CN103626877B

CN103626877B - 含ny-eso-1的融合蛋白、制备方法及应用

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Publication number: CN103626877B
Application number: CN201310613523.9A
Authority: CN
Inventors: 徐建青
Original assignee: VACDIAGN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: VACDIAGN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2013-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2017-01-11
Anticipated expiration: 2033-11-27
Also published as: CN103626877A

Abstract

本发明提供了一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由以下通式I表示：N—L—C通式I其中N表示NY‑ESO‑1抗原或具有其抗原表位的氨基酸序列；L表示连接肽，优选地，所述L通式为(G)_m，其中m为0‑5的整数，更优选地，m为0或4；C表示霍乱毒素或具有其活性的氨基酸序列，优选地，所述C为霍乱毒素A亚基的氨基酸序列和/或霍乱毒素B亚基的氨基酸序列，优选地，所述C的氨基酸序列的毒性位点发生突变；优选地，所述融合蛋白的N的氨基酸序列位于融合蛋白的氨基端，或所述融合蛋白的C的氨基酸序列位于融合蛋白的氨基端。本发明还公开了含有所述融合蛋白的疫苗及其制备方法和应用。

Description

含NY-ESO-1的融合蛋白、制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，特别地属于基因工程疫苗领域。

背景技术

NY-ESO-1基因是1997年由Chen等人使用重组cDNA文库血清学分析法筛选来自食管癌组织的cDNA表达文库而发现的；NY-ESO-1基因属于肿瘤-睾丸抗原（Cancer-TestisAntigen，CT）家族，在正常人中其表达仅限于睾丸、卵巢及胚胎滋养层细胞，在其它成年体细胞组织中不表达（Simpson,Nat.Rev.Cancer,5(8):615-625（2005）;Chen,PNAS USA,1997,94(5):1914-1918;Lethe,Int J Cancer,1998,76(6):903-908）。

研究显示，人源NY-ESO-1基因在多种组织类型肿瘤中呈不同程度的表达，包括但不限于神经母细胞瘤、恶性黑色素瘤、卵巢上皮癌、前列腺癌、肝细胞癌、食管癌和子宫癌等（Nicholaou T,Immunol Cell Biol.2006Jun;84(3):303-17;Jungbluth,Int.J.Cancer,2001,92(6):856-860;Odunsi,Cancer Res,2003,63:6076-6083;Perez,Int.J.Cancer,2008,123:1551-1555）。NY-ESO-1抗原在癌症患者中能引起较强的免疫原性，因而被广泛应用于肿瘤疫苗的开发，在肿瘤治疗中配合手术及放疗、化疗等手段，能有效的限制癌组织的转移、复发。有研究报道，所述NY-ESO-1抗原既能诱导体液免疫应答，又能激活CD4⁺T和CD8⁺T淋巴细胞，血清NY-ESO-1抗体阳性的患者中超过90%会产生NY-ESO-1特异性细胞毒性T细胞（Jager,PNAS USA2000(9):4760-4765）。

霍乱毒素（Cholera toxin，CT）作为一种公认的粘膜免疫佐剂，已经广泛应用于疫苗开发和应用研究。天然的CT分子是由一个A亚单位（CTA）和五个相同的形成环状的B亚单位（CTB）结成的六聚体。A亚单位易被外源性蛋白水解酶切断其二硫键，产生由单一的二硫键连结的Al和A2片段。A1片段具有ADP-核糖基化转移酶活性，能够催化某些哺乳动物蛋白的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性ADP核糖基化，尤其是三聚体GTP结合蛋白Gs的调节亚单位(调节腺苷酸环化酶的活性)，此作用导致环腺苷酸（cAMP）的细胞内浓度增高和蛋白激酶A的活化以及肠细胞内的主要氯化物通道的磷酸化和开放。A2片段是一种衔接分子，其主要功能是与B亚单位相结合。B亚单位能与大多数哺乳动物小肠粘膜上皮细胞上的GM1神经节苷脂受体结合，介导A亚单位进入细胞，而GM1几乎分布于体内所有细胞类型中，如T细胞、B细胞、抗原呈递细胞以及上皮细胞等，因而也利于抗原进入细胞。多年来对CT免疫原性和佐剂活性的研究认为，作为一种黏膜免疫佐剂，CT是直接作用于免疫系统，提高整体的反应强度，使针对于抗原的免疫反应增强。确切的说，CT是常见的肠粘膜佐剂，而非一般意义上的系统途径投递的佐剂。由于CT发挥毒性的作用在其亚单位A（即CTA），所以尚未将CT或其亚单位CTA直接与目的抗原融合表达，通过融合表达发挥佐剂活性的研究主要集中在CTB亚单位上。

