SSX家族等。(2)组织特异性分化抗原：它们高表达于特定组织肿瘤，在其相应正常组织中低表达，在其它正常组织或其它肿瘤中不表达。如黑色素瘤中发现的tyrosinase，MART-1/MelanA，gp100/Pmel 17等抗原。(3)基因突变所致的抗原：某些病人的免疫细胞可识别肿瘤细胞中突变基因编码的抗原分子。这种基因突变改变抗原肽的一个或几个氨基酸残基，导致与MHC分子结合的亲和力改变或出现新的识别表位，而成为新的抗原。如p53，β-catenin等。(4)过量表达的抗原：这类抗原指那些表达过量，超出维持机体自身耐受而诱发免疫应答的抗原。许多肿瘤抗原均属于这一范畴。它们在肿瘤组织中高表达，在正常组织中低表达。如galectin-9，HER2/neu等。(5)不同剪切造成的变异体或融合蛋白抗原：在肿瘤细胞中，常有正常基因不同mRNA剪切体产生。它们成为新的变异体或融合蛋白，导致免疫应答。如Hodgkin病中的restin，LDLR/FUT。(6)肿瘤相关性自身抗原：肿瘤相关性自身抗原在正常组织和肿瘤组织中具有相似的表达水平。但只诱导肿瘤病人的抗体免疫应答。如HOM-MEL-2。其机制可能是由于肿瘤导致的翻译后修饰的改变而引起抗原加工和/或提呈的改变。(7)病毒基因编码的抗原：如肾癌中发现的逆转录病毒H编码的env蛋白，HOM-RCC-1，14。这些肿瘤抗原，无论以何种方法筛选得到，其中很多已被发现既可以诱导CTL应答，又可以诱导CD4⁺T细胞应答。以上这些肿瘤特异性和相关性抗原的发现标志着肿瘤免疫治疗进入了一个新的纪元，为肿瘤治疗性疫苗的研制提供了大量的分子基础。现代医学研究表明在对实体瘤治疗过程中抗体起的作用很小，主要是T淋巴细胞对肿瘤抗原的识别和对承载该抗原细胞的杀伤。因此，国际上研究肿瘤疫苗的一个主要思路是：发现新的肿瘤抗原-研究抗原的免疫学特性和可诱导CTL应答的多肽-利用抗原和多肽研发新的肿瘤疫苗。

进行肿瘤多肽疫苗的免疫治疗首先需要进行肿瘤抗原的选择。一般而言，由于CT抗原、突变抗原、肿瘤特异性变异体抗原为肿瘤组织特异性表达抗原，特异性表达于肿瘤组织，这些抗原成为衍生肿瘤多肽疫苗的首选抗原。特别是CT抗原，这类抗原只在肿瘤组织及睾丸等原始的组织中表达，正常组织中不表达，而睾丸又不表达HLA分子，所以使该组织成为免疫豁免组织，不受HLA限制性的CT抗原特异性CTL的攻击。由于它们在多种肿瘤中均有表达，为肿瘤共享抗原，使它们成为肿瘤多肽疫苗抗原的第一选择。

CT抗原包括MAGE、NY-ESO-1、SSX、BAGE、LAGE、PAGE、GAGE等很多家族成员，国际上研究最多也最有应用前景的是前三种CT抗原。迄今人们已发现多个CT抗原基因编码的特定多肽可以被T淋巴细胞识别并且激发很强的针对于这些特定多肽的HLA限制性的CTL活性。MAGE-1、MAGE-3已被证明有消退黑色素瘤及肺癌肿瘤的作用而用于治疗黑色素瘤及肺癌肿瘤I期临床试验。另一个例子是NY-ESO-1。NY-ESO-1是1997年Chen YT等人用SEREX方法从人食道癌中克隆得到的一个CT抗原。它对多种实体瘤病人血清呈阳性反应，在多种癌组织中mRNA为阳性。随后的实验证明，NY-ESO-1不仅可以诱导抗体应答，同样可以诱导CTL应答，并发现了其自然产生的CTL识别表位及CD4⁺T细胞识别表位，从理论上讲，既可以诱导又可以维持抗肿瘤免疫应答。利用NY-ESO-1多肽疫苗进行的晚期黑色素癌病人的临床治疗实验证实了以上理论。在接受治疗的12位病人中，7位为NY-ESO-1血清抗体阴性，5位为阳性。前者经疫苗免疫后，4/7的病人发生了NY-ESO-1多肽疫苗特异性的CTL和CD4⁺的DTH应答，后者虽未检测到NY-ESO-1特异性T细胞应答的变化，但3/5例病人的病情得到了控制。

