CN116751801A - 以pGEX6P1作为载体制备肿瘤相关抗原NY-ESO-1的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，提供了以pGEX6P1作为载体制备肿瘤相关抗原NY‑ESO‑1的方法及应用。将NY‑ESO‑1基因与带GST标签蛋白的pGEX6P1载体重组后转染感受态细胞，依次经种子获取及扩大培养、IPTG诱导后破菌收集上清、纯化后得到毫克级别的GST/NY‑ESO‑1融合蛋白。本发明选择pGEX6P1载体作为承载载体，并在后续表达纯化过程对各项工艺过程及条件进行优化，使得目标蛋白在可溶性上清中出现，避免了现有包涵体制备方式中需要对包涵体进行复性的步骤，简化了分离纯化流程及操作难度。得率方面，5L菌液经过本发明方法进行表达、纯化后，获得的GST/NY‑ESO‑1蛋白约为20mg，相较于现有微克级别的得率有大幅提升。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及肿瘤相关抗原NY-ESO-1的制备方法及其相关应用。
背景技术
肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)是指在肿瘤细胞或正常细胞上都存在的一类抗原分子，常用于临床肿瘤的诊断。它并非肿瘤细胞所特有，正常细胞可微量合成，并且在肿瘤细胞增殖时高度表达。在实体瘤治疗中，TAA靶点是特异性抗肿瘤免疫治疗的首选，针对TAA的抗体不仅可以通过ADCC效应直接杀死肿瘤细胞，也可以作为诊断标记物或者创新性的增加传统癌症疗法的靶向性。以TAA为基础的肿瘤治疗性疫苗可以激活机体的免疫系统，诱导产生特异性的免疫细胞，对肿瘤细胞产生杀伤，还可以TAA为靶点，设计相关的TCR/CAR，制备出TAA特异性的T细胞，用以开展细胞治疗。
NY-ESO-1(New York Esophageal Squamous Cell Carcinoma)抗原首先是由ChenYT等[1]通过SEREX技术从食管癌组织中筛选得到。此后，大量文献相继报道，在滑膜肉瘤(80％)、恶性黑素瘤(45％)、卵巢癌(43％)等肿瘤组织中表达较高，在肝癌(43％)、尿路上皮癌(35％)、多发性骨髓瘤(26％)、肺癌(18.2％)中也有不同程度的表达[2-5]，为将来免疫治疗的应用提供了基础。NY-ESO-1在正常组织中也有表达，但是由于血睾屏障的存在，使得这些正常组织并不会遭受免疫毒性，说明NY-ESO-1具有肿瘤特异性，展现了良好的临床应用前景。研究发现，在NY-ESO-1mRNA阳性的恶性黑素瘤患者中，50％患者血清中存在自发性特异性抗体[6]；对1374名乳腺癌患者进行血液检测后发现，1％的患者体内可以检测到自发性的NY-ESO-1特异性抗体[7]；此外，在肺癌、多发性骨髓瘤等患者中也有类似发现[8，9]，说明NY-ESO-1具有较强的激发特异性体液免疫应答的能力。不仅如此，NY-ESO-1还能诱导自发性特异性细胞免疫反应，主要是激活CD4+和CD8+T淋巴细胞。Jager团队[10]首先发现NY-ESO-1能诱导特异性的细胞免疫应答，随后Chen、Zeng等[11,12]也相继发现NY-ESO-1抗原肽能被CD4+或CD8+T淋巴细胞所识别，并与HLA-I类或HLA-II类分子结合，产生特异性的细胞免疫应答，而且90％以上血清NY-ESO-1抗体(+)的患者体内存在特异性CTL。因此，NY-ESO-1被认为是理想的肿瘤免疫治疗靶标。
现有NY-ESO-1抗原的制备主要通过包涵体的方法，不仅需要复性等复杂的操作，而且也会影响得率，仅能得到微克级别的蛋白。与此同时，商品化的NY-ESO-1蛋白价格极其昂贵，如某品牌通过大肠杆菌重组表达的NY-ESO-1蛋白价格为：￥3220/2μg、
￥4945/5μg、￥8970/10μg。因此亟需对现有制备方法进行优化，以期优化NY-ESO-1蛋白的价格。
发明内容
本发明基于上述研究进行，对现有NY-ESO-1蛋白的制备进行改进，使得蛋白主要在上清中，避免包涵体复性步骤，制备流程更加简便，同时一次得率可达mg级别，得率更高。
本发明的第一方面，提供了一种肿瘤相关抗原NY-ESO-1的制备方法，主体包括如下步骤：将NY-ESO-1基因与带GST标签蛋白的pGEX6P1载体重组后转染感受态细胞，依次经种子获取及扩大培养、IPTG诱导后破菌收集上清、纯化后得到毫克级别的GST/NY-ESO-1融合蛋白。
其中，NY-ESO-1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，GST标签蛋白的基因序列如SEQID NO.2所示，GST/NY-ESO-1融合蛋白的大小为40kD，基因序列和氨基酸序列分别如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。