然而，并非所有的蛋白抗原均能通过CTB融合表达的形式均能显著性提高其免疫原性，相反，抗原与CTB的融合有时反而会诱导免疫耐受，从而降低机体针对目的抗原的免疫应答，比如Bublin等利用CTB融合蛋白抑制了Th2免疫应答（Vaccine25(2007)8395–8404）。甚至将CTB与目的蛋白融合或偶联还是诱导免疫耐受的研究热点。

虽然现有技术有CT与其它抗原的融合蛋白，但未有将此类融合蛋白用作系统途径投递应用（因为系统途径投递CT，特别是CTA与肠道无关），也尚未见将CT佐剂用于提高肿瘤抗原NY-ESO-1的报道。

发明内容

现有技术表明NY-ESO-1疫苗的免疫原性相对较低，活化产生的与肿瘤细胞杀伤有关的细胞免疫应答尚不能满足需要。因此，为了进一步提高NY-ESO-1的免疫原性，本发明提供了一种含有肿瘤抗原的融合蛋白、表达该蛋白的基因及其表达载体，以及所述融合蛋白、融合基因和表达载体的应用。本发明提供的融合基因可以表达为疫苗，特别地为与肿瘤抗原融合表达形式的疫苗，以提高肿瘤免疫原NY-ESO-1的免疫原性，特别是细胞免疫原性，增强肿瘤疫苗的效果。

一方面，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白由以下通式I表示：

N—L—C

通式I

其中N表示NY-ESO-1抗原或具有其抗原表位的氨基酸序列；

L表示连接肽，优选地，所述L通式为(G)_m，其中m为0-5的整数，更优选地，m为0或4；

C表示霍乱毒素或具有其活性的氨基酸序列，优选地，所述C为霍乱毒素A亚基的氨基酸序列和/或霍乱毒素B亚基的氨基酸序列，优选地，所述C的氨基酸序列的毒性位点发生突变；

优选地，所述融合蛋白中N的氨基酸序列位于融合蛋白的氨基端，或所述融合蛋白中C的氨基酸序列位于融合蛋白的氨基端。

优选地，所述NY-ESO-1是人源或猴源的，优选猴源的。

优选地，其中所述N的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示和/或所述C的氨基酸序列如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8所示。

优选地，所述融合蛋白还包括其他抗原或功能性氨基酸序列；优选地，所述功能性氨基酸序列为组氨酸标签或GST标签。

另一方面，本发明提供了一种融合基因，所述融合基因含有上述的融合蛋白的编码核苷酸序列，优选地，所述编码核苷酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示。

再一方面，本发明提供了一种表达构建体，所述表达构建体含有上述融合蛋白的编码核苷酸序列，优选地，所述编码核苷酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示。

优选地，所述表达构建体是原核表达构建体，优选地，所述原核表达构建体为pET载体系列；

或所述表达构建体为真核表达构建体；优选地，所述真核表达构建体为质粒DNA载体，优选pVAX1载体和pSV1.0载体；重组病毒载体，优选重组痘苗病毒载体、重组腺病毒载体或重组腺相关病毒载体；或逆转录病毒载体，优选HIV病毒载体。

另一方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括上述表达构建体；

优选地，当所述表达构建体是原核表达构建体时，所述宿主细胞是原核生物细胞，优选细菌细胞；或当所述表达构建体是真核表达构建体时，所述宿主细胞是真核生物细胞，优选哺乳动物细胞。

另一方面，本发明提供了一种抗肿瘤疫苗，所述疫苗包括上述融合蛋白。所述疫苗能在受体内表达，并活化免疫系统，以使产生抗肿瘤的免疫应答。

优选地，本发明提供一种DNA疫苗，所述DNA疫苗为包括能表达上述融合蛋白的编码核苷酸序列的真核表达载体，优选地，所述真核表达载体为pSV1.0-NY-ESO-1，优选地，所述编码核苷酸序列为SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所述的序列。