CT抗原中的多肽表位是受HLA限制的，中国人同欧美人在HLA分布上是不完全相同的。我国常见的是A2(53.5％)，A11(25.6％)，A24(20.9％)，A33(20.9％)，B13(28.3％)，B35(23.2％)(见陈红松等人Chinese Medical Journal2001；113(12)：P1112-1118)。而欧美较多的A1(28.6％)和A3(20.6)在我国均不足10％。这个研究结果提示，我们肝癌免疫治疗的研究不能照抄欧美国家的研究成果，而应制定适合我国大多数HLA型别(如A2，A11，A24)的免疫治疗方案。

在肿瘤多肽疫苗的免疫的研制过程中，辅以佐剂可以增强细胞免疫应答。以往的十多年来，使用细胞因子进行免疫治疗的研究有了很大进展。IL-2、GM-CSF、IFNs、TNF等免疫治疗方法应用于不能外科手术切除的肝癌病人，均取得了一定的疗效。例如GM-CSF通过增强CD1a⁺的皮肤朗格罕氏细胞的抗原提呈能力提高免疫应答的强度，并维持持久的Th1和CD8+T细胞应答。IL-2为辅助性T细胞因子，可以增强细胞免疫应答，但大剂量使用有较强的副作用。近年来，越来越多的证据表明，辅助性T细胞(CD4⁺T细胞)对维持肿瘤免疫应答起着重要作用。在用合成的gp100抗原肽对晚期黑色素瘤病人的临床治疗试验发现，单独给予疫苗时，91％的病人外周血中检测出特异性的CD8⁺CTL，但病人临床指征并未改善。而佐以大剂量IL-2后，35％的病人得到缓解，而单独使用同样剂量的IL-2时的效果为15-20％。证明CD4⁺的T辅助细胞在抗肿瘤免疫中的重要作用。因此，在设计肿瘤多肽疫苗时，CTL识别的表位和CD4+T细胞的识别表位应同时考虑。而在NY-ESO-1中，发现了可以同时诱导CTL和CD4+T细胞的表位。这不仅节约了多肽的使用，更提高了疫苗的效率。但是使用大剂量的佐剂有较强的副作用。因此寻找适宜的佐剂以增强细胞免疫应答，也是肿瘤多肽疫苗的免疫的研制的重点。

本发明的目的在于提供一种治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂，所述的治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂适合中国人的HLA、采用混合CT抗原和适当的佐剂，可以使肿瘤抗原诱导特异性免疫反应的能力增强，有效地诱导特异性CTL应答，以杀伤所有残存肿瘤细胞。

本发明的另一目的在于提供一种治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂的制备方法，所述制备方法简单、适合大规模生产、产品性能好。

本发明的再一目的在于提供一种治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂作为治疗肝癌的肿瘤抗原免疫诱导剂在治疗和预防肝癌药物方面的用途。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂，包括至少两种肿瘤共享抗原(CT抗原)肽，所述的肿瘤共享抗原肽为MAGE-3、4、10(黑色素瘤相关抗原3，4，10)或NY-ESO-1(纽约-食管癌相关抗原-1)。所述每种抗原肽用量为100ug/次免疫。

本发明所述的治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂，进一步包括细胞佐剂，所述的细胞佐剂为树突状细胞，树突状细胞佐剂为10⁶个细胞/次免疫。

本发明所述的治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂，进一步还包括细胞因子佐剂，所述的细胞因子佐剂为GM-CSF，用量为75ug/天GM-CSF(粒巨-集落刺激因子)。

使用时，可以将至少两种抗原多肽直接用作治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂。

本发明的治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂进一步包括将至少两种抗原多肽经DC处理递呈，处理方法为20uM多肽与106DC在37℃、5％CO₂的条件下共孵育1-18小时。

本发明所述的一种治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂的制备方法为：

1)采用化学合成可与HLA-A2结合MAGE-3九肽FLWGPRALV、MAGE-4十肽GVYDGREHTV、MAGE-10九肽GLYDGMEHL和NY-ESO-1九肽SLLMWITQC，至少两种所合成的多肽混合得到肿瘤CT抗原肽；