进一步，本发明肿瘤相关抗原NY-ESO-1的制备方法具体包括如下步骤：
A、pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体构建
采用EcoR I和Xho I双酶切位点，将pGEX6P1载体进行切开，与NY-ESO-1基因序列进行拼接，所得的pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体经测序验证后，用于后续扩增、表达；
其中，NY-ESO-1的BamHI酶切位点引物序列如SEQ ID NO.3所示，XhoI酶切位点的引物序列如SEQ ID NO.4所示。
B、转染
将pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体转入BL-21/DE3感受态细胞，扩增后涂到氨苄抗性的LB培养板上(氨苄浓度20μg/mL)，挑菌；
C、种子获取及扩大培养
用枪头挑出菌落，放入氨苄抗性的LB培养基内，37℃，200rpm进行扩增；而后取菌液加入到250倍体积的氨苄抗性LB培养基中37℃，200rpm继续扩增，作为接种的种子；取多份种子液分别加入至多瓶200倍体积的氨苄抗性LB培养基中37℃，200rpm摇床扩大培养，过程中监测OD值，当OD值为0.6-0.7时，停止摇菌；
D、IPTG诱导后破菌收集上清
向步骤C的每瓶培养瓶中加入终浓度为0.5mM的IPTG，20℃、180rpm诱导过夜；而后将所有菌液转到离心瓶中，配平，5000rpm，15min离心后弃上清；向菌体中加入破菌缓冲液并充分打散，采用超声264W/m2、0.5Hz破菌12min后，将破好的菌液转到离心瓶中，配平，12000rpm，离心30min，收集上清；
其中，破菌缓冲液的配方组成如下：50mM Tris/HCl、1mM EDTA、0.5M NaCl，调节pH为8.0。
E、纯化
采用GSTRap柱子纯化，平衡液平衡后用洗脱液洗脱，待出现UV＝280nm的峰开始出现上升趋势后立即收集洗脱液，峰最高值约为600，待峰落下平稳后停止收集，采用平衡液继续平衡并收集流穿液；将洗脱液透析后采用Sepharose Q柱纯化，收集流穿液和洗脱液；将Sepharose Q柱纯化后收集的流穿液和洗脱液再次重复上述纯化步骤，收集洗脱液和流穿液，获得毫克级别的GST/NY-ESO-1融合蛋白。
该步骤中，GSTRap柱子的平衡液配方如下：50mM Tris/HCl、5％甘油、0.5MNaCl，体积为GSTRap柱子体积的100倍；进行柱子平衡时，平衡液流速为3ml/min。洗脱液配方如下：20mM Tris/HCl、20mM还原型GSH，体积为GSTRap柱子体积的20倍。
洗脱液透析方法如下：配制体积为洗脱液100倍的透析液，4h后换液一次，换液后透析过夜，透析液的配方组成如下：20m Tris/HCl、1mM EDTA、0.15M NaCl。
本发明的第二方面，提供了采用上述方法制备得到的GST/NY-ESO-1融合蛋白的应用，如在制备NY-ESO-1抗体检测试剂盒、肿瘤治疗性疫苗、NY-ESO-1单克隆抗体或NY-ESO-1特异性T细胞中的应用。
具体的，GST/NY-ESO-1融合蛋白作为抗原制备ELISA检测试剂盒，检测患者体内是否存在抗NY-ESO-1抗体及其滴度；作为抗原制备成肿瘤治疗性疫苗；作为抗原免疫小鼠等动物，筛选和制备可以产生抗NY-ESO-1抗体的杂交细胞瘤，制备大量单克隆抗体；NY-ESO-1为基础的治疗性疫苗免疫小鼠等动物后，获取NY-ESO-1特异性T细胞，克隆其TCR序列，可用于后续NY-ESO-1特异性TCR-T细胞治疗。
发明的作用与效果
本发明选择pGEX6P1载体作为承载载体，并在后续表达纯化过程对各项工艺过程及条件进行优化，使得目标蛋白在可溶性上清中出现，避免了现有包涵体制备方式中需要对包涵体进行复性的步骤，简化了分离纯化流程及操作难度。得率方面，5L菌液经过本发明方法进行表达、纯化后，获得的GST/NY-ESO-1蛋白约为20mg，相较于现有微克级别的得率有大幅提升。因此，本发明为GST/NY-ESO-1蛋白的制备提供了新的思路。
附图说明
图1是pGEX6P1载体质粒图谱和多克隆位点信息；
图2显示了pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体经BL-21/DE3感受态细胞表达后的蛋白情况；
图3显示了pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体表达的蛋白WB验证结果；
图4显示了pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体表达的蛋白纯化情况；
图5显示了pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体表达的蛋白纯化后WB验证情况。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。