另一方面，本发明提供了一种融合蛋白的制备方法，所述方法包括将NY-ESO-1基因核苷酸序列与CTA或CTB基因核苷酸序列相连，并克隆至原核表达载体的步骤。

具体地，所述制备方法包括以下步骤：

1）构建上述融合蛋白的核酸序列；

2）构建包含步骤1）的核酸序列的原核表达载体；

3）将步骤2）的原核表达载体用于转染或转化宿主细胞，并使所述核酸序列在宿主细胞中表达。

4）将步骤3）中表达的蛋白进行纯化。

另一方面，本发明提供了一种DNA疫苗的制备方法，所述方法包括NY-ESO-1基因核苷酸序列与CTA或CTB基因核苷酸序列相连，并克隆至真核表达载体的步骤；

具体地，所述制备方法包括以下步骤：

1）构建上述融合蛋白的核酸序列；

2）构建包含步骤1）的核酸序列的真核表达载体；

3）将步骤2）中的真核表达载体转化宿主细菌细胞，以复制产生大量的真核表达载体，即所述DNA疫苗。

4）纯化步骤3）中产生的DNA疫苗。

本发明还提供了上述融合蛋白、融合基因、表达构建体、所述的宿主细胞或疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。

与现有技术相比，本发明显著提高了肿瘤抗原NY-ESO-1的免疫原性，特别是增强了针对NY-ESO-1的T细胞应答，活化增加了可杀伤肿瘤细胞的T细胞。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1为根据本发明的实施例1的重组蛋白NY-ESO-1的免疫印迹结果，其中第1道为蛋白标记，第2道为实施例1中制备的重组蛋白NY-ESO-1，从图1中可以看出，第2道样品特异性条带大小约为25kD，符合重组蛋白NY-ESO-1大小预期，因而表明实施例1所制备的重组蛋白为NY-ESO-1。

图2为根据本发明的实施例2的融合蛋白的免疫印迹结果，其中第1道为蛋白标记，第2道为实施例1中制备的重组蛋白NY-ESO-1，第3道、第4道分别为实施例2中制备的重组蛋白NY-ESO-1-mCTA和NY-ESO-1-CTB，从图2中可以看出，第2道样品特异性条带位于25kD处，第3道特异性条带位于54kD处，第4道特异性条带位于39kD处，分别符合重组蛋白NY-ESO-1-mCTA和NY-ESO-1CTB大小预期，因而表明实施例2所制备的重组蛋白正确。

图3为根据本发明的实施例3的真核表达构建体的表达鉴定结果，其中第4道为蛋白标记，第1至3道分别为实施例3中制备的真核表达构建体pSV1.0-NY-ESO-1，pSV1.0-NY-ESO-1-CTB和pSV1.0-NY-ESO-1-CTA转染293T细胞表达蛋白样品，从图3中可以看出，第1道样品特异性条带位于18kD处，第2道特异性条带位于33kD处，第3道特异性条带位于48kD处，均符合预期，因而表明实施例3所制备的真核表达构建体能正确表达目的蛋白。

图4为根据本发明的实施例4的细胞免疫检测结果。纵坐标表示特异性T细胞应答强度，表述为每百万小鼠脾细胞的斑点形成单位（SFU/百万脾细胞）。A、B、C、D代表各免疫小鼠（见表1）。p值表示组间T检验水平，p<0.05认为具有统计学差异。

图5为根据本发明的实施例5的细胞免疫检测结果。纵坐标表示特异性T细胞应答强度，表述为每百万小鼠脾细胞的斑点形成单位（SFU/百万脾细胞）。A、B、C、D代表各免疫小鼠（见表2）。p值表示组间T检验水平，p<0.05认为具有统计学差异。

图6为根据本发明的实施例6的细胞免疫检测结果。纵坐标表示特异性T细胞应答强度，表述为每百万小鼠脾细胞的斑点形成单位（SFU/百万脾细胞）。A、B、C、D代表各免疫小鼠（见表3）。p值表示组间T检验水平，p<0.05认为具有统计学差异。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1 重组蛋白NY-ESO-1