2)制备DC佐剂(DC的体外分离和培养)：取抗凝外周静脉血60ml，经Ficoll梯度离心(25℃，515g，20分钟)后分离界面单个核细胞(PBMC)。或经血液细胞成分分离仪器分离病人外周血单个核细胞(PBMC)1×10⁸。细胞经洗涤后，用AIM-V培养液悬浮，调整细胞浓度到3×10⁶/ml，接种入24孔培养板。在37℃、5％CO₂孵箱中培养过夜后，轻轻吹打悬浮细胞并回收冻存，用以制备效应细胞。在贴壁细胞培养液中加入含1000u/ml GM-CSF(粒单集落刺激因子，购自先灵葆雅公司)和500u/ml IL-4(白细胞介素-4)的AIM-V。培养至第6-7天时，收获悬浮的DC。

3)本发明方法制备的DC，纯度可达80％-90％。

本发明的治疗肝癌的肿瘤CT抗原多肽进一步可以经DC处理递呈，处理方法为20uM多肽与106DC在37℃、5％CO₂的条件下共孵育1-18小时。

选择至少两种肿瘤共享抗原(CT抗原)肽混合，配制为每种肽100ug/包装后干燥，即得肿瘤CT抗原肽，使用时，用0.9ml生理盐水配置的33％DMSO(二甲基亚砜)溶解肿瘤CT抗原肽，单独或与10⁶/ml DC(1ml)混合1-18小时后皮下或皮内分3点注射。每周1次，共3-4周。在免疫前3天到后3天可皮下给予GM-CSF(75ug/天)。

由于肿瘤细胞是高度异质性的细胞群体，不同部位、甚至同一部位的肿瘤细胞可能表达不同的肿瘤抗原。因此在选择肿瘤多肽抑制剂时，可使用多价抗原多肽疫苗，以达到杀伤所有残存肿瘤细胞的目的，减少因抗原丢失变异体肿瘤细胞导致的肿瘤逃避。同时由于不同肿瘤病人表达的肿瘤抗原的差异，联合使用多种多肽疫苗还可提高标准化疫苗的使用人群范围。

肿瘤多肽抑制剂的免疫治疗另一个很重要的方面是佐剂的使用。由于大剂量使用佐剂有较强的副作用，本发明中采用低剂量的细胞因子佐剂将可以增强肿瘤多肽抑制剂的免疫效果。另一方面，随着细胞分子生物学的进展，树突状细胞(DendriticCell，DC)在抗肿瘤免疫中的作用越来越受到人们的重视。现今人们发现的专职抗原递呈细胞包括单核巨嗜细胞、B细胞和树突状细胞，后者是自然界中已知的具有最强的抗原递呈功能的细胞。其膜表面除了表达丰富的MHC-I和II外，还有大量的活化T细胞必须的B7-1、B7-2和ICAM等辅助分子。人们已经证明通过多种方法使DC递呈肿瘤多肽抑制剂，可以使肿瘤抗原诱导特异性免疫反应的能力增强。因此本发明将DC作为肿瘤多肽抑制剂的细胞佐剂。

树突状细胞(Dendritic Cell，DC)是体内最强的抗原递呈细胞，其可以显著活化处女型或初始型T淋巴细胞。DC可以高效加工、处理来自于自体和异体抗原分子，并通过MHC-I和II类分子递呈给免疫效应细胞。

本发明首先收集、整理了肝癌标本，包括收集整理了78例肝癌病人的新鲜非坏死癌组织标本，液氮保存。提取这些组织的核酸，-70℃保存。另外，收集这些病人的血清及外周血淋巴细胞标本，也进行了冷冻保存。为今后研究工作的顺利进行提供了保证。我们对这78例患者的背景资料进行了较全面的整理，包括病例、病理、HLA分型、肝炎病毒感染状况(包括乙肝病毒、丙肝病毒的检测)等资料以建立一个肝癌标本资源库。其方法参见陈红松等人Chinese Medical Journal2001；113(12)：P1112-1118。

同时本发明进行了MAGE和NY-ESO-1的基因表达的研究。方法参见陈红松等人Chinese Medical Journal 2001；113(12)：P1112-1118，结果如下：

采用逆转录—多聚酶链反应(RT-PCR)方法检测肝癌组织中MAGE-1，3，4，10以及NY-ESO-1mRNA的表达情况，并用探针杂交和测序的方法加以验证PCR的可靠性。研究结果显示如表1。经测序证明，我国的MAGE家族基因同国外分离到的序列同源性很高，基因变异很小。癌旁组织不表达上述CT抗原，但一部分癌旁标本可检出弱的MAGE-3表达，经病理诊断其癌旁组织有明显的异型增生。这些研究结果提示CT抗原在癌组织中表达高且具有明显的特异性，特别是至少表达一种CT抗原的阳性率大于90％。同时，提示CT抗原的检测对一些异型增生(癌前病变)的诊断可能具有应用价值。