一、表达载体的构建
根据GE公司的pGEX6P1载体信息，设计酶切位点和引物。采用EcoR I和Xho I双酶切位点，将pGEX6P1载体进行切开，与NY-ESO-1基因序列进行拼接。所得的pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体经测序验证后，用于后续扩增、表达。
其中，pGEX6P1载体质粒图谱和多克隆位点信息如图1所示，其带有GST标签蛋白。NY-ESO-1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，GST标签蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示；NY-ESO-1的BamHI酶切位点引物序列如SEQ ID NO.3所示，XhoI酶切位点的引物序列如SEQID NO.4所示。
NY-ESO-1基因序列(SEQ ID NO.1)：
atgcagg ccgaaggccg gggcacaggg ggttcgacgg gcgatgctga tggcccaggaggccctggca
ttcctgatgg cccagggggc aatgctggcg gcccaggaga ggcgggtgcc acgggcggca
gaggtccccg gggcgcaggg gcagcaaggg cctcggggcc gggaggaggc gccccgcggg
gtccgcatgg cggcgcggct tcagggctga atggatgctg cagatgcggg gccagggggc
cggagagccg cctgcttgag ttctacctcg ccatgccttt cgcgacaccc atggaagcag
agctggcccg caggagcctg gcccaggatg ccccaccgct tcccgtgcca ggggtgcttc
tgaaggagtt cactgtgtcc ggcaacatac tgactatccg actgactgct gcagaccacc
gccaactgca gctctccatc agctcctgtc tccagcagct ttccctgttg atgtggatca
cgcagtgctt tctgcccgtg tttttggctc agcctccctc agggcagagg cgctaa
GST基因序列(SEQ ID NO.2)：
ATG TCCCCTATAC TAGGTTATTG GAAAATTAAG GGCCTTGTGC
AACCCACTCG ACTTCTTTTG GAATATCTTG AAGAAAAATA TGAAGAGCAT TTGTATGAGC
GCGATGAAGG TGATAAATGG CGAAACAAAA AGTTTGAATT GGGTTTGGAG TTTCCCAATC
TTCCTTATTA TATTGATGGT GATGTTAAAT TAACACAGTC TATGGCCATC ATACGTTATA
TAGCTGACAA GCACAACATG TTGGGTGGTT GTCCAAAAGA GCGTGCAGAG ATTTCAATGC
TTGAAGGAGC GGTTTTGGAT ATTAGATACG GTGTTTCGAG AATTGCATAT AGTAAAGACT
TTGAAACTCT CAAAGTTGAT TTTCTTAGCA AGCTACCTGA AATGCTGAAA ATGTTCGAAG
ATCGTTTATG TCATAAAACA TATTTAAATG GTGATCATGT AACCCATCCT GACTTCATGT
TGTATGACGC TCTTGATGTT GTTTTATACA TGGACCCAAT GTGCCTGGAT GCGTTCCCAA
AATTAGTTTG TTTTAAAAAA CGTATTGAAG CTATCCCACA AATTGATAAG TACTTGAAAT
CCAGCAAGTA TATAGCATGG CCTTTGCAGG GCTGGCAAGC CACGTTTGGT GGTGGCGACC
ATCCTCCAAA ATCGGATCTG GAAGTTCTGT TCCAGGGGCC CCTGGGATCC CCGGAATTCC
CGGGTCGACT CGAGCGGCCG CATCGTGACT GA
NY-ESO-1的BamHI酶切位点引物(SEQ ID NO.3)：
5'CGGATCCCAGGCCGAAGGCCGGGGCACA 3'；
NY-ESO-1的XhoI酶切位点引物(SEQ ID NO.4)：
5'CCGCTCGAGTTAGCGCCTCTGCCCTGAGGGAGGC 3'。
二、NY-ESO-1的表达与纯化