NY-ESO-1氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。通过在线密码子优化软件（http://www.jcat.de/）将NY-ESO-1氨基酸序列优化成大肠杆菌密码子使用偏好的核苷酸序列（SEQ ID NO:3），经上海捷瑞生物技术有限公司合成后，克隆至原核表达构建体pET-30a(+)（Novagen，货号69909）上的多克隆位点NcoI与HindⅢ之间，构建成可表达NY-ESO-1抗原的原核表达构建体pET-30a(+)-NY-ESO-1（其核酸序列为SEQ ID NO:4），经测序鉴定正确后入库。将pET-30a(+)-NY-ESO-1转化至BL21(DE3)感受态细胞（天根生化科技（北京）有限公司，货号CB105），转化方法参看感受态细胞说明书。根据《pET系统手册》（TB0558thEdition02/99，Novagen）制备重组蛋白NY-ESO-1，所制蛋白分装后，-80℃保存。

经BCA法（碧云天生物技术研究所，货号P0009）检测，所制备的重组蛋白NY-ESO-1蛋白浓度为1mg/mL，检测方法参看检测试剂盒说明书。经凝胶法（厦门鲎试剂实验厂有限公司，货号G011000）检测，所制备的重组蛋白NY-ESO-1内毒素含量<1EU/mg，符合动物实验要求，检测方法参看鲎试剂说明书。此外，所得重组蛋白制成蛋白样品进行免疫杂交实验。其中，一抗用NY-ESO-1免疫小鼠血清（上海市公共卫生临床中心提供）以1:1000室温孵育2小时，孵育后PBST（含0.05%吐温20的PBS缓冲液）洗涤3遍，然后用羊抗鼠-HRP（SantaCruz，货号：sc-2005，美国）1:2000室温孵育2小时，孵育后PBST洗涤3遍，用DAB直接在膜上显色。结果如图1所示，其中第1道为蛋白标记，第2道为实施例1中制备的重组蛋白NY-ESO-1，从图1中可以看出，第2道样品特异性条带大小约为25kD，符合重组蛋白NY-ESO-1大小预期，因而表明实施例1所制备的重组蛋白为NY-ESO-1。

实施例2 融合蛋白的制备

将编码定点突变毒性位点的CTA氨基酸序列（以下简称mCTA，SEQ ID NO:5）的大肠杆菌密码子优化核苷酸序列（SEQ ID NO:6，苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供）插入实施例1制备的原核表达构建体pET-30a(+)-NY-ESO-1中的酶切位点XhoⅠ和HindⅢ之间，构建成可表达融合蛋白NY-ESO-1-mCTA的原核表达构建体pET-30a(+)-NY-ESO-1-mCTA（SEQ ID NO:7），经测序鉴定正确后入库。将pET-30a(+)-NY-ESO-1-mCTA转化至BL21(DE3)感受态细胞（天根生化科技（北京）有限公司，货号CB105），转化方法参看感受态细胞说明书。根据《pET系统手册》（TB0558th Edition02/99，Novagen）制备重组融合蛋白NY-ESO-1-mCTA，所制蛋白分装后，-80℃保存。

将编码CTB氨基酸序列（SEQ ID NO:8）的大肠杆菌密码子优化核苷酸序列（SEQ IDNO:9，苏州唯可达生物科技有限公司提供）插入原核表达构建体pET-30a(+)-NY-ESO-1中的酶切位点XhoⅠ和HindⅢ之间，构建成可表达融合蛋白NY-ESO-1-CTB的原核表达构建体pET-30a(+)-NY-ESO-1-CTB（SEQ ID NO:10），经测序鉴定正确后入库。将pET-30a(+)-NY-ESO-1-mCTA转化至BL21(DE3)感受态细胞（天根生化科技（北京）有限公司，货号CB105），转化方法参看感受态细胞说明书。根据《pET系统手册》（TB0558th Edition02/99，Novagen）制备重组融合蛋白NY-ESO-1-CTB，所制蛋白分装后，-80℃保存。