表1中国人肝癌组织MAGE及NY-ESO-1的表达

例数癌组织癌旁组织

MAGE-1 45 71.1％ 0

MAGE-3 75 75.6％ 8.0％(弱阳性，病理证实为异型增生)

MAGE-4 78 26.9％ 0

MAGE-10 78 25.6％ 0

NY-ESO-1 61 42.6％ 0

本发明的肿瘤多肽抑制剂中的细胞佐剂DC，经过荧光标记抗体鉴定，DC特征为CD3-、CD19-、CD86+、HLA-DR+、CD14-、CD1a+、CD80+、CD83+。纯度可达80％-90％。同时研究表明IL-4(白细胞介素-4)，GM-CSF(粒-巨集落刺激因子)及TNF-(肿瘤坏死因子-)为DC诱导必须细胞因子；第7天至第9天是DC应用的最佳时间。

本发明合成了一系列可激活体外细胞毒T淋巴细胞的MAGE-3、4、10以及NY-ESO-1中可被HLA-A2结合的九肽或十肽片段，不采用用DC递呈该或DC递呈该肽，可激活具有特异性杀伤功能的CTL，活化的淋巴细胞的分泌IL-12和IL-10的功能增强。本发明利用DC递呈MAGE和NY-ESO-1抗原肽，在体外建立了有效的针对MAGE和NY-ESO-1特异性的细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)应答，结果表明无论是正常人还是HCC患者，均可以通过DC递呈MAGE和NY-ESO-1抗原肽活化效应T细胞，从而产生特异性的针对MAGE和NY-ESO-1抗原肽的CTL应答。证明单独或由DC递呈的MAGE和NY-ESO-1抗原肽是一种有前途的治疗肝癌的肿瘤CT抗原疫苗。也可能成为一种预防性疫苗。本发明的方法简单可行，适合工业化生产。

下面结合附图和具体实施例详细描述本发明，所述的实施例是用于描述本发明，而不是限制本发明。附图说明：

图1a.体外培养7天时DC在光镜下形态；

图1b.体外培养7天时DC电镜下形态；

图2.一例肝癌患者的体外CTL应答实验；

图2中DC+pep表示经载有上述CT抗原多肽的DC刺激活化的T细胞；pep表示单独多肽活化的T淋巴细胞；LC表示没经DC刺激的T细胞；T2+pep表示经上述CT抗原多肽处理过的T2细胞。

具体实施方式。

以下实施例中的研究对象：用于检测CT抗原mRNA表达和序列分析的78例HCC患者的肝癌及癌旁标本由北京和广西的医疗机构提供。HCC患者的平均年龄为45±10岁。其中男性27例，女性3例。癌及癌旁标本(距癌组织5cm外)均在术中取材，术后均经病理诊断确证。用于诱导体外免疫应答的7例原发性肝细胞癌(HCC)患者为北京某医院手术病人，3名正常献血员来自河北省。对以上患者及献血员采用美国One Lambda公司试剂盒对HLA-A位点分型结果均为HLA-A2。

实施例

DC的体外分离和培养：取抗凝外周静脉血60ml，经Ficoll梯度离心(25℃，515g，20分钟)后分离界面单个核细胞。细胞经2次洗涤后，用AIM-VAIM-V(-)种无血清培养基，购自美国GIBCO公司)培养液悬浮，调整细胞浓度到3×10⁶/ml，接种入24孔培养板。在37℃、5％CO₂孵箱中培养过夜后，轻轻吹打悬浮细胞并回收冻存，用以制备效应细胞。在贴壁细胞培养液中加入含1000u/ml GM-CSF(粒单集落刺激因子，购自先灵葆雅公司)和500u/ml IL-4(白细胞介素-4，北京大学医学部免疫教研室提供)的AIM-V。培养至第6-7天时，收获悬浮的DC。

MAGE-3/HLA-2多肽(FLWGPRALV)和MAGE-4/HLA-2多肽(GVYDGREHTV)和MAGE-10/HLA-A2多肽(GLYDGMEHL)和NY-ESO-1/HLA-2多肽(SLLMWITQC)的制备方法为多肽合成仪合成，本发明中的一个实施例采用MAGE-3/HLA-2多肽(FLWGPRALV)和MAGE-4/HLA-2多肽(GVYDGREHTV)和MAGE-10/HLA-A2多肽(GLYDGMEHL)和NY-ESO-1/HLA-2多肽(SLLMWITQC)四种多肽，另一个实施例采用MAGE-3/HLA-2多肽(FLWGPRALV)和MAGE-4/HLA-2多肽(GVYDGREHTV)两种多肽，每种用量都是100ug/次免疫。