1、重组质粒转染：将pGEX6P1/NY-ESO-1重组质粒转入BL-21/DE3感受态细胞，扩增后涂到氨苄抗性的LB培养板上，挑菌；其中，氨苄浓度为20μg/ml，下同。
2、菌落扩增：用枪头挑出菌落，放入4ml的氨苄抗性的LB培养基，37℃，200rpm进行扩增；
3、种子获取：取200μl的菌液加入50ml的氨苄抗性的LB培养基中扩增作为接种的种子，37℃，200rpm进行扩增；
4、扩大培养：配制氨苄抗性的LB培养基6瓶，每瓶400ml，加入200μL菌液，37℃，200rpm；
5、监测OD值：2小时后测OD值，然后每半小时监测一次，当OD值为0.6-0.7左右时，停止摇菌，留样1；
6、IPTG诱导：每瓶加入IPTG，终浓度为0.5mM/L，20℃，180rpm诱导过夜(具体为14h)，留样2；
7、收集细菌：将所有菌液转到离心瓶中，配平，5000rpm，15min，弃上清；
8、破菌：配制破菌缓冲液(50mM Tris/HCl；1mM EDTA；0.5M NaCl；共200ml，调节pH＝8.0)。将菌液冲下混匀，用搅拌子充分打散菌液30min，然后用超声264W/m2，0.5Hz破菌12min，留样3；
4、收集可溶上清：将破好的菌液转到离心瓶中，配平，12000rpm，离心30min，收集上清，留样4；同时用枪头挑一点沉淀(包涵体)加入50μl超纯水中，作为样品5；
5、蛋白烤染：将样品1-5跑电泳，分离胶浓度12％，浓缩胶浓度5％，120V，35min，然后将凝胶用考马斯亮蓝染色，漂洗至凝胶透明后，观察融合蛋白位置。结果如图2所示，载体的标签蛋白是N-GST，大小约为21kD；NY-ESO-1大小约为18-21kD，可溶上清样品40kD左右处的条带比较浓，提示GST/NY-ESO-1融合蛋白高表达，且主要在上清中，同时留样a；
6、初步纯化：配制平衡液(50mM Tris/HCl；5％甘油；0.5M NaCl；共500ml)和洗脱液(20mM Tris/HCl；20mM还原型GSH；共100ml)。用5ml的GSTRap柱子纯化，流速3ml/min平衡液平衡后(收集流穿液b)，用洗脱液洗脱，待出现UV＝280nm的峰开始出现上升趋势后立即收集洗脱液，并留样c；峰最高值约为600，待峰落下平稳后停止收集，共收集20ml左右洗脱液；平衡液继续平衡，收集流穿液，留样d。
7、蛋白烤染：同步骤10；结果如图3所示，利用NY-ESO-1抗体，通过WB的方法，对pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体表达的蛋白进行了验证，确认其表达的蛋白为NY-ESO-1蛋白。
8、洗脱液透析：配制透析液(20mM Tris/HCl；1mM EDTA；0.15M NaCl；共2L)，4h后换液一次，换液后透析过夜；
9、Sepharose Q柱纯化：将上述GSTrap柱纯化后样品再次通过Sepharose Q柱进行纯化，收集流穿液和洗脱液。蛋白烤染结果参见图4，pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体表达的蛋白经过GSTrap和Sepharose Q柱两步纯化后，在目的位置(40kD)获得了较纯的蛋白(为GST/NY-ESO-1融合蛋白)。
10、再次纯化：步骤同初次纯化，收集流穿液共30ml左右。pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体表达的蛋白纯化后WB验证情况参见图5，pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体表达的蛋白经过GSTrap和Sepharose Q柱两步纯化后，在目的位置(40kD)获得了较纯的蛋白。经过WB验证后，确认其为GST/NY-ESO-1融合蛋白。
采用BCA法蛋白含量检测试剂盒(ThermoFisher)测定蛋白浓度。经过多次重复，5L菌液经过本法进行表达、纯化后，获得的GST/NY-ESO-1蛋白约为20mg。
GST/NY-ESO-1融合蛋白的基因序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示。
GST/NY-ESO-1融合蛋白基因序列(SEQ ID NO.5)：
ATG TCCCCTATAC TAGGTTATTG GAAAATTAAG GGCCTTGTGC
AACCCACTCG ACTTCTTTTG GAATATCTTG AAGAAAAATA TGAAGAGCAT
TTGTATGAGCGCGATGAAGG TGATAAATGG CGAAACAAAA AGTTTGAATT
GGGTTTGGAG TTTCCCAATCTTCCTTATTA TATTGATGGT GATGTTAAAT
TAACACAGTC TATGGCCATC ATACGTTATATAGCTGACAA GCACAACATG