经BCA法（碧云天生物技术研究所，货号P0009）检测，所制备的上述重组蛋白蛋白浓度为1mg/mL，检测方法参看检测试剂盒说明书。经凝胶法（厦门鲎试剂实验厂有限公司，货号G011000）检测，上述所制备的重组蛋白内毒素含量<1EU/mg，符合动物实验要求，检测方法参看鲎试剂说明书。上述所得重组蛋白分别制成蛋白样品进行免疫杂交实验。其中，一抗分别用NY-ESO-1免疫小鼠血清（上海市公共卫生临床中心提供）以1:1000室温孵育2小时，孵育后PBST（含0.05%吐温20的PBS缓冲液）洗涤3遍，然后用羊抗鼠-HRP（SantaCruz，货号：sc-2005，美国）1:2000室温孵育2小时，孵育后PBST洗涤3遍，用DAB直接在膜上显色。结果如图2所示，其中第1道为蛋白标记，第2道为实施例1中制备的重组蛋白NY-ESO-1，第3道、第4道分别为实施例2中制备的重组蛋白NY-ESO-1-mCTA和NY-ESO-1-CTB，从图2中可以看出，第2道样品特异性条带位于25kD处，第3道特异性条带位于54kD处，第4道特异性条带位于39kD处，分别符合重组蛋白NY-ESO-1-mCTA和NY-ESO-1CTB大小预期，因而表明实施例2所制备的重组蛋白正确。

实施例3 真核表达构建体

NY-ESO-1氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。通过在线密码子优化软件（http://www.jcat.de/）将NY-ESO-1氨基酸序列优化成哺乳动物密码子使用偏好的核苷酸序列（SEQ ID NO:11），经上海捷瑞生物技术有限公司合成后，克隆至真核表达载体pDRVISV1.0载体（本文为叙述方便起见，以下简称为pSV1.0，参见中国国家发明专利200410028280.3权利要求1，其核酸序列为SEQ ID NO:12）上，构建成可真核表达NY-ESO-1的真核表达载体pSV1.0-NY-ESO-1（其核酸序列为SEQ ID NO:13），经测序鉴定后入库。

CTA、CTB哺乳动物密码子优化的编码核酸由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供（CTA氨基酸序列为SEQ ID NO:14，其哺乳动物密码子优化编码序列为SEQ ID NO:15；CTB氨基酸序列为SEQ ID NO:8，哺乳动物密码子优化编码序列为SEQ ID NO:16），然后通过本领域熟知的重叠PCR技术将前述NY-ESO-1编码序列分别与CTA、CTB编码序列相连，分别克隆至真核表达载体pSV1.0上，形成可真核表达融合蛋白的真核表达构建体pSV1.0-NY-ESO-1-CTA（SEQ ID NO:17）和pSV1.0-NY-ESO-1-CTB（SEQ ID NO:18），经测序鉴定后入库。

将真核表达构建体pSV1.0-NY-ESO-1、pSV1.0-NY-ESO-1-CTA、pSV1.0-NY-ESO-1-CTB以及载体对照pSV1.0用Turbofect转染试剂（赛默飞，美国）分别转染至293T细胞系上，转染方法为本领域熟知。转染48小时后收集并裂解细胞，制成蛋白样品进行免疫杂交实验。其中，一抗用NY-ESO-1免疫小鼠血清（上海市公共卫生临床中心提供）以1:1000室温孵育2小时，孵育后PBST（含0.05%吐温20的PBS缓冲液）洗涤3遍，然后用羊抗鼠-HRP（SantaCruz，货号：sc-2005，美国）1：2000室温孵育2小时，孵育后PBST洗涤3遍，用DAB直接在膜上显色。结果如图3所示，其中第4道为蛋白标记，第1至3道分别为实施例3中制备的真核表达构建体pSV1.0-NY-ESO-1，pSV1.0-NY-ESO-1-CTB和pSV1.0-NY-ESO-1-CTA转染293T细胞表达蛋白样品，从图3中可以看出，第1道样品特异性条带位于18kD处，第2道特异性条带位于33kD处，第3道特异性条带位于48kD处，均符合预期，因而表明实施例3所制备的真核表达构建体能正确表达目的蛋白。

实施例4 重组蛋白的免疫原性

体重为18-22g的SPF级雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。BALB/c小鼠随机分为四组，每组5只。其中，对照组A小鼠皮下接种100μL PBS，实验组小鼠分别于第0、3、6周皮下接种实施例1到2中制备的NY-ESO-1、NY-ESO-1-mCTA、NY-ESO-1-CTB重组蛋白，每次接种剂量为10μg，第一次接种使用完全弗氏佐剂，这与CT使用方法不同，CT是直接与目的抗原融合形成的融合表达蛋白，实际上是通过化学键连在一起的，而弗氏佐剂是通过蛋白与佐剂乳化后形成的一种复合物，以期提高免疫效果（FA，购自西格玛，中国），后面两针接种使用不完全弗氏佐剂（IFA，购自西格玛，中国），动物分组与免疫规划如表1。最后一次疫苗接种后两周，处死小鼠，并收集血清和脾细胞。