通过下述方式鉴定本发明的治疗肝癌的肿瘤CT抗原疫苗，通过DC递呈MAGE3，4，10和NY-ESO-1抗原肽活化效应T细胞，产生特异性的针对MAGE-3，4，10和NY-ESO-1抗原表位的CTL应答作用。

1.DC膜标志的鉴定：用荧光标记抗体CD1a、CD3、CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-DR(购自Pharmingen公司)检测，通过流式细胞仪(FACScalibur)检测细胞表型。

2.DC细胞的处理：DC经离心后重悬浮在2mlAIM-V中，并加入MAGE-3/HIA-2多肽(FLWGPRALV)和MAGE-4/HLA-2多肽(GVYDGREHTV)和MAGE-10/HLA-A2多肽(GLYDGMEHL)和NY-ESO-1/HLA-2多肽(SLLMWITQC)混合液至每种多肽终浓度为40ug/ml。37C，5％CO2培养18小时，经3000rad放射线照射后，洗涤待用。

3.效应细胞的制备：3中的非贴壁细胞复苏后，与照射后的DC以20∶1混合共孵育6-7天，再按照相同比例加入DC，6-7天后，再次重复刺激一次。于0，3，7，10，14，19天，分别留取培养上清，备细胞因子检测之用。

4.靶细胞的制备：T2细胞或HLA-A2的EBV转染的人B淋巴细胞与终浓度分别均为20ug/ml的MAGE-3、MAGE-4、MAGE-10、NY-ESO-1多肽混合液共孵育4小时，洗涤后进行细胞毒分析。

5.细胞毒分析：效应细胞同靶细胞按照比例为30∶1，设3个复孔，采用经典Cr51释放细胞毒实验。

6.细胞因子检测：采用IL-10和IL-12细胞因子检测试剂盒(购自美国Endogen公司)检测培养上清中分泌的细胞因子。

西方白种人的HLA表型以A1和A2为多，而我国肝癌患者以HLA-A2为主，阳性率为53.5％，A1不足10％。因此我们应首先研究基于HLA-A2的免疫治疗策略。本文的研究对象均为HLA-A2表型。分别用两种靶细胞(表达A2分子的处理缺陷型细胞株T2和EBV病毒转染的HLA-A2人B淋巴细胞)重复验证免疫应答实验。结果如下。

参见图1，至第7天，体外培养的DC细胞具有典型的树突特征，并呈集落生长。经膜标志鉴定为CD1a弱阳、CD3阴性、CD14阴性、CD80弱阳、CD83阳性、CD86阳性、HLA-DR阳性。用CD86和HLA-DR双阳标记评价DC纯度为80.1-88.6％。HCC患者和献血员就以上指标比较，没有显著性差异。

参见图2，图中DC+pep表示经载有上述CT抗原多肽的DC刺激活化的T细胞；pep表示单独多肽活化的T淋巴细胞；LC表示没经DC刺激的T细胞；T2+pep表示经上述CT抗原多肽处理过的T2细胞。图中分别给出了采用MAGE-3/HLA-2多肽(FLWGPRALV)、MAGE-4/HLA-2多肽(GVYDGREHTV)、MAGE-10/HLA-A2多肽(GLYDGMEHL)和NY-ESO-1/HLA-2多肽(SLLMWITQC)四种多肽，以及采用MAGE-3/HLA-2多肽(FLWGPRALV)和MAGE-4/HLA-2多肽(GVYDGREHTV)两种多肽的情况。

经用多肽刺激的DC活化的T淋巴效应细胞可以特异性杀伤结合有相同上述混合CT抗原多肽的T2靶细胞。DC+pep表示经载有上述CT抗原多肽的DC刺激活化的T细胞；pep表示单独多肽活化的T淋巴细胞；LC表示没经DC刺激的T细胞；T2+pep表示经上述CT抗原多肽处理过的T2细胞。上述CTL应答实验结果表明无论是正常人还是HCC患者，均可以通过DC递呈MAGE3，4，10和NY-ESO-1抗原肽活化效应T细胞，从而产生特异性的针对相对应抗原肽的CTL应答。