TTGGGTGGTT GTCCAAAAGA GCGTGCAGAG ATTTCAATGCTTGAAGGAGC
GGTTTTGGAT ATTAGATACG GTGTTTCGAG AATTGCATAT AGTAAAGACT
TTGAAACTCT CAAAGTTGAT TTTCTTAGCA AGCTACCTGA AATGCTGAAA
ATGTTCGAAGATCGTTTATG TCATAAAACA TATTTAAATG GTGATCATGT
AACCCATCCT GACTTCATGTTGTATGACGC TCTTGATGTT GTTTTATACA
TGGACCCAAT GTGCCTGGAT GCGTTCCCAA AATTAGTTTG TTTTAAAAAA
CGTATTGAAG CTATCCCACA AATTGATAAG TACTTGAAATCCAGCAAGTA
TATAGCATGG CCTTTGCAGG GCTGGCAAGC CACGTTTGGT GGTGGCGACC
ATCCTCCAAA ATCGGATCTG GAAGTTCTGT TCCAGGGGCC CCTGGGATCC
cagg ccgaaggccg gggcacaggg ggttcgacgg gcgatgctga tggcccaggaggccctggca
ttcctgatgg cccagggggc aatgctggcg gcccaggaga ggcgggtgccacgggcggcagaggtccccg
gggcgcaggg gcagcaaggg cctcggggcc gggaggaggc gccccgcggggtccgcatggcggcgcggct
tcagggctga atggatgctg cagatgcggg gccagggggccggagagccg cctgcttgagttctacctcg ccatgccttt
cgcgacaccc atggaagcagagctggcccg caggagcctg gcccaggatg ccccaccgcttcccgtgcca ggggtgcttc
tgaaggagtt cactgtgtcc ggcaacatac tgactatccg actgactgctgcagaccaccgccaactgca gctctccatc
agctcctgtc tccagcagct ttccctgttg atgtggatcacgcagtgctt tctgcccgtgtttttggctc agcctccctc
agggcagagg cgctaaCT CGAGCGGCCGCATCGTGACTGA
GST/NY-ESO-1融合蛋白基因序列(SEQ ID NO.6)：
MSPILGYWKIKGLVQPTRLLLEYLEEKYEEHLYERDEGDKWRNKKFELGLEFPNLPYYIDGDVKLTQSMAIIRYIADKHNMLGGCPKERAEISMLEGAVLDIRYGVSRIAYSKDFETLKVDFLSKLPEMLKMFEDRLCHKTYLNGDHVTHPDFMLYDALDVVLYMDPMCLDAFPKLVCFKKRIEAIPQIDKYLKSSKYIAWPLQGWQATFGGGDHPPKSDLEVLFQGPLGSQAEGRGTGGSTGDADGPGGPGIPDGPGGNAGGPGEAGATGGRGPRGAGAARASGPGGGAPRGPHGGAASGLNGCCRCGARGPESRLLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQDAPPLPVPGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHRQLQLSISSCLQQLSLLMWITQCFLPVFLAQPPSGQRR-LERPHRD。
本发明背景技术部分所引用的参考文献如下：
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以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (10)
1.一种肿瘤相关抗原NY-ESO-1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将NY-ESO-1基因与带GST标签蛋白的pGEX6P1载体重组后转染感受态细胞，依次经种子获取及扩大培养、IPTG诱导后破菌收集上清、纯化后得到毫克级别的GST/NY-ESO-1融合蛋白，而后去除GST标签。
2.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原NY-ESO-1的制备方法，其特征在于：
其中，NY-ESO-1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，GST标签蛋白的基因序列如SEQ IDNO.2所示。