表1.动物分组与免疫规划

用常规分离方法分离脾细胞，简要叙述如下：

(1)摘眼球取血后，颈椎脱臼处死免疫小鼠，小鼠眼眶取的血放入灭菌的1.5mL离心管中，室温放置至凝血后3000g离心15分钟，小心吸取上层血清转移至新的1.5mL无菌离心管中，56℃灭活30分钟，存于-80℃冰箱；

(2)75%乙醇浸泡消毒，在超净台内取脾，放入已加入5mL RPMI1640培养基（含2%胎牛血清，1%PS，1%谷氨酰胺）的平皿中，纱布研磨；

(3)用吸管将研磨的脾淋巴细胞转移至15mL离心管中，以1200转/分，离心8分钟，弃去上清；

(4)每管加入3mL冰预冷的红细胞裂解液，室温放置3分钟，加入2mLRPMI1640培养基（2%含胎牛血清，1%PS，1%谷氨酰胺），以1200转/分，离心8分钟，弃上清；

(5)每管加入5mL RPMI1640完全培养基（10%含胎牛血清，1%PS，1%谷氨酰胺）重悬，吸取100μL用PBS稀释10倍后进行白细胞计数，以1200转/分，离心8分钟，弃去上清；

(6)用RPMI1640完全培养基将细胞稀释至合适浓度备用。

小鼠脾细胞用于酶联免疫斑点试验（ELISPOT），以检测特异性T细胞应答。小鼠IFN-γELISPOT试剂盒购自美国BD公司（货号551083），按照试剂盒说明书进行。实验结束后，用免疫斑点读板仪获取并分析数据（ChampspotⅢ，北京赛智）。

小鼠脾细胞用于酶联免疫斑点试验（ELISPOT），以检测特异性T细胞应答。小鼠IFN-γELISPOT试剂盒购自美国BD公司（货号551083），实验方法根据试剂盒说明书进行。其中，刺激细胞分泌IFN-γ的肽的氨基酸序列为：WITQCFLPVFLAQPP（由上海科肽生物科技有限公司合成），刺激浓度为10μg/mL，阳性刺激物佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯（phorbol12-myristate-13-acetate，PMA）和离子霉素（inomysin）均购自美国Sigma公司，刺激浓度分别为50ng/μL，1μg/μL。实验完成后，分析每孔的斑点数目，标准化处理后，反映免疫小鼠活化T细胞应答水平的特异性T细胞频数表述为斑点形成单位（Spots formulation units，SFCs）/百万脾细胞。检测结果见图4，相对于对照组A（5±3），与CTA或CTB融合的重组蛋白NY-ESO-1-mCTA（158±50）或NY-ESO-1-CTB（150±45）均能活化产生显著性的特异性T细胞应答，而未融合的重组蛋白NY-ESO-1（15±7）未能活化产生显著性的特异性T细胞应答。表明肿瘤抗原NY-ESO-1与CTA或CTB融合后，能显著提高细胞免疫原性，有助于活化产生特异性的T细胞应答，利于肿瘤细胞的杀伤。

实施例5 融合肿瘤抗原DNA疫苗初免的免疫原性

用德国QIAGEN公司去内毒素质粒大提试剂盒制备上述实施例2中的质粒DNA疫苗pSV1.0-NY-ESO-1、pSV1.0-NY-ESO-1-CTA、pSV1.0-NY-ESO-1-CTB以及对照pSV1.0。所有操作按说明书进行。将制备好的无内毒素的质粒溶于无菌的PBS溶液中(pH7.2)，调整浓度为1mg/mL。

体重为18-22g的SPF级雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。BALB/c小鼠随机分为四组，每组5只。其中，在第0周免疫第一针，对照组A小鼠肌肉注射100μgpSV1.0，实验组小鼠分别肌肉注射上述制备的DNA疫苗pSV1.0-NY-ESO-1、pSV1.0-NY-ESO-1-CTA、pSV1.0-NY-ESO-1-CTB，注射剂量为100μg，在第3周和第6周，对照组A小鼠皮下接种100μL PBS，实验组小鼠皮下接种实施例1制备的NY-ESO-1重组蛋白疫苗，每次接种剂量为10μg，所用佐剂为不完全弗氏佐剂（IFA，购自西格玛，中国），动物分组与免疫规划如表2。最后一次疫苗接种后两周，处死小鼠，并收集血清和脾细胞。