实验结果表明，7名肝癌患者中有5名及3名正常人中有2名可以产生针对混合CT抗原肽的CTL应答(全部混合或MAGE-3、MAGE-4两者混合)并且均比单-多肽诱导的CTL反应增强。同时DC承载CT抗原肽可明显增强免疫应答的反应性。

迄今人们已经发现MAGE抗原中存在多个九个氨基酸残基左右的抗原肽可以体外活化特异性的CTL应答。这些抗原肽分别结合不同的HLA分子，即HLA限制性。本发明人工合成了与HLA-A2匹配的MAGE-3、MAGE-4、MAGE-10和NY-ESO-1中各一条多肽(如前所述)，两种或多种混合使用以增加CTL应答效果。本发明发现无论是正常人还是HCC患者，均可以通过DC递呈CT抗原肽活化效应T细胞，从而产生特异性的针对CT抗原肽的CTL应答。但这种应答的产生并不是100％的，文中有个别献血员和HCC患者没有产生CTL应答。提示免疫应答过程存在个体差异。但总的结果表明MAGE-3、MAGE-4、MAGE-10和NY-ESO-1的混合抗原肽可以有效地活化CTL细胞，从而清除表达该抗原的HCC肿瘤细胞。经过抗原肽刺激的DC可以作为一种HCC治疗行疫苗。同时，由于通过本文的方法可以诱导正常人对CT抗原肽的特异性CTL应答，而且80％以上的肝癌患者合并肝硬化，因此有可明确预防的人群，提示经过上述单独或DC承载的抗原肽也可能成为一种肝癌的预防性疫苗。

经过携带有MAGE3、4、10和NY-ESO-1抗原肽的DC活化的T淋巴细胞分泌Th1类(IL-12)和Th2类(IL-10)细胞因子的能力显著增强。提示这种活化了的效应细胞不仅可以增强细胞免疫，而且可能会促进体液免疫。这对于肿瘤免疫治疗及体液免疫起重要作用的病毒性传染病的免疫治疗会大大有益。

Claims

1.一种治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂，包括至少两种肿瘤CT抗原肽混合抗原多肽，所述的肿瘤CT抗原肽为MAGE-3、4、10或NY-ESO-1，所述每种抗原肽的用量为100ug/次免疫。

2.根据权利要求1所述的治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂，进一步包括细胞佐剂，所述的细胞佐剂为树突状细胞。

3.根据权利要求1或2所述的治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂，进一步还包括细胞因子佐剂，所述的细胞因子佐剂为GM-CSF。

4.根据权利要求3所述的治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂，所述每种抗原肽的量为100ug/次免疫；GM-CSF为75ug/天，树突状细胞佐剂量为10⁶个细胞/次免疫。

5.根据权利要求1或2所述的治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂，所述的混合抗原多肽是经DC处理递呈的混合抗原多肽，处理方法为20uM多肽与10⁶DC在37℃、5％CO₂的条件下共孵育1-18小时。

6.权利要求1所述治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂的制备方法为：采用化学合成的方法合成与HLA-A2结合的MAGE-3九肽FLWGPRALV、MAGE-4十肽GVYDGREHTV、MAGE-10九肽GLYDGMEHL和NY-ESO-1九肽SLLMWITQC，至少两种所合成的多肽混合配制为每种肽100ug/包装后干燥，即得肿瘤CT抗原肽。

7.根据权利要求6所述的治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂的制备方法，进一步包括制备树突状细胞，方法为：取抗凝外周静脉血60ml，经Ficoll梯度离心(25℃，515g，20分钟)后分离界面单个核细胞；或经血液细胞成分分离仪器分离病人外周血单个核细胞1×10⁸；细胞经洗涤后，用AIM-V培养液悬浮，调整细胞浓度到3×10⁶/ml，接种入24孔培养板；在37℃、5％CO₂孵箱中培养过夜后，轻轻吹打悬浮细胞并回收冻存，用以制备效应细胞；在贴壁细胞培养液中加入含1000u/mlGM-CSF和500u/ml IL-4的AIM-V；培养至第6-7天时，收获悬浮的DC，所述DC纯度为80％-90％。

8.根据权利要求6或7所述的治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂的制备方法，所述的肿瘤CT抗原多肽进一步经DC处理递呈，处理方法为20uM多肽与10⁶DC在37℃、5％CO₂的条件下共孵育1-18小时。

9.根据权利要求1所述治疗肝癌的肿瘤CT抗原免疫诱导剂在作为治疗和预防肝癌的肿瘤抗原免疫诱导剂在治疗和预防肝癌药物方面的用途。