3.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原NY-ESO-1的制备方法，其特征在于：
其中，GST/NY-ESO-1融合蛋白的大小为40kD，基因序列和氨基酸序列分别如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求1所述的肿瘤相关抗原NY-ESO-1的制备方法，其特征在于：
其中，所述肿瘤相关抗原NY-ESO-1的制备方法具体包括如下步骤：
A、pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体构建
采用EcoR I和Xho I双酶切位点，将pGEX6P1载体进行切开，与NY-ESO-1基因序列进行拼接，所得的pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体经测序验证后，用于后续扩增、表达；
B、转染
将pGEX6P1/NY-ESO-1重组载体转入BL-21/DE3感受态细胞，扩增后涂到氨苄抗性的LB培养板上，挑菌；
C、种子获取及扩大培养
用枪头挑出菌落，放入氨苄抗性的LB培养基内，37℃，200rpm进行扩增；而后取菌液加入到250倍体积的氨苄抗性LB培养基中继续扩增，作为接种的种子；取多份种子液分别加入至多瓶200倍体积的氨苄抗性LB培养基中摇床扩大培养，当OD值为0.6-0.7时，停止摇菌；
D、IPTG诱导后破菌收集上清
向步骤C的每瓶培养瓶中加入终浓度为0.5mM的IPTG，20℃、180rpm诱导过夜；而后将所有菌液转到离心瓶中，配平，5000rpm，15min离心后弃上清；向菌体中加入破菌缓冲液并充分打散，采用超声264W/m2、0.5Hz破菌后收集可溶上清；
E、纯化
采用GSTRap柱子纯化，平衡液平衡后用洗脱液洗脱，待出现UV＝280nm的峰开始出现上升趋势后立即收集洗脱液，峰最高值约为600，待峰落下平稳后停止收集，采用平衡液继续平衡并收集流穿液；将洗脱液透析后采用Sepharose Q柱纯化，收集流穿液和洗脱液，
将Sepharose Q柱纯化后收集的流穿液和洗脱液再次重复上述纯化步骤，收集洗脱液和流穿液，获得毫克级别的GST/NY-ESO-1融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的肿瘤相关抗原NY-ESO-1的制备方法，其特征在于：
其中，步骤A中，NY-ESO-1的BamHI酶切位点引物序列如SEQ ID NO.3所示，XhoI酶切位点的引物序列如SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求4所述的肿瘤相关抗原NY-ESO-1的制备方法，其特征在于：
其中，步骤B和步骤C中，氨苄浓度均为20μg/mL，
步骤C中，种子获取与扩大培养的条件与菌落扩增条件相同。
7.根据权利要求4所述的肿瘤相关抗原NY-ESO-1的制备方法，其特征在于：
其中，步骤D中，IPTG诱导时间为14h；
破菌缓冲液的配方组成如下：50mM Tris/HCl、1mM EDTA、0.5M NaCl，调节pH为8.0；破菌时，将破菌缓冲液冲下混匀，用搅拌子充分打散菌液30min，然后用超声264W/m2，0.5Hz破菌12min；
收集可溶上清的步骤如下：将破好的菌液转到离心瓶中，配平，12000rpm，离心30min，收集上清。
8.根据权利要求4所述的肿瘤相关抗原NY-ESO-1的制备方法，其特征在于：
其中，步骤E中，GSTRap柱子的平衡液配方如下：50mM Tris/HCl、5％甘油、0.5MNaCl，体积为GSTRap柱子体积的100倍；进行柱子平衡时，平衡液流速为3ml/min；
洗脱液配方如下：20mM Tris/HCl、20mM还原型GSH，体积为GSTRap柱子体积的20倍；
洗脱液透析方法如下：配制体积为洗脱液100倍的透析液，4h后换液一次，换液后透析过夜，透析液的配方组成如下：20m Tris/HCl、1mM EDTA、0.15M NaCl。
9.权利要求1～8任一项所述的方法制备得到的NY-ESO-1融合蛋白在制备NY-ESO-1抗体检测试剂盒、肿瘤治疗性疫苗、NY-ESO-1单克隆抗体或NY-ESO-1特异性T细胞中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，NY-ESO-1单克隆抗体或NY-ESO-1特异性T细胞制备时，先将NY-ESO-1作为抗原免疫动物，然后筛选和制备可以产生抗NY-ESO-1抗体的杂交细胞瘤，制备大量单克隆抗体；或者从免疫动物体内获取NY-ESO-1特异性T细胞，克隆其TCR序列，用于后续NY-ESO-1特异性TCR-T细胞治疗。
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