表2.动物分组与免疫规划

小鼠脾细胞用于酶联免疫斑点试验（ELISPOT），以检测特异性T细胞应答。小鼠IFN-γELISPOT试剂盒购自美国BD公司（货号551083），实验方法根据试剂盒说明书进行。其中，刺激细胞分泌IFN-γ的肽的氨基酸序列为：WITQCFLPVFLAQPP（由上海科肽生物科技有限公司合成），刺激浓度为10μg/mL，阳性刺激物佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯（phorbol12-myristate-13-acetate，PMA）和离子霉素（inomysin）均购自美国Sigma公司，刺激浓度分别为50ng/μL，1μg/μL。实验完成后，分析每孔的斑点数目，标准化处理后，反映免疫小鼠活化T细胞应答水平的特异性T细胞频数表述为斑点形成单位（Spots formulation units，SFCs）/百万脾细胞。检测结果见图5，相对于对照组A（5±3），所有组均能产生显著性水平的特异性T细胞免疫应答。与非融合NY-ESO-1DNA疫苗初免（B组,120±18）相比，NY-ESO-1-CTADNA疫苗初免（C组，374±79）或NY-ESO-1-CTB DNA疫苗初免（D组，152±54）均能活化产生更高水平的特异性T细胞应答，特别是NY-ESO-1-CTA DNA疫苗初免增加了2倍以上的特异性T细胞应答。表明肿瘤抗原NY-ESO-1与CTA或CTB融合后，能显著提高细胞免疫原性，有助于活化产生特异性的T细胞应答，利于肿瘤细胞的杀伤。

实施例6 融合重组蛋白疫苗的免疫原性

体重为18-22g的SPF级雌性BALB/c小鼠购自上海斯莱克实验动物中心。BALB/c小鼠随机分为四组，每组5只。其中，在第0周免疫第一针，对照组A小鼠肌肉注射100μg实施例5中制备的DNA疫苗pSV1.0，实验组小鼠分别肌肉注射实施例5中制备的DNA疫苗pSV1.0-NY-ESO-1，注射剂量为100μg，在第3周和第6周，对照组A小鼠皮下接种100μL PBS，实验组小鼠皮下接种实施例1到2中制备的NY-ESO-1、NY-ESO-1-mCTA、NY-ESO-1-CTB重组蛋白疫苗，每次接种剂量为10μg，所用佐剂为不完全弗氏佐剂（IFA，购自西格玛，中国），动物分组与免疫规划如表3。最后一次疫苗接种后两周，处死小鼠，并收集血清和脾细胞。

表3.动物分组与免疫规划

小鼠脾细胞用于酶联免疫斑点试验（ELISPOT），以检测特异性T细胞应答。小鼠IFN-γELISPOT试剂盒购自美国BD公司（货号551083），实验方法根据试剂盒说明书进行。其中，刺激细胞分泌IFN-γ的肽的氨基酸序列为：WITQCFLPVFLAQPP（由上海科肽生物科技有限公司合成），刺激浓度为10μg/mL，阳性刺激物佛波醇-12-肉豆蔻酯-13-乙酯（phorbol12-myristate-13-acetate，PMA）和离子霉素（inomysin）均购自美国Sigma公司，刺激浓度分别为50ng/μL，1μg/μL。实验完成后，分析每孔的斑点数目，标准化处理后，反映免疫小鼠活化T细胞应答水平的特异性T细胞频数表述为斑点形成单位（Spots formulation units，SFCs）/百万脾细胞。检测结果见图6，相对于对照组A（5±3），所有组均能产生显著性水平的特异性T细胞免疫应答。与非融合NY-ESO-1蛋白疫苗加强（B组,120±18）相比，NY-ESO-1-mCTA蛋白疫苗加强（C组，200±21）或NY-ESO-1-CTB DNA疫苗初免（D组，183±35）均能活化产生更高水平的特异性T细胞应答。表明肿瘤抗原NY-ESO-1与CTA或CTB融合后，能显著提高细胞免疫原性，有助于活化产生特异性的T细胞应答，利于肿瘤细胞的杀伤。

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由以下通式I表示：

N—L—C

通式I

其中N表示NY-ESO-1抗原或具有其抗原表位的氨基酸序列；

L表示连接肽；

C表示霍乱毒素。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述L通式为(G)_m，其中m为0-5的整数。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，m为0或4。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述C为霍乱毒素A亚基的氨基酸序列和/或霍乱毒素B亚基的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述C的氨基酸序列的毒性位点发生突变。

6.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白中N的氨基酸序列位于融合蛋白的氨基端，或所述融合蛋白中C的氨基酸序列位于融合蛋白的氨基端。

7.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述NY-ESO-1是人源或猴源的。

8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中，所述NY-ESO-1是猴源的。

9.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述N的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示和/或所述C的氨基酸序列如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:8所示。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白还包括功能性氨基酸序列；其中，所述功能性氨基酸序列为组氨酸标签或GST标签。

11.一种融合基因，其特征在于，所述融合基因为如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白的编码核苷酸序列。

12.根据权利要求11所述的融合基因，其中，所述编码核苷酸序列如SEQ ID NO:7、SEQID NO:10、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示。

13.一种表达构建体，其特征在于，所述表达构建体含有权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白的编码核苷酸序列。

14.根据权利要求13所述的表达构建体，其中，所述编码核苷酸序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所示。

15.根据权利要求13或14所述的表达构建体，其中，所述表达构建体是原核表达构建体或所述表达构建体为真核表达构建体。

16.根据权利要求15所述的表达构建体，其中，所述原核表达构建体为pET载体系列；

或，所述真核表达构建体为质粒DNA载体，重组病毒载体，或逆转录病毒载体。

17.根据权利要求16所述的表达构建体，其中，所述质粒DNA载体为pVAX1载体和pSV1.0载体，所述重组病毒载体为重组痘苗病毒载体、重组腺病毒载体或重组腺相关病毒载体，所述逆转录病毒载体为HIV病毒载体。

18.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求13～17中任一项所述的表达构建体。

19.根据权利要求18所述的宿主细胞，其中，当所述表达构建体是原核表达构建体时，所述宿主细胞是原核生物细胞；或当所述表达构建体是真核表达构建体时，所述宿主细胞是真核生物细胞。

20.根据权利要求19所述的宿主细胞，其中，所述原核生物细胞是细菌细胞；所述真核生物细胞是哺乳动物细胞。

21.一种抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述疫苗包括如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白。

22.一种抗肿瘤疫苗，其特征在于，所述抗肿瘤疫苗为DNA疫苗，所述DNA疫苗为包括能表达如权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白的编码核苷酸序列的真核表达载体。

23.根据权利要求22所述的抗肿瘤疫苗，其中，所述真核表达载体为pSV1.0-NY-ESO-1；其中，所述真核表达载体pSV1.0-NY-ESO-1是将编码NY-ESO-1的氨基酸的核苷酸序列克隆至真核表达载体pDRVISV1.0载体构建而成；所述真核表达载体pSV1.0-NY-ESO-1的核酸序列为SEQ ID NO:13。

24.根据权利要求22或23所述的抗肿瘤疫苗，其中，所述编码核苷酸序列为SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18所述的序列。

25.一种权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

1)构建根据权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白的核酸序列；

2)构建包含步骤1)的核酸序列的原核表达载体；

3)将步骤2)的原核表达载体用于转染或转化宿主细胞，并使所述核酸序列在宿主细胞中表达，产生融合蛋白；

4)将步骤3)中表达的融合蛋白进行纯化。

26.一种DNA疫苗的制备方法，所述方法包括将NY-ESO-1基因核苷酸序列与CTA或CTB基因核苷酸序列相连，并克隆至真核表达载体的步骤；其中，所述制备方法包括以下步骤：

2)构建包含步骤1)的核酸序列的真核表达载体；

3)将步骤2)中的真核表达载体转化宿主细菌细胞，以复制产生大量的真核表达载体，即所述DNA疫苗；

4)纯化步骤3)中产生的DNA疫苗。

27.权利要求1-10中任一项所述的融合蛋白、权利要求11或12所述的融合基因、权利要求13～17中任一项所述的表达构建体、权利要求18～20中任一项所述的宿主细胞或权利要求21～24中任一项所述的疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。